WO2019177146A1 - シート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents

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WO2019177146A1
WO2019177146A1 PCT/JP2019/010817 JP2019010817W WO2019177146A1 WO 2019177146 A1 WO2019177146 A1 WO 2019177146A1 JP 2019010817 W JP2019010817 W JP 2019010817W WO 2019177146 A1 WO2019177146 A1 WO 2019177146A1
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sheet
cell culture
cells
culture
hours
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PCT/JP2019/010817
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菊池実記
佐野進弥
小河由美
野口枝莉
菅野智規
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テルモ株式会社
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing a sheet-shaped cell culture that can be suitably used in the treatment of various diseases, particularly heart diseases, a sheet-shaped cell culture produced by the method, and a composition comprising the sheet-shaped cell culture
  • the present invention relates to an article, a graft, a medical product, a disease treatment method using the sheet-shaped cell culture, and the like.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc., for repairing myocardial tissue damaged by ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction has been attempted (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • sheet cell culture For the application of sheet cell culture to the treatment, use of cultured epidermis sheet for skin damage caused by burns, use of corneal epithelial sheet cell culture for corneal injury, oral mucosa sheet for endoscopic resection of esophageal cancer Studies on the use of cell cultures are underway, and some of them are in the clinical application stage.
  • the present disclosure relates to a method for producing a sheet-shaped cell culture that can be suitably used in the treatment of various diseases, particularly heart diseases, a sheet-shaped cell culture produced by the method, and a composition comprising the sheet-shaped cell culture
  • the object is to provide a product, a graft and a medical product, a disease treatment method using the sheet-shaped cell culture, and the like.
  • sheet-shaped cell culture As the clinical application of sheet-shaped cell culture progresses, it has become necessary to provide a sheet-shaped cell culture that is easier to handle with higher quality and can be easily manufactured.
  • the present inventors investigated whether the formed sheet-shaped cell culture was formed during the incubation for forming the sheet-shaped cell culture using the temperature-responsive culture dish. I found a phenomenon that peeled off naturally. We have continued research based on the hypothesis that this phenomenon occurs because the adhesion between cells of the cells that make up the sheet increases with the formation of the sheet-like cell culture, resulting in greater adhesion between the cells and the substrate.
  • the present invention relates to the following: [1] (i) seeding a cell population containing at least one sheet-forming cell on a culture substrate; (Ii) sheeting the cell population seeded in step (i) in a cell culture medium to form a sheet-like cell culture, and (iii) the sheet-like cell culture formed in step (ii) A method for producing a sheet-shaped cell culture, comprising a step of peeling from a culture substrate, wherein the sheeting in step (ii) is performed by incubation for 2 to 12 hours. [2] The production method of [1], wherein the sheet-forming cells are myoblasts or cardiomyocytes.
  • Sheeting takes 2 to 12 hours, 2 to 11.5 hours, 2 to 11 hours, 2 to 10 hours, 2 to 9 hours, 2 to 8 hours, 2 to 7 hours, 2 to 6 hours, 2 The production method of [1] to [6], which is performed by incubation for ⁇ 5 hours or 2 to 4 hours.
  • the production method of [1] to [8], wherein the peeled sheet-shaped cell culture has an area of 35% or more with respect to the area of the culture substrate.
  • a method for treating a disease ameliorated by the application of a sheet-shaped cell culture, wherein the sheet-shaped cell culture produced by the production method of [1] to [9] Applying said method.
  • the sheet-shaped cell culture since it takes a short time to obtain a peeled sheet-shaped cell culture after cell seeding, the sheet-shaped cell culture can be efficiently obtained in a short time.
  • the sheet-like cell culture is formed by artificially peeling the sheet-shaped cell culture before the natural peeling, so that the sheet-like cell culture is not flattened or contracted even if it is immersed in the liquid for a while after being peeled. Because it becomes a product, it can be stored for a long time. Furthermore, since shrinkage after peeling from the base material of the sheet-shaped cell culture is suppressed, even if the same base material is used, a sheet-shaped cell culture having a larger area than the conventional one can be obtained.
  • FIG. 1 is a photograph showing the state of a sheet-like cell culture after incubating each time and performing a peeling operation. Photographs when A is 30 minutes, B is 1 hour, C is 2 hours, D is 4 hours, E is 5.5 hours, F is 6 hours, G is 11.5 hours, and H is 12 hours. It is.
  • sheet-like cell culture refers to a sheet-like cell connected to each other.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance that can connect cells at least physically (mechanically), and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, in particular, derived from the cells constituting the cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be further functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-shaped cell culture is composed of one cell layer (single layer) or composed of two or more cell layers (laminated (multilayer) body, for example, two layers, three layers, 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without the cells showing a clear layer structure. For example, in the vertical cross section of the sheet-shaped cell culture, the cells may be present in a non-uniform (for example, mosaic) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
  • a non-uniform for example, mosaic
  • the sheet-shaped cell culture preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells on and / or within its surface and maintain the physical integrity of sheet-like cell cultures, for example, polyvinylidene difluoride ( PVDF) membranes and the like are known, but the sheet-like cell culture of the present disclosure can maintain its physical integrity without such a scaffold.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure is preferably composed only of cells derived from the cells constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain other substances.
  • the cells constituting the sheet-shaped cell culture are not particularly limited as long as they can form a sheet-shaped cell culture, and include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells, periosteum cells, skin Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) Etc.
  • adherent somatic cells eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells
  • Somatic cells may be stem cells, especially those differentiated from iPS cells (iPS cell-derived adherent cells).
  • Non-limiting examples of cells constituting the sheet-shaped cell culture include, for example, myoblasts (for example, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (for example, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair root, Muscle tissue, endometrium, placenta, umbilical cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells) Retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells), hepatocytes (eg, liver parenchymal cells), pancreatic cells (eg, islet cells), kidney cells, adrenal cells , Period
  • Non-limiting examples of iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells Skin cells, synovial cells, chondrocytes and the like.
  • myoblast is a progenitor cell of striated muscle cell, and includes skeletal myoblast and cardiac myoblast.
  • skeletal myoblast means a myoblast present in skeletal muscle. Skeletal myoblasts are well known in the art, and can be prepared from skeletal muscle by any known method (for example, the method described in JP-A-2007-89442) or commercially. Also available (eg Lonza, Cat # CC-2580).
  • Skeletal myoblasts are not limited to markers such as CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3, etc. Can be identified.
  • the skeletal myoblast is CD56 positive.
  • the skeletal myoblast is CD56 positive and desmin positive.
  • Skeletal myoblasts can be any organism with skeletal muscle, including but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, It may be derived from mammals such as horses, cows, goats and sheep.
  • the skeletal myoblast is a mammalian skeletal myoblast.
  • the skeletal myoblast is a human skeletal myoblast.
  • cardioblast means a myoblast present in the myocardium.
  • Myocardial blasts are well known in the art and can be identified by markers such as Isl1.
  • Cardiomyocytes can be any organism with a heart muscle, including but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, horses, It may be derived from mammals such as cows, goats and sheep.
  • the cardiac myoblast is a mammalian cardiac myoblast.
  • the cardiac myoblast is a human cardiac myoblast.
  • cardiomyocytes means cells having the characteristics of cardiomyocytes, and the characteristics of the cardiomyocytes include, but are not limited to, expression of a cardiomyocyte marker, presence of autonomous pulsation, and the like.
  • Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (also known as SIRPA or SHPS-1), KDR (also known as CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM, etc.
  • Preferred examples of the cardiomyocytes include iPS cell-derived cardiomyocytes.
  • the cells constituting the sheet-shaped cell culture can be derived from any organism that can be treated with the sheet-shaped cell culture. Examples of such organisms include, but are not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, and the like. Is included.
  • the number of types of cells constituting the sheet-shaped cell culture is not particularly limited, and may be composed of only one type of cell, but may be one using two or more types of cells.
  • the content ratio (purity) of the most cells is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably at the end of the formation of the sheet-shaped cell culture. Is 70% or more, more preferably 75% or more.
  • the cell may be a xenogeneic cell or a homologous cell.
  • heterologous cell as used herein means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys or pigs correspond to xenogeneic cells.
  • the “same species-derived cell” means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • the human cell corresponds to the allogeneic cell.
  • the allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), that is, cells derived from the recipient, and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection even after transplantation. However, it is also possible to use heterologous cells or allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, heterologous cells and allogeneic nonautologous cells may be collectively referred to as nonautologous cells.
  • the cell is an autologous cell or an allogeneic cell. In one aspect of the present disclosure, the cell is an autologous cell. In another aspect of the present disclosure, the cell is an allogeneic cell.
  • the sheet-shaped cell culture can be produced by any known method (see, for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-110368, etc.).
  • the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes a step of seeding cells on a culture substrate, a step of forming the seeded cells into a sheet, and peeling the formed sheet-shaped cell culture from the culture substrate. Including but not limited to steps. Prior to the step of seeding the cells on the culture substrate, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed. Further, a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells.
