KR20140097442A - 망막 조직 및 망막 관련 세포의 제조 방법 - Google Patents

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스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은, [1] 하기 (1) 내지 (3) 의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 망막 조직의 제조 방법: (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계, (2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계, 및 (3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계; [2] 단계 (3) 에서 배양된 응집체를 각각 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 또는 혈청 배지 중에 부유 배양하는 단계를 포함하는 안배형 구조체의 제조 방법; [3] 단계 (3) 에서 배양된 망막 조직을 포함하는 응집체를 각각 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 (여기서, 상기 무혈청 배지 및 혈청 배지는 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는다) 중에서 부유 배양하는 단계를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법; 및 [4] 영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포에 Notch 신호전달 경로 저해 물질을 접촉시키는 것을 포함하는 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법을 제공한다.

Description

망막 조직 및 망막 관련 세포의 제조 방법 {METHODS FOR PRODUCING RETINAL TISSUE AND RETINA-RELATED CELL}
본 발명은, 망막 조직 및 망막층 특이적 신경세포 및 망막 색소 표피 세포 등의 망막 관련 세포의 제조 방법 등에 관한 것이다.
뇌나 망막등의 중추 신경계 조직은, 재생 능력이 낮고, 장해를 받은 조직이 자연 회복하는 일이 거의 없다. 따라서, 다능성 줄기 세포로부터 분화시킨 세포를 이식해 치료하는 재생 의료는 난치병 극복의 비장의 카드로서 기대되고 있다. 나아가, 다능성 줄기 세포로부터 분화시켜 수득된 인간 유래의 세포는, 인간에 대한 화학 물질의 영향을 정밀하게 평가할 수 있다고 생각되어 화합물의 독성 평가나 창약에 대한 이용을 향한 연구개발도 진행되고 있다.
망막은 광을 수용해, 전기 신호로 변환해, 추가로 정보처리 후에, 축색을 통해 뇌의 시각 중추에 정보를 전하는 중요한 감각 조직이다. 망막은 대략 내외 2 개의 상피조직이 서로 겹쳐져 이루어진다. 내측은 광을 수용하고 정보처리를 행하는 신경 망막이며, 시세포 (photoreceptor) 등의 여러 종류의 세포를 포함한다. 외측은 시세포의 생존과 기능을 뒷받침하는 단층의 세포 시트인 망막 색소 표피이다.
지금까지, 신경 망막을 구성하는 망막층 특이적 신경세포 (시세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 신경절 세포 등) 를 다능성 줄기 세포로부터 제조하는 것이 보고된 바 있다 (특허문헌 1). 또, 다능성 줄기 세포로부터 입체적인 망막 조직을 제조하는 방법으로서 무혈청 배지 중에 균일한 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시켜, 이것을 기저막 제제의 존재 하에 부유 배양하는 것으로, 망막 전구 조직, 안배형 구조체 및 다층의 신경 망막 조직을 시험관내에서 제조하는 것이 기재된 바 있다 (비특허문헌 1 및 특허문헌 2).
한편, 다능성 줄기 세포를 이용해 망막 색소 표피 세포를 제조하는 보고도 알려져 있지만 (비특허문헌 2), 고효율로 망막 색소 표피 세포를 제조했다는 보고는 없다.
WO2008/087917호 WO2011/055855호
Mototsugu Eiraku, Nozomu Takata, Hiroki Ishibashi, Masako Kawada, Eriko Sakakura, Satoru Okuda, Kiyotoshi Sekiguchi, Taiji Adachi & Yoshiki Sasai (2011) Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature Volume: 472, Pages: 51-56 Maria Idelson, Ruslana Alper, Alexey Obolensky, Etti Ben-Shushan, Itzhak Hemo, Nurit Yachimovich-Cohen, Hanita Khaner, Yoav Smith, Ofer Wiser, Michal Gropp, Malkiel A. Cohen, Sharona Even-Ram, Yael Berman-Zaken, Limor Matzrafi, Gideon Rechavi, Eyal Banin, and Benjamin Reubinoff (2009) Directed Differentiation of HumanEmbryonic Stem Cells into Functional Retinal Pigment Epithelium Cells. Cell Stem Cell 5, 396-408
망막 조직, 안배형 구조체 및 망막층 특이적 신경세포, 및 망막 색소 표피 세포를 더욱 효율적으로 제조할 방법이 요망되고 있었다.
