CN101868536A - 从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定。在所处理样品数方面除可重现外，且100％可靠，所述方法在短时间内产生比现有技术先前所述高且确定数的前体细胞，所述前体细胞是单次离体粘附和扩展/增殖期后得到的细胞中的大部分(因此承诺细胞表型)。用此方法，可在直接冷冻细胞条段后，且在大部分细胞的一次离体扩展/增殖期(P0末)后9天内获得约8.6(±0.1)×105细胞/克经处理脐带。反过来，所述细胞的特征使得，例如在35天后，从100％经处理脐带样品中得到平均7.7×1015具有前体表型的细胞。因为简单、稳健且100％可靠，所述方法可在优质生产规范(GMP)下在致力于人的细胞治疗的实验室中进行。而且，所述方法还应用于药学、化妆品和生物技术领域。

Description

从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定的方法
技术领域
本发明涉及从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定的方法。
本发明中的“前提细胞”指能够在表面和确定的生长培养基中粘附和扩展/增殖的一类细胞，其中培养物中的大部分细胞表达细胞表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105，且大部分细胞表现出细胞表面标记物CD14、CD31、CD34和CD45的仅残量表达，其中大部分细胞能够经历至18次扩展/增殖期，保持约1.7/24小时的恒定的翻倍因数，恒定的成纤维细胞样形态，及部分或终端分化为特定细胞(如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经胶质细胞/神经细胞)的能力。
本发明的目标给现有技术添加了稳健的方法，其允许有关组织样品加工的100％的效力，且有关从每脐带质量分离的干细胞数及消耗时间的效力。
作为本发明的基础的技术革新基本上构成为：将细胞分离过程分为三个独立的细胞回收阶段，及沿流程优化多个技术参数。所述参数远未被现有技术所提及或定义。
所述三阶段回收方法基于从三个不同独立来源随分离过程解离的细胞的依次回收：
阶段1：回收能够粘附于细胞培养瓶表面的第一组细胞，在所述细胞培养瓶中进行消化反应。粘附在消化温育期过后随即发生，所述瓶仍保持水平位置，室温下30分钟，且仍在消化溶液存在下。在培养条件下温育所述粘附细胞，且使所述细胞经历扩展和增殖至汇合率接近100％；
阶段2：阶段1后，从通过离心所述消化溶液所得上清中回收第二组细胞。然后使这些细胞在培养条件下温育，并将能够粘附于细胞培养瓶表面的细胞经历扩展和增殖至汇合率接近100％；
阶段3：从通过离心阶段2所得沉淀中回收第三组细胞。可不经粘附、扩展和增殖而将这些细胞冷冻保存。
有关随流程优化的技术参数，这些是：
1.机械操作类型和初始脐带条段尺寸，
2.脐带血管中有无血块，
3.酶的类型、单独或组合作用、及消化溶液中酶的浓度，
4.消化溶液的组成，
5.消化反应期间的pH变化，
6.温育时期/时间，
7.搅拌类型(缓和或剧烈)，
8.温育气氛类型(干或湿)，及
9.冷冻保存期间的细胞密度。
用于解离细胞回收的三阶段方法与上述技术方面的优化的组合产生了与在细胞治疗(基于细胞施用)中的用途更一致的方法。这是由于方法的稳健性(100％效力)及由于在相对短的时间段内得到的高细胞产量。而且，还优化了冷冻保存的方法，以最大化用于将来使用的细胞活力
用新建立的方法可能在9天内，在直接冷冻细胞条段后，且在大部分细胞两次独立的单阶段离体粘附和扩展/增殖(P0末)后，从100％的经处理脐带样品中得到相比现有技术空前的约8.6(±0.1)×105细胞/克经处理脐带的产量。所述效力代表可从一个脐带(平均35cm长)得到共3.0×109细胞的可能性。相反，所述细胞的特征使得在35天内(P6末)，用5.0×105细胞/cm2恒定接种物经6次传代，从100％的经处理脐带条段中得到例如平均7.7×1015细胞。最后，所述效力代表用现有技术中已存在的相似流程得到相同细胞数所需时间减少约56％。根据早先所述，为用相同的初始接种物得到接近1.0×1015细胞的数量，最少需要80天(Harris et al.，2006；Can和Karahuseyinoglu，2007)。
尽管专门开发用于细胞治疗，所述新方法也适合用于创建的细胞库，所述细胞库：
●待用于基因治疗方案，
●待成为药理学和化妆组合物的基础，
●待产生细胞，所述细胞：
■用于生产分子或分子成分，
■用于生产细胞培养支持用细胞层，及
■用于通过基因操作生产细胞系。
背景技术
前体细胞(干细胞、生殖细胞、未分化细胞、或原始细胞)是一类在显著期间具有自我再生能力，尤其是具有部分或终端分化为其他更特化的细胞类型的能力的细胞。
尽管胚胎前体细胞的巨大分化潜能，但它们在研究或/和治疗应用是有争议的，且已引起了严重的伦理学和安全问题。因此，此领域的研究已聚焦于替代性的非胚胎干细胞(例如从骨髓、骨膜、骨小梁、脂肪组织、滑膜区域、骨骼肌、乳牙髓和终牙(definitive teeth)髓、及嗅粘膜得到的细胞)的鉴定和评估(Barry and Murphy，2004；Roisen et al.，2001)。已证实从这些组织中分离的细胞有能力体外及体内分化为尤其是：软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、星形细胞和肌腱细胞(tenocyte)(Carvalhal et al.，2007；Majumdar et al.，1998和Pittenger et al.，1999)。所述分离自非胚胎来源，且能够分化为非造血特化细胞，源自三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的前体细胞被称为间质干细胞。
利用间质前体细胞的主要限制在临床实践期间(即细胞收获期间)发生。收集间质细胞一定涉及对供体的侵入性方法(如手术操作(例如，从骨髓收集干细胞)，其甚至涉及全身麻醉)。而且，由于间质干细胞稀少，最终所得细胞数一般低。
作为替代，脐带组织已被描述为可能的成体前体细胞来源(Romanov et al.，2003)。例如，脐带血已知是前体细胞的丰富来源，但主要是造血性质的(血谱系)。因为间质干细胞以有限数量存在于脐带血中，从该组织中分离这些细胞的尝试受阻，并且，甚至是使用甚高量血液的最成功的尝试，相对经处理组织样品总数，也未超过60％的成功率。怀疑终究仍在有关所分离细胞的来源上；即细胞来源是否真的是血液，或是胎儿组织(Chul-Wan et al.，2003；Bieback et al.，2004)。
其他报道描述了从其他间质特性比脐带血显著更丰富脐带组成组织中分离间质干细胞。这些方法中的一些例子基于脐带基质(也被称为脐带胶质(Wharton’s jelly)(Purchio et al.，1998；Mitchell et al.，2003；Davies et al.，2004；Wang et al.，2006))、脐带静脉(Romanovet al.，2003；Auger et al.，2005)、动脉组织(Kadner et al.，2004)、或其他衬组织(如羊膜(Phan et al.，2004))。
详细分析揭示，所述方案要么这样要么那样受限于所得细胞的特性，或所分离细胞数方面的成功率和效率相当不确定。实际上，这些方案的限制性特点必然导致所分离细胞群的表型多样性的丧失，主要由于不必要的聚焦于脐带组织结构内的特定组织或几何位置。而且，最终可得到的实际干细胞数必然不确定。
因此，例如细胞研究公司提出方案，其仅基于羊膜为间质干细胞来源，衍化出的细胞已保藏为内皮细胞系(Phan et al.，2004)。
此外，至今所报道的方法中尚无表现出成功的经处理组织样品数方面的效力，以足以可靠应用于细胞治疗方案。换言之，尽管从脐带基质分离间质细胞的成功率高于从脐带血(或甚至骨髓)分离间质细胞的成功率，但至今尚无方法保证经处理组织样品数方面的100％的分离成功率，以使最终结果足以稳健而用于细胞治疗(Deryl和Weiss，2008)。
而且，导入不必要的结构操作步骤(如提取脐带血管(Purchio etal.，1998；Mitchell et al.，2003；Davies et al.，2004；Wang et al.，2006)、机械浸渍(Seyda et al.，2006))使得已有方案难以标准化和重现，更无法保证用于细胞治疗的足够的细胞数。
而且，过度组织操作诱导不期望(如果期望保持前体细胞表型)的细胞分化(Gardner et al.，2000；Claes et al.，2002；Cullinane et al.，2003)。
基于脐带血管本身的方案也显示出局限性，这些方案涉及复杂的动脉或脐带静脉提取，并将间质干细胞的分化潜能限制于内皮下和内皮细胞系(Romanov et al.，2003；Auger et al.，2005；Kadner et al.，2004；Sarugaser et al.，2005)。