  • the manufacturing method of the present disclosure may include a step of manufacturing a sheet-shaped cell culture, and in that case, the step of manufacturing the sheet-shaped cell culture is a step related to the manufacturing method of the sheet-shaped cell culture as a substep. 1 or 2 or more may be included. In one embodiment, after the step of thawing the cells, the step of growing the cells before the step of seeding the cells on a culture substrate is not included.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as cells can form a cell culture thereon, and includes, for example, containers of various materials, solid or semi-solid surfaces in containers, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution. Examples of such materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl. Examples include acrylamide and metals (for example, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass).
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • Examples of such a container include, but are not limited to, a culture container having a bottom surface made of a culture substrate capable of forming a cell culture and a liquid-impermeable side surface.
  • Specific examples of such culture vessels include, but are not limited to, cell culture dishes, cell culture bottles, and the like.
  • the bottom surface of the container may be transparent or opaque. When the bottom surface of the container is transparent, it is possible to observe and count cells from the back side of the container.
  • the container may have a solid or semi-solid surface therein. Examples of solid surfaces include plates and containers of various materials as described above, and examples of semi-solid surfaces include gels and soft polymer matrices.
  • the culture substrate may be prepared using the above materials, or commercially available materials may be used.
  • Preferable culture substrates include, but are not limited to, substrates having an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures.
  • a substrate having a hydrophilic surface for example, a substrate coated with a hydrophilic compound such as polystyrene subjected to corona discharge treatment, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, fibronectin, laminin , Substrates coated with an extracellular matrix such as vitronectin, proteoglycan and glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family and integrin family.
  • substrates are commercially available (e.g., Corning (R)? TC- Treated Culture Dish, Corning , etc.).
  • the whole or part of the culture substrate may be transparent or opaque.
  • the surface of the culture substrate may be coated with a material whose physical properties change in response to stimulation, for example, temperature or light.
  • materials include, but are not limited to, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylate Amide), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethyl
  • the physical properties for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and peeling of the cell culture adhered on the materials can be promoted.
  • Culture dishes coated with a temperature-responsive materials are commercially available (e.g., UpCell of CellSeed Inc. (R)), they can be used in the production method of the present disclosure.
  • the culture substrate may have various shapes, but is preferably flat.
  • the area is not particularly limited, and may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 , and the like.
  • a circular culture dish having a diameter of 10 cm can be used as the culture substrate. In this case, the area is 56.7 cm 2 .
  • the culture substrate may be coated (coated or coated) with serum. By using a culture substrate coated with serum, a denser sheet-shaped cell culture can be formed.
  • “Coated with serum” means a state in which serum components are attached to the surface of a culture substrate. Such a state is not limited, and can be obtained, for example, by treating a culture substrate with serum. Treatment with serum includes contacting the serum with a culture substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time.
  • heterologous serum and / or allogeneic serum can be used as the serum.
  • Xenogeneic serum refers to serum derived from a different species of organism than the recipient when a sheet cell culture is used for transplantation.
  • serum derived from bovine or horse for example, fetal calf serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc. corresponds to the heterologous serum.
  • FBS, FCS fetal calf serum
  • CS calf serum
  • H horse serum
  • Allogeneic serum means serum derived from the same species of organism as the recipient.
  • human serum corresponds to allogeneic serum.
  • Allogeneic serum includes autoserum (also called autologous serum), ie, serum derived from the recipient, and allogeneic serum derived from allogeneic individuals other than the recipient.
  • autoserum also called autologous serum
  • serum derived from the recipient serum derived from allogeneic individuals other than the recipient.
  • sera other than autoserum that is, heterologous serum and allogeneic sera are sometimes collectively referred to as non-self serum.
  • Serum for coating the culture substrate is commercially available or can be prepared from blood collected from a desired organism by a conventional method. Specifically, for example, the collected blood is allowed to stand at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, and centrifuged at about 1000 ⁇ g to about 1200 ⁇ g to collect the supernatant. Etc.
  • serum When incubating on a culture substrate, serum may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be any medium such as, without limitation, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.) can be used.
  • the dilution concentration is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate. For example, the dilution concentration is about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v / V), more preferably from about 5% to about 40% (v / v).
  • the incubation time is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate.
  • the incubation time is about 1 hour to about 72 hours, preferably about 2 hours to about 48 hours, and more preferably about 2 hours to about 48 hours. 24 hours, more preferably about 2 hours to about 12 hours.
  • a step of peeling the sheet-shaped cell culture is performed without further incubation.
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the culture substrate.
  • the incubation temperature is about 0 ° C. to about 60 ° C., preferably about 4 ° C. to about 45 ° C., more preferably room temperature to about 40 ° C. It is.
  • Serum may be discarded after incubation.
  • a conventional liquid disposal method such as suction with a pipette or decantation can be used.
  • the culture substrate may be washed with a serum-free washing solution after serum is discarded.
  • the serum-free washing solution is not particularly limited as long as it is a liquid medium that does not contain serum and does not adversely affect the serum components attached to the culture substrate.
  • a washing method for example, without limitation, a method of adding a serum-free washing solution on the culture substrate, stirring for a predetermined time (for example, about 5 seconds to about 60 seconds), and then discarding it. Etc. can be used.
  • the culture substrate may be coated with a growth factor.
  • growth factor means any substance that promotes cell proliferation as compared to the case without it, such as epithelial cell growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast, and the like. Cell growth factor (FGF) and the like.
  • the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.0001 ⁇ g / mL to about 1 ⁇ g / mL, preferably about 0.0005 ⁇ g / mL to about 0.00. It is basically the same as serum except that it is 05 ⁇ g / mL, more preferably about 0.001 ⁇ g / mL to about 0.01 ⁇ g / mL.
  • the culture substrate may be coated with a steroid agent.
  • the “steroid agent” refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect a living body such as adrenal cortex dysfunction and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like.
  • the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.1 ⁇ g / mL to about 100 ⁇ g / mL, preferably about 0.4 ⁇ g / mL to dexamethasone. It is basically the same as serum except that it is about 40 ⁇ g / mL, more preferably about 1 ⁇ g / mL to about 10 ⁇ g / mL.
  • the culture substrate may be coated with any one of serum, growth factor and steroid agent, any combination of these: serum and growth factor, serum and steroid agent, serum and growth factor and steroid agent, Alternatively, it may be coated with a combination of a growth factor and a steroid. When coating with a plurality of components, these components may be mixed and coated simultaneously, or may be coated in separate steps.
  • the culture substrate may be seeded with cells immediately after coating with serum or the like, or may be stored after coating and then seeded with cells.
  • the coated substrate can be stored for a long time, for example, by keeping it at about 4 ° C. or lower, preferably about ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably about ⁇ 80 ° C. or lower.
  • Cell seeding on the culture substrate can be performed by any known technique and condition.
  • the seeding of the cells on the culture substrate may be performed, for example, by injecting a cell suspension obtained by suspending the cells in the culture solution into the culture substrate (culture vessel).
  • an apparatus suitable for the operation of injecting the cell suspension such as a dropper or a pipette, can be used.
  • a method for producing a high-quality sheet-shaped cell culture includes: (I) seeding a cell population containing sheet-forming cells on a culture substrate; (Ii) sheeting the cell population seeded in (i) above in a cell culture medium to form a sheet-like cell culture; and (iii) forming the sheet-like cell culture formed in (ii) above. Peel from the culture substrate.
  • the sheet-forming cell is not particularly limited as long as it is a cell described above as a cell that can constitute a sheet-shaped cell culture.
  • the cell population includes at least one type of sheet-forming cell, but may include two or more types of sheet-forming cells, or may include cells other than sheet-forming cells.
  • at least one sheet-forming cell included in the cell population is a myoblast, preferably a skeletal myoblast.
  • the cell population can further include fibroblasts. That is, a sheet-like cell culture containing myoblasts and fibroblasts as sheet-forming cells can be mentioned.
  • At least one sheet-forming cell included in the cell population is a cardiomyocyte.
  • the cell population can further include vascular endothelial cells. That is, a sheet-like cell culture containing cardiomyocytes and vascular endothelial cells as sheet-forming cells can be mentioned.
  • the at least one sheet-forming cell included in the cell population is a mesenchymal stem cell. In such embodiments, the cell population can further include vascular endothelial cells.
  • the cell density to be seeded is not particularly limited as long as it is a density capable of forming a sheet-shaped cell culture, but in a preferred embodiment, the cell population is seeded at a density reaching confluence or higher.
  • the “density reaching confluence” refers to a density that is assumed to cover the entire adhesion surface of the culture vessel with no gap when the cells are seeded. For example, when seeded, the density is such that cells are expected to contact each other, the density at which contact inhibition occurs, or the density at which cell growth is substantially stopped by contact inhibition.
  • Non-limiting examples of the seeding density of the cell population are about 7.1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , about 7.3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to about 2. 8 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.8 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.3 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 8.0 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.0 ⁇ 10 6 Pieces / cm 2 , about 8.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 1.8 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 9.0 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 1.6 ⁇ 10 6 pieces / including the density of such cm 2.
