CN107219359A - 一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，其涉及生物技术领域。本发明用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体，试剂盒用于检测具有致病性的特异性抗供者抗体。本发明是将器官受者的血清加入与供者组织相容抗原相同的血管内皮细胞培养物内，在摄氏温度35℃‑37℃下培育后测定血管内皮细胞的反应。试验结果揭示了器官移植受者与供者之间高度特异且精准的相互作用，为早期发现器官排异反应并制定早期治疗方案提供了病理学依据。不需活检材料，为临床医师提供了一种定期监视接受器官移植病人的有力、有效且十分经济的手段。

Description

一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试 剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体。

背景技术

外科移植是目前根治器官衰竭最有效的途径，它不但需要严格广泛的医疗护理，还要求器官供者和受者之间的人类组织相容抗原相同以避免受者的免疫系统攻击外来的组织。如果二者的人类组织相容抗原类型不同，受者体内天然存在或诱导合成的抗体将攻击移植的器官组织。然而，在临床实践中，器官供者和资源十分限制，供者和受者之间的抗原相同程度变异相当巨大。据报道，8－25％的接受器官移植的病人都会产生针对供者特异的抗体即DSA,其中50％的病人在五年内将出现抗体介导的排斥反应并最终导致器官移植失败。

然而，不是所有的DSA都能介导排斥反应。虽然DSA的某些特性包括亚型、滴度、特异性、结合力及克隆性与致病性有密切关系，但是目前尚无试验手段直接观察DSA与供者血管细胞的相互作用。这是鉴定DSA的致病性的关键步骤；DSA与供者细胞的相互作用才是决定器官在受者体内生存时间的决定性因素。

迄今为止，LUMINEX公司生产的单抗原微球是临床上检测DSA最常用的方法。它评估的原理是在每个微球上均包被不同的人类组织相容抗原，它们可特异性地结合病人血内的DSA，从而确定它们的种类和强度。虽然单抗原微球法可以提供DSA在免疫学上的特性，但是，它不能完全确立DSA在介导细胞功能方面的作用。这在一定程度上限制了它在指导临床医师决策的应有的价值。

C1q单抗原球检测法是在临床中使用的鉴定致病性DSA的试验。C1q受抗体活化并启动经典补体激活途径，其产物C4d沉积在组织中导致细胞毒性溶解，造成移植的器官功能丧失。迄今为止，大量科学研究与临床结果认为补体激活是急性排斥反应的主要途径，而慢性排斥反应与非补体途径的激活更相关。

抗体介导的排斥反应是一个极为复杂包含众多机制的过程。具有致病性的DSA不但要与血管内皮细胞表面的人类组织相容抗原紧密结合，而且能进一步触发细胞内的信号传导通路，才会造成内皮细胞激活。持续激活的内皮细胞一方面加速释放炎性因子，另一方面在细胞表面增加粘附蛋白。这些反应的综合结果是在毛细血管周围侵润大量炎性细胞和细胞增殖，进一步发展为血管阻塞，组织坏死。由此可见，精准评估DSA的致病性必须依赖于DSA与血管内皮细胞的相互作用。

综上所述，慢性抗体介导的排斥反应是当今器官移植医学首要解决的问题，它不仅增加了病人的经济负担，而且令移植的器官在体内不能发挥予期的功能。本发明建立了洞察DSA与血管内皮细胞相互作用的检测手段；它可特异地，准确地确定DSA的致病性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是解决功能性地检测抗体介导的器官排异的方法。

所述再构细胞板的血管内皮细胞培养物均具有确定的人类白细胞组织相容抗原谱。确定抗原的方法是提取血管内皮细胞培养物DNA，使用微量聚合酶链式反应试剂盒，美国One Lamda产品，将人类白细胞组织相容抗原分类为：HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，和HLA－DP。将所获得的细胞抗原的信息储存在数据库内；确定抗原的细胞冻存在液氮中备用。

本发明所述的诊断试剂盒使用抗原确定的血管内皮细胞培养物，它们能与DSA特异地结合并被DSA激活。在加入病人血清后，致病性DSA激活细胞内的信号传导通路，导致细胞表面粘附蛋白表达增加，并释放引起炎性反应的细胞因子和介质；而非致病性DSA不能激活上述传导通路。通过测定细胞激活的产物，本试剂盒可准确地区别致病与非致病性DSA，为临床医师提供了可靠的诊断依据。