본 발명자들은, 이와 같은 상황을 예의 검토한 결과, 본 발명에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 이하와 같다.
［1］하기 (1) 내지 (3) 의 단계를 포함하는 망막 조직의 제조 방법.
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계
［2］ 상기［1］기재된 방법으로 수득된 망막 조직을, 각각 Sonic hedgehog (이하, "Shh" 로 언급되기도 함) 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에 부유 배양하는 단계를 포함하는 안배형 구조체의 제조 방법.
［3］상기［1］기재된 방법으로 수득된 망막 조직을 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 (단, 상기 무혈청 배지 및 혈청 배지는 Sonic hedgehog (이하, "Shh" 로 언급되기도 함) 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는다) 중에서 부유 배양하는 공정을 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
［4］상기 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지가 Activin 신호전달 경로 작용 물질을 추가로 함유하는, 상기［3］에 기재된 방법.
［5］상기 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 상기［1］내지［4］중 어느 하나에 기재된 방법.
［6］상기 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 상기［1］내지［4］중 어느 하나에 기재된 방법.
［7］상기 기저막 제제가 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴 (entactin) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포외 매트릭스 분자인 상기［1］내지 [6］중 어느 하나에 기재된 방법.
［8］상기 제 1 단계 내지 제 3 단계가 넉아웃 혈청 대체물 (이하, "KSR" 로 언급되기도 함) 존재 하에 실시되는 상기［1］내지 [7］중 어느 하나에 기재된 방법.
［9］영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포에 Notch 신호전달 경로 저해 물질을 접촉시키는 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법.
［10］상기 Notch 신호전달 경로 저해 물질이 감마 세크레타아제 활성 저해 물질인 것을 특징으로 하는 상기［9］에 기재된 방법.
［11］상기 Notch 신호전달 경로 저해 물질이 N-[N-(3,5-디플루오로 펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐 글리신 t-부틸 에스테르(이하, "DAPT" 로 언급되기도 함) 인 것을 특징으로 하는 상기［9］또는［10］에 기재된 방법.
［12］상기 영장류가 인간인 상기［9］내지 [11］중 어느 하나에 기재된 방법.
［13］망막층 특이적 신경세포가 시세포인 상기［9］내지 ［12］중 어느 하나에 기재된 방법.
［14］망막층 특이적 신경세포가 신경절 세포인 상기［9］내지［12］중 어느 하나에 기재된 방법.
［15］영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포가 하기 단계로 제조된 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포인 상기［9］내지 ［14］중 어느 하나에 기재된 방법.
(1) 영장류 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 영장류 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계 및
(4) 제 3 단계에서 배양된 응집체를, Sonic hedgehog (이하, "Shh" 로 언급되기도 함) 신호전달 경로 작용 물질과 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 또는 혈청 배지 중에 부유 배양함으로써, 안배형 구조체를 형성시키는 제 4 단계, 및
(5) 제 4 단계에서 형성된 안배형 구조체를 부유 배양하는 단계.
［16］상기［1］내지 ［15］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 함유하는 독성 또는 약효 평가용 시약.
［17］상기［1］내지［15］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포에 피검물질을 접촉시켜, 그 물질이 그 조직, 그 구조체 또는 그 세포에 미치는 영향을 검정하는 단계를 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가방법.
［18］상기［1］내지［15］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료제.
［19］상기［1］내지［15］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 유효량의 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포 이식을 필요로 하는 대상으로 이식하는 것을 포함하는 망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료 방법.
［20］망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료에 있어서의 사용하기 위한 상기［1］내지［15］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포.
본 발명에 의하면, 고효율로 망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 또는 망막 색소 표피 세포를 제조하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가나 이식 치료 등을 목적으로 하여, 망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 또는 망막 색소 표피 세포를 효율적으로 제공한다는 관점에서 매우 유용하다.