  • these density shall be the density of all the cells contained in a cell population unless there is
  • the seeding can be performed at a density such that at least one sheet-forming cell that can be included in the cell population does not substantially grow in a cell culture medium that is substantially free of growth factors.
  • other cells that can be included in the cell population can be of a density that allows proliferation while undergoing growth inhibition.
  • the culture substrate used in the method of the present disclosure is as described above.
  • the culture substrate may be coated with serum.
  • the culture substrate may be coated with a temperature responsive material.
  • the culture substrate may be coated with a temperature-responsive material and serum.
  • the seeded cell population is formed into a sheet by incubating in a cell culture medium to form a sheet-like cell culture.
  • the seeded cells can be formed into a sheet by any known technique and conditions. Non-limiting examples of such techniques are described in, for example, Patent Document 1, WO 2014/185517. It is considered that the formation of a cell sheet is achieved when cells adhere to each other via an adhesion molecule or an intercellular adhesion mechanism such as an extracellular matrix. Therefore, sheet formation of the seeded cells can be achieved, for example, by culturing the cells under conditions that form cell-cell adhesion.
  • Such conditions may be any as long as cell-cell adhesion can be formed, but cell-cell adhesion can usually be formed under the same conditions as general cell culture conditions. Examples of such conditions include culture at about 37 ° C. and 5% CO 2 . Further, the culture can be performed under normal pressure (atmospheric pressure, non-pressurized). Culturing can be performed in containers of any size and shape.
  • the size and shape of the sheet-shaped cell culture can be adjusted by adjusting the size and shape of the cell adhesion surface of the culture vessel, or by placing a mold of the desired size and shape on the cell adhesion surface of the culture vessel, It can be arbitrarily adjusted by, for example, culturing cells therein.
  • the culture for forming the seeded cells into a sheet may be referred to as “sheet culture”.
  • sheet culture the thickness of the sheet-like cell culture on the culture substrate (in the culture vessel) is reduced. That is, after seeding, after the cells settle, the thickness of the cell layer on the culture substrate is reduced by subsequent sheet formation, but the sheet-like cell culture shrinks by peeling from the culture substrate and increases again. .
  • the reduction in thickness due to sheeting is about 90% to about 10%, assuming that the thickness of the cell layer immediately after seeding is 100%.
  • the sheet-like cell culture contracts again by peeling from the culture substrate, and the rate of increase in the thickness of the sheet-like cell culture at that time is about 120% to 300% when the thickness of the cell layer immediately after peeling is 100%. It is.
  • the incubation time for forming a sheet is not particularly limited as long as the sheet can be formed.
  • the time during which a sheet can be formed varies depending on the type of cells (particularly the type of sheet-forming cells) contained in the seeded cell population and the state of the cells. For example, cells containing skeletal myoblasts as sheet-forming cells When the population is seeded, a sheet can be formed in about 2 hours. Thus, in one embodiment, the incubation time for sheeting can be 2 hours or more.
  • the present inventors release the sheet-shaped cell culture by releasing it artificially before peeling off from the culture substrate.
  • the present inventors have found that the produced sheet-shaped cell culture can be maintained in high quality by subjecting the sheet-shaped cell culture to the treatment for adhesion prevention. Therefore, the incubation for forming a sheet is terminated before the sheet-shaped cell culture is naturally detached.
  • the time from the start of incubation to the start of spontaneous detachment can vary depending on the type of cells (particularly the type of sheet-forming cells) contained in the seeded cell population and the state of the cells. When a cell population containing myoblasts is seeded, spontaneous detachment often occurs in about 6 to 12 hours. Therefore, in one aspect of the present disclosure, the upper limit of the incubation time for sheeting is 12 hours, 11.5 hours, 11 hours, 10 hours, 9 hours, 8 hours, 7 hours, 6 hours, 5 hours, or 4 hours. possible.
  • the incubation time for sheeting is 2 to 12 hours, 2 to 11.5 hours, 2 to 11 hours, 2 to 10 hours, 2 to 9 hours, 2 to 8 hours, It may be ⁇ 7 hours, 2 to 6 hours, 2 to 5 hours or 2 to 4 hours, preferably 2 to 4 hours or 2 to 6 hours.
  • the step of peeling the sheet-shaped cell culture is performed without further incubation.
  • the cell culture medium used for the culture (sometimes simply referred to as “culture medium” or “medium”) is not particularly limited as long as it can maintain the survival of the cells. Typically, amino acids, vitamins, electrolytes are used. Can be used.
  • the culture medium is based on a basal medium for cell culture.
  • a basal medium is not limited, for example, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80 -7 etc. are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used in a standard composition (for example, as it is commercially available), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. Therefore, the basal medium used in the present disclosure is not limited to those having a known composition, and includes one in which one or more components are added, removed, increased or decreased.
  • the amino acid contained in the basal medium is not limited, and for example, L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like are not limited to vitamins such as calcium D-pantothenate, choline chloride, folic acid, i Inositol, niacinamide, riboflavin, thiamine, pyridoxine, biotin, lipoic acid, vitamin B12, adenine, thymidine and the like, but not limited to, for example, CaCl 2 , KCl, MgSO 4 , NaCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, Fe (NO 3) 3, FeS 4, CuSO 4, MnSO 4, Na
  • the concentration of the amino acid contained in the basal medium is L-arginine: about 63.2 mg / L to about 84 mg / L, L-cystine: about 35 mg / L to about 63 mg / L, L-glutamine : About 4.4 mg / L to about 584 mg / L, glycine: about 2.3 mg / L to about 30 mg / L, L-histidine: about 42 mg / L, L-isoleucine: about 66 mg / L to about 105 mg / L, L-leucine: about 105 mg / L to about 131 mg / L, L-lysine: about 146 mg / L to about 182 mg / L, L-methionine: about 15 mg / L to about 30 mg / L, L-phenylalanine: about 33 mg / L To about 66 mg / L, L-serine: about 32 mg / L to about 42 mg / L, L-th
  • the concentration of the vitamin preparation contained in the basal medium is as follows: calcium D-pantothenate: about 4 mg / L to about 12 mg / L, choline chloride: about 4 mg / L to about 14 mg / L, folic acid : About 0.6 mg / L to about 4 mg / L, i-inositol: about 7.2 mg / L, niacinamide: about 4 mg / L to about 6.1 mg / L, riboflavin: about 0.0038 mg / L to about 0 .4 mg / L, thiamine: about 3.4 mg / L to about 4 mg / L, pyridoxine: about 2.1 mg / L to about 4 mg / L.
  • the cell culture solution may contain one or more additives such as serum, growth factor, steroid component, and selenium component.
  • these components may be impurities derived from the manufacturing process that cannot be ruled out as side effects such as anaphylactic shock to the recipient in clinical practice. It may be desirable to exclude derived components.
  • the cell culture medium does not contain an effective amount of at least one of these non-autologous additives.
  • the cell culture medium is substantially free of at least one of these non-autologous additives.
  • the cell culture medium is substantially free of non-autologous additives.
  • the cell culture medium may contain only a basal medium.
  • the cell culture medium is substantially free of serum.
  • a cell culture medium substantially free of serum may be referred to herein as “serum-free medium”.
  • “substantially free of serum” means that the serum content in the culture solution does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body (for example, in the sheet-shaped cell culture). It means that the serum albumin content is less than about 50 ng), preferably that these substances are not actively added to the culture medium.
  • the cell culture medium in order to avoid side effects at the time of transplantation, preferably contains substantially no heterogeneous serum, and more preferably contains substantially no non-self serum.
  • the cell culture medium includes serum.
  • the serum may be homologous serum or heterologous serum.
  • the cell culture medium includes autologous serum.
  • the serum contained in the cell culture medium (serum used for culturing cells) may be the same as the serum used to coat the culture substrate. May be.
  • the serum contained in the cell culture medium is the same as that used to coat the culture substrate, and in a particular embodiment, the serum is autologous serum.
  • the serum may be for use in the production method of the present disclosure.
  • the serum may be for use in cell culture or for coating a culture substrate.
  • the cell culture fluid does not contain an effective amount of growth factor.
  • an “effective amount of growth factor” refers to the amount of growth factor that significantly promotes cell proliferation as compared to the absence of growth factor, or, for convenience, cell proliferation in the art. It means the amount usually added for the purpose.
  • the significance of cell growth promotion can be appropriately evaluated, for example, by any statistical method known in the art, for example, t-test, and the usual addition amount is various in the art. It can be known from known literature.
  • the effective amount of EGF in cell culture is, for example, about 0.005 ⁇ g / mL or more.
  • the concentration of the growth factor in the culture medium in the present disclosure is less than the effective amount.
  • the concentration of EGF in the culture medium in cell culture is preferably less than about 0.005 ⁇ g / mL, more preferably less than about 0.001 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the growth factor in the culture medium is less than the normal concentration in the living body.
  • the concentration of EGF in the culture medium in cell culture is preferably less than about 5.5 ng / mL, more preferably less than about 1.3 ng / mL, and even more preferably about 0.5 ng / mL. Is less than.
