CN113528519A - 蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用，属于基因工程技术领域，其中所述蛋鸭环状RNA circ_2136对应的cDNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明克隆得到了蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列，并设计了相应的特异性引物用于鉴定环状RNA是否正确成环，并分析检测所述蛋鸭环状RNA circ_2136在待测样品中是否表达及其相对表达量；同时本发明通过构建蛋鸭环状RNA circ_2136的过表达载体，使其稳定表达circ_2136，经转染蛋鸭小肠上皮细胞，首次发现了所述环状RNA circ_2136可以促进肠上皮细胞增殖，进而调控肠道屏障功能，这为环状RNA调控蛋鸭肠屏障功能障碍的分子机制带来了更深层次的认知以及新的思路。

Description

蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用。

背景技术

circ RNA是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。在反向剪接过程中，下游5'端剪接位点与上游3'端剪接位点反向连接，在连接位点形成一个具有3',5'磷酸二酯键的circ RNA分子。circ RNA与传统线性RNA不同，circ RNA以环状形式存在，其3'头端和5'尾端以共价键连接而成，使其避免被RNA核酸外切酶和脱支酶降解，这是其表达稳定，不易降解的重要原因。circ RNA根据来源可分为三大类：(1)外显子来源的circ RNA(exonic circ RNA，ecirc RNA)，ecirc RNA是由一个或多个外显子首尾拼接而成，其占circ RNA的绝大多数(超过80％)；(2)外显子-内含子来源的circ RNA(exon-intron circ RNA，EIcirc RNA)，EIcirc RNA由编码基因的外显子序列和内含子序列组成，不同于仅由外显子序列组成的特异RNA；(3)内含子来源的circ RNA(circular intronic RNA，ciRNA)，ciRNA广泛存在于细胞核中，由内含子自身环化形成。

circ RNA主要通过三种机制发挥调控功能：(1)作为miRNA的海绵吸附体调控基因的表达(ceRNA)；(2)circ RNA结合RNA结合蛋白(RBP)以形成RNA-蛋白复合物(RPC)，调控线性亲本基因的转录；(3)已经有数篇论文研究发现circ RNA可编码蛋白质，发挥生物学功能。

肠屏障功能障碍分子机制的相关研究众多，但circ RNA调控肠道屏障功能障碍的研究却鲜见报道。早在1993年，Capel等人就在在小鼠精子决定基因SRY中发现了环状RNA，并且SRY也被证实可以吸附miR-138，发挥miRNA海绵作用。Liu等人在败血症大鼠肠黏膜组织中发现circ-0001105表达显著下调，而上调circ-0001105表达后发现，肠黏膜通透性、肠道炎症反应及氧化损伤程度均显著降低。但circ RNA具有多种途径发挥调控作用，例如可以吸附miRNA、通过影响其靶基因的表达来实现功能。众所周知，circ RNA具有强大的生物学功能，但其在家畜肠道屏障功能中的作用及作用机制还有待进一步研究。

发明内容

本发明针对现有技术的空白，提供了一种蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用，并验证了所述蛋鸭环状RNA circ_2136在蛋鸭肠道屏障功能中的具体作用机制，为进一步解析蛋鸭肠屏障功能障碍的作用机理提供了新的思路。

本发明的目的之一在于提供一种蛋鸭环状RNA circ_2136，所述蛋鸭环状RNAcirc_2136对应的cDNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之二在于提供一种载体，所述载体中包含上述蛋鸭环状RNA circ_2136。

进一步地，所述载体为过表达载体PLCDH-circ_2136。

进一步地，所述过表达载体的构建过程为：合成所述蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列，然后整合到载体PLCDH-ciR中得到。

进一步地，所述蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列中还包括EcoRI与BamHI限制性内切酶的酶切位点，其全长序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的目的之三在于提供一种细胞，所述细胞中包含上述载体。

本发明的目的之四在于提供所述蛋鸭环状RNA circ_2136，或所述载体，或所述细胞在调控肠道屏障功能中的应用。

进一步地，所述蛋鸭环状RNA circ_2136，或所述载体，或所述细胞通过通过调控小肠上皮细胞增殖，进而调控肠道屏障功能。

进一步地，所述蛋鸭环状RNA circ_2136通过内源性竞争RNA和吸附miRNA，并影响其靶基因，从而调控肠道屏障功能。

本发明的目的之五在于提供所述蛋鸭环状RNAcirc_2136的检测引物对，包括：上游引物PF1和下游引物PR1，所述上游引物PF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物PR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的目的之六在于提供一种蛋鸭环状RNA circ_2136的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括上述检测引物对。