도 1 은 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가하지 않고, Matrigel (이하, 마트리겔이라고 하는 경우도 있다) 만을 첨가해 제조된 인간 다능성 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 25 일째의 명시야상 (A) 과 형광상 (B), Nodal 신호전달 경로 저해 물질 및 마트리겔을 첨가해 제조된 인간 다능성 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 25 일째의 명시야상 (C) 과 형광상 (D), Wnt 신호전달 경로 저해 물질 및 마트리겔을 첨가해 제조된 인간 다능성 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 25 일째의 명시야상 (E) 과 형광상 (F) 을 나타내는 도면이다.
도 2 는 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재 하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 비존재하에서 부유 배양한 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명시야상 (A) 과 형광상 (B), Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 존재하에서 부유 배양한 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명시야상 (C) 과 형광상 (D), Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 및 Sonic hedgehog (이하, "Shh" 로 언급되는 경우도 있음) 신호전달 경로 작용 물질 존재하에서 부유 배양한 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명시야상 (E) 과 형광상 (F) 을 나타내는 도면이다.
도 3 은 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 비존재하에서 부유 배양한 부유 배양 개시 18 일째의 응집체를 구성하는 GFP 발현 세포의 FACS 막대그래프 (A), Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 존재하에서 부유 배양한 부유 배양 개시 18 일째의 응집체를 구성하는 GFP 발현 세포의 FACS 막대그래프 (B), Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가해 인간 다능성 줄기 세포를 부유 배양한 후, 마트리겔 존재하에서 부유 배양해, 추가로 우태아 혈청 및 Shh 신호전달 경로 작용 물질 존재하에서 부유 배양한 부유 배양 개시 18 일째의 응집체를 구성하는 GFP 는 발현 세포의 FACS 막대그래프 (C) 및, 망막 전구 세포인 GFP 강력 양성 세포의 비율의 그래프 (D) 이다.
도 4 는 본 발명의 망막 조직의 제조 방법에 의해 제조한 부유 배양 개시 60일째의 망막 조직 (A, B, C) 및 부유 배양 개시 126 일째의 망막 조직 (D, E, F, G, H, I) 의 면역 염색 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 안배형 구조체의 제조 방법에 의해 부유 배양을 실시한 응집체의 부유 배양 개시 후 14 일째 (A), 15 일째 (B), 16 일째 (C), 17 일째 (D)의 동일 부분의 명시들 및 형광상의 중첩 영상을 나타내는 도면이다.
도 6 은 본 발명의 안배형 구조체의 제조 방법에 의해 부유 배양 개시 후 24 내지 26 일까지 부유 배양한 응집체의 현미경 관찰에 의한 명시야상 (A), 형광상 (B) 과 이광자 현미경 관찰상 (C) 및 이광자 현미경 관찰상으로부터 수득된 3 D재구성 이미지 (D) 를 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 안배형 구조체의 제조 방법에 의해 부유 배양을 실시해 제조된 안배형 구조체의 동결 절편을 항-Mitf 항체 및 항-Chx10 항체를 이용해 면역 염색을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은, Crx::GFP 넉인 (knock-in) 인간 ES 세포 유래의 부유 배양 개시 29 일째 망막 조직을 10 μM DAPT 를 첨가하지 않는 조건으로 부유 배양 개시 41 일째까지 부유 배양했을 경우의 형광 현미경 (A) 과 DAPT 를 첨가한 조건으로 부유 배양 개시 41 일째까지 부유 배양했을 경우의 형광 현미경 (B), 10μM DAPT 를 첨가하지 않는 조건으로 부유 배양 개시 43일째까지 부유 배양했을 경우의 동결 절편을 항-Recoverin 항체로 면역 염색한 사진 (C) 과 항-Brn3 항체로 면역 염색한 사진 (E), DAPT 를 첨가한 조건으로 분화 유도 43일째까지 부유 배양했을 경우의 동결 절편을 힝-Recoverin 항체로 면역 염색한 사진 (D) 과 항-Brn3 항체로 면역 염색한 사진 (F) 을 나타내는 도면이다.