  • the culture medium in the present disclosure is substantially free of growth factors.
  • “substantially free” means that the content of the growth factor in the culture solution is such that it does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body. Means not actively added. Therefore, in this embodiment, the culture solution does not contain a growth factor at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the cell culture solution is substantially free of steroid component.
  • steroid component refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect a living body such as adrenal cortex dysfunction and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like.
  • substantially free of steroid component means that the content of these compounds in the culture solution is such that it does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body, This means that these compounds are not actively added to the culture solution, that is, the culture solution does not contain steroid agent components at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the cell culture solution does not substantially contain a selenium component.
  • the “selenium component” includes a selenium molecule and a selenium-containing compound, in particular, a selenium-containing compound capable of releasing a selenium molecule in vivo, such as selenite. Therefore, “substantially free of selenium component” means that the content of these substances in the culture solution is such that there is no adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body, This means that these substances are not positively added to the liquid, that is, the culture liquid does not contain selenium components at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the selenium concentration in the culture solution is the normal value in human serum (eg, 10.6 ⁇ g / dL to 17.4 ⁇ g / dL), and the concentration of human serum contained in the medium is Lower than the ratio multiplied (ie, if the human serum content is about 10%, the selenium concentration is, for example, about 1.0 ⁇ g / dL to less than about 1.7 ⁇ g / dL).
  • impurities derived from manufacturing processes such as growth factors, steroid components, and heterogeneous serum components, which have been conventionally required when preparing a cell culture to be applied to a living body, are removed by washing or the like. A step becomes unnecessary. Accordingly, one aspect of the method of the present disclosure does not include the step of removing impurities from this manufacturing process.
  • “manufacturing process-derived impurities” typically include those listed below, which are derived from each manufacturing process.
  • a substance derived from a cell substrate for example, host cell-derived protein, host cell-derived DNA
  • a substance derived from a cell culture medium for example, inducer, antibiotic, medium component
  • a step after cell culture It is derived from the extraction, separation, processing, and purification steps of a certain target substance (see, for example, Pharmaceutical Examination No. 571).
  • the formed sheet-shaped cell culture is peeled from the culture substrate.
  • the separation of the sheet-shaped cell culture from the culture substrate is not particularly limited as long as the sheet-shaped cell culture can be released (detached) from the culture substrate serving as a scaffold while at least partially maintaining the sheet structure.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin
  • mechanical treatment such as pipetting.
  • a predetermined stimulation is applied when cells are cultured on a culture substrate whose surface is coated with a material that changes its physical properties in response to stimulation.
  • a predetermined stimulation is applied. It can also be released non-enzymatically.
  • the temperature is set to be lower than the lower critical solution temperature (LCST) or higher upper limit critical solution temperature (UCST) for water of the temperature responsive material.
  • LCST lower critical solution temperature
  • UST upper limit critical solution temperature
  • the sheet-like cell culture can be released non-enzymatically.
  • Such temperature treatment is not limited, and for example, the culture substrate to which the formed sheet-like cell culture is attached can be removed from a culture environment at a temperature higher than LCST (for example, in an incubator at a temperature of about 37 ° C.). It can be achieved by shifting to an environment below LCST (for example, a room temperature environment outside the incubator).
  • Transition to the environment below the LCST is not limited, for example, a medium having a temperature higher than the LCST in which the formed sheet-shaped cell culture is present is transferred to a medium having a temperature below the LCST (for example, a buffer (PBS, PBS, HBSS or the like) or a liquid such as a culture solution).
  • a medium having a temperature below the LCST for example, a buffer (PBS, PBS, HBSS or the like) or a liquid such as a culture solution.
  • the medium such as the buffer solution can be used for non-enzymatic release of the sheet-shaped cell culture from the culture substrate in the production method of the present disclosure.
  • the sheet-like cell culture peeled in the step (iii) shrinks and the area becomes smaller than before the peeling.
  • the sheet-like cell culture produced by the production method of the present disclosure is characterized in that it does not easily shrink after peeling and has a larger area.
  • the sheet-shaped cell culture after detachment is about 20% or more, for example, about 20%, about, 25%, about 30%, about 31%, about 32%, about 33%, about 34%, about 35%, about 36%, about 37%, about 38%, about 39%, about 40%, about 50% About 60%, preferably about 35% or more, such as about 35%, about 36%, about 37%, about 38%, about 39%, about 40%, about 50%, about 60% Has an area.
  • Area of the sheet-like cell culture after peeling, when a sheet with culture dish area 56.7cm 2 (diameter 10 cm), after the separation 1800 mm 2 or more, may be at 1847Mm 2 or more or 1923Mm 2 or more.
  • 2600mm 2, 2505mm 2 may be 2462mm 2.
  • the area after stripping 1800mm 2 ⁇ 2600mm 2, 1847mm 2 ⁇ 2600mm 2, 1923mm 2 ⁇ 2600mm 2 may be any of 1923mm 2 ⁇ 2505mm 2.
  • the sheet When the sheet is formed in a culture dish having an area of 8.8 cm 2 (diameter 3.5 cm), or when the sheet is formed in a culture dish having an area 3.5 cm 2 (12 wells), the area is 56.7 cm 2 (diameter 10 cm).
  • a sheet-like cell culture having an area proportional to the area of the sheet-like cell culture obtained after detachment from the culture dish can be obtained.
  • the contraction after peeling off the sheet-shaped cell culture is affected by the magnitude of the cell-cell adhesive force of the cells constituting the sheet-shaped cell culture. Therefore, when the incubation time for sheet formation is increased to some extent, for example, when incubation is performed to such an extent that spontaneous detachment of the sheet-shaped cell culture occurs, the contraction rate after detachment of the sheet-shaped cell culture reaches the maximum. it is conceivable that. Therefore, the area of the sheet-shaped cell culture may be defined on the basis of the area when the shrinkage rate after peeling becomes the maximum, that is, when the area of the sheet-shaped cell culture after peeling becomes the minimum.
  • the minimum area of the sheet-shaped cell culture after detachment (that is, the area of the sheet-shaped cell culture after detachment when incubated until the time when spontaneous detachment occurs) is 1 (iii) )
  • the production method of the present disclosure includes the following: (I) A cell population containing myoblasts or cardiomyocytes is about 7.1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 and about 7.3 ⁇ 10 5 cells / cm 2. To about 2.8 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 3.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 7.8 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.3 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 8.0 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.
  • the cell population seeded in (i) above is 2 to 12 hours, 2 to 11.5 hours, 2 to 11 hours, 2 to 10 hours, 2 to 9 hours, 2 to 8 hours in the cell culture medium.
  • the production method of the present disclosure may include a step of freezing cells (cell population) and a step of thawing frozen cells before (i). Freezing of cells can be performed by any known technique. Such techniques include, but are not limited to, for example, subjecting the cells in the container to a freezing means such as a freezer, a deep freezer, or a low-temperature medium (for example, liquid nitrogen).
  • the temperature of the freezing means is not particularly limited as long as it is a temperature at which a part of the cell population in the container, preferably the whole can be frozen, but is typically about 0 ° C. or lower, preferably about ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably. Is about ⁇ 40 ° C. or lower, more preferably about ⁇ 80 ° C.
  • the cooling rate in the freezing operation is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after freezing and thawing. Typically, the cooling rate is about 1 until cooling starts from 4 ° C. and reaches about ⁇ 80 ° C.
  • the cooling rate is such that it takes from about 2 hours to about 5 hours, preferably from about 2 hours to about 4 hours, especially about 3 hours.
  • cooling can be performed at a rate of about 0.46 ° C./min.
  • Such a cooling rate can be achieved by providing the container containing the cells directly or in a freezing treatment container in a freezing means set to a desired temperature.
  • the freezing treatment container may have a function of controlling the temperature lowering speed in the container to a predetermined speed.
  • any known one for example, BICELL (R) (Nippon Freezer), a program freezer, etc. can be used.
  • the freezing operation may be performed while the cells are immersed in a culture solution or physiological buffer solution, but a cryoprotectant for protecting the cells from freezing and thawing operations is added to the culture solution, or the culture solution is cryoprotected. You may perform after performing the process of replacing with the cryopreservation liquid containing an agent. Accordingly, the production method of the present disclosure including a freezing step may further include a step of adding a cryoprotectant to the culture solution or a step of replacing the culture solution with a cryopreservation solution. When replacing the culture solution with a cryopreservation solution, if the solution in which cells are immersed during freezing contains an effective concentration of cryoprotectant, remove the culture solution before adding the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may be added while leaving a part of the culture solution.
  • the “effective concentration” means that the cryoprotectant exhibits a cryoprotective effect without exhibiting toxicity, for example, the viability, vitality, and function of the cell after freeze-thawing compared to the case where the cryoprotectant is not used. This means a concentration that exhibits a decrease-suppressing effect. Such a concentration is known to those skilled in the art or can be appropriately determined by routine experimentation.
