JP5153638B2 - 毛包前駆細胞を皮膚に送達する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2005年10月17日に出願された米国仮特許出願第60/727,588号の利益を請求し、米国仮特許出願第60/727,588号は、本明細書中に参考として援用される。
(連邦政府の支援による研究または開発に関する陳述)
適用なし。
適切な細胞送達技術の開発は、多くの用途に対して重要である。この細胞は、被験体の適切な部分に送達されなければならないだけではなく、この細胞の形態も維持されなければならない。細胞の形態は多くの状況において重要であり得る。細胞の形態は、この細胞の健康状態および細胞の分化状態の両方の観点において、細胞の状態を示す。細胞の形状における変化または形態発生は、細胞の機能、発達、および疾患の中核をなす。細胞における生理学的プロセスはしばしば、細胞形態における変化を伴う。例としては、細胞構成物質(例えば、細胞小器官、高分子クラスター、または細胞骨格)の細胞内の位置、配置および構造における変化、細胞全体の形態(例えば、その形状および面積)における変化、細胞間の間隔および近接性、ならびに多細胞コロニーの特性(例えば、その形状、大きさ、および細胞の位置)における変化が挙げられる。
一つの実施形態において、本発明は、皮膚に創傷を作製し、そしてその創傷上に、毛包前駆細胞を置く工程を包含する、生える(egressing)毛幹を形成する方法であり、ここで、生える毛幹は、その毛包前駆細胞から形成される。本発明はまた、皮膚に創傷を作製し、そしてその創傷上に皮膚形成細胞を置く工程を包含する、新しい皮膚を形成する方法であり、ここで、新しい皮膚は、その皮膚形成細胞から形成される。
細胞は、その細胞が所望される領域に創傷を作製し、そしてその創傷上に、その細胞を置くことにより、その細胞の固有の特徴を妨げることなく、表皮に送達され得ることが発見された。その細胞は、本発明の方法による、送達の際に、所望の構造を形成するようにそれら自体が適切に適応することが予想される。適切には、その細胞は、その創傷の上の皮膚の表面上に置かれ得るか、またはその創傷自体の中に置かれ得る。
胸腺欠損ヌード(nu/nu)マウス(Charles River,Inc)に麻酔をかけ、そして表面の切断部のグリッドを、Number11のメスの刃を用いて、背面の皮膚上に作製した。その切断部は、出血しないほど十分に浅かった。新たに単離された新しく生まれたブラックマウスの皮膚細胞(これらは、100,000個の表皮細胞および200,000個の真皮細胞を含む)を、以下のように調製した。体幹の皮膚を新しく生まれたマウスから取り出し、Ca2+およびMg2+を含まないPBS中で洗浄した。その皮膚を、Dispase(2.5mg/ml、Invitrogen,Calsbad,CA)を含むPBS中に、4℃で一晩中、または37℃で2時間、平らに寝かした。誘発性真皮細胞および表皮細胞を、Weinberg et al.,J.Invest.Dermatol.,100:229−236(1993)(本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、単離した。2マイクロリットルの滅菌生理食塩水溶液中の、細胞の懸濁液を、ピペットにより切断部のグリッドに送達した。その皮膚を、数秒間の間ゆるやかに引き、流体をグリッドの至るところに運んだ。非接着性の疎水性の包帯(ワセリンで被覆されたガーゼ)を、その創傷に適用し、そしてそのマウスを弾性のラップでさらに包帯をし、麻酔からの回復の際に上記包帯がとれてしまうことを防止した。その包帯を10日後に取り除いた。2週間後に、髪の成長が、主にグリッドパターン内に観察された(図1、挿入)。次にそのマウスを安楽死させ、そして皮膚をゆっくりと取り出した。皮膚の下側の観察により、内側に成長する髪がほぼ全くないこと、および皮膚の表面に見られる目に見える髪に対応する濾胞球の存在が示された。
胸腺欠損ヌード(nu/nu)マウス(Charles River,Inc)に麻酔をかけ、そして皮膚の表面に対して低い角度で保持したNumber11のメスの刃の先端で突き刺すことで、刺創を作製した(図2)。新たに単離された新しく生まれたブラックマウスの皮膚細胞(これらは、100,000個の表皮細胞および200,000個の真皮細胞を含む)を、上に記載されるように調製した。2マイクロリットルの滅菌生理食塩水溶液中の、細胞の懸濁液を、ピペットにより切断部に滴注した。非接着性の疎水性の包帯(ワセリンで被覆されたガーゼ)を、その創傷に適用し、そしてそのマウスを弾性のラップでさらに包帯をし、麻酔からの回復の際に上記包帯がとれてしまうことを防止した。その包帯を10日後に取り除いた。2週間後に、髪の成長が、ちょうど刺創の部位に観察された(図2、挿入)。次いで、そのマウスを安楽死させ、そして皮膚をゆるやかに取り出した。皮膚の下側の観察により、内側に成長する髪がほぼ全くないこと、および皮膚の表面に見られる目に見える髪に対応する濾胞球の存在が示された。
