PT103844B - Método de isolamento de células precursoras a partir do cordão umbilical humano utilizando enzimas de origem vegetal - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE À UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS OU COMPLEXOS ENZIMÁTICOS DE ORIGEM ESTRITAMENTE VEGETAL, NOMEADAMENTE ENZIMAS COM ACTIVIDADE PEPTIDICA, MAIS ESPECIFICAMENTE A PAPAINA, PARA A DIGESTÃO DO CORDÃO UMBILICAL HUMANO COM O FIM DE ISOLAR CÉLULAS ÍNTEGRAS, VIÁVEIS, COM CAPACIDADE DE ADESÃO E EXPANSÃO/MULTIPLICAÇÃO EM CULTURA. A PRESENTE INVENÇÃO CONSTITUI A BASE PARA DUM MÉTODO DE ISOLAMENTO DE CÉLULAS PRECURSORAS HUMANAS, CUJO PASSO DE DISSOCIAÇÃO DAS CÉLULAS DO TECIDO É LIVRE DA UTILIZAÇÃO DE COMPOSTOS DE ORIGEM ANIMAL, COM VISTA À CRIAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE ISOLAMENTO QUE ORIGINE CÉLULAS MAIS SEGURAS PARA FUTURAS APLICAÇÕES DE TERAPIA CELULAR.

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE PEPTIDASES DE ORIGEM VEGETAL PARA ISOLAMENTO DE CÉLULAS PRECURSORAS A PARTIR DAS ZONAS SUBAMNIÓTICA, INTERVASCULAR, E PERIVASCULAR DO CORDÃO UMBILICAL HUMANO

Dominio Técnico da Invenção

É objecto da presente invenção a utilização de enzimas com origem estritamente vegetal, contendo actividade peptidica, como seja a papaina, para a digestão do cordão umbilical humano com o fim de isolar células precursoras.

Entenda-se por células precursoras, no âmbito da presente invenção, células capazes de aderirem e de se multiplicarem numa superfície e meio de cultura definidos, onde a maioria das células expressam os marcadores de superfície celular CD44, CD73, CD90 e

CD105, e de igual forma a maioria das células apresenta apenas expressão residual dos marcadores de superfície celular CD14, CD31, CD34 e CD45, com uma taxa de multiplicação de aproximadamente l,5/24h, podendo atingir 14 fases de adesão e expansão/multiplicação, mantendo uma morfologia fibroblastóide constante, e com capacidade de se diferenciarem parcial ou terminalmente noutro tipo de células, como sejam, comprovadamente, os osteoblastos, condrócitos, adipócitos, cardiomiócitos e células neurais/gliais.

A invenção pretende, acima de tudo, contribuir para a criação de um protocolo reprodutível, livre da utilização de compostos de origem animal, com vista à utilização mais segura das células precursoras obtidas em futuras aplicações de terapia celular em humanos.

Para além disso, os rendimentos, em termos de número de células isoladas, permitem a criopreservação de um número significativo das mesmas após somente duas fases de adesão e expansão/multiplicação, envolvendo apenas uma passagem (Pl).

Entenda-se por passagem o re-inóculo das células aderentes, após estas terem atingido confluência máxima durante a fase de adesão e expansão/multiplicações precedente, a uma confluência optimizada mais baixa, aumentando simultaneamente a superfície de crescimento e o volume total de meio de cultura. Dá-se assim inicio a uma nova fase de adesão e expansão/multiplicação, e consequente aumento do número de células aderentes in vitro. Com apenas uma passagem (Pl) fica garantida a identidade fenotípica das células isoladas, cuja probabilidade de sofrer alterações aumenta com o número de fases de adesão e expansão/multiplicação.

Sendo robusto e seguro, o método permite a utilização das células precursoras para vários fins, nomeadamente a aplicação clínica, farmacêutica, cosmética e biotecnológica.

Antecedentes da Invenção

Uma célula precursora (estaminal, progenitora, germinal, indiferenciada ou primitiva) é um tipo de célula com capacidade de auto-renovação durante um período de tempo significativo e, sobretudo, com capacidade de diferenciação parcial ou terminal em outro tipo de células, sendo que, a diferenciação parcial origina células com um grau de especialização mais avançado, ainda com capacidade de diferenciação, enquanto que a diferenciação terminal origina células totalmente especializadas, sem capacidade de diferenciação.

Apesar do enorme potencial de diferenciação das células precursoras com origem embrionária, a sua utilização tem suscitado grande controvérsia com base não só em questões éticas graves mas também em questões de segurança.

Como tal, a investigação nesta área tem vindo a analisar a viabilidade de fontes alternativas não embrionárias, como sejam a medula óssea, periósteo, osso trabecular, tecido adiposo, região sinovial, músculo esquelético, dentes definitivos e epitélio da mucosa olfactiva (Barry and Murphy, 2004; Roisen et al., 2001). Foi já demonstrado que as células isoladas a partir destes tecidos têm capacidade de diferenciação inter alia em condrócitos, adipócitos, osteoblastos, mioblastos, cardiomiócitos, astrócitos e tenócitos in vitro, tendo já sido também diferenciadas in vivo (Carvalhal et al., 2007; Majumdar et al., 1998 e Pittenger et al., 1999). Estas células precursoras, isoladas a partir de fontes não-embrionárias, e capazes de se diferenciarem em células de tecidos com natureza não-hematopoiética (outros tecidos que não o tecido sanguíneo), são denominadas da linhagem mesenquimatosa, ou simplesmente, células mesenquimatosas.

É na prática clínica, nomeadamente na colheita, que surgem as maiores limitações à utilização das células mesenquimatosas. A colheita destas células é frequentemente feita através de métodos invasivos para o paciente, normalmente através de procedimentos cirúrgicos que, como por exemplo no caso da colheita de células da medula óssea, pode envolver anestesia geral. Para além disso, e por serem raras, o número de células obtido é na maioria dos casos limitado, e o potencial regenerador das células reduzido, devido à sua menor capacidade de se diferenciarem em vários tipos de células especializadas.

Como alternativa, os tecidos constituintes do cordão umbilical têm sido descritos como possíveis fontes de células precursoras de carácter mais embrionário, e logo com um potencial regenerador mais elevado (Romanov et al., 2003). O sangue do cordão umbilical, por exemplo, é reconhecidamente uma fonte rica em células estaminais, mas maioritariamente da linhagem hematopoiética.

Dado que as células mesenquimatosas são bastante mais raras no sangue do cordão umbilical do que as células hematopoiéticas, tentativas de as isolar a partir deste tecido têm suscitado alguma frustração e mesmo os estudos mais bem sucedidos, com uma eficácia de isolamento pouco acima dos 60%, relativa ao número de amostras testadas, utilizaram quantidades limitantes de sangue. E ainda assim, a incerteza persistiu quanto à origem das células, isto é, se seriam realmente originárias do sangue ou de qualquer outro tecido fetal (Chul-Won et al., 2003;

Bieback et al., 2004).

Mais recentemente, a investigação tem-se virado para o isolamento de células precursoras mesenquimatosas a partir dos tecidos constituintes do próprio cordão umbilical. Estes tecidos são consideravelmente mais ricos em células mesenquimatosas do que o tecido sanguíneo e as suas características fetais tornam as células muito mais capacitadas de se diferenciarem e vários tipos de células especializadas, da linhagem ectodérmica e não só (Deryl e Weiss, 2008).

Apesar de alguns registos onde os autores recorreram a estruturas do cordão umbilical, como sejam a membrana amniótica e os vasos umbilicais, na busca de células precursoras direccionadas, isto é, próximas da diferenciação terminal (tanto da linhagem epitelial como endotelial), estudos topográficos prévios revelaram que as células mesenquimatosas mais primogénitas, com maior potencial de diferenciação, se encontravam na zona interior da matriz, mais precisamente nos tecidos constituintes das zonas sub-amniótica, intervascular e perivascular do cordão umbilical, globalmente conhecidos por geleia de Wharton. Estas células demonstraram potencial para se diferenciar, por exemplo, em condrócitos e células do sistema nervoso central (Nanaev et al., 1997; Purchio et al. 1998; Mitchell et al., 2003; Romanov et al., 2003; Kadner et al., 2004; Auger et al., 2005; Phan, 2007).