  • the cryoprotectant is not particularly limited as long as it exhibits a cryoprotective action on cells, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, sericin, propanediol, dextran, polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl alcohol, hydroxyethyl starch, chondroitin sulfate, polyethylene glycol, formamide, acetamide, adonitol, perseitol, raffinose, lactose, trehalose, sucrose, mannitol and the like.
  • Cryoprotectants may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the cryoprotectant added to the culture solution or the concentration of the cryoprotectant in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as it is an effective concentration as defined above. About 2% to about 20% (v / v) with respect to the whole stock solution. However, although outside this concentration range, alternative use concentrations known or experimentally determined for each cryoprotectant may be employed and such concentrations are within the scope of the present disclosure.
  • the step of thawing the frozen cells can be performed by any known cell thawing technique, typically involving, for example, freezing the cells by thawing means, eg, a solid, liquid or gas at a temperature above the freezing temperature. It can be achieved by using a conditioned medium (for example, water), a water bath, an incubator, an incubator, or by immersing the frozen cells in a medium (for example, a culture solution) at a temperature higher than the freezing temperature. However, it is not limited to this.
  • the temperature of the thawing means or the soaking medium is not particularly limited as long as the cells can be thawed within a desired time, but typically about 4 ° C. to about 50 ° C., preferably about 30 ° C.
  • the thawing time is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after thawing, but it is typically within about 2 minutes, and particularly within about 20 seconds, The decrease can be greatly suppressed.
  • the thawing time can be adjusted, for example, by changing the temperature of the thawing means or the immersion medium, the volume or composition of the culture solution or cryopreservation solution at the time of freezing.
  • the frozen cells include cells frozen by any technique, and non-limiting examples thereof include, for example, cells frozen by the step of freezing the above cells.
  • the frozen cell is a cell that has been frozen in the presence of a cryoprotectant.
  • the frozen cells are for use in the production method of the present disclosure.
  • the production method of the present disclosure is to wash the cells after the step of thawing the frozen cells and the step of forming a sheet-like cell culture, preferably before the step of seeding the cells on a culture substrate. Steps may be included. Washing of cells can be performed by any known technique. Typically, for example, cells are washed with a washing solution (for example, serum or serum component (serum albumin, etc.), or a culture solution (for example, a medium). Etc.) or a physiological buffer (eg, PBS, HBSS, etc.), centrifuged, and the supernatant is discarded, and the precipitated cells are collected, but not limited thereto.
  • a washing solution for example, serum or serum component (serum albumin, etc.
  • a culture solution for example, a medium
  • Etc. or a physiological buffer (eg, PBS, HBSS, etc.), centrifuged, and the supernatant is discarded, and the precipitated cells are collected, but not limited
  • the suspension, centrifugation, and recovery cycle may be performed once or a plurality of times (for example, 2, 3, 4, 5 times, etc.). In one aspect of the present disclosure, the step of washing the cells is performed immediately after the step of thawing the frozen cells.
  • the production method of the present disclosure may further include a step of growing the cells before the step of freezing the cells.
  • the step of growing the cells may be performed by any known technique, and those skilled in the art are familiar with the culture conditions suitable for the growth of various cells.
  • the production method of the present disclosure does not include a step of introducing a gene into a cell.
  • the production method of the present disclosure includes a step of introducing a gene into a cell.
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it is useful for treatment of the target disease, and may be, for example, cytokines such as HGF and VEGF.
  • the gene can be introduced by any known method such as calcium phosphate method, lipofection method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, adenovirus vector, retrovirus vector or other viral vector method, or microinjection method. Can be used.
  • the introduction of the gene into the cell is not limited and can be performed, for example, before the step of freezing the cell.
  • all steps of the manufacturing method of the present disclosure are performed in vitro.
  • the production method of the present disclosure includes a step performed in vivo, including, but not limited to, a cell or a source of cells from a subject (eg, striated muscle tissue, particularly skeletal muscle tissue). Including the step of collecting.
  • the manufacturing method of the present disclosure is performed under aseptic conditions in all steps.
  • the production method of the present disclosure is performed such that the finally obtained sheet-shaped cell culture is substantially sterile.
  • the production method of the present disclosure is performed such that the finally obtained sheet-shaped cell culture is sterile.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure is useful for the treatment of diseases improved by application of the sheet-shaped cell culture, for example, various diseases related to tissue abnormalities. Accordingly, in one aspect, the sheet-shaped cell culture of the present disclosure is for use in the treatment of diseases improved by application of the sheet-shaped cell culture, particularly diseases related to tissue abnormalities. Since the sheet-shaped cell culture of the present disclosure has the same properties inherent in the constituent cells except that it has a higher mechanical strength than the conventional sheet-shaped cell culture, at least the conventional myoblast It can be applied to tissues and diseases that can be treated with a sheet-like cell culture containing cells or fibroblasts.
  • tissue to be treated examples include, but are not limited to, myocardium, esophagus, skin, pancreas, and skeletal muscle.
  • the disease to be treated is not limited, for example, heart disease (eg, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac injury), cardiomyopathy, etc.), esophageal disease (eg, esophageal surgery (esophageal cancer removal)) Prevention of inflammation and constriction of the esophagus later), skin diseases (eg skin damage (trauma, burn), etc.), pancreatic diseases (eg pancreatic fistula etc.), muscle diseases (eg muscle damage, myositis, etc.) It is done.
  • myocardial injury myocardial infarction, cardiac injury), cardiomyopathy, etc.
  • esophageal disease eg, esophageal surgery (esophageal cancer removal)
  • skin diseases eg skin damage (trauma, burn), etc.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1 Tanaka et al., J J Gastroenterol. 2013; 48 (9): 1081-9.
  • the sheet-shaped cell culture of the present disclosure can be fragmented into an injectable size, and can be obtained at a higher effect than the injection with a single cell suspension by injecting it into a site requiring treatment (Wang et). al., Cardiovasc Res. 2008; 77 (3): 515-24). Therefore, such a utilization method is also possible for the sheet-shaped cell culture of the present disclosure.
  • the sheet cell culture of the present disclosure is substantially sterile. In one embodiment, the sheet cell culture of the present disclosure is sterile. In one embodiment, the sheet cell culture of the present disclosure is not genetically engineered. In another embodiment, the sheet cell culture of the present disclosure has been genetically engineered. Genetic manipulation includes, but is not limited to, for example, the introduction of genes that enhance the viability, engraftment, function, etc. of sheet-like cell cultures and / or genes that are useful in the treatment of diseases. Examples of the gene to be introduced include, but are not limited to, cytokine genes such as HGF gene and VEGF gene.
  • compositions eg, pharmaceutical composition
  • graft a medical product, and the like
  • composition etc. including the sheet-shaped cell culture of the present disclosure.
  • additional components such as a pharmaceutically acceptable carrier, the viability, engraftment and / or the sheet-shaped cell culture.
  • the component which improves a function etc., the other active ingredient useful for treatment of a target disease, etc. may be included. Any known additional components can be used, and those skilled in the art are familiar with these additional components.
  • composition of the present disclosure can be used in combination with components that enhance the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, and other active ingredients useful for treating the target disease.
  • the composition or the like of the present disclosure is for use in the treatment of a disease that is ameliorated by application of a sheet-like cell culture (for example, a disease related to tissue abnormality).
  • a sheet-like cell culture for example, a disease related to tissue abnormality.
  • the tissue or disease to be treated is as described above for the sheet-shaped cell culture of the present disclosure.
  • Treatment Method of the Present Disclosure is a method for treating a disease (for example, a disease related to tissue abnormality) that is improved by application of a sheet-shaped cell culture in a subject.
  • the present invention relates to a method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount such as a sheet-shaped cell culture or composition of the present disclosure (hereinafter sometimes referred to as “treatment method of the present disclosure”).
  • treatment method of the present disclosure The tissues and diseases to be treated by the treatment method of the present disclosure are as described above for the sheet-shaped cell culture of the present disclosure.
  • a component that enhances the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, other active ingredients useful for the treatment of the target disease, and the like are used. It can be used in combination with a cell culture or composition.
  • the treatment method of the present disclosure may further include a step of manufacturing a sheet-shaped cell culture according to the manufacturing method of the present disclosure.
  • the treatment method of the present disclosure may further include a step of collecting cells or a tissue serving as a source of cells for producing a sheet-shaped cell culture from a subject before the step of producing the sheet-shaped cell culture.
  • the subject from which the cells or the tissue that serves as the source of the cells is collected is the same individual as the subject that receives administration of the sheet-shaped cell culture or composition.
  • the subject from which the cells or tissue from which the cells are supplied is collected is a separate body of the same type as the subject receiving the sheet-like cell culture or composition.
  • the subject from whom the cell or tissue that serves as the source of the cell is collected is an individual different from the subject receiving the sheet-like cell culture or composition.
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • the subject may be healthy or may have some kind of disease, but the disease can be improved by the application of the sheet-shaped cell culture (for example, a disease related to tissue abnormality).
  • the sheet-shaped cell culture for example, a disease related to tissue abnormality.
  • treatment typically means a subject suffering from or at risk of suffering from the disease.
  • treatment is intended to encompass all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at healing, temporary remission or prevention of disease.