本发明所述的诊断试剂盒使用抗原确定的血管内皮细胞培养物是依据供者白细胞相容抗原分型而选择的；它们有序地种植在微孔培养板上，为再构细胞板。所述血管内皮细胞为高度选择性，亦是，所述细胞诊断试剂盒内再构细胞板的设计是由医师依据供者的人类白细胞组织相容抗原的类型而为受者特殊制定的。当医师申请使用此诊断试剂的同时，亦提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP。依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部，种植数量为3000-4000活细胞/孔。

本发明所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，包括如下步骤：

(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应抗原的血管内皮细胞；

(2)将所述血管内皮细胞种植在96-孔细胞培养微孔板的底部，详见附图2，每孔含3000-4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；

(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；

(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；

(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；

(6)准备试剂盒；

(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。

本发明所采用的血管内皮细胞培养物来自正常人群志愿者。

原代细胞自分离培养后，种植于血管内皮细胞板用于测定DSA的细胞传代次数低于3代。

本发明采用两种手段判断细胞反应终点：

(1)使用免疫酶联试剂盒定量培养上清液内炎性因子，敏感度为0.1-1.0pg/mL；

(2)使用免疫荧光组化定量细胞表面粘附分子，以同时测定的阴性和阳性标本为对照判定结果。

所述血管内皮细胞培养在本诊断试剂盒中的特征为：

(1)从正常人群组织中分离；

(2)与供者人类白细胞组织相容抗原相同的培养物；

(3)与器官移植受者血清孵育后，具有致病性的DSA可激活损伤血管内皮细胞。

所述血管内皮细胞在DSA刺激下的反应，在诊断试剂盒中的特征为：

(1)使用免疫酶联法测定上清液内白细胞介素－1β，白细胞介素－2，白细胞介素－6，白细胞介素－8(IL-8)，单核细胞趋化蛋白－1(MCP-1)，干扰素，粒单－克隆刺激因子，单核－克隆刺激因子，肿瘤坏死因子－A(TNF－A)；

(2)使用免疫荧光测定细胞表面细胞间粘附分子－1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)。致病性DSA引发血管内皮细胞的激活与损伤，因而，增加上述分子的表达与释放，非致病性DSA不引发上述分子的改变。

优选的，血管内皮细胞表达的人类组织相容抗原与接受器官移植的病人DSA抗体相对应。

优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法步骤(3)中，所述条件为摄氏温度35℃－37℃、二氧化碳分压为4％－5％。

优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法步骤(3)中，所述病人血清和血管内皮细胞的反应时间是24小时。

优选的，人类组织相容抗原的测定使用低分辨分型方法。

优选的，血管内皮细胞来自人的新鲜标本，为血管片段、脂肪、肌肉、皮肤、脐带、肝、肺、肾中的一种。

优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是检测接受器官移植后的病人血液内的DSA是否具有攻击供者组织的能力的应用。

优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是揭示病人慢性抗体介导的排斥反应，鉴别引发血管内皮细胞活化、调整、以及功能紊乱的体液因子。

优选的，所述一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的试剂盒，所述试剂盒包括阳性对照血清、阴性对照血清、阳性标准品、空白试剂、再构细胞板、培养液、汉氏磷酸缓冲液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、抗体a、抗体b，白蛋白溶液；其中，所述的阳性标准品、培养液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、白蛋白溶液的组分及配比如下：

阳性标准品：0.1ng/mL肿瘤坏死因子－A；

培养液：EGM-2培养液，EGM-2培养液内含HAM’氏12培基、生长因子添加物；

羊血清/磷酸缓冲液：体积比10％；

聚甲醛：体积比4％。

白蛋白溶液：重量比1％。

优选的，所述一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的试剂盒，抗体a是羊抗ICAM-1，抗体b是抗羊FITC于抗体。

