CN113481155A - 骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法 - Google Patents

骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法。所述骨髓间充质干细胞培养基包括基础培养基、血清、庆大霉素、两性霉素B、维生素C、碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松。所述基础培养基为DEME。所述血清为胎牛血清、人体血清中的任意一种。本发明提供的骨髓间充质干细胞培养基培养能够增强骨髓间充质干细胞的增殖能力和附着效率，同时不影响骨髓间充质干细胞的多功能性，有利于骨髓间充质干细胞的临床研究和应用。

Description

骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法。
背景技术
骨髓液等中所含的间充质干细胞具有多能性，可分化为骨、软骨、脂肪等组织。因此，它备受细胞治疗和再生医学领域的关注。然而，骨髓液中所含的间充质干细胞非常少。所以，如何在短时间内从骨髓液中获取的大量间充质干细胞是实现细胞治疗和再生医疗的关键。
从骨髓液中提取间充质干细胞的方法之一是把骨髓液放在培养皿，让间充质干细胞附着到培养皿底面。但是，骨髓液中含的大量含有的红细胞等血细胞成分，而且密度比间充质干细胞重，这些细胞就会更快地沉降到培养容器底部阻碍间充质干细胞的贴壁。
鉴于上述情况，本发明是从提高骨髓里的间充质干细胞在原代培养中对培养容器底部的贴壁效率和培养速度出发，达到快速获得临床所需的量间充质干细胞。
为了实现上述目的，本发明首先是在骨髓里的间充质干细胞在原代培养时添加地塞米松来提高间充质干细胞的贴壁效率，同时在为了提高细胞生长速度同时添加了维生素C和碱性成纤维细胞生长因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞培养基及骨髓间充质干细胞培养方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种骨髓间充质干细胞培养基，所述骨髓间质干细胞培养基包括基础培养基、血清、两性霉素B、维生素C、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和地塞米松。
上述基础培养基为DEME。
上述血清为胎牛血清（FBS）、人体血清中的任意一种。
上述骨髓间质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、25-1000μg/ml维生素C、1-100ng/ml bFGF和1-1000nM地塞米松。
作为优选，上述骨髓间质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50-200μg/ml维生素C、10-50ng/ml bFGF和10-100nM地塞米松。
作为优选，上述骨髓间充质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50μg/ml维生素C、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10nM地塞米松。
本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞培养方法，采用本发明提供的骨髓间充质干细胞培养基培养骨髓间充质干细胞。
本发明中所用DMEM还可替换为其他基础培养基。
本发明的有益效果在于：本发明提供的骨髓间充质干细胞培养基能有效提高骨髓间充质干细胞的体外扩增效率和贴壁效率，利用该骨髓间充质干细胞培养基，可快速获得足够数量的骨髓间充质干细胞，有利于骨髓间充质干细胞的临床研究和应用。
附图说明
图1为实施例1中不同培养基培养下所获得的骨髓间充质干细胞集落数。
图2为实施例2中不同培养基培养下所获得的骨髓间充质干细胞数。
图3为实施例3中不同个体样本在不同培养基培养下所获得的骨髓间充质干细胞数。
图4为实施例4中骨分化诱导第3天和第7天的碱性磷酸酶染色结果。
图5为实施例4中脂肪细胞分化诱导第 6天的脂肪细胞形成结果。
图6为实施例5中不同培养基培养下所获得的骨髓间质干细胞数。
图7为实施例6中不同培养基培养下所获得的骨髓间质干细胞数。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所用到的材料及试剂如下：
DMEM、庆大霉素、两性霉素B均购自Gibco公司；
FBS购自HyClone公司；
维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠均购自Sigma-Aldrich公司；
bFGF购自R&D SYSTEMS公司；
健康人体髂嵴骨髓液原液（BM040408、BM1017、BM1019）购自AllCells公司；
人骨髓来源间充质干细胞购自Lonza公司；
碱性磷酸酶染色试剂盒Alkaline Phosphatase Staining Kit购自Cosmo Bio公司；
脂肪细胞分化培养基BMK-R006购自Funakoshi公司；
人体血清为骨科手术前征得病人及家属同意，抽取病人自体血液术中备用，临床使用后剩余的部分，按照按文献Int J Ophthalmol. 2017; 10(6): 908–913.的方法调制而成。
实施例1
本实施例中的培养基如下：
培养基A：DMEM＋终浓度10vol% FBS＋终浓度50μg/mL庆大霉素＋终浓度0.25 μg/mL两性霉素B。
培养基B：培养基A＋终浓度50μg/ml维生素C＋终浓度10ng/ml bFGF。
培养基C：培养基B＋终浓度10nM/ml地塞米松。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将10ml健康人体髂嵴骨髓液原液（BM1019）以1500rpm x 5min离心分离，除去离心分离后的脂肪和上清液，得到骨髓间充质干细胞沉淀；将上述细胞沉淀分成三等份，每份分别加入培养基A、培养基B和培养基C，分别制备成30mL的细胞悬浊液；分别取10mL上述细胞悬浊液于无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2-3天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加10mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第7天时，除去培养皿中的培养基；用PBS（pH7.4）清洗培养皿两次，然后除去PBS；向培养皿中加入10ml 0.5wt%的结晶紫溶液，室温放置30min以上，再除去结晶紫溶液；用自来水清洗培养皿，吸去水分，将培养皿风干，统计细胞集落数。