Relativamente aos protocolos de isolamento de células mesenquimatosas a partir da geleia de Wharton, alguns autores descrevem métodos não envolvendo passos enzimáticos mas, estes são pouco eficientes em termos de número de células obtido e do tempo necessário para o isolamento das mesmas, o que e consequentemente torna estes métodos incompatíveis com as necessidades da terapia celular (Phan, 2007; Mitchell et al., 2003, Purchio et al. 1998).

Por outro lado, considerando as metodologias envolvendo digestão enzimática do cordão umbilical, a escolha tem recaído, quase sempre, sobre composições contendo a Colagenase, tipo I ou II, extraída a partir da bactéria Clostridium histolycum, devido à sua especificidade para digerir o colagénio - componente mais abundante na geleia de Wharton (Davies et al., 2004; Seyda et al., 2006; Wang et al., 2006; Mistry et al., 2006).

Ά utilização da colagenase no isolamento de células precursoras pode, no entanto, apresentar algumas limitações.

Por um lado, a colagenase encontra-se normalmente disponível sob a forma de extracto não purificado cuja composição é naturalmente variável. Para além disso, os extractos de colagenase podem conter impurezas de origem proteolítica, incluindo clostripaína, tripsina e caseinase, que podem provocar a degradação catalítica da própria enzima. Isto faz com que o grau de eficiência com que a colagenase digere o tecido possa oscilar, tornando-se portanto mais difícil de optimizar e uniformizar um protocolo.

Para além do mais, devido à baixa pureza e catálise da própria colagenase nos extractos enzimáticos disponíveis, a grande maioria dos protocolos descritos complementa a acção da colagenase com outras enzimas, mormente de origem animal, como sejam a tripsina ou a hialuronidase (Lee et al., 1994; Seyda et al., 2006; Mistry et al. , 2006; Wang et al., 2006).

Pelas razões acima mencionadas, existe o interesse em encontrar alternativas às colagenases, ou às enzimas que normalmente as complementam, por forma a criar um método robusto, reprodutível, preferencialmente livre da utilização de compostos de origem animal, com vista a uma utilização mais segura das células obtidas em futuras aplicações de terapia celular.

A actividade proteolitica das endopeptidases de origem vegetal, nomeadamente das proteases de cisteina, como a papaina, tem desde há muito vindo a ser utilizada como alternativa às peptidases de origem microbiana e animal, como sejam as colagenases e as peptidases pancreáticas, com o intuito de estudar a composição de vários tipos de matrizes extracelulares de tecidos animais (Da-Silva et al., 2001; Quezada-Calvillo et al., 2002; Rodrigues et al., 2005; Kalea et al., 2006; Rogers et al., 2006).

A papaina (papainase ou peptidase I da papaia) é uma peptidase com uma actividade endopeptídica abrangente, clivando preferencialmente ligações peptidicas entre aminoácidos básicos, leucina ou glicina. A enzima consiste numa única cadeia polipeptidica contendo três pontes dissulfureto e um grupo sulfidrilo, necessário para a actividade da enzima.

Mais recentemente, a papaina provou não só ser uma peptidase eficiente, desagregando tecido através da sua como também acção nas matrizes extracelulares, relativamente pouco traumática, em relação a algumas congéneres, no que respeita à viabilidade celular; caso o objectivo seja não só a dissociação do tecido mas também a recuperação e expansão das células ín vitro. Por exemplo, a papaina foi já utilizada com sucesso no isolamento de células do músculo esquelético da artéria carótida, utilizando o modelo suino, e do tracto gastrointestinal e traqueia, utilizando os modelos canino e coelho (Driska e Porter, 2006; Eddinger et al, 2006).

Da mesma forma, células do sistema nervoso central foram isoladas e caracterizadas, no modelo de ratinho (Panchsion et al., 2007).

É objecto da presente invenção a utilização de uma enzima, contendo actividade peptidica, de origem vegetal, nomeadamente a papaina, para a digestão da matriz do cordão umbilical humano em condições onde se descarta os componentes bioquímicos da matriz digerida e se dissociam as células precursoras a partir das zonas sub-amniótica, intervascular e perivascular, constituintes da geleia de Wharton do cordão umbilical humano, mantendo, para além da integridade, a sua viabilidade e a sua capacidade de adesão e expansão/multiplicação em condições de cultura adequadas para células mesenquimatosas.

A capacidade da papaina para digerir o colagénio do cordão umbilical, com o objectivo de isolar, separar e identificar os peptidoglicanos constituintes da geleia de Wharton havia já sido comprovada (Inoue e Iwasaki, 1976; Heinegàrd et al., 1978). O aproveitamento desta actividade, aliada à sua acção relativamente pouco traumática para a viabilidade celular, com o intuito isolar células humanas viáveis e seguras para efeitos de terapia, a partir do cordão umbilical humano, não tem precedentes no estado da arte, e é a base da presente invenção.

A invenção pretende, fundamentalmente, em relação ao estado da arte, destacar-se pelo facto de criar um passo, que possa ser integrado dentro dos métodos existentes, de dissociação das células a partir do cordão umbilical, que seja livre da utilização de compostos de origem microbiana ou animal, mas que recorra ainda assim a uma digestão enzimática, condição essencial para que sejam obtidas células em números que viabilizem a sua utilização em futuras aplicações relacionadas com a terapia celular.

A principal repercussão da invenção é a obtenção de células em qualidade e quantidade significativa, que ofereçam maiores garantias de segurança para a sua aplicação em humanos.

Descrição Geral da Invenção

É objecto da presente invenção a utilização de enzimas de origem estritamente vegetal, nomeadamente a papaína, para a digestão do cordão umbilical humano, ou fracções do mesmo, com o fim de isolar células humanas viáveis (neste caso específico de cariz precursor), finalidade nunca antes considerada.

A presente invenção acima de tudo, quando aplicada a um método de isolamento de células precursoras humanas, liberta o passo de dissociação das células a partir de um tecido da utilização de compostos de origem animal, condição relevante para que as células obtidas possam ser utilizadas com segurança em futuras aplicações de terapia celular.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras humanas utiliza, preferencialmente, uma enzima pura (papainase ou peptidase I purificada a partir do miolo da Ca ri ca papaya) , sem ser em forma de extracto, livre de componentes animais e microbianos, de forma a que todos os parâmetros da reacção enzimática sejam controlados e mais facilmente optimizados.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras, a partir do cordão umbilical humano, cria as condições ideais para a viabilidade celular e a degradação preferencial dos componentes matriciais extracelulares, libertando especificamente células precursoras com as caracteristicas desejadas.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras, a partir do cordão umbilical humano, torna-o isento de complexas operações de extracção dos vasos umbilicais.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras, a partir do cordão umbilical humano, permite atingir 100% de eficácia com respeito ao número de amostras bem sucedidas, podendo gerar, através da utilização de um meio selectivo, uma população de células com as caracteristicas desejadas, nomeadamente serem células integras e viáveis, capazes de aderir e de se multiplicarem numa superfície e meio de cultura definidos, onde a maioria das células expressam os marcadores de superfície celular CD44, CD73, CD90 e CD105, e de igual forma a maioria das células apresenta apenas expressão residual dos marcadores de superfície celular CD14, CD31, CD34 e CD45, com uma taxa de multiplicação de aproximadamente l,5/24h, podendo atingir 14 fases de adesão e expansão/multiplicação, mantendo uma morfologia fibroblastóide constantes, e com capacidade de se diferenciarem parcial ou terminalmente noutro tipo de células, como sejam, por exemplo, comprovadamente, os osteoblastos, condrócitos, adipócitos, cardiomiócitos e células neurais/gliais.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras, a partir do cordão umbilical humano, permite isolar células em números que viabilizam a criopreservação das mesmas após somente uma, ou no máximo duas fases de adesão e expansão/multiplicação ex vivo, garantindo assim a sua identidade fenotípica, que poderá alterar-se com o número de duplicações. Assim, todo o potencial de diferenciação e expansão fica garantido até à altura da sua aplicação clínica, farmacêutica, cosmética ou biotecnológica.

A presente invenção, aplicada a um método de isolamento de células precursoras, a partir do cordão umbilical humano, permite a obtenção de uma população de células viáveis, de fénotipo controlado e em número suficiente, que permite a sua utilização para vários fins, mesmo após criopreservação, nomeadamente a sua aplicação em formas de terapia celular e terapia genética, na criação de bancos celulares, na produção de composições farmacológicas e cosméticas, na produção de moléculas ou compostos moleculares, na produção de camadas de células de suporte para culturas, assim como para servir de base para gerar novas linhas celulares através da sua manipulação genética.