도 9 는, Crx::GFP 넉인 인간 ES 세포 유래의 부유 배양 개시 33 일째 망막 조직을 냉동-해동한 후의 부유 배양 개시 38 일째 망막 조직을 10 μM DAPT 를 첨가하지 않는 조건으로 부유 배양 개시 49 일째까지 부유 배양했을 경우의 형광 현미경 (A) 과 DAPT 를 첨가한 조건으로 부유 배양 개시 49 일째까지 부유 배양했을 경우의 형광 현미경 (B), 10μM DAPT 를 첨가하지 않는 조건으로 부유 배양 개시 49 일째까지 부유 배양했을 경우의 동결 절편을 항-Recoverin 항체로 면역 염색한 사진 (C) 과 항-Brn3 항체로 면역 염색한 사진 (E), DAPT 를 첨가한 조건으로 부유 배양 개시 49 일째까지 부유 배양했을 경우의 동결 절편을 항-Recoverin 항체로 면역 염색한 사진 (D) 과 항-Brn3 항체로 면역 염색한 사진 (F) 을 나타내는 도면이다.
도 10 은 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 응집체를 형성시켜, 형성시킨 응집체를 무혈청 배지 안으로 기저막 제제의 존재하에서 부유 배양해, 배양된 응집체를 혈청을 포함하는 배지 중에 배양해, 배양된 응집체를 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 배지 중에 배양해 제조된 응집체의 명시들을 나타내는 도면이다.
도 11 은 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 응집체를 형성시켜, 형성시킨 응집체를 무혈청 배지 안으로 기저막 제제의 존재하에서 부유 배양해, 배양된 응집체를 혈청을 포함하는 배지 중에 배양해, 배양된 응집체를 Wnt 신호전달 경로 작용 물질 및 Activin A 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 배지 중에 배양해 제조된 응집체의 명시들을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 실시 형태에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서의 "형질전환체" 란, 형질전환에 의해 제작된 세포 등의 생명체의 전부 또는 일부를 의미한다. 형질전환체로서는, 예를 들어, 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충 세포 등을 언급할 수 있다. 형질전환체는 그 대상에 따라, 형질전환 세포, 형질전환 조직, 형질전환 호스트 등으로 지칭된다. 본 발명에 사용되는 세포는 형질전환체일 수 있다.
본 발명에 있어서의 유전자 조작 기술에 이용되는 원핵생물 세포로서는, 예를 들어, 에셰리키아 (Escherichia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 미크로박테리움 (Microbacterium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 등에 속하는 원핵생물 세포, 예를 들어, Escherichia XL1-Blue, Escherichia XL2-Blue, Escherichia DH1 등을 언급할 수 있다. 이와 같은 세포는, 예를 들어, ["Molecular Cloning (3rd edition)", by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3(Volume3), Vectors and Bacterial strains. A3.2(Cold Spring Harbor USA 2001)] 에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에 있어서의 "벡터" 는 목적하는 폴리뉴클레오티드 배열을 목적의 세포로 이입시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 이와 같은 벡터의 예시는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충 세포, 동물 개체 및 식물 개체 등의 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 또는 염색체 중으로의 혼입이 가능하고, 폴리뉴클레오티드의 전사에 적절한 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 포함한다.