最后，不欠复杂的是基于脐带胶质(Wharton’s jelly)(WJ)为间质干细胞来源的方案。这些报道不一致，也缺乏应用方法学的定义和标准。因此，当Purchio et al.，1998、Mitchell et al.，2003、和Wanget al.，2006进行复杂且难以重现的最初血管提取，处理留存的组织用于细胞分离；Davies et al.，2004也移出脐带血管，但相比使用留存的组织，他们处理了仍连接在血管周围的组织用于细胞分离，丢弃了第一种方案。不仅如此，所有作者都异口同声地肯定他们的方案基于仅WJ(Purchio et al.，1998；Mitchell et al.，2003；Davies et al.，2004；Wang et al.，2006)。这些方法之间的差异无法分辨，且这两种方案中的既存组织的过度组织操作发掘队前体表型维持的期望的影响，并威胁到通常群分离和冷冻保存服务中分离的前体细胞的利用。
现有技术中明显漏掉了基于简单、稳健和确定的方案的方法，以使保证效力和效率的重现。只要间质干细胞可应用于细胞治疗，有必要向患者保证用于细胞分离的方法会提供治疗剂必要的质量和数量。既然至今现有技术所述的方案缺乏保证，预期本发明会缓解对具有上述特征的方法的需求。
发明概述
本发明旨在针对现有技术增添具有特定间质特征的从人脐带分离的前体细胞的筛选方法，所述方法基于通过特殊消化胶原(脐带基质(Wharton’s jelly)的支持物质)的筛选策略。
细胞释放无需初始组织的机械操作即发生，保证了原细胞表型完整，且保持细胞活力。本发明中所述“机械操作”指浸渍和/或破碎脐带的羊膜下、血管间、和血管周围区中的任意组织；及/或提取脐带血管；及/或任意其他可干扰稳定性，及由此干扰存在于脐带基质(Wharton’s jelly)中的表型和活力的机械作用，
除缺去机械操作外，导入三个独立的细胞回收解离阶段及沿过程的多个技术参数的优化使所述方法变得简单、稳健、在效力方面100％可靠，且在随着时间所得细胞数方面高效。结果，所述方法可应用于细胞治疗服务，及对分离所得间质干细胞的冷冻保存(用于将来使用)。
根据导入各参数后所得总细胞产量评估导入用于细胞分离的依次的三阶段过程和优化个技术特征(现有技术远未提及或以不确定的方式描述)的结果。总细胞产量对应于在液氮汽相中直接冷冻而未经历粘附和扩展/增殖期的小细胞部分，加上两组之前从组织消化随即的第一粘附筛选阶段和消化产物离心随即的第二粘附阶段分离的细胞。所述两组经历一个阶段的粘附和扩展/增殖，且一旦对应的培养物在任何传代(P0末)前达到最大汇合率就冷冻。
本发明中所述“传代(P)”指：由于粘附细胞在确定的生长培养基中扩展/增殖，为同时增加粘附和扩展表面、及生长培养基的总体积，通过在粘附细胞达到在生长表面接近100％的汇合率(细胞密度)后，用胰蛋白酶消化所述粘附细胞来进行重接种，以启动新的扩展/增殖期。
本发明中所述“最大汇合率”指培养支持物的生长表面被单层细胞均匀覆盖。
包括三阶段方法的3个依次的回收阶段是：
阶段1：在消化溶液仍存在的情况下回收能够粘附于细胞培养瓶表面的第一组细胞，在所述细胞培养瓶中进行消化反应。
阶段2：从消化溶液的离心回收能够在由上清和培养基组成的溶液中粘附于另一细胞培养瓶表面的第二组细胞。
阶段3：从通过离心阶段2所得沉淀中回收第三组细胞。所述细胞无需粘附和扩展/增殖而直接冷冻。
所优化的技术参数是：
1.消化溶液中的待用初始组织条段尺寸，保持组织质量(g)、瓶底表面积(cm2)、消化体积(ml)、和总瓶体积(ml)之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例，考虑到1cm人脐带条段的重量约1g。在除去羊膜后，测试了几种类型的分段方法：低(5cm条段)、中(2.5cm条段)、高(0.3cm条段)、和组织糜。在解剖刀的辅助下进行全部分段，并用实际上同一条件处理样品。得出，当使用2.5cm条段时得到最佳产量(在P0末的总细胞/脐带质量/时间方面)。
2.组织血管(1个静脉和2个动脉)内血块的有无：已知红细胞裂解有毒性，降低细胞的体外活力。因此，在进行消化时，在有无血块的情况下比较了细胞产量。对于后者，用解剖刀在血管中纵切，以制作待去除所述块的孔。得出，血块对总细胞产量具有负面影响。
3.酶的性质、浓度和在组织消化步骤中使用的酶的单独或组合作用：在培养基存在下，细胞直接粘附于培养瓶，无消化，且因此在缺少酶的情况下；用单种酶解离组织：测试了0.075％(w/v)胶原酶II或2.0％(w/v)链霉蛋白酶。因为仅利用胶原酶II是最有效的方法，就将此酶与其他酶组合，尤其与0.125％(w/v)胰蛋白酶(在有无0.260mM EDTA的情况下)组合、与仅0.5％(w/v)透明质酸酶组合、且与0.5％(w/v)透明质酸酶和2.0％(w/v)链霉蛋白酶的组合组合。通过0.075％(w/v)胶原酶II与0.125％(w/v)胰蛋白酶的组合作用得到最佳产量(在P0末的总细胞/脐带质量/时间方面)。此外，当改变胶原酶II的浓度(0.0375％、0.075％和0.15％w/v)时，保持胰蛋白酶浓度0.125％(w/v)，在0.260mM EDTA的存在下，证实，0.075％(w/v)的胶原酶II浓度提供最佳结果，保持之前优化的条件恒定。
4.消化溶液的成分：测试了几种酶消化溶液的成分，即补充有20％ FBS和1％青霉素/链霉素的α-Mem；补充有EDTA(更具体为186mg/ml CaCl2·2H2O、400mg/ml KCl、60mg/ml KH2PO4、200mg/mlMgSO4·7H2O、8000mg/ml NaCl、350mg/ml NaHCO3、90mg/mlNaH2PO4·7H2O、1000mg/ml葡萄糖和76mg/ml(0.260mM)EDTA)的盐缓冲溶液(如HBSS)；补充有5mM CaCl2的前述HBSS溶液；补充有5mM CaCl2的25mM HEPES缓冲液。补充有0.260mM EDTA的盐缓冲溶液(HBSS)产生最佳产量。
5.监控消化反应期间pH变化：随着消化过程监控pH，观察到培养基的酸化。平均情况为，当使用0.075％(w/v)的胶原酶II与0.125％(w/v)胰蛋白酶的组合作用时，在补充有0.260mM EDTA的汉克斯盐溶液(HBSS)中，初始pH为7.2，在4小时温育后降低至6.4，在16小时后降低至5.9。培养基酸化可解释为在长期培养(16小时)中细胞分离缺乏效率。尽管长期培养后消化会更完全，但培养基酸化会开始有害于细胞活力。溶液pH因此被考虑为计算温育时间时的参数，且决不能低于6.4，此pH以下将有害于所述方法的有效性(如通过对可分离的活细胞的计数所确定)。尽管在16小时时观察到更完全的消化，发现更长的时间对细胞活力具有负面影响，并导致培养基显著酸化。
6.消化反应的温育时期/时间：测试了几个温育时间(2小时、4小时、6小时、和16小时)。得出，4小时温育时间产生最佳产量。
7.消化反应温育期间的振荡类型(温和或剧烈)：用温和或剧烈振荡速率定轨振荡水浴来进行温育，所述振荡速率分别由100振荡/分钟(opm)和140振荡/分钟(opm)组成。100opm的温和振荡导致在细胞产量方面更佳的结果。
8.酶消化的温育气氛(干或湿)：于37℃在两种环境下进行温育：干或湿。为此测试，在浸渍的定轨振荡器(其中热交换通过水和饱和空气发生)中或在干室(其中热交换通过干空气发生)中平行处理组织样品。在干室中温育导致更佳的细胞产量。
9.在经历一个阶段粘附和扩展/增殖后细胞冷冻保存效率中细胞密度的影响：在P0末，在液氮汽相中以不同密度(细胞/ml)，在由10％二甲基亚砜(DMSO)和90％胎牛血清(FBS)组成的溶液中冷冻1ml细胞悬液。测定了解冻后各条件下的细胞活力(活细胞/总细胞)和细胞恢复(解冻后计数的活细胞/冷冻保存前计数的活细胞)。所得结果显示3×106细胞/ml的细胞密度最可能保证冷冻保存后所测试条件下活细胞的适当保持和恢复。
一般而言，假定上述优化，本发明基于从人脐带分离细胞的筛选方法，其中各脐带的血被除去，并被运输到实验室含葡萄糖和抗生素的盐缓冲液中，始终在无菌环境中，如在48小时内处理，则优选在室温下。对于更长时间储存，则可推荐2℃～8℃之间的温度。
下列步骤(包括处理脐带及分离前体细胞)在无菌条件下，在竖通层流通风橱室(vertical flux laminar flow hood chamber)中进行。
首先，剥离羊膜，且用新盐溶液洗涤脐带，其中所述羊膜为衬结构，所述羊膜已在组织收集期间与空气接触，并因此更易被微生物污染。
一般而言，为分离期望前体细胞，所述方法始于以确定尺寸分段，所述尺寸源于优化的组织分段，其不涉及组织的机械操作，如可应用，包括任意提取除脐带内的血块之外的器官的内部结构。
从脐带组织释放细胞受针对脐带基质的酶消化促进，遵守组织质量(g)、附着组织消化瓶表面(cm2)、消化溶液体积(ml)、和消化瓶总体积(ml)之间已建立的约1∶2∶2∶37的比例关系；考虑1cm脐带条段平均重1g。
为用酶消化处理，使用酶的特定组合，以特定浓度，在确定组成的溶液中，在温育期间，以特定最小pH，及振荡类型和温育气氛也特选。