De uma forma geral, o procedimento baseia-se no seguinte:

cordão umbilical recolhido após o parto é escorrido de sangue e o transporte até ao laboratório deve ser feito preferencialmente à temperatura ambiente, desde que a amostra seja processada num período até 48h. Para períodos de espera superiores, aconselha-se uma temperatura de transporte e armazenamento entre os 2 e os 8°C.

processamento do cordão umbilical e o isolamento das células precursoras é efectuado em câmara de fluxo laminar vertical, sob condições de máxima esterilidade.

No início do processamento, o cordão é lavado com uma solução tampão e a membrana amniótica é retirada.

Para o isolamento das células pretendidas parte-se, preferencialmente, duma fracção entre 2cm e 3cm de cordão umbilical, preferencialmente 2,5cm.

Na base da invenção, utiliza-se uma enzima, ou combinação de enzimas, com origem estritamente vegetal, como seja a papaína pura, cristalizada, isolada do miolo de Carica papaya (papaia), na dissociação das células precursoras a partir das zonas sub-amniótica, intervascular e perivascular (constituintes da geleia de Wharton) do cordão umbilical humano, mantendo inalterados a integridade e viabilidade celular, assim como a capacidade de aderir e expandir/multiplicar em cultura, células dissociadas do tecido por esta via.

A totalidade das células resultantes da digestão é recolhida e incubada em meio de cultura próprio para a manutenção e multiplicação celular. A cultura das células neste meio permite seleccionar uma população constituída, maioritariamente, por células precursoras com as características desejadas.

Descrição dos desenhos

Figura 1: A - Ilhas de células 5 dias após inoculação de PO. B - A mesma cultura de A, com 50% de confluência. C Ainda a mesma cultura de A, no final de PO, apresentando 100% de confluência, 12 dias após inoculação de PO. Esta fase precede a primeira passagem (Pl). Barra de escala = lOOprn (Ampliação de 100X).

Figura 2: A - Cultura de células precursoras em Pl, apresentando 50% de confluência, 3 dias após a primeira passagem. B - A mesma cultura de células precursoras em A, no final de Pl, apresentando 100% de confluência, 5 dias após a primeira passagem. As células em cultura apresentam uma morfologia fibroblastóide, esperada para as células mesenquimatosas. Esta fase precede uma segunda passagem ou a criopreservação. Barra de escala = ΙΟΟμιη (Ampliação de 100X).

Figura 3: Grupos de células obtidos recorrendo à técnica de citometria de fluxo. As células foram imuno identificadas utilizando anticorpos acoplados a um de dois fluoróforos, PE ou FITC, contra os antigénios CD44 (88,3% das células), CD73 (98,7% das células), CD90 (96,5% das células) e CD105 (98% das células), marcadores positivos do estroma mesenquimatoso.

Figura 4: Grupos de células obtidos recorrendo à técnica de citometria de fluxo. As células foram imunoidentifiçadas utilizando anticorpos acoplados a um de dois fluoróforos, PE ou FITC, contra antigénios que são reconhecidamente marcadores negativos para as células mesenquimatosas. Ainda assim, um número significativo de células deu sinal positivo para estes marcadores, devido a uma certa heterogeneidade da população celular: CD14 (10,2% das células), da linhagem monocítica; CD34 (10,8% das células), da linhagem hematopoiética; CD31 (10,6% das células), marcador endotelial e de algumas subpopulações de células da linhagem hematopoiética, e CD45 (15,5% das células), marcador panleucocitário.

Figura 5: Diferenciação das células precursoras em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A - Morfologia celular das células controlo (sem diferenciação) em meio de manutenção e multiplicação. B - Diferenciação osteogénica: as células foram inoculadas em meio de diferenciação osteogénica, e mantidas durante 3 semanas, ao fim das quais foram realizados ensaios de coloração específica com Fosfatase alcalina. C - Diferenciação adipogénica: as células foram inoculadas em meio de manutenção e multiplicação até atingirem uma confluência de 100%. Quando tal aconteceu, o meio foi mudado para meio de diferenciação adipogénica, durante 3 semanas, ao fim das quais foram realizados os ensaios de coloração específica com Oil-red-O. D - Diferenciação condrogénica: as células foram ressuspendidas e mantidas num tubo cónico, em meio de diferenciação condrogénica, durante 4 semanas, ao fim das quais se procedeu ao ensaio de coloração específica com Alcian blue e hematoxilina. Barras de escala = 100 pm.

Figura 6: Diferenciação das células precursoras em cardiomiócitos. A - Morfologia celular das células controlo (sem diferenciação) em meio de cultura basal

Alpha-MEM, suplementado apenas com 10% FBS e 1% de

Penicilina/Estreptomicina. B

Morfologia celular das células após diferenciação cardiomiogénica. C

Células controlo (sem diferenciação) detectadas através de imunofluorescência. Foi utilizado um anticorpo primário contra uma proteína típica dos tecidos musculares, a Troponina T cardíaca, específica dos cardiomiócitos. Para efeitos de localização das células em cultura, os núcleos celulares foram detectados com o fluorocromo DAPI. Na cultura das células controlo só é possível detectar os núcleos corados com DAPI. D - Células diferenciadas detectadas através de imunofluorescência. Foi utilizado um anticorpo primário contra uma proteína típica dos tecidos musculares cardíacos, a Troponina T, típica dos cardiomiócitos. Para efeitos de localização das células em cultura, os núcleos celulares foram corados com o fluorocromo DAPI. Na cultura das células diferenciadas é possível detectar o citoesqueleto das células, corado para a Troponina T, assim como os núcleos, corados com DAPI.

Figura 7: Diferenciação das células precursoras neuronais/gliais. A

Morfologia celular das células controlo (sem diferenciação) em meio de cultura basal

Alpha-MEM, suplementado apenas com 10% FBS e 1% de

Penicilina/Estreptomicina. B

Morfologia celular das células após diferenciação neuronal/glial. C

Células controlo (sem diferenciação) detectadas através de imunofluorescência. Foi utilizado um anticorpo primário contra a β - tubulina III, uma proteína típica das células neuronais/gliais. Para efeitos de localização das células em cultura, os núcleos celulares foram detectados com o fluorocromo DAPI. Na cultura das células controlo só é possível detectar os núcleos corados com DAPI. D

Células diferenciadas detectadas através de imunofluorescência. Foi utilizado um anticorpo primário contra a β- tubulina III, uma proteína típica das células neuronais/gliais. Para efeitos de localização das células em cultura, os núcleos celulares foram corados com o fluorocromo DAPI. Na cultura das células diferenciadas é possível detectar o citoesqueleto das células, corado para a β- tubulina III, assim como os núcleos, corados com DAPI.

Descrição pormenorizada da invenção

1. Recolha do cordão umbilical

Após consentimento informado das mães e obtida a autorização por parte da comissão de ética da instituição onde é feita a recolha, o cordão umbilical, desprovido de placenta, é escorrido de sangue e colocado num contentor apropriado, estéril, devidamente fechado, numa solução de transporte, preferencialmente um tampão salino ou meio fisiológico similar, como seja uma solução salina de Hanks (HBSS), suplementado com nutrientes e antibióticos, como seja lg/L de glucose, lOOU/mL de penicilina e 100pg/mL de estreptomicina, podendo ser utilizado qualquer outro antibiótico similar. Nesta fase podem adicionar-se também compostos fungicidas.

2. Transporte do cordão umbilical transporte até ao laboratório deve ser feito preferencialmente à temperatura ambiente, desde que a amostra seja processada num período até 48h. Para períodos de espera superiores, aconselha-se uma temperatura de transporte e armazenamento entre os 2 e os 8°C.

método deve ser efectuado em ambiente estéril, como seja em câmara de fluxo laminar vertical.

3. Processamento do cordão umbilical processamento do cordão umbilical, ou fracções do mesmo, assim como o isolamento das células precursoras, são efectuados em câmara de fluxo laminar vertical, sob condições de esterilidade.

cordão é lavado várias vezes, preferencialmente 3 vezes, com HBSS, ou outro tampão semelhante, e a membrana exterior (membrana amniótica) retirada com o auxílio de uma pinça estéril.