  • treatment refers to delaying or stopping the progression of a disease (eg, a disease associated with a tissue abnormality) that is ameliorated by application of a sheet cell culture, regression or disappearance of a lesion, Includes medically acceptable interventions for various purposes, including prevention or prevention of recurrence.
  • the effective amount is, for example, an amount that can suppress the onset or recurrence of a disease, reduce symptoms, or delay or stop progression (for example, the size, weight, number, etc. of sheet-like cell culture).
  • it is an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount can be appropriately determined by, for example, testing in laboratory animals such as mice, rats, dogs or pigs, and disease model animals, and such test methods are well known to those skilled in the art.
  • the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
  • Administration methods typically include direct application to tissues, but when using sheet cell culture fragments, various routes that can be administered by injection, such as intravenous, intramuscular, Administration may be made by routes such as internal, subcutaneous, local, intraarterial, intraportal, intraventricular, and intraperitoneal.
  • routes such as internal, subcutaneous, local, intraarterial, intraportal, intraventricular, and intraperitoneal.
  • the frequency of administration is typically once per treatment, but multiple administrations are possible if the desired effect is not obtained.
  • Example 1 Manufacture of sheet-like cell culture (1) Preparation of cell population Cells obtained from skeletal muscle tissue aseptically collected from adult thighs are seeded in a culture flask, and the ratio of the number of myoblasts to the number of fibroblasts was adjusted in MCDB131 medium containing 20% FBS. The grown cells were detached from the culture flask with a proteolytic enzyme solution, collected, and concentrated by centrifugation.
  • FIG. 1 is a photograph showing the state of a sheet-like cell culture that has been detached after each incubation time.
  • the incubation time was 2 hours or more, it was confirmed that a sheet was formed and could be peeled without damage.
  • the average value of the size (minor axis and major axis) was measured, and the area was calculated.
  • the area ratio of the peeled sheet-shaped cell culture obtained by each incubation time was calculated with the area when the incubation time was 12 hours being 1. When the incubation time is 12 hours or longer, the area of the peeled sheet-shaped cell culture hardly changes.

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Abstract

本発明は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。　少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種すること、播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離することを含み、前記シート化が、２～１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法により、上記課題が解決された。

Description

シート状細胞培養物の製造方法
　本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などに関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
　このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。
　シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
特表２００７－５２８７５５号公報
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41 Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
　本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。
　シート状細胞培養物の臨床応用が進むにつれて、より高品質で取り扱いが容易であり、簡便に製造可能なシート状細胞培養物を提供することが求められるようになってきた。本発明者らは、シート状細胞培養物の改良について研究する中で、温度応答性培養皿を用いたシート状細胞培養物の形成のためのインキュベート中に、形成されたシート状細胞培養物が自然と剥離してしまうという現象を見出した。この現象は、シート状細胞培養物の形成とともにシートを構成する細胞の細胞間接着力が増大した結果、細胞と基材との接着力を上回るために起こるとの仮説に基づいて研究を続けたところ、シート状細胞培養物の自然剥離が起こった後、遊離状態のまま適切な処理をせずに放置しておくと、シート状細胞培養物が細胞間接着力により収縮し、縮んだまま癒着してしまい、シート状細胞培養物として使用が困難になるという新たな課題に直面した。かかる課題を解決すべくさらに研究を続けたところ、細胞播種後２時間ほどのインキュベートにより十分な強度のシート状細胞培養物が形成されること、およびシート状細胞培養物が培養基材上に形成された後自然剥離前に人為的に基材からシート状細胞培養物を剥離すると、収縮が起こりにくく、癒着も防止できることを見出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］（ｉ）少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップ
を含み、ステップ（ｉｉ）におけるシート化が、２～１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法。
［２］シート形成細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、［１］の製造方法。
［３］細胞培養液が、同種血清を含む、［１］または［２］の製造方法。
［４］培養基材が、血清で被覆されている、［１］～［３］の製造方法。
［５］培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、［１］～［４］の製造方法。
［６］ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、［１］～［５］の製造方法。
［７］シート化が、２～１２時間、２～１１．５時間、２～１１時間、２～１０時間、２～９時間、２～８時間、２～７時間、２～６時間、２～５時間または２～４時間のインキュベートにより行われる、［１］～［６］の製造方法。
［８］シート化が、２～６時間のインキュベートにより行われる、［７］の製造方法。
［９］剥離後のシート状細胞培養物が、培養基材の面積に対して３５％以上の面積を有する、［１］～［８］の製造方法。
［１０］シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、［１］～［９］の製造方法により製造されたシート状細胞培養物を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
　本発明によれば、細胞播種した後、剥離されたシート状細胞培養物を得るまでの時間が短くなるため、短時間で効率よくシート状細胞培養物を得ることができる。また、シート状細胞培養物をシート形成後に自然剥離前に人為的に剥離することにより、剥離された後しばらく液中に浸漬したままでも収縮および癒着が起こりにくく平らで縮みのないシート状細胞培養物となるため、長時間の保存が可能となる。さらに、シート状細胞培養物の基材から剥離後の収縮が抑制されているため、同じ基材を用いても従来のものより大きな面積のシート状細胞培養物が得られる。
図１は、各時間インキュベートし、剥離作業を行った後のシート状細胞培養物の様子を表した写真である。それぞれ、Ａは３０分、Ｂは１時間、Ｃは２時間、Ｄは４時間、Ｅは５．５時間、Ｆは６時間、Ｇは１１．５時間、Ｈは１２時間インキュベートした場合の写真である。
　以下、本開示を詳細に説明する。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
　本開示において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。
　シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
　本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。
　本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。
　本開示において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。
　本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ－ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ－１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。心筋細胞としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞が好ましく例示される。
　シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
　シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特開２０１０－０８１８２９、特開２０１１－１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本開示の製造方法は、シート状細胞培養物を製造するステップを含んでもよく、その場合、シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を培養基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。
　培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R)?TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
　培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２－２１１８６５、特開２００３－３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
　培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、培養基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。
　培養基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた培養基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、培養基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。
　血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。
　培養基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分～約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ～約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
　培養基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％～約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％～約４０％（ｖ／ｖ）である。
　インキュベート時間も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間～約７２時間、好ましくは約２時間～約４８時間、より好ましくは約２時間～約２４時間、さらに好ましくは約２時間～約１２時間である。本開示において、かかるインキュベート時間によりインキュベートを行なった後は、さらなるインキュベートは行なわず、シート状細胞培養物を剥離するステップを行なう。インキュベート温度も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃～約６０℃、好ましくは約４℃～約４５℃、より好ましくは室温～約４０℃である。
　インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、培養基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、培養基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の培養基材洗浄手法、例えば、限定することなく、培養基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒～約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。
　本開示において、培養基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ～約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ～約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　本開示において、培養基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
　培養基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。
　培養基材は、血清等でコートした後直ちに細胞を播種してもよいし、コートした後に保存しておき、その後細胞を播種することもできる。コートした基材は、例えば約４℃以下、好ましくは約－２０℃以下、より好ましくは約－８０℃以下に保つことにより長期間保存することができる。
　培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
＜１＞本開示の製造方法
　本開示の一側面において、品質の高いシート状細胞培養物を製造する方法が提供される。
　本開示の製造方法は、以下を含む：
（ｉ）シート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種すること、
（ｉｉ）上記（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離すること。
　（ｉ）において、培養基材上にシート形成細胞を含む細胞集団を播種する。シート形成細胞は、シート状細胞培養物を構成し得る細胞として上述した細胞であれば特に限定されない。細胞集団には、少なくとも１種のシート形成細胞が含まれるが、２種以上のシート形成細胞を含んでもよいし、シート形成細胞以外の細胞を含んでもよい。本開示の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は筋芽細胞であり、好ましくは骨格筋芽細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに線維芽細胞が含まれ得る。すなわち、筋芽細胞と線維芽細胞をシート形成細胞として含むシート状細胞培養物が挙げられる。本開示の別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は心筋細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。すなわち、心筋細胞と血管内皮細胞をシート形成細胞として含むシート状細胞培養物が挙げられる。本開示のさらに別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は、間葉系幹細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。