解离细胞的回收在3个阶段进行，其中第一阶段回收一组能够粘附于细胞培养瓶(在其中进行组织消化反应)表面的细胞。粘附在消化温育期过后随即发生，于室温下使瓶仍保持水平位置站立10～120分钟之间，优选30分钟。在第二阶段，在阶段1后，从消化溶液离心得到的上清中回收新的一组细胞。在阶段1和2中，将细胞在培养条件下温育，能够粘附于细胞培养瓶表面的细胞经历一个阶段的扩展/增殖至达到近100％的汇合率。最后在步骤3，从阶段2中离心得到的沉淀中回收一组细胞，并不经历任何轮的粘附和扩展/增殖而直接冷冻保存。
优化依次细胞回收及全部其他上述优化因素，由此所述方法在所选和所分离细胞数方面表现出100％效力和最高效率。反过来，得到的细胞群可通过细胞能够在表面和确定的生长培养基中粘附和扩展/增殖来鉴定，其中培养物中的大部分细胞表达细胞表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105，且大部分细胞表现出细胞表面标记物CD14、CD31、CD34和CD45的仅残量表达，其中大部分细胞能够经历至18次扩展/增殖期，保持约1.7/24小时的恒定的翻倍因数，恒定的成纤维细胞样形态，及部分或终端分化为特定细胞(如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经胶质细胞)的能力。
此外，本发明涉及用于经历一轮粘附和扩展/增殖的细胞的冷冻保存的细胞密度(细胞/体积)的优化，以有助于最大化将来使用的细胞活力方面的效率。
用新方法可在直接冷冻细胞条段后，且在两次独立的离体粘附和扩展/增殖期后(P0末)，在9天内，从每脐带样品中得到相比现有技术空前的约8.6(±0.1)×105细胞/克脐带的产量。所述效力代表可从一个脐带(回收后平均35cm长，约35g)得到共3.0×109细胞的可能性。相反，因为所分离的间质干细胞一般表现出1.7/24小时的翻倍因数，在具有175cm2的生长表面的细胞培养瓶中的7轮(6次传代，P6)粘附和扩展/增殖期间，使用5.0×105细胞/cm2恒定接种物，可在35天内得到平均7.7×1015细胞。这代表用现有技术中所述相似流程得到相同细胞数所需时间减少约56％，其中为用相同的5.0×105细胞/cm2的初始接种物达到相同细胞数，需要80天(Harris et al.，2006；Canand Karahuseyinoglu，2007)。
尽管新方法被开发主要用于细胞治疗方案，但其也适于其他方面，例如：细胞储蓄、基因治疗方案、药物和化妆组合物、分子或分子化合物的生产、细胞培养支持用细胞层的生产、及通过基因操作的细胞系生产。
附图简述
图1：脐带基质衍生细胞的流式细胞术结果。细胞用连接于PE或FITC的抗CD44(97％阳性细胞)、CD73(99％阳性细胞)、CD90(97％阳性细胞)和CD105(95％阳性细胞)(均为间质基底细胞的阳性标记物)的抗体进行免疫标记。
图2：脐带基质衍生细胞的流式细胞术结果。细胞用连接于PE或FITC的抗已知为间质细胞系的阴性标记物的抗原(CD14(单核细胞系(＜1％阳性细胞))、CD34(特异于造血细胞系(1.2％阳性细胞))、CD31(内皮标记物(1％阳性细胞))和CD45(全白细胞标记物(1.1％阳性细胞)))的抗体进行免疫标记。
图3：细胞密度对细胞粘附和扩展/增殖后细胞冷冻保存效率的影响：
A：不同细胞密度的解冻后活力(活细胞/总细胞×100％)。
B：细胞恢复(解冻后回收的活细胞/初始冷冻活细胞数)。
用3×106细胞/ml的细胞密度得到所测条件(含1ml细胞悬液和0.5ml液上空间的1.5ml无菌冷冻管)的最佳结果。
图4：体外扩展解冻细胞。所观察到的翻倍因数是1.7/24小时，近似于这些细胞冷冻保存前的翻倍因数。在解冻后36小时观察到80～90％的汇合率(24小时后更换培养基)：A：解冻后12小时(培养基更换前)的前体细胞。B：解冻后36小时的前体细胞(24小时后进行培养基更换)。标尺：100μm。
图5：分离的前体细胞分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。
A：正常生长培养基中对照细胞(非分化细胞)的细胞形态。
B：成骨分化：将细胞接种于成骨分化培养基中，并保持3周，后用碱性磷酸酶染色。
C：脂肪形成分化：将脂肪形成分化培养基加于完全汇合的细胞培养物上，且保持细胞3周，后用油-O-红染色。
D：软骨形成分化：将细胞重悬，并在离心管中的软骨形成分化培养基中保持4周。
然后将细胞用阿辛蓝和苏木精染色。标尺：100μm。
图6：分离的前体细胞分化为心肌细胞。
A：正常生长培养基(补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的α-MEM)中对照细胞(非分化细胞)的细胞形态。
B：心肌形成分化后的细胞形态。
C：用DAPI和抗肌钙蛋白T(心肌细胞特异性标记物)的抗体标记的对照细胞(非分化细胞)。仅观察到DAPI标记的核。
D：用DAPI和抗肌钙蛋白T的抗体标记的分化细胞。可兼观察到DAPI标记的核和肌钙蛋白T标记的细胞骨架。
图7：分离的前体细胞分化为神经胶质细胞/神经细胞。
A：正常生长培养基(补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的α-MEM)中对照细胞(非分化细胞)的细胞形态。
B：神经胶质/神经分化后的细胞形态。
C：用DAPI和抗β-微管蛋白III(特异性神经元蛋白)抗体标记的对照细胞(非分化细胞)。仅观察到DAPI标记的核。
D：用DAPI和抗β-微管蛋白III抗体标记的分化细胞。可兼观察到DAPI标记的核和β-微管蛋白III标记的细胞骨架。
发明详述
在应用所述方法前，应从血中分离人脐带，并于以下温度在无菌闭合的受体中运输至实验室设备，
●所述温度为：
■如果在收集后72小时的时期内处理，则优选为室温，或
■如果在收集后48～144小时的时期内处理，则为2～8℃，优选为4℃；
●所述收集为不用或优选用无菌盐溶液收集，所述盐溶液如HBSS；
●所述无菌闭合的受体是：
■干燥的，或
■优选被浸入含以下成分的无菌溶液中：186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、2000μg/ml葡萄糖、及青霉素和链霉素的1％等摩尔混合物；
所述盐溶液可补充有营养物和抗生素，例如1g/l葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
所述方法应在无菌环境中进行，所述无菌环境如层流通风橱内。用汉克斯盐缓冲溶液(HBSS)洗涤脐带3次，并在无菌镊子的辅助下去除脐带周围的羊膜。
然后在解剖刀的辅助下将所述脐带横向分段为约2.5cm的条段。考虑到人脐带的平均密度(接近1g/cm)，各条段对应约2.5g的组织。
如果这些条段中存在血块，则应在解剖刀的辅助下去除。在下列步骤中，各自处理各组7个2.5g无血块的条段。
通过解离各组7个条段来得到细胞，所述解离在无菌且密封的含缓冲pH的消化溶液的瓶中，通过浓度0.075％(重量/总消化体积)的胶原酶II与浓度0.125％(重量/总消化体积)的胰蛋白酶的组合作用来进行，保持组织质量、瓶底表面积、消化体积、和总瓶体积之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例，且其中所述瓶在确定的温育时间、温度、加热环境、环境湿度和搅拌条件下温育；
更具体地，
●从一组7个各约2.5cm(2.5g)的脐带条段开始，从血块中游离出；
●使用35ml的消化溶液体积；
●在不通气且闭合的培养瓶中，所述不通气且闭合的培养瓶如总体积650ml的T175，且消化期间615ml的液上空间减去消化物下7个条段的浸没体积；
●其中所述消化溶液除酶外，由下列成分组成：186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、1000μg/ml葡萄糖、和76μg/ml(0.260mM)EDTA；
●保持pH为6.4或更高；且
●其中所述酶反应于37℃恒定温度下在闭合干燥的温育箱中在100振荡/分钟(opm)的恒定速率搅拌下温育4小时。
以三个阶段(三阶段法)进行从组织解离得到的细胞的回收。
在第一阶段，从解离组织回收细胞，更具体通过于室温下在发生消化的瓶中静置水平温育5～300分钟(优选30分钟)的时间来回收细胞。将消化上清通过用移液器移溶液来转移到50ml离心管中，避免吸出任何未消化组织。除去全部未消化组织。这里，向所述消化瓶中加入35ml体积的补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基。所述不通气的瓶盖替换为含通气盖的滤膜，并于37℃下在含7％CO2的湿润气氛中温育。应每72小时更换总培养基，以促进水平温育期(筛选期)间粘附的细胞生长，至达到最大表面汇合率。