A partir deste momento, o procedimento deve continuar com uma fracção de cordão umbilical com um comprimento entre 2cm e 3cm (2g-3g) , preferencialmente 2,5cm (aproximadamente 2,5g), obtida através dum fraccionamento transversal do cordão umbilical em relação ao seu eixo longitudinal, consistindo de cortes produzidos com o auxilio dum bisturi. Caso as fracções de cordão umbilical contenham coágulos de sangue, estes podem alternativamente ser removidos com o auxílio dum bisturi.

4. Dissociação das células a partir do cordão umbilical

A digestão de cada fracção com 2,5g de cordão umbilical processa-se recorrendo à actividade peptidica da papaina pura, a uma concentração final na solução de digestão que pode variar entre lU/ml e 30U/ml, preferencialmente 20U/ml, dentro dum recipiente estéril, como seja um frasco para cultura de tecidos, selado com tampa estanque, com um volume total de 77cm³, com uma superfície do fundo do recipiente onde assenta o tecido durante a digestão de ll,25cm², em 5ml duma solução de digestão consistindo de 25mM de Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES), ou alternativamente HBSS, suplementada com 5mM de CaCÍ2 e 5mM de L-Cisteína, durante 2h, num banho oscilatório, com oscilações de 120 (±20) oscilações.min^-1 (opm), com uma temperatura constante da água no banho de 37°C, e onde as células, após o período de incubação, são recolhidas através da sua sedimentação por centrifugação da solução de digestão, num tubo de centrífuga de 50mL, com uma força centrífuga entre os lOOg e 500g, preferencialmente 350g, durante um período que pode variar entre os 5min e 45min, preferencialmente lOmin, a uma temperatura entre os 12°C e 37°C, preferencialmente à temperatura ambiente.

Alternativamente, as células podem também ser recolhidas a partir do frasco para cultura de tecidos onde se procedeu à digestão, assim como do sobrenadante da centrifugação da solução de digestão, por forma a maximizar os rendimentos em termos de células isoladas por massa de cordão.

No caso de se proceder uma recolha a partir do frasco de cultura onde foi feita a digestão, e logo após o período de incubação da reacção de digestão, esta baseia-se na recuperação das células que têm a capacidade de aderir à superfície do frasco de cultura celular, ainda na presença da solução de digestão, com o frasco mantido na sua posição horizontal, durante um período que pode variar entre 5 a 300 minutos, preferencialmente 30 minutos, à temperatura e meio ambiente.

Após 30 minutos, a solução de digestão é colocada num tubo de centrífuga de 50mL e é centrifugada a 350gr, durante lOmin, à temperatura ambiente.

Entretanto, decantam-se do frasco onde foi feita a digestão quaisquer resquícios de tecido não digerido e adicionam-se ao mesmo 5ml de meio de cultura Alpha MEM com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos e glutamina, suplementado com 10% de Soro fetal bovino (FBS), lOOU/mL de penicilina e 100μg/mL de estreptomicina, por forma a iniciar uma fase de expansão/multiplicação das células que foram capazes de aderir ao suporte de cultura durante os cerca de 30 minutos de selecção. A cultura celular é incubada a 37°C numa incubadora com uma atmosfera húmida, contendo 7% CO₂. O frasco de cultura está agora apetrechado com uma tampa com filtro, permitindo assim trocas gasosas.

Podem-se também recuper as células a partir do sobrenadante resultante duma centrifugação da solução de digestão, recolhida por pipetagem a partir do recipiente de digestão para um tubo de centrífuga do tipo Falcon de 50ml, evitando a sucção de porções de tecido remanescentes. Tal como anteriormente, as células seleccionadas a partir do sobrenadante têm a capacidade de aderir à superfície de um frasco de cultura celular T₂s (NUNC), e entrar numa fase de expansão/multiplicação, desta feita numa solução consistindo de 5ml de sobrenadante e 5ml de meio Alpha MEM com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos e glutamina, suplementado com 10% de Soro fetal bovino (FBS), lOOU/mL de penicilina e 100μg/mL de estreptomicina, numa incubadora a 37°C, com uma atmosfera húmida, contendo 7% CO₂. O frasco desta cultura está também apetrechado com uma tampa com filtro, permitindo assim trocas gasosas.

Os sedimentos derivados da centrifugação são ressuspendidos num volume apropriado de meio de cultura Alpha MEM com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos e

glutamina, suplementado	com 10% de	soro	fetal bovino
(FBS), lOOU/mL de	penicilina	e	100pg/mL de
estreptomicina.
As concentrações dos suplementos no	meio	podem variar
entre os 2.5% e 30%	de soro, OU/ml	e 300U/ml de

penicilina e 0 gg/ml e 200 μg/ml de estreptomicina, respectivamente.

As células totais obtidas nos sedimentos, a partir de cada uma das fracções, são contadas com o auxílio dum hemacitómetro e coloração com azul tripano e inoculadas na totalidade para início de expansão ex vivo (PO), em suportes com o tratamento químico típico dos frascos para cultura de tecidos, como por exemplo os da NUNC (Tflask) .

A densidade de inoculo ideal é de 2.0xl0⁴ células/cm², sendo que poderá ser utilizada qualquer outra densidade de inoculo inicial entre as l.OxlO³ células/cm² e as 5.0xl0⁵ células/cm². As culturas celulares são incubadas a 37°C numa incubadora com uma atmosfera húmida, contendo 7% de CO2, no meio acima descrito.

5. Cultura das células totais seleccionando para células precursoras

A selecção das células precursoras é feita através da capacidade de adesão das mesmas à superfície tratada dos suportes de cultura utilizados.

processo de selecção ocorre no meio de cultura descrito, com mudanças da totalidade do meio em intervalos de 72h, podendo este período variar entre as 48h e as 96h. Após um intervalo de tempo que pode ir de 7 a 20 dias, procede-se a uma primeira passagem (Pl) .

Para o efeito, retira-se o meio e lavam-se as células aderentes com tampão fosfato salino (PBS). As células são tratadas de seguida com uma solução de tripsina-EDTA 0.25%, podendo esta concentração variar entre 0.025% e 2.5%. A acção da tripsina é inactivada através da adição do mesmo volume de meio de cultura.

As células são contadas com o auxílio de um hemacitómetro e coloração com azul tripano. Inicia-se Pl com uma densidade de inoculo ideal de 2.0xl0⁴ células/cm², sendo que poderá ser utilizada qualquer outra densidade de inoculo inicial entre as l.OxlO³ células/cm² e as 5.0xl0⁵ células/cm². A partir deste momento, as células expandem uniformemente, desde o inicio, sobre toda a superfície dos frascos para cultura de tecidos (T-flasks), com um tempo de duplicação que pode variar entre 40h e 60h, com mudanças da totalidade do meio em intervalos de 72h, podendo estes variar entre a 24h e 92h. No final de Pl o rendimento esperado é, em média, num intervalo de tempo que pode variar entre 15 e 30 dias, 6.9 (±1.1) xlO⁵ células/grama de cordão umbilical.

6. Criopreservação e recuperação das células precursoras isoladas

A população de células maioritariamente com caracteristicas precursoras é congelada no final de Pl a uma densidade que pode variar entre as l.OxlO⁶ e 10xl0⁶ células/mL em tubos de 1.5mL (criotubos estéreis), contendo lml de suspensão celular, em 10% de Dimetilsulfóxido e 90% FBS, e mantida na fase de vapor do azoto líquido.

As células são criopreservadas desta forma e recuperadas quando necessário através de um descongelamento rápido, num banho a 37°C, podendo esta temperatura variar entre os 25°C e os 40°C, ressuspendidas em meio de cultura previamente aquecido a qualquer temperatura dentro do intervalo anterior, por forma a que, no total, a suspensão celular seja diluída no mínimo 1:10.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1:	Isolamento e multiplicação de células
precursoras	a partir de um cordão umbilical humano
utilizando	a papaína, uma peptidase de cisteína

purificada a partir da papaia.

Após consentimento informado por parte da parturiente e obtida a autorização por parte da Comissão de Ética da instituição onde foi feita a recolha, o cordão umbilical foi separado da placenta, escorrido de sangue e colocado em tampão salino de transporte, uma solução salina de Hanks (HBSS), suplementada com lg/L de glucose, lOOU/mL de penicilina e 100 gg/mL de estreptomicina.