结果如图1所示，培养基A、培养基B、培养基C培养下所获得的骨髓间充质干细胞集落数分别为60个、81个、153个；在骨髓间充质干细胞培养基中添加地塞米松对可有效提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率。
实施例2
本实施例中的培养基如下：
培养基B：配方同实施例1。
培养基B1：培养基B＋终浓度1nM/ml地塞米松。
培养基B2：培养基B＋终浓度100nM/ml地塞米松。
培养基B3：培养基B＋终浓度1000nM/ml地塞米松。
培养基C：培养基B＋终浓度10nM/ml地塞米松。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将10ml健康人体髂嵴骨髓液原液（BM1019）以1500rpmx5min离心分离，除去离心分离后的脂肪和上清液，得到骨髓间充质干细胞沉淀；将上述细胞沉淀分成五等份，每份分别加入培养基B、培养基B1、培养基B2、培养基B3和培养基C，分别制备成30mL的细胞悬浊液；分别取10mL上述细胞悬浊液于无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2-3天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加10mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第10-11天时，回收培养皿中的细胞并通过血细胞计数器进行计数。
如图2所示，培养基B1、培养基B2、培养基B3和培养基C培养下所获得的骨髓间充质干细胞数分别是培养基B的1.7倍、2.7倍、2.5倍和4.1倍；在骨髓间充质干细胞培养基中添加终浓度为10nM的地塞米松，最有利于骨髓间充质干细胞的增殖。
实施例3
本实施例中的培养基如下：
培养基A：配方同实施例1。
培养基B：培养基A＋终浓度50μg/ml维生素C＋终浓度10ng/ml bFGF。
培养基C：培养基B＋终浓度10nM/ml地塞米松。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将10ml健康人体髂嵴骨髓液原液以1500rpmx5min离心分离，除去离心分离后的脂肪和上清液，得到骨髓间充质干细胞沉淀；将上述细胞沉淀分成三等份，每份分别加入培养基A、培养基B和培养基C，分别制备成30mL的细胞悬浊液；分别取10mL上述细胞悬浊液于无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2-3天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加10mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第10-11天时，回收培养皿中的细胞并通过血细胞计数器进行计数。
三个不同健康人体髂嵴骨髓液原液样品（BM040408，BM1017和 BM1019）间充质干细胞培养结果如图3和表1所示。培养基C培养下所获得的骨髓间充质干细胞数是培养基A的7.5-19倍，是培养基B组的1.8-3.5倍。因此，在骨髓间充质干细胞培养基中添加地塞米松，可在短时间内从骨髓液中获得大量间充质干细胞，从而缩短细胞培养时间和移植物的制造周期。
表1不同个体的骨髓在各培养基培养后所获得的间充质干细胞数(1x106/10mLBM)
Figure 916465DEST_PATH_IMAGE001
实施例4
本实施例中的培养基如下：
培养基B：配方同实施例1。
培养基C：培养基B＋终浓度10nM/ml地塞米松。
骨分化培养基：DMEM＋终浓度10vol% FBS＋终浓度50μg/mL维生素C ＋终浓度10- 7M地塞米松 + 10 mM β-甘油磷酸钠。
脂肪细胞分化培养基：购自日本Funakoshi 公司。
采用培养基B和培养基C培养骨髓间充质干细胞，然后将所获得的骨髓间充质干细胞进行骨分化和脂肪分化诱导，具体步骤如下：
将10ml健康人体髂嵴骨髓液原液（BM1019）以1500rpmx5min离心分离，除去离心分离后的脂肪和上清液，得到骨髓间充质干细胞沉淀；将上述细胞沉淀分成两等份，每份分别加入培养基B和培养基C，分别制备成30mL的细胞悬浊液；分别取10mL上述细胞悬浊液于无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2-3天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加10mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第11天时，回收培养皿中的细胞；将所获得的间充质干细胞用分别用骨分化培养基和脂肪细胞分化培养基稀释，分别按10000 cells/cm2播种到六孔板中，放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，每2-3天更换一次新的培养基；利用碱性磷酸酶染色试剂盒AlkalinePhosphatase Staining Kit对骨分化培养后的骨髓间质干细胞细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色（染色方法参照：Adv Healthc Mater. 2015 Jan 28;4(2):215-22）。
骨分化诱导第3天和第7天的 ALP 染色结果如图4所示，在骨分化诱导的第3天，培养基B和培养基C原代培养下所获得的骨髓间充质干细胞都具有非常低的碱性磷酸酶活性；在骨分化诱导的第7天，培养基B和培养基C培养下所获得的骨髓间充质干细胞显示出同等的碱性磷酸酶活性。脂肪细胞分化诱导第 6天的脂肪细胞形成结果如图5所示，低浓度的地塞米松（培养基C）和不添加地塞米松（培养基B）均不影响骨髓间充质干细胞的脂肪分化。
实施例5
本实施例中的培养基如下：
培养基A：配方同实施例1。
培养基A1：培养基A＋终浓度25μg/ml维生素C。
培养基A2：培养基A＋终浓度50μg/ml维生素C。
培养基A3：培养基A＋终浓度100μg/ml维生素C。