所述试剂盒整合了分子生物学和免疫学手段，不仅能定量地分析培养上清液内的可溶性分子，而且能测定血管内皮细胞在DSA刺激下其表面的反应分子。

由以上本发明提供的技术方案可见，本发明具有以下有益效果：

(1)该试剂盒用于鉴定能导致血管内皮激活和损伤的DSA；

(2)该试剂盒所检测的DSA分型是特异性，是确定的，例如，抗A11、抗B44；

(3)该试剂盒用于检测接受器官后的病人血内DSA功能性，亦即导致DSA引发血管内皮细胞的激活与损伤；

(4)该试剂盒为临床医生提供诊断病情的依据；

(5)该试剂盒为临床医生提供诊断病情的依据早于病理活检、影像学和临床症状；

(6)该试剂盒依据抗原－抗体反应原理测定DSA，结果是特异的；

(7)该试剂盒使用基于免疫酶联和免疫组化定量反应结果具有高度灵敏性和精确性。

本发明首次建立了模拟毛细血管的细胞培养系统，检测DSA与所述细胞的相互作用，从而在功能的角度上鉴定DSA的致病性。本发明所建立体外诊断方法不仅填补DSA功能检测的空白，而且完善现行的在实验室内评估抗体介导的排斥反应应有的环节。

附图说明

图1为实施例4中的PCR电泳图谱。

图2为制作血管内皮细胞板的96-微孔细胞板。

图3为实施例5中的制作再构血管内皮细胞板的96-微孔细胞板图。

图4为实施例9中的DSA诱发的MCP-1释放图。

图5为实施例9中的DSA诱发的IL-8释放图。

图6为实施例9中的DSA诱发的细胞表面ICAM-1的表达图。

图7为实施例10中的制作再构血管内皮细胞板的96-微孔细胞板图。

图8为实施例10中的DSA诱发的MCP-1释放图。

图9为实施例10中的DSA诱发的IL-8释放图。

图10为实施例10中的DSA诱发的细胞表面ICAM-1的表达图。

图11为实施例11中的制作再构血管内皮细胞板的96-微孔细胞板图。

图12为实施例12中的DSA诱发的MCP-1释放图。

图13为实施例12中的DSA诱发的IL-8释放图。

图14为实施例12中的DSA诱发的细胞表面ICAM-1的表达图。

阳－阳性对照血清，阴－阴性对照血清，TNF－阳性标准品，空－空白试剂。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图对本发明作进一步的详细说明：

实施例1血管内皮细胞的分离

经外科手术无菌获得的实体组织置于富含培养基内，在3－5小时内转送至加工室。依据实体组织的性质，采用不同的处理方案。

(1)对于不完整组织如血管片段，脂肪，肌肉，皮肤，部分脏器，脐带，将采用直接消化收集细胞。具体步骤为：将组织剪碎至1立方毫米的碎块，清洗并移除全部血液，置于含体积比1％胶原酶的培养基内解体组织，在摄氏温度37℃下孵育0.5－1小时，机械地松散被消化的组织并用纱布分离单细胞和残余组织。在使用离心方法去除胶原酶。

(2)对于有血管连接的完整器官如肝、肺、肾等，用器官灌流的途径收集血管内皮细胞。依据器官血管的大小，将不同孔径的乳胶管与之结扎。在反复使用生理盐水冲洗组织后，在摄氏温度37℃下灌流0.5－1小时。机械地松散被消化的组织并用纱布分离单细胞和残余组织。在使用离心方法去除胶原酶后，收集单细胞悬液备用。

实施例2血管内皮细胞的培养

将实施例1所得的单细胞悬液置于含体积比20％胎牛血清、15毫克/毫升内皮细胞生长刺激添加物(ECGS)、50单位/毫升肝素，100单位/m1青霉素一100单位/m1链霉素的培养基内，接种于涂有1％明胶的培养瓶中，放于摄氏温度35℃、体积比4％C0₂饱和湿度培养箱中培养，24小时后更换培养液。

实施例3血管内皮细胞的冻存

当细胞的生长达到覆盖培养瓶内90％的表面积时，使用浓度为体积比0.05％胰蛋白酶－乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)消化液将细胞从培养瓶表面脱落。在离心移除残余酶后，将细胞悬浮于含浓度为体积比5％DMSO的培养液内，以1－2℃/分钟的速度逐步降低上述液体的温度至-80℃，随后转入液氮罐内保存。