在第二回收阶段，通过于室温下对所述50ml离心管中的消化上清以350g离心10分钟来回收细胞。在离心后，将35ml上清转移到具有含通气盖的滤膜的静置培养瓶(T175)；并加入35ml补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基。于37℃下在含7％ CO2的湿润气氛中温育所述培养瓶，每72小时更换总培养基，以促进粘附和扩展/增殖，至达到最大表面汇合率。
从第一和第二阶段回收的细胞群在第一轮粘附和扩展/增殖(P0末)后冷冻保存。这在于直接在0.5ml含期望总细胞数的细胞悬液与相同体积的含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷冻，以在1.5ml无菌冷冻管(因此含1.0ml细胞悬液和0.5ml液上空间)中得到约3×106细胞/ml的终浓度。
第三且最后阶段的细胞回收在于直接冷冻保存由之前所述的消化上清离心得到的细胞沉淀，将所述细胞沉淀重悬于2ml由含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)组成的溶液中，用控速冷冻器以1℃/分钟的温度下降速度在2.5ml含2ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中冷冻至-80℃。
可根据需要通过在37℃水浴中快速解冻来恢复冷冻保存的细胞，然后将细胞于相同温度下，以1∶10的稀释倍数重悬于培养基中。可用5.0×103细胞/cm2～2.0×104细胞/cm2之间的免疫接种密度进行随后的扩展循环，每72小时更换总培养基。细胞一般表现出1.7/24小时的翻倍因数。
实施例
实施例1：优化机械操作和条段尺寸的类型和量
优化了机械操作类型和初始组织片段的尺寸，保持组织质量(g)、消化瓶底表面积(cm2)、消化体积(ml)、和总瓶体积(ml)之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例，考虑1cm人脐带条段重约1g。在除去羊膜后，测试了几种类型的脐带分段：低(5cm条段)；中(2.5cm条段)；高(0.3cm条段)；及组织糜。所有分段均在解剖刀的辅助下进行，并用实质相同的条件处理样品。得出，当使用2.5cm条段时，得到在P0末总细胞/脐带质量/时间方面的最佳产量。表1总结了得到的定量结果。
表1：分段优化：细胞产量
  低(5cm)   中(2.5cm)   高(0.3cm)   组织糜
  +   ++   +   -
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例2：有关脐带血管(1个静脉和2个动脉)内有无血块的优 化
已知红细胞裂解有毒性，降低细胞体外活力。因此，比较了在有无血块的情况下进行消化时的细胞产量。对于后一实验，在解剖刀的辅助下除去血块。得出，血块对P0末总细胞/脐带质量/时间方面的产量具有负面作用。表2总结了所得定量结果。
表2：血块：对细胞产量的影响
  有   无
  -   ++
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例3：有关消化溶液中的酶性质、单独或组合的酶作用、及 酶浓度的优化
为最大化具有期望特征的分离自初始组织的细胞数方面的产量，有关酶消化采用了两个初始方法：在存在培养基、无消化，因此缺乏酶的情况下细胞直接粘附到培养瓶，并用单个酶：0.075％(w/v)胶原酶II或2.0％(w/v)链霉蛋白酶解离组织。
由于仅利用胶原酶II是最有效的方法，就将此酶与其他酶组合，尤其是与0.125％(w/v)胰蛋白酶(在有无0.260mM EDTA的情况下)组合、与仅0.5％(w/v)透明质酸酶组合、且与0.5％(w/v)透明质酸酶和2.0％(w/v)链霉蛋白酶的组合组合。
为此测试，使用了优化的2.5cm的条段尺寸，且保持了组织质量(g)、瓶底表面积(cm2)、消化体积(ml)、和总瓶体积(ml)之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例。
结果显示，通过0.075％(w/v)胶原酶II与0.125％(w/v)胰蛋白酶的组合作用得到在P0末总细胞/脐带质量/时间方面的最佳产量。此外，当改变胶原酶II的浓度(0.0375％、0.075％和0.15％w/v)时，保持胰蛋白酶浓度0.125％(w/v)，在0.260mM EDTA的存在下，证实，0.075％(w/v)的胶原酶II浓度提供最佳结果，表3定量总结了这些结果。
表3：酶性质、组合作用和浓度：对细胞产量的影响。
无酶   链霉蛋白酶(2.0％)   Col II(0.0375％)   Col II(0.075％)   Col II(0.150％)
  无酶   0   --   -   +   --
  胰蛋白酶(0.125％)   X   X   +   +   --
  胰蛋白酶(0.125％)+EDTA(0.260mM) X X X ++ X
  透明质酸酶(0.5％)   X   X   X   +   X
无酶   链霉蛋白酶(2.0％)   Col II(0.0375％)   Col II(0.075％)   Col II(0.150％)
  链霉蛋白酶(2.0％)+透明质酸酶(0.5％) X X X + X
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例4：酶溶液的化学成分的优化
测试了几种酶消化溶液的成分，即补充有20％ FBS和1％青霉素/链霉素的α-Mem；补充有EDTA(更具体为186mg/ml CaCl2·2H2O、400mg/ml KCl、60mg/ml KH2PO4、200mg/ml MgSO4·7H2O、8000mg/mlNaCl、350mg/ml NaHCO3、90mg/ml NaH2PO4·7H2O、1000mg/ml葡萄糖和76mg/ml(0.260mM)EDTA)的盐缓冲溶液(如HBSS)；补充有5mM CaCl2的前述HBSS溶液；补充有5mM CaCl2的25mMHEPES缓冲液。
为此测试，保持之前优化的条件，即由0.075％(w/v)胶原酶II与0.125％(w/v)胰蛋白酶组成的酶组合。
补充有0.260mM EDTA的盐缓冲溶液(HBSS)得到最佳结果。
表4：酶溶液的成分：对细胞产量的影响。
  α-Mem+20％FBS+1％青霉素/链霉素   HBSS+0.26mM EDTA   HBSS+5mM CaCl2   25mMHEPES+5mM CaCl2
  Col II(0.075％)+胰蛋白酶(0.125％) -- ++   - +
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例5：酶消化温育时间和pH变化的优化
测试了几个温育时间(2小时、4小时、6小时、和16小时)。从所得结果来看，最佳温育时间是4小时。尽管在16小时时观察到更完全的消化，发现更长时间对细胞活力有负面影响，导致培养基显著酸化。表5定量总结了所得结果。
表5：温育时间和酶消化溶液的pH：对细胞产量的影响。
  2小时   4小时   6小时   16小时
  HBSS中Col II(0.075％)+胰蛋白酶(0.125％)+0.26mM EDTA +(pH 6.9) ++(pH 6.4)   -(pH 6.1) +(pH 5.9)
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例6：消化期间振荡模式(温和对剧烈)的优化
在定轨振荡水浴中用温和(100opm)或剧烈(140opm)振荡速率进行了酶消化溶液的温育。100opm的温和振荡得到细胞产量方面最佳的结果。表6定量总结了所得结果。
表6：振荡速率：对细胞产量的影响。
  100opm   140opm
  ++   +
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例7：酶消化期间温育气氛的优化(干对湿)
于37℃在两种环境下进行酶消化溶液的温育：干或湿。为此测试，在浸渍的定轨振荡器(其中热交换通过水和饱和空气发生)中或在干室(其中热交换通过干空气发生)中平行处理组织样品。在干室中温育导致更佳的细胞产量。表7定量总结了所得结果。
表7：温育环境：对细胞产量的影响。
  水浴   干室
  ++   +++
注释：+++＝优，++＝甚良，+＝良，-＝合理，--＝差，0＝不成功
实施例8：冷冻保存期间的细胞密度的优化
为评估细胞密度对冷冻保存后细胞恢复的影响，将细胞于P1末，在含0.5ml细胞悬液和相同体积的由FBS(90％)和DMSO(10％)组成的溶液的1.5ml冷冻管中，以跨1×106细胞/ml和10×106细胞/ml之间的不同密度，在液氮汽相中冷冻。
将细胞冷冻保存至少30天，然后通过将所述冷冻管置于保持在37℃的水浴中来解冻。将解冻的细胞重悬于之前加热至37℃的10ml培养基中。对总细胞和活细胞进行计数，并随后以1∶10的稀释倍数接种于组织培养瓶(NUNC)中。
24小时后，将所述培养基更换为新鲜培养基，并如上所述保持细胞。