　播種される細胞密度は、シート状細胞培養物を形成し得る密度であれば特に限定されないが、好ましい態様において、細胞集団はコンフルエントに達する密度またはそれ以上の密度で播種される。本開示において、「コンフルエントに達する密度」とは、細胞を播種した際に、播種された細胞により、培養容器の接着表面一面が隙間なく覆われることが想定される程度の密度を指す。例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度である。
　細胞集団の播種密度の非限定例は、約７．１×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２～約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２～約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２～約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２～約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２～約１．６×１０６個 ／ｃｍ２などの密度を含む。なお、これらの密度は、特段の記載がない限り、細胞集団に含有される全ての細胞の密度であることとする。
　さらに別の態様において、播種は、成長因子を実質的に含まない細胞培養液において、細胞集団に含まれ得る少なくとも１種のシート形成細胞が実質的に増殖しない密度で行うことができる。かかる態様において、細胞集団に含まれ得る他の細胞は、増殖抑制を受けながらも、増殖可能な密度であり得る。
　本開示の方法に用いられる培養基材は、上述のとおりである。好ましい一態様において、培養基材は血清で被覆されていてよい。別の好ましい一態様において、培養基材は温度応答性材料で被覆されていてよい。さらに好ましい一態様において、培養基材は温度応答性材料及び血清で被覆されていてよい。
　（ｉｉ）において、播種された細胞集団は、細胞培養液中でインキュベートしてシート化され、シート状細胞培養物として形成される。
　播種した細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、WO 2014/185517などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞のシート化は、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。シート化培養により、培養基材上（培養容器内）のシート状細胞培養物の厚みは減少する。すなわち、播種後、細胞が沈降した後、その後のシート化により培養基材上で細胞層の厚みは減少するが、シート状細胞培養物は培養基材からの剥離により収縮し、再び厚みを増す。シート化による厚みの減少は、播種直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約９０％～約１０％程度である。培養基材からの剥離によりシート状細胞培養物はふたたび収縮し、その際のシート状細胞培養物の厚みの増加率は剥離直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約１２０％～３００％である。
　シート化のためのインキュベート時間は、シートが形成され得る時間であれば特に限定されない。シートが形成され得る時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、２時間程度でシートが形成され得る。したがって一態様において、シート化のためのインキュベート時間は、２時間以上であり得る。
　上述のとおり本発明者らは、シート状細胞培養物が形成された後、形成されたシート状細胞培養物が自然に培養基材から剥離する前に人為的に剥離することにより、剥離後遊離したシート状細胞培養物に癒着防止の処理を施すことで、製造されたシート状細胞培養物を高品質に保つことが可能であることを見出したものである。したがってシート化のためのインキュベートは、シート状細胞培養物が自然剥離されるより前に終了される。インキュベート開始から自然剥離が開始されるまでの時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、６～１２時間程度で自然剥離が生じる場合が多い。したがって本開示の一態様において、シート化のためのインキュベート時間の上限は１２時間、１１．５時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間または４時間であり得る。
　したがって本開示の製造方法において、シート化のためのインキュベート時間は、２～１２時間、２～１１．５時間、２～１１時間、２～１０時間、２～９時間、２～８時間、２～７時間、２～６時間、２～５時間または２～４時間、好ましくは２～４時間または２～６時間であり得る。本開示の製造方法は、前記インキュベート時間によりインキュベートを行なった後は、さらなるインキュベートは行なわず、シート状細胞培養物を剥離するステップを行なう。　　　
　培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と称することもある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本開示の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
　基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本開示に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
　基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ－グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
　本開示の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ－アルギニン：約６３．２ｍｇ／Ｌ～約８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン：約３５ｍｇ／Ｌ～約６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン：約４．４ｍｇ／Ｌ～約５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：約２．３ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン：約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－イソロイシン：約６６ｍｇ／Ｌ～約１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン：約１０５ｍｇ／Ｌ～約１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－リジン：約１４６ｍｇ／Ｌ～約１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン：約１５ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ－フェニルアラニン：約３３ｍｇ／Ｌ～約６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－セリン：約３２ｍｇ／Ｌ～約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トレオニン：約１２ｍｇ／Ｌ～約９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン：約４．１ｍｇ／Ｌ～約１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン：約１８．１ｍｇ／Ｌ～約１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－バリン：約９４ｍｇ／Ｌ～約１１７ｍｇ／Ｌである。
　また、本開示の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ－パントテン酸カルシウム：約４ｍｇ／Ｌ～約１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：約４ｍｇ／Ｌ～約１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：約０．６ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌ、ｉ－イノシトール：約７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：約４ｍｇ／Ｌ～約６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：約０．００３８ｍｇ／Ｌ～約０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：約３．４ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：約２．１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌである。
　細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分が自己由来のものではない場合は、臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物となり得るため、臨床への適用にあたってはかかる非自己由来成分を排除することが望ましい場合がある。したがって、本開示の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本開示のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本開示の特に好ましい態様において、細胞培養液は、非自己由来の添加物を実質的に含まない。一態様において、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。
　本開示の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、シート状細胞培養物中の血清アルブミン含量が約５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本開示においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。
　本開示の一態様において、細胞培養液は血清を含む。血清は、同種血清であっても異種血清であってもよい。特定の態様において、細胞培養液は自己血清を含む。血清でコートされた培養基材上で細胞を培養する場合、細胞培養液に含まれる血清（細胞の培養に用いる血清）は、培養基材をコートするために用いる血清と同じであっても異なってもよい。一態様において、細胞培養液に含まれる血清は、培養基材をコートするために用いる血清と同一であり、特定の態様において、該血清は自己血清である。血清は、本開示の製造方法に用いるためのものであってもよい。例えば、血清は、細胞の培養に用いるためのものであっても、培養基材をコートするためのものであってもよい。
　本開示の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、細胞培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば約０．００５μｇ／ｍＬ以上である。
　したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本開示における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本開示の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本開示における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。
　本開示の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。
　本開示の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６μｇ／ｄＬ～１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が約１０％であれば、セレン濃度は、例えば、約１．０μｇ／ｄＬ～約１．７μｇ／ｄＬ未満である）。
　本開示の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去するステップが不要となる。したがって、本開示の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去するステップを含まない。
　ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。
　（ｉｉｉ）において、形成されたシート状細胞培養物が、培養基材から剥離される。
　シート状細胞培養物の培養基材からの剥離は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
　例えば、細胞を温度応答性培養皿で培養して細胞培養物を形成した場合には、温度を温度応答性材料の水に対する下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下または上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上とする温度処理により、シート状細胞培養物を非酵素的に遊離することができる。かかる温度処理は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が付着した培養基材を、ＬＣＳＴより高い温度の培養環境（例えば、約３７℃の温度のインキュベーター内など）から、ＬＣＳＴ以下の環境（例えば、インキュベーター外の室温環境など）に移行させることなどにより達成することができる。ＬＣＳＴ以下の環境への移行は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が存在するＬＣＳＴより高い温度の培養液を、ＬＣＳＴ以下の温度の媒体（例えば、緩衝液（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）や、培養液などの液体等）に置換することなどにより達成することができる。したがって、上記緩衝液等の媒体は、本開示の製造方法において、シート状細胞培養物を培養基材から非酵素的に遊離するために用いることができる。
　（ｉｉｉ）の工程により剥離されたシート状細胞培養物は、剥離前と比較して収縮し、面積が小さくなる。本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物は、剥離後に収縮しにくく、より大きな面積を有するという特徴がある。本開示の一態様において、剥離後のシート状細胞培養物は、剥離前のシート状細胞培養物の面積（すなわち培養基材の面積）に対して、約２０％以上、例えば約２０％、約２５％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約５０％、約６０％の面積を有し、好ましくは約３５％以上、例えば約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約５０％、約６０％の面積を有する。
　剥離後のシート状細胞培養物の面積は、面積５６．７ｃｍ２（直径１０ｃｍ）の培養皿でシート化した場合、剥離後に１８００ｍｍ２以上、１８４７ｍｍ２以上または１９２３ｍｍ２以上であってよい。上限としては特に制限されないが、２６００ｍｍ２、２５０５ｍｍ２、２４６２ｍｍ２であってよい。具体的には、剥離後の面積は１８００ｍｍ２～２６００ｍｍ２、１８４７ｍｍ２～２６００ｍｍ２、１９２３ｍｍ２～２６００ｍｍ２、１９２３ｍｍ２～２５０５ｍｍ２のいずれかであってよい。面積８．８ｃｍ２（直径３．５ｃｍ）の培養皿でシート化した場合、または面積３．５ｃｍ２（１２ウエル）の培養皿でシート化した場合、各々面積５６．７ｃｍ２（直径１０ｃｍ）の培養皿で剥離後に得られたシート状細胞培養物の面積に比例する面積のシート状細胞培養物を得ることができる。
　シート状細胞培養物剥離後の収縮は、シート状細胞培養物を構成する細胞の細胞間接着力の大きさに影響されるものと推測される。したがって、ある程度シート化のためのインキュベートの時間を長くした場合、例えばシート状細胞培養物の自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合、シート状細胞培養物の剥離後収縮率は最大に達するものと考えられる。したがって、剥離後収縮率が最大になった場合、すなわち剥離後のシート状細胞培養物の面積が最小になった場合の面積を基準として、シート状細胞培養物の面積を規定してもよい。本開示の一態様において、剥離後のシート状細胞培養物の最小面積（すなわち自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合の剥離後シート状細胞培養物の面積）を１とした場合の（ｉｉｉ）で得られるシート状細胞培養物の面積は、約１．０４～約１．４、約１．１～約１．４または約１．３～約１．３５であってよい。
したがって特に好ましい一態様において、本開示の製造方法は、以下を含む：
（ｉ）筋芽細胞または心筋細胞を含む細胞集団を、約７．１×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２～約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２～約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２～約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２～約１．８×１０６個／ｃｍ２または約９．０×１０５個／ｃｍ２～約１．６×１０６個／ｃｍ２のいずれかの播種密度で培養基材に播種すること、、
（ｉｉ）上記（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中で２～１２時間、２～１１．５時間、２～１１時間、２～１０時間、２～９時間、２～８時間、２～７時間、２～６時間、２～５時間または２～４時間インキュベートしてシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離すること、ここで剥離されたシート状細胞培養物の面積が、自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合の剥離後シート状細胞培養物の面積を１とした場合、約１．０４～約１．４、約１．１～約１．４または約１．３～約１．３５となる。