实施例4用低分辨PCR试剂分型血管内皮细胞的人类白细胞组织相容抗原

使用离心的方法收集内皮细胞，按照DNA纯化试剂盒创作规程(INVITROGEN，#10503027，美国)，加入细胞裂解液，提取DNA。测定样本的A260/A280比值，如大于1.8时，符合质量要求。使用微量PCR试剂盒(SSP，One Lamda,加利福尼亚，美国)确定人类白细胞组织相容抗原的类型。具体方法为：在反应液内加入100ng/μl DNA样本，PCR反应基质，Tag DNA多聚酶，水，依照设定下述循环温度和扩增时间扩增：

起始变性期:94℃，两分钟；

第一期：变性94℃，10秒；退火和延伸65℃，60秒，共10个循环；

第二期：变性94℃，10秒；退火61℃，50秒；延伸72℃，30秒，共20个循环。将PCR产物在浓度为重量比1％的琼脂胶分离。如附图1所示，琼脂胶呈现抗原特异性的电泳带谱。依据PCR试剂生产者提供的参考图谱，确定白细胞组织相容抗原的分型。

实施例5制备人类白细胞组织相容抗原确定的再构细胞板

依据病人DSA结果和器官移植供者人类白细胞组织相容抗原结果，临床医师和实验室科学家共同制定的血管内皮细胞检测方案和制定细胞板编码。表1显示了实施例5中该编码如何定位每株细胞在96-孔细胞培养微孔板(如图2)上的位置(如图3)。将欲使用的血管内皮细胞复苏后，悬浮于内皮细胞生长培基中。按照细胞板编码，在涂有细胞粘附基质的96-孔细胞培养微孔板的底部，种植具有不同人类白细胞相容抗原的细胞，数量为3，000－4，000活细胞。每株细胞重复三孔。

表1为制作血管内皮细胞板的96-微孔细胞板的编码。表1中阳对为阳性对照血清的缩写，阴对为阴性对照血清缩写，空白为空白试剂的缩写，TNF为阳性标准品的缩写。

表1

实施例6 DSA介导的血管内皮细胞激活的测定方法和结果评估

(1)标本收集与制备

用于检测的标本是1mL血清。通常情况下，5mL病人静脉全血加入不加任何添加剂的试管内，室温置放30分钟后离心收集血清。在特殊情况下，可用肝素抗凝的血浆。乙二胺四乙酸和柠檬酸钠抗凝血禁止使用本试剂盒。

在使用前30－60分钟内，使用培养基制备含体积比20％病人血清的溶液作为检体。同时，使用相同培养基制备含体积比20％对照阳性血清和阴性血清的溶液。阳性标准品为含0.1ng/mL TNF－α的细胞培养液；空白对照为细胞培养液。

(2)血管内皮细胞板的预处理

在试验前10－12小时更换培养基，在倒置显微镜下观察生长状态。

(3)步骤

去除细胞培养上清，将病人标本，阳性血清对照标本，阴性血清对照标本，阳性标准品对照和空白对照按细胞板编码位置相应地加入96-孔细胞培养微孔板。轻微混匀后，放于摄氏温度37℃、体积比5％C0₂饱和湿度培养箱中培养。24小时后，首先收集培养上清以测定细胞炎性因子；然后用汉氏磷酸缓冲液冲洗血管内皮细胞板两遍以定量细胞表面粘附分子。向所有的含细胞的孔内加入体积比4％多聚甲醛以固定细胞，5分钟后，移除固定液，用10％羊血清封闭细胞。接着使用Cy－3标记的抗人VCAM-1和Cy－5标记的抗人ICAM-1染色。完成免疫组化染色后，将96-孔细胞培养微孔板插入细胞成像系统(美国Spectra MaxPlus,Molecular Device),在Soft－MaxPro分析软件下，获得每孔内的荧光强度。

(4)数据收集与结果分析

依据阳性标准品对照和空白对照的光密度(免疫酶联法)和荧光强度(免疫荧光法)，以判断是否需要进一步的参数调整。当阳性和阴性血清对照标本的光密度比值>5，荧光强度>3时，说明所种植的血管内皮细胞具有区分致病性DSA的反应性。检测样品标本结果的计算方法为病人血清/阴性血清的比值，评判的标准如下，见表2：

表2

实施例7 DSA介导的血管内皮细胞激活的测定方法和结果评估

(3)去除细胞培养上清，将病人标本，阳性血清对照标本，阴性血清对照标本，阳性标准品对照和空白对照按细胞板编码位置相应地加入96-孔细胞培养微孔板。轻微混匀后，放于摄氏温度35℃、体积比4％C0₂饱和湿度培养箱中培养。其余步骤同实施例6。