为测定最佳细胞冷冻保存密度，测定了各条件下的解冻后细胞活力(活细胞/总细胞)和细胞恢复(解冻后计数的活细胞/冷冻保存前计数的活细胞)。所得结果显示，3×106细胞/ml的细胞密度最可能保证冷冻保存后所测试条件下活细胞的适当保持和恢复(含1ml细胞悬液和0.5ml液上空间的1.5ml冷冻管)。
监控了解冻后细胞的体外扩展能力。细胞一般表现出1.7翻倍/天的翻倍因数，类似于冷冻保存前观察到的值(图4)。
实施例9：使用所建立的方法从人脐带分离前体细胞
获得伦理委员会收集脐带的指示的批准及产妇的知情同意后，于生产后收集多个脐带。从胎盘分离脐带，去掉血，并在含无菌盐溶液(补充有营养素和抗生素(例如1g/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的HBSS)的无菌闭合的瓶中运输至实验室设备。
运输至所述设备在室温下进行。所述方法在层流通风橱内的无菌环境中进行。
用汉克斯盐缓冲溶液(HBSS)洗涤各脐带3次，用无菌镊子除去围绕脐带的羊膜。
然后将各脐带在解剖刀的辅助下横向分段为2.5cm条段。考虑到人脐带的平均线性密度(1g/cm)，各条段对应约2.5g组织。这些条段中，在解剖刀的辅助下除去确定的血块。各自处理各组7个2.5g的无血块的条段。
通过解离各组7个条段来得到细胞，所述解离在无菌且密封的含缓冲pH的消化溶液的瓶中，通过浓度0.075％(重量/总消化体积)的胶原酶II与浓度0.125％(重量/总消化体积)的胰蛋白酶的组合作用来进行，保持组织质量、瓶底表面积、消化体积、和总瓶体积之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例。所述瓶在确定的时间、温度、加热环境、环境湿度和搅拌条件下温育；
更具体地，
●从一组7个各约2.5g的脐带条段开始，从血块中游离出；
●使用35ml的消化溶液体积；
●在不通气且闭合的培养瓶中，所述不通气且闭合的培养瓶如总体积650ml的T175，且消化期间615ml的液上空间减去消化物下7个条段的浸没体积；
●其中所述消化溶液除酶外，由下列成分组成：186mg/mlCaCl2·2H2O、400mg/ml KCl、60mg/ml KH2PO4、200mg/mlMgSO4·7H2O、8000mg/ml NaCl、350mg/ml NaHCO3、90mg/mlNaH2PO4·7H2O、1000mg/ml葡萄糖、和76mg/ml(0.260mM)EDTA；
●保持pH为6.4或更高。
其中所述酶反应于37℃恒定温度下在闭合干燥的温育箱中在100振荡/分钟(opm)的恒定速率搅拌下温育4小时。
以三个阶段进行从组织解离得到的细胞的回收。
在第一阶段，从解离组织回收细胞，更具体通过于室温下在发生消化的瓶中静置水平温育5～300分钟(优选30分钟)的时间来回收细胞。将消化上清通过用移液器移溶液来转移到50ml离心管中，避免吸出任何未消化组织。除去全部未消化组织。这里，向所述消化瓶中加入35ml体积的补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基。所述不通气的瓶盖替换为含通气盖的滤膜，并于37℃下在含7％ CO2的湿润气氛中温育。应每72小时更换总培养基7天，以促进水平温育期间粘附的细胞生长，至达到最大表面汇合率。
在第二回收阶段，通过于室温下对所述50ml离心管以350g离心10分钟来回收细胞，并在离心后，将35ml上清体积转移到具有含通气盖的滤膜的静置培养瓶(如T175)；向所述培养瓶中加入35ml补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基；于37℃下在含7％ CO2的湿润气氛中温育所述培养瓶，每72小时更换总培养基，以促进粘附和扩展/增殖，至达到最大表面汇合率。
从第一和第二阶段回收的细胞群在第一轮扩展循环末(P0末)冷冻保存。这在于直接在0.5ml含期望总细胞数的细胞悬液与相同体积的含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷冻，以在1.5ml无菌冷冻管(含1.0ml细胞悬液和0.5ml液上空间)中得到约3×106细胞/ml的终浓度。
第三且最后阶段的从解离组织的细胞回收在于直接冷冻保存通过消化上清离心得到的细胞沉淀，将所述细胞沉淀重悬于2ml由含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)组成的溶液中，用控速冷冻器以1℃/分钟的温度下降速度在2.5ml含2ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中冷冻至-80℃。
31天后，通过在37℃水浴中快速解冻来恢复冷冻保存的细胞。然后于相同温度，以1∶10的稀释倍数将细胞重悬于培养基中。可用5.0×103细胞/cm2～2.0×104细胞/cm2之间的免疫接种密度进行随后的扩展步骤，每72小时更换总培养基。细胞一般表现出1.7翻倍/天的生长速率18次传代。
实施例10：分离的前体细胞的间质表型的确定
除在前体间质细胞用选择培养基中粘附和增殖的能力外，还通过流式细胞术表征了分离的细胞的P1末。
当细胞在P1末达到80％～90％的汇合率，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液(无Ca2+和Mg2+)的洗涤细胞表面。加入0.25％的胰蛋白酶，且细胞一离开瓶表面就加入2体积的培养基。然后将细胞悬液以350g离心10分钟，除去上清。将含细胞的沉淀重悬于阻断溶液(含0.2％ BSA的dPBS)中，至达到2×106细胞/ml～10×106细胞/ml之间的终细胞浓度。于室温下温育10分钟后，将100μl细胞悬液加入各含缀合荧光标记物(藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC))的第一抗体的管中。振荡细胞悬液，并在冰中避光温育20～40分钟。此过程后，将1.5ml dPBS加入各管中，重悬细胞，并以350g离心5分钟。除去上清，将含细胞的沉淀重悬于500μl1％的多聚甲醛中。
将细胞悬液储存于4℃待用。在BD Biosciences公司的FACScalibur中进行流式细胞术，检测CD44、CD73、CD90和CD105表面抗原作为间质细胞的阳性标记物。为此，使用了缀合FITC或PE的第一抗体(图1)。研究了阴性标记物CD14、CD31、CD34和CD45表便抗原的存在情况。这些特异于造血细胞(CD34)、单核细胞(CD14)、内皮细胞(CD31)和全白细胞(CD45)系，且所有这些抗体均缀合FITC(图2)。如预期，绝大部分分离的间质细胞呈CD44、CD73、CD90和CD105阳性，及呈对所述阴性标记物阴性或残量阳性。
实施例11：分离的细胞的前体表型的证实：骨形成分化
根据本发明详述，从人脐带条段中分离的前体细胞表现出分化为不同特化的细胞类型的能力。在此实施例中，证实了这些细胞分化为成骨细胞的能力。
将细胞于P3以2.0×104细胞/cm2的密度接种于含补充有10％胎牛血清(FBS)、10mM β-甘油磷酸、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、100nM地塞米松的α-Mem基础培养基(含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和超谷氨酰胺)的骨形成分化培养基中(Hung et al.，2002)。
每周更换整个培养基3周，此后进行使用茜素红和碱性磷酸酶的特异性染色步骤，两种染色均呈阳性。对于茜素红染色，从组织培养瓶中小心吸出培养基，并于室温下用4％的多聚甲醛固定细胞10分钟。
用PBS洗涤细胞，并用特异性染色溶液(茜素红S，40mM，pH4.2)于室温下温育15分钟。除去茜素红S溶液，并用水小心洗涤细胞(Kotobuki et al.，2006)。
在碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)测试中，也于室温下用4％的多聚甲醛固定细胞10分钟。然后用PBS洗涤细胞，并浸于2.5ml柠檬酸溶液中温育30秒钟。
然后除去柠檬酸溶液，并用去离子水(milliQ)洗涤细胞，并用染色溶液(中性红)温育2分钟。然后除去所述溶液，用水小心洗涤细胞(Shim，et al.，2004)。测试对于骨形成分化为阳性(图5)。
实施例12：分离的细胞的前体表型的证实：脂肪形成分化
为将细胞分化为脂肪细胞，将细胞于P3以2.0×104细胞/cm2的密度铺种于含补充有10％ FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-Mem基础培养基(含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和超谷氨酰胺)中，并在此培养基中保持。当汇合时，将所述培养基更换为由含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml胰岛素、200μM吲哚美辛、0.5mM异丁基-1-甲基黄嘌呤和1μM地塞米松的DMEM-LG组成的脂肪形成分化培养基(Shih et al.，2005)。