进一步地，所述检测试剂盒中还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系。

本发明的目的之七在于提供了所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待检测样品中的RNA，进行逆转录得到cDNA；

步骤2、利用上述检测引物对，对待检测样品的cDNA进行荧光定量PCR扩增并进行相对定量分析，判断待测样品中是否存在所述蛋鸭环状RNA circ_2136及其表达量。

进一步地，所述方法中还包括：利用上述检测引物对，对待检测样品的cDNA进行扩增，然后对扩增产物进行测序，获得接头序列的碱基信息，以验证扩增产物是否为成环的RNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明克隆得到了蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列，并设计了相应的特异性引物用于鉴定环状RNA是否正确成环，并分析检测所述蛋鸭环状RNA circ_2136在待测样品中是否表达及其相对表达量；同时本发明通过构建蛋鸭环状RNA circ_2136的过表达载体，使其稳定表达circ_2136，经转染蛋鸭小肠上皮细胞，首次发现了所述环状RNA circ_2136可以促进肠上皮细胞增殖，进而调控肠道屏障功能，这为环状RNA调控蛋鸭肠屏障功能障碍的分子机制带来了更深层次的认知以及新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中蛋鸭环状RNA circ_2136的结构示意图；

图2为本发明实施例1中蛋鸭环状RNA circ_2136的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

图3为本发明实施例1中蛋鸭环状RNA circ_2136的接头序列中环化位点的测序峰图；

图4为本发明实施例1中蛋鸭环状RNA circ_2136在不同组织中的相对表达量示意图；

图5为本发明实施例2中过表达载体PLCDH-ciR的结构图谱；

图6为本发明实施例2中过表达载体PLCDH-circ_2136加快蛋鸭肠上皮细胞增值速率示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1蛋鸭环状RNA circ_2136的克隆与鉴定

1、在湖北省农业科学院畜牧兽医研究所鸭场采集蛋鸭的心、肝、十二指肠、脾、肺、肾和肌肉组织样品各3份，经PBS清洗后放入去RNA酶的样品采集管内，放入液氮带回实验室进行总RNA的提取，剩余样本放置在-80℃冰箱保存；

2、利用天根RNA simple总RNA提取试剂盒，提取蛋鸭不同组织样品中总RNA，操作按照试剂盒说明书进行，提取后的RNA放置于-80℃冰箱保存备用。使用NanoDrop 2000型DNA/RNA浓度测定仪，测定RNA浓度和OD值，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按照所测浓度将管中的DNA做相应稀释，以50ng/μL分装，于-20℃保存备用，采用TAKARA的

RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒获得cDNA模板。操作按照试剂盒说明书进行，反转录后的cDNA放置于-80℃冰箱保存备用。

3、采用转录组测序技术分析麻鸭肠道组织中的环状RNA，根据转录组测序结果，结合NCBI数据库中蛋鸭基因信息得出，蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列是由蛋鸭ZNF326基因的第10、11、12外显子环化而成，其结构示意图如图1所示。所述环状RNA circ_2136对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其接头区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

4、以circ_2136的全长序列为模板，设计相应的检测引物对，序列如下：

上游引物PF1：ACCCAATAGTCAAGGCACG(序列表SEQ ID NO:2)；

下游引物PR1：TGCTGCTGAACGGAACTG(序列表SEQ ID NO:3)；

利用上述检测引物对，以步骤(2)获得的蛋鸭心、肝、十二指肠、脾、肺、肾和肌肉组织的cDNA为扩增反应模板，采用荧光定量PCR(qRT-PCR)进行蛋鸭环状RNA circ_2136相对表达量分析，产物长度为234bp。

qRT-PCR的反应程序为：

PCR反应体系(20μL)为：

取5μL qRT-PCR反应的扩增产物，加0.5μL Loading Buffer，混匀后点样于2％的琼脂糖凝胶上，以5μL DNA标准分子量DL 2000Marker作为参照，15V/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存，检测结果如图2所示，条带大小与预期一致，为234bp。

5、qRT-PCR反应产物采用Omega Bio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书。回收后的产物连接TAKARA公司的pMD18-T载体，连接反应总体系10μL，置于16℃条件下连接1h，连接反应体系(10μL)如下：