实施例8 DSA介导的血管内皮细胞激活的测定方法和结果评估

(3)去除细胞培养上清，将病人标本，阳性血清对照标本，阴性血清对照标本，阳性标准品对照和空白对照按细胞板编码位置相应地加入96-孔细胞培养微孔板。轻微混匀后，放于摄氏温度36℃、体积比4.5％C0₂饱和湿度培养箱中培养。其余步骤同实施例6。

实施例9实例分析1

1.血管内皮细胞板的设计和制作

(1)依据临床医师和实验室科学家共同制定的血管内皮细胞检测方案制定血管内皮细胞板编码－在获得病人的知情同意后，临床医师将病人(#2105)的抗体分析结果和器官供者(#0096)材料送至临床实验室。依据抗体在器官移植前、后的变化，医师确定病人#2105具有如下DSA：A31，B5，DR3和DQ4。详见表3。

表3

(2)依据供者人类白细胞抗原分型，实验室工作人员从细胞库内提取表达A2，A31，B5，B35，DR3，DR8，DQ4和DQ5的血管内皮细胞。

(3)在图3所示的位置种植相应的细胞

在A1-3孔内种植表达A2的血管内皮细胞；

在B1-3孔内种植表达A31的血管内皮细胞；

在C1-3孔内种植表达B5的血管内皮细胞；

在D1-3孔内种植表达B35的血管内皮细胞；

在E1-3孔内种植表达DR3的血管内皮细胞；

在F1-3孔内种植表达DR8的血管内皮细胞；

在G1-3孔内种植表达DQ4的血管内皮细胞；

在H1-3孔内种植表达DQ5的血管内皮细胞；

在A4-6孔内种植阳性对照血管内皮细胞；

在B4-6孔内种植阴性对照血管内皮细胞；

在C4-6孔内种植混合血管内皮细胞；

在D4-6孔内种植混合血管内皮细胞。

(4)在A1-3，B1-3，C1-3，D1-3，E1-3，F1-3，G1-3和H1-3孔内加入体积比20％病人血清培养液；在A4-6孔内加入体积比20％阳性对照血清培养液；在B4-6孔内加入体积比20％阴性对照血清培养液；在C4-6孔内加入阳性标准品0.1ng/mL TNF－α的细胞培养液；在D4-6孔内加入细胞培养液。

(5)放于摄氏温度37℃、体积比5％C0₂饱和湿度培养箱中培养24小时后。

(6)收集培养上清以测定可溶分子。

(7)用汉氏磷酸盐缓冲液冲洗血管内皮细胞板两遍，加入体积比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分钟后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理盐水封闭细胞。

2.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内MCP-1，结果如图4所示。

3.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内IL-8，结果如图5所示。

4.使用免疫组化法定量细胞表面ICAM-1的表达，结果如图6所示。

5.结果分析表明，如表4，A31，DQ4是强致病性DSA；B5的致病性可疑，它可引发细胞释放反应因子，但未导致细胞表面粘附因子表达增加。A2，B35，DR3，DR8和DQ5未见激活内皮细胞培养物。

表4

实施例10实例分析2

1.血管内皮细胞板的设计和制作

(1)依据临床医师和实验室科学家共同制定的血管内皮细胞检测方案制定血管内皮细胞板编码－在获得病人的知情同意后，临床医师将病人(#2106)的抗体分析结果和器官供(#0097)材料送至临床实验室。依据抗体在器官移植前、后的变化，医师确定病人#2106具有如下DSA：A3，B7，和DR7。详见表5。