培养基A4：培养基A＋终浓度200μg/ml维生素C。
培养基A5：培养基A＋终浓度400μg/ml维生素C。
培养基A6：培养基A＋终浓度1000μg/ml维生素C。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将用培养基A继代培养到第5代的人骨髓来源间充质干细胞（Lonza）分成七等份，每份分别加入培养基A、培养基A1、培养基A2、培养基A3、培养基A4、培养基A5和培养基A6，每份为含有10000个细胞的10mL细胞悬浊液；分别取3mL上述细胞悬浊液于6 well plate无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加3mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第4天时，回收培养皿中的细胞并通过血细胞计数器进行计数。
如图6所示，培养基A1、培养基A2、培养基A3、培养基A4、培养基A5和培养基A6培养下所获得的骨髓间充质干细胞数分别是培养基A的2.10倍、2.23倍、2.14倍、2.13倍、1.87倍和1.85倍；在骨髓间充质干细胞培养基中添加终浓度为50μg/ml的维生素C，最有利于骨髓间充质干细胞的增殖。
实施例6
本实施例中的培养基如下：
培养基A：配方同实施例1。
培养基A7：培养基A＋终浓度1ng/ml bFGF。
培养基A8：培养基A＋终浓度10ng/ml bFGF。
培养基A9：培养基A＋终浓度50ng/ml bFGF。
培养基A10：培养基A＋终浓度100ng/ml bFGF。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将用培养基A继代培养到第5代的人骨髓来源间充质干细胞（Lonza）分成五等份，，每份分别加入培养基A、培养基A7、培养基A8、培养基A9和培养基A10，每份为含有10000个细胞的10mL细胞悬浊液；分别取3mL上述细胞悬浊液于6 well plate无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加3mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第4天时，回收培养皿中的细胞并通过血细胞计数器进行计数。
如图7所示，培养基A7、培养基A8、培养基A9和培养基A10培养下所获得的骨髓间充质干细胞数分别是培养基A的1.90倍、2.88倍、3.34倍和3.23倍；在骨髓间充质干细胞培养基中添加终浓度为50ng/ml的bFGF，最有利于骨髓间充质干细胞的增殖。
实施例7
本实施例中的培养基如下：
培养A：DMEM＋终浓度10vol% FBS＋终浓度50μg/mL庆大霉素＋终浓度0.25 μg/mL两性霉素。
培养A11：DMEM＋终浓度10vol% HS（人体血清）＋终浓度50μg/mL庆大霉素＋终浓度0.25 μg/mL两性霉素。
培养C1：DMEM＋终浓度10vol% HS（人体血清）＋终浓度50μg/mL庆大霉素＋终浓度0.25 μg/mL两性霉素＋终浓度50μg/ml维生素C＋终浓度10ng/ml bFGF＋终浓度10nM/ml地塞米松。
采用上述培养基培养骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
将10ml健康人体髂嵴骨髓液原液（BMK040608）以1500rpm x 5min离心分离，除去离心分离后的脂肪和上清液，得到骨髓间充质干细胞沉淀；将上述细胞沉淀分成3等份，每份分别加入培养基A、培养基A11、培养基C1，分别制备成30mL的细胞悬浊液；分别取10mL上述细胞悬浊液于无菌培养皿中，然后放入37℃、湿度100%、5%CO2的培养箱中培养，以后每2-3天更换一次新的培养基（先将旧的培养基去掉，然后添加10mL新鲜的与上一次相同的培养基）；在培养至第8天时，除去培养皿中的培养基；用PBS（pH7.4）清洗培养皿两次，然后除去PBS；向培养皿中加入10ml 0.5wt%的结晶紫溶液，室温放置30min以上，再除去结晶紫溶液；用自来水清洗培养皿，吸去水分，将培养皿风干，统计细胞集落数。
培养基A、培养基A11、培养基C1培养下所获得的骨髓间充质干细胞集落数分别为77个、94个、170个。因此，用人体血清等终浓度替换本发明培养基中的胎牛血清时，地塞米松同样能够有效提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率。

Claims (7)

1.一种骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞培养基包括基础培养基、血清、大庆霉素、两性霉素B、维生素C、碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述基础培养基为DEME。
3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述血清为胎牛血清、人体血清中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、25-1000μg/ml维生素C、1-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1-1000nM地塞米松。
5.根据权利要求4所述的骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50-200μg/ml维生素C、10-50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-100nM地塞米松。
6.根据权利要求5所述的骨髓间充质干细胞培养基，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞培养基中含有10vol%血清、50μg/ml庆大霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50μg/ml维生素C、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10nM地塞米松。
7.一种骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞培养基培养骨髓间充质干细胞。
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