表1に示される、異なる型の創傷包帯材料を用いて、実施例1および実施例2を繰り返した。
皮相創傷を、外科用刃またはメスを用いて、グリッド、多数交差、平行線、または髪の成長のための所望の美的効果を達成するための類似のパターンとして、ヒト被験体の頭部の上に作る。次に、懸濁液中の自己ヒト発毛性真皮細胞および表皮細胞(これらは、髪の色素沈着を回復させる必要がある場合、毛包メラノサイトと必要に応じて混合される)を、ピペットチップまたはシリンジで、皮相切断部の上に広げ、そしてその創傷を、皮膚に取り込まれる前にその細胞が乾燥するのを防止するため、2〜3日間覆う。次いで、生える毛包が形成される。
創傷を、外科的刃またはメスを用いて、グリッド、多数交差、平行線、または髪の成長のための所望の美的効果を達成するための類似のパターンとして、ヒト被験体の頭部の上に作る。次に、懸濁液中のヒト発毛性真皮細胞(これは、髪の色素沈着を回復させる必要がある場合、毛包メラノサイトと必要に応じて混合される)のみを、ピペットチップまたはシリンジで、皮相切断部の上に広げ、そしてその創傷を、皮膚に取り込まれる前にその細胞が乾燥するのを防止するため、2〜3日間覆う。次いで、生える毛包が形成される。
糖尿病性足部潰瘍を有する被験体に、局所麻酔または全身麻酔の形で麻酔をかけ、その潰瘍に、一連の皮相切断部を作製する。その切断部は、出血しないほど十分に浅い。2マイクロリットルの滅菌生理食塩水溶液中の、基底細胞の懸濁液を、ピペットにより切断部に送達する。その皮膚を、数秒間の間ゆるやかに引き、流体をグリッドの至るところに運ぶ。非接着性の疎水性の包帯(ワセリンで被覆されたガーゼ)を、その創傷に適用する。その包帯を10日後に取り除く。新しい皮膚が形成し、そしてその潰瘍は治癒される。
褥瘡を有する被験体に、局所麻酔または全身麻酔の形で麻酔をかけ、その潰瘍に、一連の皮相切断部を作製する。その切断部は、出血しないほど十分に浅い。2マイクロリットルの滅菌生理食塩水溶液中の、基底細胞の懸濁液を、ピペットにより切断部に送達する。その皮膚を、数秒間の間ゆるやかに引き、流体をグリッドの至るところに運ぶ。非接着性の疎水性の包帯(ワセリンで被覆されたガーゼ)を、その創傷に適用する。その包帯を10日後に取り除く。新しい皮膚が形成し、そしてその褥瘡は治癒される。
Claims (15)
- 生える毛幹を形成するための毛包前駆細胞の懸濁物であって、ここで、該懸濁物は生える毛幹を形成するのに有効な量で、創傷の表面に置かれることを特徴とし、該創傷は、出血しないほど十分に浅い、皮膚の表面に沿って作製された切開性創傷であり、該毛包前駆細胞は、真皮細胞、表皮細胞またはその組み合わせを含む、懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞が、真皮細胞を含む、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞が、表皮細胞を含む、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞が、表皮下皮膚に置かれる、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞が、真皮乳頭層皮膚に置かれる、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞が、上方の真皮網状層皮膚に置かれる、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記創傷が、少なくとも10μmの深さである、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記創傷が、少なくとも200μmの深さである、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記創傷が、500μm未満の深さである、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記創傷が、250μm未満の深さである、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞を含む前記創傷が、創傷包帯で覆われることを特徴とする、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記毛包前駆細胞は、真皮細胞および表皮細胞を含む、請求項1に記載の懸濁物。
- 前記表皮細胞の前記真皮細胞に対する比率は、10:1〜1:10である、請求項12に記載の懸濁物。
- 前記表皮細胞の前記真皮細胞に対する比率は、1:2である、請求項13に記載の懸濁物。
- 前記生える毛幹は、内側への毛髪の成長を生じない、請求項1に記載の懸濁物。
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