表5

(2)依据供者人类白细胞抗原分型，实验室工作人员从细胞库内提取表达A3，A24，B7，B13，DR7，DR11，DQ5和DQ6的血管内皮细胞。

(3)在图7所示的位置种植相应的细胞

在A1-3孔内种植表达A3的血管内皮细胞；

在B1-3孔内种植表达A24的血管内皮细胞；

在C1-3孔内种植表达B7的血管内皮细胞；

在D1-3孔内种植表达B13的血管内皮细胞；

在E1-3孔内种植表达DR7的血管内皮细胞；

在F1-3孔内种植表达DR11的血管内皮细胞；

在G1-3孔内种植表达DQ5的血管内皮细胞；

在H1-3孔内种植表达DQ6的血管内皮细胞；

在A4-6孔内种植阳性对照血管内皮细胞；

在B4-6孔内种植阴性对照血管内皮细胞；

在C4-6孔内种植混合血管内皮细胞；

在D4-6孔内种植混合血管内皮细胞。

(4)在A1-3，B1-3，C1-3，D1-3，E1-3，F1-3，G1-3和H1-3孔内加入体积比20％病人血清培养液；在A4-6孔内加入体积比20％阳性对照血清培养液；在B4-6孔内加入体积比20％阴性对照血清培养液；在C4-6孔内加入阳性标准品0.1ng/mL TNF－α的细胞培养液；在D4-6孔内加入细胞培养液。

(5)放于摄氏温度35℃、体积比4％C0₂饱和湿度培养箱中培养24小时后。

(6)收集培养上清以测定可溶分子。

(7)用汉氏磷酸盐缓冲液冲洗血管内皮细胞板两遍，加入体积比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分钟后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理盐水封闭细胞。

2.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内MCP-1，结果如图8所示。

3.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内IL-8，结果如图9所示。

4.使用免疫组化法定量细胞表面ICAM-1的表达，结果如图10所示。

5.结果分析表明，如表6，A3，B7,DR7是强致病性DSA。

表6

实施例11实例分析3

1.血管内皮细胞板的设计和制作

(1)依据临床医师和实验室科学家共同制定的血管内皮细胞检测方案制定血管内皮细胞板编码－在获得病人的知情同意后，临床医师将病人(#2107)的抗体分析结果和器官供(#0098)材料送至临床实验室。依据抗体在器官移植前、后的变化，病人#2107具有如下DSA:A26，B18，B67，DR7，DR15，和DQ7。详见表7。

表7

(2)依据供者人类白细胞抗原分型，实验室工作人员从细胞库内提取表达A3，A26，B18，B67，DR7，DR15，DQ2和DQ7的血管内皮细胞。

(3)在图11所示的位置种植相应的细胞

在A1-3孔内种植表达A3的血管内皮细胞；

在B1-3孔内种植表达A26的血管内皮细胞；

在C1-3孔内种植表达B18的血管内皮细胞；

在D1-3孔内种植表达B67的血管内皮细胞；

在E1-3孔内种植表达DR7的血管内皮细胞；

在F1-3孔内种植表达DR15的血管内皮细胞；

在G1-3孔内种植表达DQ2的血管内皮细胞；

在H1-3孔内种植表达DQ7的血管内皮细胞；

在A4-6孔内种植阳性对照血管内皮细胞；

在B4-6孔内种植阴性对照血管内皮细胞；

在C4-6孔内种植混合血管内皮细胞；

在D4-6孔内种植混合血管内皮细胞。

(4)在A1-3，B1-3，C1-3，D1-3，E1-3，F1-3，G1-3和H1-3孔内加入体积比20％病人血清培养液；在A4-6孔内加入体积比20％阳性对照血清培养液；在B4-6孔内加入体积比20％阴性对照血清培养液；在C4-6孔内加入阳性标准品0.1ng/mL TNF－α的细胞培养液；在D4-6孔内加入细胞培养液。

(5)放于摄氏温度36℃、体积比4.5％C0₂饱和湿度培养箱中培养24小时后。

(6)收集培养上清以测定可溶分子。

(7)用汉氏磷酸盐缓冲液冲洗血管内皮细胞板两遍，加入体积比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分钟后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理盐水封闭细胞。

2.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内MCP-1，结果如图12所示。

3.使用免疫酶联试剂盒测定上清液内IL-8，结果如图13所示。

4.使用免疫组化法定量细胞表面ICAM-1的表达，结果如图14所示。

5.结果分析表明，如表8，A26，B18，DR15，DQ7是强致病性DSA；B67，DR7的致病性可疑，它在引发细胞释放反应因子或导致细胞表面粘附因子表达增加方面未达到预定标准。A3和DQ2未见激活内皮细胞培养物。

表8

实施例12试剂盒的制备方法

(一)制备以下试剂：

1.从正常人群中收集血清，使用单抗原微球法测定和质量控制步骤确定(1)阳性对照血清；(2)阴性对照血清。将阳性对照血清和阴性对照血清分别分装于1毫升冻存管，在摄氏温度-80℃下保存。