O transporte do cordão umbilical até ao laboratório foi efectuado à temperatura ambiente num recipiente de polipropileno estéril e hermeticamente fechado. A partir daí, o processamento do cordão umbilical, assim como o isolamento das células precursoras, foram efectuados em câmara de fluxo laminar vertical, sob condições de esterilidade.

cordão foi lavado 3 vezes com HBSS (Sigma Aldrich), e a membrana exterior (membrana amniótica) retirada com o auxílio de uma pinça estéril.

procedimento continuou utilizando apenas uma fracção de 2.5cm de comprimento (2.1g), resultante de dois cortes transversais, em relação ao plano longitudinal do cordão umbilical, efectuados com um bisturi.

As células totais foram dissociadas do tecido umbilical através duma digestão enzimática. Para o efeito, a fracção de cordão umbilical foi colocada num frasco de cultura celular, com uma superfície de 25cm² (T-flask, 40ml, NUNC), e sujeita a uma digestão de 2h, num banho oscilatório (Memmert), a 37°C, com uma oscilação de 140opm, num volume de 5mL, cobrindo por completo a fracção do cordão a digerir, de uma solução consistindo de tampão à base de Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetano-sulfónico (HEPES, Sigma Aldrich), contendo 20U/ml de papaina (papainase ou peptidase I da papaia) 2X cristalizada, purificada a partir do miolo da papaia em 0.05M Acetato de sódio (NaAc), pH 4.5, contendo timol a 0.01% (Sigma Aldrich). 0 tampão HEPES foi suplementado

com 5mM de CaCl2 (Sigma Aldrich).	(Sigma Aldrich) e	5mM	de	L-Cisteina
As células totais	foram recolhidas em	tubos	de	centrífuga
de 50mL (falcon)	e centrifugadas	a 350g,	lOmin, à

temperatura ambiente.

Os sedimento derivado da centrifugação foi ressuspendido em 5mL de meio de cultura Alpha Mem com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos e ultraglutamina, (Cambrex) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) , lOOU/mL de penicilina (Cambrex) e ΙΟΟμς/πΗΙ de estreptomicina (Cambrex).

As células totais obtidas foram inoculadas na totalidade para início de expansão ex vivo (PO) em suportes próprios para cultura de tecidos (T-flasks, NUNC), com uma densidade de inóculo de 2.0xl0⁴ células/cm². A cultura celular foi incubada durante 12 dias a 37°C numa incubadora com uma atmosfera húmida contendo 7% de CO₂, no meio acima descrito. A selecção das células precursoras foi feita através da capacidade de adesão à superfície tratada dos suportes utilizados, com mudanças da totalidade do meio após 24h e subsequentemente em intervalos de 72h.

adesão e multiplicação das células na superfície de cultura não foi uniforme na fase inicial de PO, desenvolvendo-se ilhas a partir de clones isolados que atingiram confluências localizadas na ordem dos 100%, sem que a restante superfície fosse ocupada (Fig. IA). Tal só aconteceu passados 12 dias, após o qual se procedeu a uma primeira passagem (Pl - Fig. 1B).

Para o efeito, retirou-se o meio e lavaram-se as células aderentes com tampão fosfato salino (PBS). As células foram tratadas de seguida com uma solução de tripsinaEDTA 0.25% (Sigma Aldrich), e a acção da tripsina inactivada através da adição do mesmo volume de meio de cultura. As células foram então contadas com o auxílio de um hemacitómetro e coloração com azul tripano.

Iniciou-se a segunda fase de adesão e expansão/multiplicação celular após a primeira passagem (Pl) com um inoculo inicial de 2.0xl0⁴ células/cm² sendo que, a partir deste momento, as células expandiram uniformemente sob toda a superfície dos frascos de cultura de tecidos, desde o início (T-flasks, NUNC), com um factor de duplicação de aproximadamente l,5/24h, e com mudanças da totalidade do meio em intervalos de 72h. As células atingiram uma confluência de 100% passados 8 dias (Figs. IC e ID) . O rendimento do método de isolamento de células precursoras, no final de Pl, e ao fim de 20 dias no total, foi, neste caso, de 8.0xl0⁵ células/grama de cordão umbilical.

EXEMPLO 2: Caracterização das células precursoras isoladas através da citometria de fluxo.

Para além da capacidade de adesão e multiplicação num meio de cultura próprio para as células precursoras, as células isoladas foram caracterizadas, no final de Pl, recorrendo à técnica de citometria de fluxo.

Quando as células atingiram uma confluência entre 80% e 90%, no final de Pl, o meio de cultura foi aspirado e a cultura lavada com tampão fosfato Dulbecco (sem Ca²⁺ ou Mg²⁺). Adicionou-se, então, tripsina-EDTA a 0,25% e, assim que as células se libertaram da superfície, adicionaram-se 2 volumes de meio de cultura. Centrifugouse a suspensão celular lOmin a 350g, descartou-se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células em solução bloqueante (0,2% BSA em dPBS), por forma a que a concentração final estivesse entre 2xl0⁶ e 10xl0⁶ células/ml.

Após um período de incubação de lOmin à temperatura ambiente, adicionaram-se ΙΟΟμΙ da suspensão celular a cada tubo já contendo os anticorpos primários conjugados com um de dois fluoróforos: ficoeritrina (PE) ou fluoresceína isotiocianato (FITC). A suspensão celular agitou-se bem e incubou-se em gelo, protegida da luz, durante 20-40min. Ao fim deste período, adicionaram-se a cada tubo 1.5ml dPBS, ressuspendeu-se bem a suspensão celular e centrifugou-se a 350g durante 5min. Descartou se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células em 500μ1 de paraformaldeido a 1%.

A suspensão foi armazenada a 4°C para posterior utilização. A citometria de fluxo efectuou-se num FACScalibur da BD Biosciences detectando-se os antigénios CD44, CD73, CD90 e CD105 como marcadores positivos do estroma mesenquimatosa. Para o efeito utilizaram-se anticorpos primários conjugados com FITC ou PE (Fig. 1). Como marcadores negativos, detectaram-se os antigénios CD14, CD31, CD34 e CD45, específicos para as linhagens hematopoiética (CD34), monocítica (CD14), endotelial (CD31), assim como o marcador panleucocitário (CD45); todos eles utilizando anticorpos conjugados com FITC (Fig. 2). Tal como esperado, a grande maioria das células precursoras isoladas apresentaram-se positivas para CD44, CD73, CD90 e CD105 sendo que, uma percentagem baixa, mas todavia significativa, acusou marcação para os marcadores negativos de linhagem mesenquimatosa. Estes resultados sugerem uma certa heterogeneidade da população de células obtida, que poderá representar uma vantagem futura em termos de aplicação clinica, dada a variabilidade fenotipica.

EXEMPLO 3: Certificação do carácter precursor das células isoladas: diferenciação osteogénica

De acordo com a descrição pormenorizada da invenção, as células precursoras, isoladas a partir de fracções de cordão umbilical humano, demonstraram ter a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos de células especializadas. Neste exemplo demonstra-se a capacidade de diferenciação em células constituintes do tecido ósseo: osteoblastos.

As células foram inoculadas a P3, à densidade de 2.0xl0⁴ células/cm², em meio de diferenciação osteogénica, constituído por a-MEM com 10% FBS, lOmM β-glicerofosfato, lOOU/ml penicilina, 100pg/ml estreptomicina, 50pg/ml ascorbato-2-fosfato, lOOnM dexametasona (Hung et ai., 2002).

O meio foi mudado na totalidade 2 vezes por semana, durante 3 semanas ao fim das quais foram realizados ensaios de coloração específica com Vermelho de Alizarina e Fosfatase Alcalina, ambos positivos. No caso da coloração com Vermelho de Alizarina, o meio foi cuidadosamente aspirado do frasco de cultura de tecidos e as células fixadas com paraformaldeído 4%, durante lOmin à temperatura ambiente.

As células foram então lavadas com PBS e incubadas com uma solução corante específica, Vermelho de Alizarina S, 40mM, pH 4.2, durante 15min, à temperatura ambiente. A solução de Vermelho de Alizarina S foi então removida e as células lavadas cuidadosamente com água (Kotobuki, et al., 2006).

No caso do teste da fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich), as células também foram fixadas com paraformaldeído 4%, durante lOmin, à temperatura ambiente. Posteriormente, lavaram-se as células com PBS e cobriram-se com 2.5ml de uma solução de citrato, incubando-se 30seg.