3周间每周更换2次整个培养基，此后进行使用油红O的特异性染色测定，并证实了脂肪形成分化。为此，从组织培养瓶(NUNC)中通过吸液小心移除培养基，并于室温下用4％的多聚甲醛固定细胞10分钟。用PBS洗涤细胞，并于室温下与经过滤的油红O溶液(2∶3)温育至少10分钟。然后除去油红O溶液，并用水小心洗涤细胞(Do，et al.，2006)。测试对于脂肪形成分化为阳性(图5)。
实施例13：分离的细胞的前体表型的证实：软骨形成分化
对于软骨形成分化，重悬细胞至1.1×106细胞/ml的终密度，并置于15ml的圆锥形管中，以形成软骨球。所用培养基是由含1％ FBS、6.25μg/ml胰岛素、10ng/mlTGFβ1和50μM抗坏血酸-2-磷酸酯的DMEM-LG组成的软骨形成分化培养基(Shih et al.，2005)。
每周特别小心更换(以不干扰软骨球)整个培养基2次4周，此后，用阿辛蓝和苏木精进行特异性染色测定，并证实了软骨形成分化。为此，通过吸液从管中移除整个培养基，并用PBS洗涤软骨球。然后将软骨球浸于琼脂中，并在液氮汽相中冷冻。
在切片机的辅助下，将琼脂切成5μm厚的组织切片。将这些切片于室温下用1％阿辛蓝温育5分钟，并用PBS洗涤。将固定于显微镜载玻片上的制剂转移到苏木精溶液，并于室温下温育5分钟。通过最后一步洗涤步骤用PBS除去苏木精(Okada，et al.，2005)。测试结果对软骨形成分化呈阳性(图5)。
实施例14：分离的细胞的前体表型的证实：心肌形成分化
发生心肌形成分化18天，期间使用不同的培养基(Lee et al.，2004)。将细胞以3000细胞/cm2的密度铺种于包被鸟氨酸的16孔室玻片上。将细胞铺种于由补充有10％ FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-Mem基础培养基(含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和超谷氨酰胺)组成的培养基C0中。铺种后24小时，将培养基替换为由补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10ng/ml β-FGF和10μM 5-氮胞苷的DMEM-LG组成的另一培养基(培养基C1)。将细胞铺种于培养基C1中后24小时，进行第二次培养基替换至培养基C2。培养基C2由补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10ng/mlβ-FGF的DMEM-LG基础培养基组成。将细胞保持于培养基C2中2周，每72小时更换培养基。
平行地，将对照(非分化)细胞以5000细胞/cm2的密度铺种和保持于培养基0中。分化阶段后，用抗典型肌肉蛋白(心脏肌钙蛋白T，特异于心肌细胞)的第一抗体进行免疫荧光测定。为定位测定用细胞，用特异于核酸的荧光染料(DAPI)染色细胞核。如预期，仅经心肌形成分化步骤的细胞(已显示典型的心肌细胞形态)产生荧光信号(图6D)。
实施例15：分离的细胞的前体表型的证实：神经形成/神经胶质分 化
发生神经形成分化12天，期间使用不同的培养基(Lee et al.，2004)。将细胞以3000细胞/cm2的密度铺种于包被鸟氨酸的16孔室玻片上。将细胞铺种于由补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、5ng/mlβ-FGF、0.5μM视黄酸和1mM 2-巯基乙醇的IMDM基础培养基组成的培养基(培养基N1)中。
铺种3天后，将培养基N1替换为含补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM环腺苷酸(cAMP)和100μM抗坏血酸-2-磷酸酯的IMDM基础培养基的培养基N2。
铺种3天后，将培养基N2替换为含补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM环腺苷酸(cAMP)和10μM氢化可的松的IMDM基础培养基的培养基N3。
最后，铺种3天后，将培养基N3替换为含补充有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、20ng/ml FGF-1、10ng/ml SHH、10ng/ml NGF、25ng/ml玻连蛋白、100μM抗坏血酸-2-磷酸酯、100μM异丁基甲基黄嘌呤、10μM福司柯林和20nM PMA的IMDM基础培养基的培养基N4。
平行地，将对照(非分化)细胞以5000细胞/cm2的密度铺种和保持于培养基N0中(见心肌形成分化步骤)。
分化阶段后，用抗β-微管蛋白(III型，特异于神经细胞)的第一抗体免疫荧光测定。为定位测定用细胞，将细胞核用特异于核酸的荧光染料(DAPI)染色细胞核。如预期，仅经神经形成/神经胶质分化步骤的细胞(已显示出典型的神经胶质形态(图7B))产生荧光信号(图7D)。
参考文献
Auger F.A.，Germain L.，Remy-Zolghadri M.and C.J.Hayward(2005).Method of isolating cells from umbilical cord.WO2005001081.
Barry F.P.and J.M.Murphy(2004)Mesenchymal stem cells：clinical applications and biological characterization.Int.J.Biochem.& Cell Biol.36：568-584.
Can A.and S.Karahuseyinoglu(2007).Concise review：humanumbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stemcells.Stem Cells(on line - www.StemCells.com)；DOI：10.1634/stemcells.2007-0417.
Carvalhal A.V.，Lima，C.，Basto V.，Cunha C.，Escada P.，Cruz P.and H.Cruz(2007).Adult human neuronal stem/progenitor cells fromthe olfactory epithelium and olfactory lamina propria，isolationmethod，proliferation and differentiation in serum free culturemedium and utilization for transplantation.WO2007020611.
Claes L.，Eckert-Hubner K.and P.Augat(2002).The effect ofmechanical stability on local vascularization and tissue differentiationin callus healing.J.Orthop.Res.20：255-266.
Cullinane D.M.，Salisbury K.T.，Alkhiary Y.，Eisenberg S.，Gerstenfield L.and T.A.Einhorn(2003).Effects of local mechanicalenvironment on vertebrate tissue differentiation during repair：doesrepair recapitulate development？J.Exp.Biol.206：2459-2471.
Chul-Won H.A.，Yoon-Sun Y.and Y.Sung-Eun(2003)Isolationand culture-expansion methods of mesenchymal stem/progenitor cellsfrom umbilical cord blood，and differentiation method of umbilicalcord blood-derived mesenchymal stem/progenitor into variousmesenchymal tissues.WO 03070922.
Davies J.E.，Dolores B.，Raúl S.，Morris H.and A.D.S.Lickorish(2004).Progenitor cells from Wharton’s jelly of humanumbilical cord.WO2004072273.
Deryl L.T.and M.L.Weiss(2008).Concise review：Wharton’sjelly-derived cells are a primitive stromal cell population.Stem Cells，26：591-599.