2.将肿瘤坏死因子－A，阳性标准品，溶于体积比1％人白蛋白磷酸缓冲液内，分装于1毫升冻存管，在摄氏温度-80℃下保存。

3.空白试剂是分装体积比1％人白蛋白磷酸缓冲液于1毫升冻存管，在摄氏温度-80℃下保存。

4.体积比10％羊血清的配制方法：按1:9比例将羊血清与0.9％氯化钠溶液混合，分装后在摄氏温度-20℃下保存。

5.将100微升羊抗ICAM-1抗体分装于1毫升冻存管，在摄氏温度-80℃下保存。将10微升抗羊连接FITC于抗体分装于1毫升冻存管，在摄氏温度-80℃下保存。

6.体积比4％聚甲醛配制方法：按1:3比例将16％聚甲醛与0.9％氯化钠溶液混合，分装后在室温下保存。

7.重量比1％白蛋白溶液的配制方法：称取1克白蛋白，溶于100毫升磷酸缓冲液中，分装后在摄氏温度-20℃下保存。

(二)准备以下试剂和材料，包括EGM-2培养液和汉氏磷酸缓冲液，EGM-2培养液和汉氏磷酸缓冲液是商业化的产品，不用制备。

试剂盒组装－将如下产品包装在共同的盒内，摄氏温度-80℃保存：

(1)阳性对照血清；(2)阴性对照血清；(3)阳性标准品(0.1ng/mL肿瘤坏死因子－A)；(4)空白试剂。

试剂盒组装－将如下产品包装在共同的盒内，室温下保存：

(1)再构血管内皮细胞板；(2)体积比4％聚甲醛溶液：(3)汉氏磷酸缓冲液；(4)EGM-2培养液。

试剂盒组装－将如下产品包装在共同的盒内，摄氏温度4℃下保存：

(1)体积比10％羊血清磷酸缓冲液；(2)抗体a－羊抗ICAM-1；(3)抗体b－抗羊FITC于抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：

(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应抗原的血管内皮细胞；

(2)将所述血管内皮细胞种植在96-孔细胞培养微孔板的底部，每孔含3000-4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；

(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；

(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；

(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；

(6)准备试剂盒；

(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。

2.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：使用了与供者的人类组织相容抗原表达相同的血管内皮细胞培养物，血管内皮细胞培养物与病人血清的相互作用是特异的。

3.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：所述再构细胞板为高度选择性血管内皮细胞；当医师申请使用此诊断试剂的同时，应提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP；依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部；所述细胞诊断试剂盒内的血管内皮细胞板的设计是依据供者的人类白细胞组织相容抗原的类型而为受者制定的，因而有高度的选择性。

4.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：血管内皮细胞表达的人类组织相容抗原与接受器官移植的病人DSA抗体相对应。

5.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：步骤(3)中所述条件为摄氏温度35℃－37℃、二氧化碳分压为4％－5％。

6.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：步骤(3)中所述病人血清和血管内皮细胞的反应时间是24小时。

7.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：人类组织相容抗原的测定使用低分辨分型方法。

8.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：血管内皮细胞来自人的新鲜标本，为血管片段、脂肪、肌肉、皮肤、脐带、肝、肺、肾中的一种。

9.权利要求1－8之一所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是检测接受器官移植后的病人血液内的DSA是否具有攻击供者组织的能力。

10.根据权利要求9所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是揭示病人慢性抗体介导的排斥反应，鉴别引发血管内皮细胞活化、调整、以及功能紊乱的体液因子。

11.权利要求1－8之一所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性对照血清、阴性对照血清、阳性标准品、空白试剂、再构细胞板、培养液、汉氏磷酸缓冲液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、抗体a、抗体b，白蛋白溶液；其中，所述的阳性标准品、培养液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、白蛋白溶液的组分及配比如下：

阳性标准品：0.1ng/mL肿瘤坏死因子－A；

培养液：EGM-2培养液，EGM-2培养液内含HAM’氏12培基、生长因子添加物；

羊血清/磷酸缓冲液：体积比10％；

聚甲醛：体积比4％。

白蛋白溶液：重量比1％。

12.根据权利要求11所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的试剂盒，其特征在于：抗体a是羊抗ICAM-1，抗体b是抗羊FITC于抗体。