A solução de citrato foi então removida e as células lavadas com água desionizada (milliQ) e incubadas com uma solução corante específica, vermelho neutro, durante 2min. A solução de vermelho neutro foi removida e as células lavadas cuidadosamente com água (Shim, et al., 2004) . 0 teste acusou positivo para a diferenciação osteogénica (Fig.5).

EXEMPLO 4: Certificação do carácter precursor das células isoladas: diferenciação adipogénica

Com vista à diferenciação das células em adipócitos, as células foram inoculadas a P3, à densidade de 2.0xl0⁴ células/cm², em meio de cultura Alpha MEM com desoxirribonucleósidos (Cambrex), ribonucleósidos (Cambrex) e ultraglutamina (Cambrex), suplementado com

10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco), lOOU/mL de penicilina (Cambrex) e 100gg/mL de estreptomicina (Cambrex), e mantidas neste meio até atingirem uma confluência de 100%. Quando tal aconteceu, o meio foi mudado para meio de diferenciação adipogénica, consistindo de DMEM-LG com 10% FBS, lOOU/ml penicilina, 100pg/ml estreptomicina, 10gg/ml insulina, 200μΜ indometacina, 0.5mM isobutilmetilxantina, ΙμΜ dexametasona (Shih et al., 2005).

O meio foi mudado na totalidade 2 vezes por semana, durante 3 semanas, ao fim das quais foram realizados os ensaios de coloração específica com Óleo-O-Vermelho, confirmando-se assim a diferenciação adipogénica. Para este efeito o meio foi cuidadosamente aspirado do frasco de cultura de tecidos (T-flasks, NUNC) e as células fixadas com paraformaldeído 4%, durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram, então, lavadas com PBS e incubadas com uma solução de Óleo-O-Vermelho (2:3) filtrada, durante pelo menos lOmin à temperatura ambiente. A solução de Óleo-O-Vermelho foi então removida e as células lavadas cuidadosamente duas vezes com água (Do, et al., 2006). O teste acusou positivo para a diferenciação adipogénica (Fig.5).

EXEMPLO 5: Certificação do carácter precursor das células isoladas: diferenciação condrogénica

Para a diferenciação em condrócitos as células foram ressuspendidas a P3, à densidade de l.OxlO⁶ células/ml e colocadas num tubo cónico de 15ml, com vista à formação de condrosferas. O meio de cultura utilizado foi meio de diferenciação condrogénica, consistindo de DMEM-LG com 1% soro bovino fetal (FBS), 6.25gg/ml insulina, lOng/ml TGFpi, 50μΜ ascorbato-2-fosfato (Shih et al., 2005).

O meio foi mudado na totalidade 2 vezes por semana, durante 4 semanas, tendo o cuidado de não perturbar as condrosferas, ao fim das quais se procederam aos ensaios com um corante especifico,

Azul de Alcian, e hematoxicilina, confirmando-se assim a diferenciação condrogénica. Para este efeito, o meio foi aspirado do tubo e as condrosferas lavadas com PBS.

As condrosferas foram imersas em agar e congeladas na fase de vapor do azoto liquido.

Com o auxílio de um micrótomo, seccionou-se o agar gerando secções de tecido com 5μτη de espessura. Estas secções foram então coradas com uma solução 1% do corante específico Azul de Alcian, incubadas 5min à temperatura ambiente e lavadas com PBS. As preparações fixadas em lâminas de vidro foram passadas por uma solução de hematoxilina e incubadas 5min à temperatura ambiente. A hematoxilina foi então removida através de uma última lavagem com PBS (Okada, et al., 2005). O teste acusou positivo para a diferenciação condrogénica (Fig.5).

EXEMPLO 6: Certificação do carácter precursor das células isoladas: diferenciação cardiomiogénica

A diferenciação cardiomiogénica decorreu durante um período de 18 dias, ao longo dos quais se utilizaram diferentes meios de cultura (Lee et al.,

2004). As células foram inoculadas a uma densidade de 3000 células/cm² em placas de imuno-detecção de 16 poços, com revestimento de ornitina (Lab-Tek), usando um meio de cultura, Meio 0, constituído pelo meio basal Alpha-MEM (Lonza) , suplementado 10% FBS (Gibco) e 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco).

horas após a inoculação trocou-se o meio de cultura por um outro meio (Meio 1), constituído por meio basal DMEM-LG (Lonza), suplementado com 10% FBS (Gibco), 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), 10 ng/mL de bFGF (Sigma) e 10μΜ de 5-azacytidina (Sigma).

horas após inoculação no Meio 1, procedeu-se a uma segunda troca de meio, para um meio (Meio 2) constituído por meio basal (Lonza), suplementado com 10% FBS (Gibco), 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), e 10 ng/mL de bFGF (Sigma).

As células foram mantidas em Meio 2 durante duas semanas, com mudança do mesmo em intervalos de 7 2h.

Em paralelo, foram inoculadas células controlo (sem diferenciação) à densidade 5000 células/cm², que foram mantidas em Meio 0. Decorrido o período de diferenciação, procedeu-se a um ensaio de imunofluorescência utilizando um anticorpo primário contra uma proteína típica dos tecidos musculares, a Troponina T cardíaca, específica dos cardiomiócitos (R&D System). Para efeitos de localização das células em cultura os núcleos celulares foram detectados com o fluorocromo DAPI (Sigma), especifico para os ácidos nucleicos. Tal como esperado, apenas as células que foram sujeitas ao protocolo de diferenciação cardiomiogénica, e que apresentavam à partida uma morfologia típica dos cardiomiócitos (Fig. 6B) , produziram sinal de fluorescência na reacção com o anticorpo primário contra a Troponina T (Fig. 6D).

EXEMPLO 7: Certificação do carácter precursor das células isoladas: diferenciação neurogénica/glial

A diferenciação neurogénica decorreu durante um período de 12 dias, ao longo dos quais se utilizaram diferentes meios de cultura (Lee et al., 2004).

As células foram inoculadas a uma densidade de 3000 células/cm² em placas de imuno-detecção de 16 poços, com revestimento de ornitina (Lab-Tek), usando um meio de cultura (Meio 1), constituído pelo meio basal IMDM (Cambrex) suplementado com 10% FBS (Gibco), 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), 5 ng/mL de bFGF (Sigma); 0,5 μΜ ácido retinóico e lmM 2-mercaptoetanol (Gibco).

Passados 3 dias, o Meio 1 foi substituído por um outro meio (Meio 2), constituído por meio basal IMDM (Cambrex), suplementado com 10% FBS (Gibco) , 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), 1 mM adenosina monofosfato cíclico (cAMP, Sigma) e 100 μΜ ascorbato-2-fosfato (Sigma).

Passados 3 dias, o Meio 2 foi substituído por um outro meio (Meio 3), constituído por meio basal IMDM (Cambrex), suplementado com 10% FBS (Gibco) , 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), 1 mM adenosina monofosfato cíclico (cAMP, Sigma) e 10 μΜ hidrocortisona (Sigma).

Finalmente, passados 3 dias, o Meio 3 foi substituído por um outro meio (Meio 4), constituído por meio basal IMDM (Cambrex), suplementado com 10% FBS (Gibco), 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco), 2mM L-glutamina (Sigma), 20 ng/mL de FGF-1 (Insight Biotechnology), 10 ng/mL de SHH (R&D) , 10 ng/mL de BDNF (Insight Biotechnology) , 10 ng/mL de NGF (BD) , 25 ng/mL de vitronectina (Sigma), 100μΜ ascorbato-2-fosfato (Sigma),

100μΜ Isobutilmetilxantina (IBMX, Sigma), 10μΜ forscolina (Sigma) e 20nM PMA (Sigma).

Em paralelo, foram inoculadas células controlo (sem diferenciação) à densidade 5000 células/cm², que foram mantidas em Meio 0 (ver protocolo de diferenciação cardiomiogénica).

Decorrido o período de diferenciação, procedeu-se a um ensaio de imunofluorescência utilizando um anticorpo primário contra a β-Tubulina, tipo III, especifica das células neuronais (Sigma). Para efeitos de localização das células em cultura os núcleos celulares foram detectados com o fluorocromo DAPI (Sigma), específico para os ácidos nucleicos. Tal como esperado, apenas as células que foram sujeitas ao protocolo de diferenciação neurogénica/glial, e que apresentavam à partida uma morfologia típica das células gliais (Fig. 7B), produziram sinal de fluorescência na reacção com o anticorpo primário contra a β-Tubulina III (Fig. 7D).