无菌条件下取10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞中，混匀后静置冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上3min，加入400μL不含AMP抗生素的LB液体培养基，置于37℃恒温摇床培养45min，在<5000g的转速下低速离心，取150μL上清，其余弃除，再将剩余上清吹打混匀然后均匀涂布于含有100mg/L的Amp的平板上，放于37℃恒温培养箱中1h，倒置过夜培养；

用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μL LB液体培养基含的1.5mLEpendorff管中，于37℃恒温摇床培养8h，取lμL菌液作为PCR扩增的模板，PCR扩增体系和程序同上，PCR扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录；

经菌液PCR检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果与蛋鸭环状RNAcirc_2136的接头区域序列进行对比分析，发现蛋鸭环状RNA circ_2136的首尾碱基正好连在一起形成环化位点，表明蛋鸭环状RNA circ_2136正确成环，成环结果以及蛋鸭环状RNA接头序列中环化位点的测序峰图如图3所示。

采用上述qRT-PCR方法分别分析蛋鸭的心、肝、十二指肠、脾、肺、肾和肌肉组织中环状RNA circ_2136的表达情况，采用2^-ΔΔCT方法进行分析，并利用Graphad Prism软件作图，各组织中circ_2136的表达结果如图4所示。结果显示，circ_2136在心、肝、十二指肠、脾、肺、肾和肌肉组织均有不同程度的表达。

实施例2蛋鸭环状RNA circ_2136过表达载体构建和功能鉴定

一、过表达载体PLCDH-circ_2136的构建

载体PLCDH-ciR空载体可用于环状RNA表达的工程载体，含有环状RNA表达框架如图5所示，经过大肠杆菌DH5α扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(OmegaE.Z.N.A.TM Endo-Free PlasmidMini KitISpin)进行抽提载体DNA，具体步骤见试剂盒说明书；

circ_2136全长序列合成过程为：在如SEQ ID NO:1所示的circ_2136序列两端加入EcoR I与BamH I限制性内切酶的酶切位点，将目标序列送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

载体和合成片段双酶切过程：PLCDH-ciR空载体质粒和circ_2136全长序列合成片段，分别用限制性内切酶EcoR I和BamHⅠ进行双酶切，双酶切反应体系(10μL)如下：

体系于37℃酶切3h，酶切产物在2％琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收；将酶切后纯化的PLCDH-ciR空载体质粒和circ_2136全长序列合成片段，用T4连接酶16℃连接2h，连接体系(10μL)如下：

连接完成后，按照本领域常规方法进行克隆和测序验证，以得到重组PLCDH-circ_2136载体。

二、功能验证

1、质粒提取

按照试剂盒说明书的操作步骤，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒进行抽提载体DNA。

2、蛋鸭小肠上皮细胞分离培养

(1)取孵育26天的啄壳鸭胚，在超净台中使用无菌操作取出鸭胚的小肠组织，放入提前准备好的DPBS溶液中。

(2)利用DPBS溶液清洗小肠组织，去除胰腺和肠系膜后把小肠剖开，用DPBS溶液清洗小肠内壁，直至上液清亮。

(3)将清洗好的小肠剪成1～2mm的组织块，放入DPBS溶液中。利用1％的I型胶原酶消化液20ml消化小肠组织块，37℃，80r/min振荡消化60min，后用DPBS清洗3次。

(4)利用PBS溶液轻柔吹打小肠组织块，收集上层细胞悬浮液，并保留组织块继续加入PBS溶液吹打，重复上述步骤6-7次，直至上液清亮。

(5)将获得的细胞悬液1000r/min离心3min后弃上清，将获得的细胞团用完全培养基吹打重悬，并用100μm细胞筛过滤，鸭小肠上皮细胞完全培养基为：DMEM-F12培养基中加入5％的胎牛血清，0.5％的肝素钠(100μg/mL)，0.1％的表皮生长因子(105ng/ml)，0.1％的胰岛素(25mg/ml)，1％的青链霉素(10000U)。

(6)过筛后的细胞用完全培养基悬浮吹打均匀，接种到细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱内培养90min，去掉贴壁杂细胞，收集未贴壁细胞，细胞按照10×10⁶个/mL密度接种于细胞培养板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(7)小肠上皮细胞培养36小时后，更换新的DMEM/F12完全培养基，贴壁后可用于后续研究。

3、细胞转染：

(1)转染前1天，将细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；

(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μL OPTI-MEM培养基中混匀，取2.0μLLipofectamine 3000加入50μL OPTI-MEM培养基中混匀，室温静置5min；