　本開示の製造方法は、（ｉ）の前に、細胞（細胞集団）を凍結するステップと凍結細胞を解凍するステップとを含んでもよい。細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には約０℃以下、好ましくは約－２０℃以下、より好ましくは約－４０℃以下、さらに好ましくは約－８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて約－８０℃に達するまで約１時間～約５時間、好ましくは約２時間～約４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、約０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）、プログラムフリーザーなどを用いることができる。
　凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、凍結ステップを含む本開示の製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
　凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
　培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して約２％～約２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本開示の範囲内である。
　凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には約４℃～約５０℃、好ましくは約３０℃～約４０℃、より好ましくは約３６℃～約３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には約２分以内であり、特に約２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。
　本開示の製造方法は、上述の凍結した細胞を解凍するステップの後、かつ、シート状細胞培養物を形成するステップ、好ましくは細胞を培養基材に播種するステップの前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後に行われる。
　本開示の製造方法は、上述の細胞を凍結するステップの前に、細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。
　一態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含まない。別の態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含む。導入する遺伝子は、対象とする疾患の処置に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦなどのサイトカインであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などの既知の任意の方法を用いて行うことができる。細胞への遺伝子の導入は、限定されずに、例えば、細胞を凍結するステップの前に行うことができる。
　一態様において、本開示の製造方法はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本開示の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞または細胞の給源となる組織（例えば、横紋筋組織、特に骨格筋組織）を採取するステップを含む。一態様において、本開示の製造方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。一態様において、本開示の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が実質的に無菌となるように行われる。一態様において、本開示の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が無菌となるように行われる。
　本開示の別の側面は、本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物に関する。本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、例えば、組織の異常に関連する種々の疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、特に、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。本開示のシート状細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物に比べて高い機械的強度を有する以外は、これと同様の構成細胞固有の性質を有しているため、少なくとも従来の筋芽細胞または線維芽細胞を含むシート状細胞培養物による処置が可能な組織や疾患に適用することができる。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、食道、皮膚、膵臓、骨格筋などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、膵臓疾患（例えば、膵液瘻など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）が挙げられる。本開示のシート状細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013;48(9):1081-9.などに記載されている。本開示のシート状細胞培養物は、注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することで、単細胞懸濁液による注射よりも高い効果を得ることもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008;77(3):515-24）。したがって、本開示のシート状細胞培養物についても、このような利用法が可能である。
　一態様において、本開示のシート状細胞培養物は実質的に無菌である。一態様において、本開示のシート状細胞培養物は無菌である。一態様において、本開示のシート状細胞培養物は、遺伝子操作されていない。別の態様において、本開示のシート状細胞培養物は、遺伝子操作されたものである。遺伝子操作は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物の生存性、生着能、機能などを高める遺伝子、および／または、疾患の治療に有用な遺伝子の導入を含む。導入される遺伝子としては、限定されずに、例えば、ＨＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子が挙げられる。
　本開示の別の側面は、本開示のシート状細胞培養物を含む、組成物（例えば、医薬組成物等）、移植片および医療製品など（以下、「組成物等」と総称することがある）に関する。
　本開示の組成物等は、本開示のシート状細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本開示の組成物等は、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本開示の組成物等は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本開示のシート状細胞培養物について上記したとおりである。
＜２＞本開示の処置方法
　本開示の別の側面は、対象においてシート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）を処置する方法であって、本開示のシート状細胞培養物または組成物等の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する（以下、「本開示の処置方法」と称することがある）。本開示の処置方法の対象となる組織や疾患は、本開示のシート状細胞培養物について上記したとおりである。また、本開示の処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示のシート状細胞培養物または組成物等と併用することができる。
　本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、シート状細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、シート状細胞培養物を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物を製造するための細胞または細胞の給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
　本開示において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズや重量、枚数など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
　投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられるが、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。
　投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。
　本開示を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本開示の特定の具体例を示すものであり、本開示はこれらに限定されるものではない。
例１．シート状細胞培養物の製造
（１）細胞集団の調製
　成人大腿部から無菌的に採取した骨格筋組織から得られた細胞を培養フラスコに播種し、筋芽細胞数と線維芽細胞数の比率を調整するために、２０％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で増殖させた。増殖させた細胞をタンパク質分解酵素液で培養フラスコから剥離させ、回収後、遠心分離により濃縮した。
（２）シート状細胞培養物の作製
　２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をφ10cm温度応答性培養皿に添加し一晩静置した。その後、添加した培地を廃棄した。
　２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬあたり細胞を６．０×１０６～６．１×１０６個懸濁して得た細胞懸濁液を１０ｍＬ、φ１０ｃｍ温度応答性培養皿（UpCell(R)、セルシード製、培養基材の面積：５６．７ｃｍ２）に播種した。播種後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートし、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、５．５時間後、６時間後、１１．５時間後、１２時間後にそれぞれ培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップに供した（ｎ＝３）。
　結果を図１および下表に示す。図１は各インキュベート時間の後に剥離を行ったシート状細胞培養物の様子を示す写真である。インキュベート時間が２時間以上の場合に、シートが形成され、損傷なく剥離可能であることが確認された。剥離されたシート状細胞培養物について、大きさ（短径および長径）の平均値を計測し、面積を算出した。インキュベート時間を１２時間とした場合の面積を１として、上記各インキュベート時間により得られた剥離シート状細胞培養物の面積比を算出した。
なお、インキュベート時間を１２時間以上とした場合には、剥離したシート状細胞培養物の面積はほぼ変動しない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書に記載された本開示の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本開示の範囲内である。また、当業者は、本開示の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本開示の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本開示の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

Claims (10)

  1. 　（ｉ）少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種するステップ、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成するステップ、および
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップ
    を含み、ステップ（ｉｉ）におけるシート化が、２～１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法。
  2. 　シート形成細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　細胞培養液が、同種血清を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　培養基材が、血清で被覆されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２～３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. シート化が、２～１２時間、２～１１．５時間、２～１１時間、２～１０時間、２～９時間、２～８時間、２～７時間、２～６時間、２～５時間または２～４時間のインキュベートにより行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　シート化が、２～６時間のインキュベートにより行われる、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　剥離後のシート状細胞培養物が、培養基材の面積に対して３５％以上の面積を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたシート状細胞培養物を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7575392B2 (ja) 2019-09-30 2024-10-29 国立大学法人大阪大学 心筋細胞のシート化方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003306434A (ja) * 2002-04-15 2003-10-28 Mitsuo Okano 心筋細胞シートによる心筋症治療薬
JP2010161954A (ja) * 2009-01-13 2010-07-29 Dainippon Printing Co Ltd 生体組織の作製方法
JP2011115058A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Terumo Corp 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
JP2014000095A (ja) * 2013-09-25 2014-01-09 Terumo Corp 医療用細胞シートの製造方法
JP2014138556A (ja) * 2013-01-21 2014-07-31 Terumo Corp シート状細胞培養物の製造方法
JP2015151334A (ja) * 2014-02-10 2015-08-24 テルモ株式会社 血清調製方法および器具
WO2015146559A1 (ja) * 2014-03-27 2015-10-01 テルモ株式会社 シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具およびそれを用いたシート状細胞培養物の製造方法
JP2017164000A (ja) * 2017-06-30 2017-09-21 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP2017212952A (ja) * 2016-06-01 2017-12-07 大日本印刷株式会社 細胞集合体の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5634646B1 (ja) * 2013-05-17 2014-12-03 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003306434A (ja) * 2002-04-15 2003-10-28 Mitsuo Okano 心筋細胞シートによる心筋症治療薬
JP2010161954A (ja) * 2009-01-13 2010-07-29 Dainippon Printing Co Ltd 生体組織の作製方法
JP2011115058A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Terumo Corp 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
JP2014138556A (ja) * 2013-01-21 2014-07-31 Terumo Corp シート状細胞培養物の製造方法
JP2014000095A (ja) * 2013-09-25 2014-01-09 Terumo Corp 医療用細胞シートの製造方法
JP2015151334A (ja) * 2014-02-10 2015-08-24 テルモ株式会社 血清調製方法および器具
WO2015146559A1 (ja) * 2014-03-27 2015-10-01 テルモ株式会社 シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具およびそれを用いたシート状細胞培養物の製造方法
JP2017212952A (ja) * 2016-06-01 2017-12-07 大日本印刷株式会社 細胞集合体の製造方法
JP2017164000A (ja) * 2017-06-30 2017-09-21 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7575392B2 (ja) 2019-09-30 2024-10-29 国立大学法人大阪大学 心筋細胞のシート化方法

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