REFERÊNCIAS

Auger F. A., Germain L., Remy-Zolghadri M. e C. J. Hayward (2005) . Method of isolating cells from umbilical cord. W02005001081.

Barry F. P. e J. M. Murphy (2004) Mesenchymal stem cells: clinicai applications and biological characterization. Int. J. Biochem. & Cell Biol. 36:568-584.

Bieback K., Kern S., Kluter H. e H. Heichler (2004). Criticai parameters for isolating mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells, 22:625-634.

Carvalhal A. V., Lima, C., Basto V., Cunha C., Escada P., Cruz P. e H. Cruz (2007). Adult human neural stem/progenitor cells from the olfactory epithelium and olfactory lamina própria, isolation method, proliferation and differentiation in serum free culture médium and utilization for transplantation. W02007020611.

Chul-Won Η. A., Yoon-Sun Y. e Y. Sung-Eun (2003). Isolation and culture-expansion methods of mesenchymal stem/progenitor cells from umbilical cord blood, and differentiation method of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem/projenitor into various mesenchymal tissues. W02003070922.

Da-Silva E. A., Sampaio F. J. , Dornas M. C., Damiao R. e L. E. Cardoso (2002) Extracellular matrix changes in urethral stricture disease. J. Urol. 168:805-807.

Davies J. E., Dolores B. , Raúl S. , Morris H. e A. D. S. Lickorish (2004). Progenitor cells from Wharton's jelly of human umbilical cord. W02004072273.

Deryl L. T. e M. L. Weiss (2008). Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells, 26:591-599.

Driska S. P. e R. Porter (1986). Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 25:474-481.

Eddinger T. J. , Schiebout' J. D. e D. R. Swartz (2007) Adherens junction-associated protein distribution differs in smooth muscle tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292:684-697.

Heinegârd D., Lohmander S. e J. Thyberg (1978) Cartilage proteoglycan aggregates. Electron-microscopic studies of native and fragmented molecules. Biochem J. 175:913-9.

Inoue S. e M. Iwasaki (1976) Dermatan sulfate-chondroitin

sulfate copolymers	from	ambilical cord.	Isolation and
characterization. J	Biochem	. 80:513-24.
Kadner A., Zund G.,	Maurus	C., Breymann C.,	Yakarisik S.,
Kadner G. , Turina	M. e S	P. Hoerstrup	(2004).	Human
umbilical cord	cells	for cardiovascular	tissue

engineering: a comparative study. European Journal of

Cardio-Thoracic Surgery 25:635-641.

Kalea A. Z., Lamari F. N., Theocharis A. D., Schuschke D.

A., Karamanos N. K. e D. J. Klimis-Zacas (2006) Dietary manganese affects the concentration, composition and sulfation pattern of heparin sulphate glycosaminoglycans in Sprague-Dawley rat aorta. Biometals 19:535-546. phosphate. J. Mat. Sei.: Mat. Med. 17:33-41.

Lee C., Hornacek C. e T. T. Dinh (1994). Process for purifying collagenase. WO1994024272

Lee 0. K.,	Kuo T.	K., Chen W	. M., Lee	K. D	., Hsieh	S. L.
E T. H.	Chen	(2004) .	Isolation	of	multipontent
mesenchymal	stem	cells from	umbilical	cord	blood.	Blood,
103:1669-1675.
Majumdar M	. K. ,	Thiede M.	A. e J.	D.	Mosca (	1998) .
Phenotypic	and	functional	comparison of	cultures of

marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J. Cell Physiol 176:57-66.

Mistry S., Kihm, A., Harris I., Harmon A., Messina D., Seyda A., Yi C. F. e A. Gosiewska (2006). Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same. W02005001078.

Mitchell K. E., Weiss M. L., Mitchell Β. M., Martin P., Davis D., Morales L., Helwig B., Beerenstrauch M., AbouEasa K. , Hildreth T. e D. Troyer (2003) . Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells 21:50-60, 2003.

Nanaev A. K., Kohnen G., Milovanov A. P., Domogatsky S. P. e P. Kaufmann (1997). Stromal differentiation and architecture of the human umbilical cord. Placenta 18:53.64.

Phan T. T. (2007) . Isolation and cultivation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord and uses of cells differentiated therefrom. W02007046775.

Panchision D. M., Chen H. L., Pistollato F., Papini D., Ni Η. T. e T. S. Hawley (2007). Optimized flow cytometric analysis of CNS tissue reveals novel functional relationships. Stem Cells 0:2006-0260vl.

Pittenger M. F., Mackay A. M. e C. B. Beck (1999) . Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284:143-147.

Purchio A. F., Naughton Β. A. e J. San Roman (1998) . Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly. W0199801779.

Quezada-Calvillo R., Rodriguez-Zuniga F. e B. J. Underdown (2002). Partial characterization of murine maltase-glucoamylase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 295:394-400.

Rawlings N. D. e A. J. Barret (1999) MEROPS: the peptidase database. Nuc. Acids Res. 27:325-331.

Rodrigues E. D., Pimentel E. R., Mourao P. A. e L. Gomes (2005) . Distribution of small proteoglycans and glycosaminoglycans in humerus-reiated articular cartilage of chikens, Braz. J. Med. Biol. Res. 38:381-390.

Roisen F. J., Klueber K. M., Lu C. L., Hatcher L. M.,

Dozier A., Shields C. B. e S. Maguire (2001) Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890:11-22.

Rogers Β. A., Murphy C. L., Cannon S. R. e T.W. Briggs (2006). Topographical variation in glycosaminoglycan content in human articular cartilage. J. Boen Joint Surg. 88:19670-1674.

Romanov Y. A., Svintsitskaya V. A. e V. N. Smirnov (2003). Searching fro alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-lke cells from umbilical cord. Stem Cells 21:105-110.

Schaller A. (2004). A cut above the rest: the regulatory function of plant proteases. Planta 220:183-197.

Seyda A. e A. Gosiewska (2006). Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same. W02006101548.

Wang H. S., Hung S. C., Peng S. T., Huang C. C., Wei H. M., Guo Y. J., Fu Y. S., Lai M. C. e C. C. Chen (2006). Mesenchymal stem cells in he Wharton's jelly of the umbilical cord, Stem Cells 22:1330-1337.

Claims (16)

1- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, como sejam a papaina, bromelaína, ficina, actinidina, fitocalpainas, legumainas, metacaspases, saspases, quimotripsinas, subtilisinas, carboxipeptidases, presenilinas, e pepsinas, como sejam as fitepsinas, mais precisamente as cardosinas e as ciprosinas/cinarases/cinarinas, bem como outras enzimas pertencentes às famílias destas, caracterizada pelas peptidases serem preferencialmente puras, estarem livres de componentes animais e microbianos, como sejam, por exemplo, mas não limitados a, vírus, priões, e toxinas animais e microbianas em geral, e a sua utilização ser direccionada à digestão da matriz do cordão umbilical humano, constituinte das zonas sub-amniótica, intervascular, e perivascular do tecido, com o objectivo de libertar as células, mantendo, para além da integridade celular, a viabilidade celular, e a capacidade de adesão e expansão/multiplicação das células em cultura.

2- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas enzimas serem utilizadas isoladamente ou em combinações entre si.

3- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelas enzimas de origem vegetal serem utilizadas em combinações com outras enzimas de origem não vegetal, como sejam extractos de colagenase, colagenase pura, tripsinas, hialuronidase, dispase, proteinase K, extractos de pronase, pronase pura, extractos de liberase, ou liberase pura.

4- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por conter os seguintes passos, sequencialmente:

b)

Um passo precedente de recolha onde o cordão umbilical humano é escorrido de sangue e transportado para o laboratório, num recipiente estéril hermeticamente fechado, a seco, ou numa solução contendo 186pg/ml CaCl₂-2H₂O, 400μς/ιη1 KC1, 60gg/ml KH₂PO₄, 20C^g/ml MgSO₄-7H₂O, 8000μρ/ιη1 NaCl, 35C^g/ml NaHCO₃, 9C^g/ml NaH₂PO4 · 7H₂O, 2000pg/ml glucose, e 1% duma mistura equimolar de penicilina e estreptomicina, preferencialmente à temperatura ambiente, desde que a amostra seja processada num período até 4 8h, ou a uma temperatura entre os 2 e os 8°C, caso a amostra seja processada num período superior a 48h.