Do M.，Jeong H.，Choi B.，Hunter L.，Langley S.，Pazmany L.andP.Trayhurn(2006).Inflammatory gene expression patterns revealedby DNA microarray ahalysis in TNF- -treated SGBS humanadipocytes.Yonsei Medical Journal，Vol.47，No5，729-736.
Gardner T.N.，Stoll T.，Marks L.，Mishra S.and M.K.Tate(2000).The influence of mechanical stimulus on the pattern of tissuedifferentiation in a long bone fracture -a FEM study.J.Biomech.33：415-425.
Harris I.R.，Messina D.J.，Kihm A.and A.Seyda(2006).
Postpartum cells derived from umbilical cord tissue，and methods ofmaking and using the same.WO2006/071794.
Hung S.-C.，Chen N.-J.，Hsieh S.-L.，Li H.，Ma H.-L.and W.-H.Lo(2002).Isolation and Characterization of Size-Sieved Stem Cellsfrom Human Bone Marrow.Stem Cells 20：249-258
Kadner A.，Zund G.，Maurus C.，Breymann C.，Yakarisik S.，Kadner G.，Turina M.and S.P.Hoerstrup(2004).Human umbilicalcord cells for cardiovascular tissue engineering：a comparative study.European Journal of Cardio-Thoracic Surgery 25：635-641.
Kotobuki N.，Kawagoe D.，Nomura D.，Katou Y.，Muraki K.，Fujimori H.，Goto S.，Ioku K.and H.Ohgushi(2006).Observationand quantitative analysis of rat bone marrow stromal cells cultured invitro on newly formed transparentβ-tricalcium phosphate.J.Mat.Sci.：Mat.Med.17：33-41.
Lee O.K.，Kuo T.K.，Chen W.M.，Lee K.D.，Hsieh S.L.and T.H.Chen(2004).Isolation of multipontent mesenchymal stem cellsfrom umbilical cord blood.Blood，103：1669-1675.
Majumdar M.K.，Thiede M.A.and J.D.Mosca(1998).Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derivedmesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cells.J.Cell Physiol176：57-66.
Mitchell K.E.，Weiss M.L.，Mitchell B.M.，Martin P.，Davis D.，Morales L.，Helwig B.，Beerenstrauch M.，Abou-Easa K.，Hildreth T.and D.Troyer(2003).Matrix cells from Wharton’s jelly form neuronsand glia.Stem Cells 21：50-60，2003.
Nanaev A.K.，Kohnen G.，Milovanov A.P.，Domogatsky S.P.and P.Kaufmann(1997).Stromal differentiation and architecture ofthe human umbilical cord.Placenta 18：53-64.
Okada A.，Shiomi T.，Aoki Y.and M.Fujiwara(2005).Phenytoinstimulates chondrogenic differentiation in mouse clonal chondrogenicEC cells，ATDC5.J.Toxicol.Sci.，Vol.30，No3，145-156.
Phan T.T.and I.J.Lim(2006).Isolation of stem/progenitor cellsfrom amniotic membrane of umbilical cord.WO2004019357.
Pittenger M.F.，Mackay A.M.and C.B.Beck(1999).Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science 284：143-147.
Purchio A.F.，Naughton B.A.and J.San Roman(1998).Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton’s jelly.WO199801779.
Roisen F.J.，Klueber K.M.，Lu C.L.，Hatcher L.M.，Dozier A.，Shields C.B.and S.Maguire(2001)Adult human olfactory stem cells.Brain Res.890：11-22.
Romanov Y.A.，Svintsitskaya V.A.and V.N.Smirnov(2003).Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymalstem cells：candidate MSC-lke cells from umbilical cord.Stem Cells21：105-110.
Seyda A.and A.Gosiewska(2006).Postpartum cells derived fromumbilical cord tissue，and methods of making，culturing，and using thesame.WO2006101548.
Shih D.T.-B.，Lee D.-C.，Chen S.-C.，Tsai R.-Y.，Huang C.-T.，Tsai C.-C.，Shen E.-Y.and W.-T.Chiu(2005).Isolation andCharacterization of Neurogenic Mesenchymal Stem Cells in HumanScalp Tissue.Stem Cells 23：1012-1020.
Shim W.S.N.，Jiang S.，Wong P.，Tan J.，Chua Y.L.，Tan Y.S.，Sin Y.K.，Lim C.H.，Chua T.，Teh M.，Liu T.C.and E.Sim(2004).Ex vivo differentiation of human adult bone marrow stem cells intocardiomyocyte-like cells.Biochem.Biophys.Res.Com.324：481-488.
Wang H.S.，Hung S.C.，Peng S.T.，Huang C.C.，Wei H.M.，GuoY.J.，Fu Y.S.，Lai M.C.and C.C.Chen(2006).Mesenchymal stemcells in he Wharton’s jelly of the umbilical cord，Stem Cells22：1330-1337.

Claims (15)

1.从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，
其在经处理样品方面100％有效，
其比先前现有技术所述产生更高细胞数，
其时间和成本有效，并因而更有利于工业应用，且
其特征在于依次包括：
(A)回收步骤，其中所述人脐带从血中分离，并于以下温度在无菌闭合的受体中运输至实验室设备，
●所述温度为：
■如果在收集后72小时的时期内处理，则优选为室温，或
■如果在收集后48～144小时的时期内处理，则为2～8℃，优选为4℃；
●所述无菌闭合的受体是：
■干燥的，或
■优选被浸入含以下成分的无菌溶液中：186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml  KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、2000μg/ml葡萄糖、及青霉素和链霉素的1％等摩尔混合物；
(B)三次脐带洗涤步骤，用含下列成分的溶液洗涤脐带三次：186μg/ml CaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、和90μg/mlNaH2PO4·7H2O；
(C)外膜(羊膜)去除步骤，在无菌镊子的辅助下进行；
(D)分段步骤，其中所述脐带在解剖刀的辅助下沿其纵轴被横向分段，以产生约2.5cm长的条段；
(E)由(D)得到的条段的血块消除步骤，其中在解剖刀的辅助下在鉴定出血块的位置制作切口，并从该切口消除血块；
(F)分组步骤，其中由(E)得到的条段合并每7个成组，在下列步骤中各自处理；
(G)由(F)得到的各组7个条段的细胞解离步骤，
在无菌且密封的含缓冲pH的消化溶液的瓶中，通过浓度0.075％(重量/总消化体积)的胶原酶II与浓度0.125％(重量/总消化体积)的胰蛋白酶的组合作用来进行，保持组织质量(g)、瓶底表面积(cm2)、消化体积(ml)、和总瓶体积(ml)之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例，且其中所述瓶在确定的温育时间、温度、热扩散、环境湿度和搅拌条件下温育；
更具体地，
●从一组7个各约2.5cm(2.5g)的脐带条段开始，从血块中游离出；
●使用35ml的消化溶液体积；
●在不通气且闭合的培养瓶中，所述不通气且闭合的培养瓶如总体积650ml的T175，且消化期间615ml的液上空间减去消化物下7个条段的浸没体积；
●其中所述消化溶液除酶外，由下列成分组成：186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml  KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、1000μg/ml葡萄糖、和76μg/ml(0.260mM)EDTA；
●保持pH为6.4或更高；且
●其中所述酶反应于37℃恒定温度下在闭合干燥的温育箱中在100振荡/分钟(opm)的恒定速率搅拌下温育4小时；
(H)第一细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，
●通过于室温下在发生消化的瓶中静置水平温育5～300分钟的时间来回收细胞，所述温育时间优选为30分钟，
●随后将消化上清通过用移液器移溶液来转移到50ml离心管中，避免吸出任何未消化组织；
●随后从所述消化瓶中除去全部未消化组织；
●向所述消化瓶中加入35ml体积的补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基；且
●其中所述不通气的瓶盖替换为含通气盖的滤膜；
●随后于37℃下在含7％CO2的湿润气氛中温育，每72小时更换培养基，以促进粘附和细胞生长/增殖，至达到最大表面汇合率；
(I)第二细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，并含于如(H)中所述得到的消化上清中，
●通过于室温下对(H)中的50ml离心管以350g离心10分钟来回收细胞；
●在离心后，将35ml上清体积转移到静置培养瓶，所述静置培养瓶如T175，具有含通气盖的滤膜；
●向同一培养瓶中加入35ml补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基础培养基；
●于37℃下在含7％CO2的湿润气氛中温育所述培养瓶，每72小时更换培养基，以促进粘附和细胞生长/增殖，至达到最大表面汇合率；
(J)第三细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，
●细胞被回收为细胞沉淀，所述细胞沉淀通过离心如(I)所述的消化上清而得到，
●将所述细胞沉淀重悬于2ml由含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)组成的溶液中，并
●直接用控速冷冻器以1℃/分钟的温度下降速度在2.5ml含2ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中冷冻至-80℃；
(K)如(H)和(I)所述得到的细胞群的冷冻阶段，
在细胞培养物达到最大表面汇合率后，直接在0.5ml细胞悬液和0.5ml含10％二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷冻，从而使1.5ml最终含1.0ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中的最终细胞密度为约3×106细胞/ml。