(3)将(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min；

(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用OPTI-MEM清洗两遍；

(5)将每孔细胞加入(3)中混合液100μL，后用OPTI-MEM补至500μL；

(6)置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，等待后续处理。

4、CCK-8法检测细胞增殖：

将上述转染circ_2136过表达载体质粒的细胞取出备用，每孔加入80μLCCK-8，溶液放入细胞培养箱中孵育一小时。孵育结束后，利用酶标仪在450nm测定溶液吸光度。

CCK-8检测结果如图6所示，结果表明，转染了circ_2136过表达载体的试验组蛋鸭小肠上皮细胞增值速率显著高于PLCDH-ciR对照组，说明过量表达的蛋鸭环状RNA circ_2136可以加速蛋鸭小肠上皮细胞的增殖。即本发明中的蛋鸭环状RNA circ_2136过表达载体能够稳定表达，观测细胞增殖凋亡情况，并且可促进小肠上皮细胞的增殖。

综上，本发明提供了所述蛋鸭环状RNA circ_2136的全长序列，并设计的特异引物用于鉴定环状RNA是否正确成环、分析相对表达量，提供了对蛋鸭环状RNA circ_2136进行定量分析所需的PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测不同组织样本中circ_2136是否成环及其表达水平。同时本发明还研究并验证了蛋鸭环状RNA circ_2136对蛋鸭小肠上皮细胞增殖具有调控作用，进而调控了肠道屏障功能，通过构建蛋鸭环状RNA circ_2136过表达载体，并转染至原代鸭小肠上皮细胞中，可显著促进小肠上皮细胞增殖。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 蛋鸭环状RNA circ_2136及其检测试剂、方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> DNA

<213> 麻鸭(Tadorna tadornoides)

<400> 1

gagtgtatgg taaataaatt caagaagaca gctatgcgta agcaacagac aagtaaccaa 60

acagacaacg ctcaagctgt tgaaaaagat ataatggaag ggttactgct gatgaccaca 120

tgatgaaagt tgagactgtt cattgcagtg cttgcagcgt gtatgttcct gcattacaca 180

gttccgttca gcagcactta aaatctcctg atcacacaaa aggaaaacaa cctacagaga 240

acaaataaaa agggagagtg ttcttactgc taccagtatc ttgaataacc caatagtcaa 300

ggcacggtat gagctgtatg tgaag 325

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccaatagt caaggcacg 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctgctgaa cggaactg 18

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaggcacg gtatgagctg tatgtgaagg agtgtatggt aaataaattc aagaagac 58

<210> 5

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcgagt gtatggtaaa taaattcaag aagacagcta tgcgtaagca acagacaagt 60

aaccaaacag acaacgctca agctgttgaa aaagatataa tggaagggtt actgctgatg 120

accacatgat gaaagttgag actgttcatt gcagtgcttg cagcgtgtat gttcctgcat 180

tacacagttc cgttcagcag cacttaaaat ctcctgatca cacaaaagga aaacaaccta 240

cagagaacaa ataaaaaggg agagtgttct tactgctacc agtatcttga ataacccaat 300

agtcaaggca cggtatgagc tgtatgtgaa gggatcc 337

Claims (10)

1.一种蛋鸭环状RNA circ_2136，其特征在于，所述蛋鸭环状RNA circ_2136对应的cDNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求1所述的蛋鸭环状RNA circ_2136。

3.一种细胞，其特征在于，所述细胞中包含如权利要求2所述的载体。

4.如权利要求1所述的蛋鸭环状RNA circ_2136，或如权利要求2所述的载体，或如权利要求3所述的细胞在调控肠道屏障功能中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋鸭环状RNA circ_2136，或所述载体，或所述细胞通过调控小肠上皮细胞增殖，进而调控肠道屏障功能。

6.如权利要求1所述的蛋鸭环状RNA circ_2136的检测引物对，其特征在于，所述引物对包括：上游引物PF1和下游引物PR1，所述上游引物PF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物PR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.一种蛋鸭环状RNA circ_2136的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括如权利要求6所述的检测引物对。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系。

9.如权利要求7-8任一所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待检测样品中的RNA，进行逆转录得到cDNA；

步骤2、利用如权利要求6中所述的检测引物对，对待检测样品的cDNA进行荧光定量PCR扩增并进行相对定量分析，判断待测样品中是否存在所述蛋鸭环状RNA circ_2136及其表达量。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述方法中还包括：利用如权利要求6中所述的检测引物对，对待检测样品的cDNA进行扩增，然后对扩增产物进行测序，获得接头序列的碱基信息，以验证扩增产物是否为成环的RNA。

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