Três passos precedentes de lavagem do cordão umbilical com uma solução contendo 186μg/ml CaCl₂-2H₂O, 40C^g/ml KC1, 60gg/ml KH₂PO₄, 20C^g/ml Μς3Ο₄·7Η₂Ο, 8000pg/ml NaCl, 350μς/πι1 NaHCO₃, 9C^g/ml NaH₂PO4 · 7H₂O,

Um passo precedente de eliminação da película exterior (membrana amniótica) com o auxílio de uma pinça estéril,

d) Um passo precedente de fraccionamento transversal do cordão umbilical em relação ao seu eixo longitudinal, consistindo de cortes produzidos com um bisturi, produzindo fracções com 2,

5cm de comprimento, correspondendo aproximadamente a 2,5g,

e) Um passo precedente, alternativo, de eliminação de coágulos de sangue existentes nos vasos umbilicais das fracções de d),

f)

Um passo de utilização onde cada fracção com

2,5g de cordão umbilical é digerida recorrendo à actividade peptidica da papaína, mantendo uma relação proporcional entre a massa de cordão umbilical (g) e o volume da solução de digestão (ml) de 1:2, mais especificamente, utilizando papaína com uma concentração final na solução de digestão entre lOOU/ml, preferencialmente

20U/ml, dentro dum recipiente estéril, como seja um frasco para cultura de tecidos, selado com tampa estanque, com uma superfície de fundo entre

11,25 e

3 5 cm², numa solução consistindo de de digestão

25mM de Ácido 4-(2hidroxietil)-1-piperazina-etano-sulfónico (HEPES), suplementada com 5mM de CaCl₂ e 5mM de L-Cisteína, durante um período de 2 a 16 h, preferencialmente entre 2 e 4 h, a 37°C, com agitação entre 100 e 140 oscilações.min^-1 (opm).

g) Um passo posterior, alternativo, de recuperação de células libertadas a partir do tecido digerido tal como descrito em f) , recorrendo à sua capacidade de adesão, consistindo duma incubação estática, horizontal, do frasco de cultura de tecidos onde é processada a digestão, durante um período que pode variar entre 5 e 300 minutos, preferencialmente de 30 minutos, à temperatura e meio ambiente; duma pipetagem, evitando a sucção de resquícios de tecido não digerido, da solução de digestão para um tubo de centrífuga de 50mL; duma decantação dos resquícios de tecido não digerido; duma adição de 5ml de meio de cultura basal, ao frasco onde foi processada a digestão, suplementado com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos e

10% de Soro Fetal

Bovino (FBS);

h)

Um passo posterior, alternativo, de recuperação de células libertadas a partir do tecido digerido tal como descrito em f) ,

recorrendo à sua capacidade de adesão, consistindo duma centrifugação do tubo de centrífuga de 50mL para onde em g) foi

a 350g, decantada a solução de digestão, durante lOmin, à temperatura ambiente; da pipetagem de 5ml do sobrenadante resultante da centrifugação para um frasco de cultura de tecidos, como seja um T25, apetrechado com tampa com filtro; da adição de 5ml de meio de cultura basal, suplementado com desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos e 10% de Soro Fetal Bovino,

i) Um passo posterior em que as células, após o período de incubação, são recolhidas através da sua sedimentação por centrifugação da solução de digestão, num tubo de centrífuga

de 50mL, com uma força centrífuga entre os lOOg e 500g, preferencialmente 350g, durante um período que pode variar entre os 5min e 45min, preferencialmente lOmin, a uma temperatura entre os 12°C e 37°C, preferencialmente à temperatura ambiente.

6- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pela maioria das células da população isolada reunir as seguintes caracteristicas: capacidade de adesão e expansão/multiplicação numa superfície e meio de cultura adequados para adesão as células mesenquimatosas, expressão dos marcadores de superfície celular CD44, CD73, CD90 e CD105, ausência de expressão dos marcadores de superfície celular CD14, CD31, CD34 e CD45, com uma taxa de multiplicação de aproximadamente l,5/24h, podendo atingir 14 fases de adesão e expansão/multiplicação, mantendo uma morfologia fibroblastóide constantes, e capacidade de diferenciação parcial ou terminal noutro tipo de células, como sejam, comprovadamente, os osteoblastos, condrócitos, adipócitos, cardiomiócitos e células neurais/gliais.

Ί- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por coexistirem, na população isolada, uma minoria de células da linhagem epitelial, assim como outras células em estados de diferenciação mais avançados, como sejam, mas não limitadas a, miofibroblastos, fibroblastos, células endoteliais, condrócitos, mastócitos, adipócitos, macrófagos, monócitos, linfócitos, e células estaminais provenientes do sangue do cordão umbilical.

8- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pela maioria das células serem aplicáveis a protocolos de terapia celular, como sejam, mas não limitados a, protocolos onde a células são administradas no paciente directamente após o isolamento, com ou sem criopreservação intermédia, com ou sem expansão intermédia, por via sistémica ou localizada, como seja uma administração intravenosa, injecção local ou punção lombar, sem que as células sejam sujeitas a qualquer diferenciação prévia à sua administração no paciente.

9- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por se recorrer a uma acção terapêutica das células derivada da sua actividade adjuvante da multiplicação e diferenciação de outras células existentes no organismo, como sejam, mas não limitadas a, células precursoras ou estaminais em geral, células estaminais do tipo embrionário, células da linhagem hematopoiética, e células estaminais precursoras dos gâmetas adultos.

10- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por se recorrer a uma acção terapêutica das células derivada à capacidade das mesmas modularem o funcionamento do sistema imunitário, como seja através da síntese de moléculas, tais como, mas não limitadas a, citocinas e factores estimulantes da formação de colónias de macrófagos.

11- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por se recorrer a uma acção terapêutica das células derivada à sua capacidade de, uma vez dentro do organismo, migrar e/ou aderir a áreas patologicamente afectadas, como sejam, mas não limitadas a, onde exista crescimento tumoral.

12- Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelas células servirem de veículo para administração localizada de uma molécula ou um composto molecular, seja esta molécula, ou composto, natural ou sintético, como seja, mas não limitado a, uma proteína, um péptido, uma pequena molécula orgânica, um oligossacárido, um polissacárido, um proteoglicano, um lípido, ou qualquer combinação das anteriores, desde que com actividade terapêutica.

13 - Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizada pela maioria das células ser aplicável a protocolos de terapia celular, como sejam, mas não limitados a, protocolos onde as células são administradas no paciente, com ou sem criopreservação intermédia, com ou sem expansão intermédia, por via sistémica ou localizada, como seja uma administração intravenosa, injecção local, lombar, após diferenciação induzida in vitro em qualquer outro tipo de células do corpo humano, percursoras ou terminalmente diferenciadas, como sejam, para além dos osteoblastos, condrócitos, adipócitos, cardiomiócitos, e células gliais, células de músculo liso, células de músculo esquelético, tenócitos, fibroblastos, células dos folículos capilares, células das glândulas endócrinas e células de linhagem neural para além das células gliais, incluindo células neuroprecursoras e células do sistema nervoso, como neurónios, oligodendrócitos e astrócitos, células constituintes do epitélio conjuntivo, do epitélio da pele, do epitélio da córnea, do epitélio da retina, do epitélio do fígado, do epitélio do rim, do epitélio do pâncreas, do epitélio do intestino delgado, do epitélio do intestino grosso, do epitélio da bexiga e do epitélio uterino, do epitélio da faringe e do epitélio da laringe.

14 - Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pela maioria das células, com ou sem criopreservação intermédia, com ou sem expansão intermédia, com ou sem diferenciação intermédia, serem aplicáveis a protocolos de terapia celular onde as células são administradas de uma forma autóloga ou de uma forma alogénica.

15 - Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pelo desenvolvimento duma composição farmacológica contendo a maioria das células, íntegras, sob a forma de extracto ou separadas em componentes.

16 - Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pela utilização das células, íntegras, sob forma de extractos ou em componentes, para a produção de superfícies e/ou camadas e/ou suportes para culturas celulares de mamífero.

17 - Utilização de peptidases de origem estritamente vegetal, acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pela manipulação genética das células com vista a alterar a sua capacidade de multiplicação e/ou diferenciação, como o fim, mas não limitado a, desenvolver linhas celulares.