2.权利要求1的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，衍化出细胞群，
●其中大部分细胞具有在适于间质细胞的表面和培养基中粘附和生长的能力，
●其中大部分细胞表达细胞表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105，且
●其中大部分细胞仅残量表达细胞表面标记物CD14、CD31、CD34和CD45，且
●其中大部分细胞表现出至18期粘附和扩展/扩增的扩展能力，保持约1.7/24h的生长速率，保持成纤维细胞样形态，且
●其中所述大部分细胞保持部分或终端分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞的能力。
3.权利要求1和2的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，在9天内，在首次粘附和扩展循环末(P0)产生共约8.6(±0.1)×105细胞/克脐带。
4.以上权利要求的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，用恒定细胞接种物，以全部5.0×103细胞/cm2的传代(P)，在35天内产生共约7.7×1015细胞。
5.以上权利要求的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，用恒定细胞接种物，以全部2.0×104细胞/cm2的传代(P)，在65天内产生共约2.1×1017细胞。
6.以上权利要求的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，应用于细胞治疗方案，所述细胞治疗方案例如但不限于将所述细胞在分离后直接施用于患者的方案，
●其中所述细胞，
■经历或不经历中间冷冻保存阶段；
■经历或不经历中间扩展阶段；
●其中所述施用为通过全身或局部施用途径例如静脉内施用途径施用、通过局部注射或腰椎穿刺施用，
●其中所述细胞在施用于患者前不进行任何分化。
7.权利要求6的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，使用细胞的治疗作用，
所述治疗作用源于它们作为其他细胞增殖、分化和移植效力的佐剂的活性，
所述其他细胞例如但不限于：一般而言任何前体细胞或干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞和配子前体细胞。
8.权利要求6的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，使用细胞的治疗作用，
所述治疗作用源于它们通过例如分子合成的免疫调节能力，
所述分子例如但不限于：细胞因子、趋化因子及其他生长因子。
9.权利要求6的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，使用细胞的治疗作用，
所述治疗作用源于它们一旦在生物体内，就迁移到和/或粘附于病理患区的能力，
所述病理患区例如但不限于存在肿瘤生长的区。
10.权利要求9的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，所述细胞起到用于局部施用天然或合成的分子或分子化合物的载体的作用，
所述分子或分子化合物例如但不限于：蛋白质、肽、小有机分子、寡糖、多糖、蛋白聚糖、脂类，或上述的任意组合，前提是这些显示出治疗活性。
11.权利要求1～5的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，应用于细胞治疗方案，所述细胞治疗方案例如但不限于将所述细胞施用于患者的方案，
●其中所述细胞，
■经历或不经历中间冷冻保存阶段；
■经历或不经历中间扩展阶段；
●其中所述施用为通过全身或局部施用途径例如静脉内施用途径施用、通过局部注射或腰椎穿刺施用，
●其中所述细胞预先经诱导体外分化成部分或终端分化的人体任意细胞类型，
●所述部分或终端分化的人体任意细胞类型例如但不限于：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、和神经细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞(squeletal muscle cells)、肌腱细胞、成纤维细胞、毛囊细胞、内分泌腺细胞和除神经胶质细胞之外的神经细胞，源自下列上皮的细胞：结合上皮、皮肤上皮、角膜上皮、视网膜上皮、肝上皮、肾上皮、胰腺上皮、小肠上皮、结肠上皮、膀胱上皮、子宫上皮、咽上皮、和喉上皮，
■所述神经细胞包括神经胶质细胞；
■所述除神经胶质细胞之外的神经细胞包括神经前体细胞和神经系统细胞；
■所述神经系统细胞例如神经元细胞、少突胶质细胞和星形细胞。
12.权利要求6～11的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，应用于细胞治疗方案，
●其中以自体或同种异体方式施用所述细胞，
●所述细胞：
■经历或不经历中间冷冻保存阶段；
■经历或不经历中间扩展阶段；
■经历或不经历中间分化过程。
13.权利要求1～5的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，开发含完整细胞、细胞提取物或细胞成分的药物组合物。
14.权利要求1～5的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，使用完整细胞、细胞提取物或细胞成分，用于产生哺乳动物细胞培养用表面和/或表面层和/或支持物。
15.权利要求1～5的从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，其特征在于，
以例如但不限于开发细胞系为目的，
通过对所述细胞的基因操作来改变其表型，
所述表型如细胞粘附和/或扩展和/或分化的能力。
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PT (1) PT103843B (zh)
WO (1) WO2009044379A2 (zh)
ZA (1) ZA201002260B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102550543A (zh) * 2012-02-10 2012-07-11 四川新生命干细胞科技股份有限公司 用于保存脐带组织的液体
CN103461322A (zh) * 2012-06-07 2013-12-25 臻景生物技术（上海）有限公司 用于冻存复苏后的细胞的保存液
CN113025567A (zh) * 2021-03-31 2021-06-25 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种椎间盘单细胞的分离方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2576768T (pt) 2010-06-01 2017-08-11 Auxocell Laboratories Inc Células estaminais da geleia nativa de wharton e a sua purificação
AU2011317203B2 (en) * 2010-10-18 2016-10-20 Sunshine Life Science & Technology Corp. Human multipotent embryonic stem cell-like progenitor cells
TWI535377B (zh) * 2011-09-01 2016-06-01 Storage, culture and application of umbilical cord tissue and its derived cells
ES2890126T3 (es) * 2011-12-30 2022-01-17 Amit Patel Métodos y composiciones para la obtención clínica de una célula alogénica y usos terapéuticos
EP2756754B1 (de) 2013-01-17 2017-01-04 Vita 34 Ag Verfahren zur Behandlung von Nabelschnurgewebe, insbesondere im Zusammenhang mit der Konservierung des Gewebes
US20170119824A1 (en) * 2014-05-24 2017-05-04 Neelam Krishnan Venkataramanaa A method for the treatment of glioblastoma with wharton jelly-mesenchymal stem cells (wj-msc) derived from human umbilical cord
JP2017533917A (ja) * 2014-11-05 2017-11-16 ティッシュテック，インク． 神経成長および再生を促進するための組成物および方法
WO2017004460A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Surgenex, LLC Compositions and methods for flowable allograft tissue
EP3388512B1 (en) * 2015-12-11 2023-08-23 Lei Guo Method for separating and culturing mesenchymal stem cells from wharton's jelly tissue of umbilical cord
US20210047621A1 (en) 2018-03-12 2021-02-18 Universidade Do Porto Compositions for use in the treatment of musculoskeletal conditions and methods for producing the same leveraging the synergistic activity of two different types of mesenchymal stromal/stem cells
CN112342191A (zh) * 2019-08-07 2021-02-09 路春光 hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立
CN111893092A (zh) * 2020-06-28 2020-11-06 国大生命科学产业集团(深圳)有限公司 一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT402890B (de) * 1994-03-16 1997-09-25 Berbi Gmbh Verwendung von notoginsenosid r1 zur herstellung von arzneimitteln
AU2003221173A1 (en) * 2002-03-27 2003-10-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Placenta-origin mesenchymal cells and medicinal use thereof
AU2006332680A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
WO2008060541A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-22 Ethicon, Incorporated In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARK L. WEISS. ET AL.: ""Human Umbilical Cord Matrix Stem Cells: Preliminary Characterization and Effect of Transplantation in a Rodent Model of Parkinson’s Disease"", 《STEM CELL》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102550543A (zh) * 2012-02-10 2012-07-11 四川新生命干细胞科技股份有限公司 用于保存脐带组织的液体
CN103461322A (zh) * 2012-06-07 2013-12-25 臻景生物技术（上海）有限公司 用于冻存复苏后的细胞的保存液
CN103461322B (zh) * 2012-06-07 2016-08-03 西比曼生物科技（上海）有限公司 用于冻存复苏后的细胞的保存液
CN113025567A (zh) * 2021-03-31 2021-06-25 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种椎间盘单细胞的分离方法

Also Published As

Publication number Publication date
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