이와 같은 벡터 가운데, 클로닝에 적절한 벡터를 "클로닝 벡터" 로 표시하기도 한다. 이와 같은 클로닝 벡터는, 통상, 제한 효소 부위를 복수 포함하는 다양한 클로닝 부위를 포함한다. 현재, 유전자의 클로닝에 사용 가능한 벡터는, 당해 기술 분야에 있어서 다수 존재하며, 판매사마다 미묘한 차이 (예를 들어, 멀티 클로닝 사이트의 제한 효소의 종류나 배열) 를 두어 상이한 상품명으로 판매되고 있다. 예를 들어, ["Molecular Cloning (3rd edition)" by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001))] 에 대표적인 것이 기재 (판매사도 기재) 되어 있고, 이와 같은 것을 당업자는 목적에 따라 적절히 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "벡터" 는, "발현 벡터", "리포터 벡터", "재조합 벡터"도 포함한다. 또한, "발현 벡터" 란, 구조 유전자 및 그 발현을 조절하는 프로모터에 추가하여 여러 가지의 조절 엘리먼트가 숙주 세포에서 작동가능한 상태로 연결되고 있는 핵산 배열을 의미한다. "조절 엘리먼트" 의 예시는 터미네이터, 약제 내성 유전자와 같은 선택 마커 및 인핸서를 포함하는 것을 포함한다. 생물 (예를 들어, 동물) 의 발현 벡터의 타입 및 사용되는 조절 엘리먼트의 종류가 숙주 세포 에 따라 바뀔 수 있는 것은, 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 있어서의 "재조합 벡터" 의 예시는 (a) 게놈 라이브러리의 스크리닝을 위한 Lambda FIX 벡터 (살균 바이러스 벡터), (b) cDNA의 스크리닝을 위한 Lambda ZAP 벡터 (살균 바이러스 벡터), (c) 게놈 DNA의 클로닝 하기 위한, 예를 들어, pBluescript II SK+/-, pGEM, pCR2.1 벡터 (플라스미드 벡터) 등을 포함한다. 또한, "발현 벡터" 의 예시는 pSV2/neo 벡터, pcDNA 벡터, pUC18 벡터, pUC19 벡터, pRc/RSV 벡터, pLenti6/V5-Dest 벡터, pAd/CMV/V5-DEST 벡터, pDON-AI-2/neo 벡터, pMEI-5/neo 벡터등 (플라스미드 벡터) 등을 포함한다. "리포터 벡터" 의 예시는 pGL2 벡터, pGL3 벡터, pGL4.10 벡터, pGL4.11 벡터, pGL4.12 벡터, pGL4.70 벡터, pGL4.71 벡터, pGL4.72 벡터, pSLG 벡터, pSLO 벡터, pSLR 벡터, pEGFP 벡터, pAcGFP 벡터, pDsRed 벡터 등을 포함한다. 이와 같은 벡터는, 전술한 Molecular Cloning 를 참고로 해 적절히 이용하면 된다.
본 발명에 있어서의 핵산 분자를 세포 내에 도입하는 기술로서는, 예를 들어, 형질전환, 형질 도입, 트랜스펙션 등을 언급할 수 있다. 이와 같은 도입 기술로서는, 구체적으로는 예를 들어, [Ausubel F.A. et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.들 (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판 및 제 3 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 별책 Experimental Medicine "transgene & expression analysis experiment method" YODOSHA Co., Ltd. 1997] 등에 기재되는 방법을 언급할 수 있다. 유전자가 세포 내에 도입된 것을 확인하는 기술로서는, 예를 들어 노던 블랏 분석, 웨스턴 블랏 분석 또는 다른 공지된 통상적인 기술 등을 언급할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "줄기 세포" 란, 세포 분열을 거쳐도 같은 분화 역량을 유지하는 세포로, 조직이 상해를 받았을 때에 그 조직을 재생할 수 있다. 여기서 줄기 세포는, 배성줄기 세포 (ES 세포) 또는 조직줄기 세포 (조직성 줄기 세포, 조직 특이적 줄기 세포 또는 체세포의 줄기 세포라고도 한다), 또는 인공 다능성 줄기 세포 (iPS cell: induced pluripotent stem cell) 일 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다. 상기의 줄기 세포 유래의 조직 세포는 조직을 재생할 수 있고, 생체에 가까운 정상적인 세포를 분화할 수 있는 것이 알려져 있다.
줄기 세포는 소정 기관으로부터 입수할 수 있거나 또는, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배성줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 Kyoto University 의 Institute for Frontier Medical Science 로부터 입수가능하다. 마우스 배성줄기 세포인 EB5 세포는, RIKEN 으로부터 입수가능하며, D3 세포주는 ATCC 에서 입수가능하다.
줄기 세포는 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는, 소 태아 혈청 (FCS), Knockout Serum Replacement (KSR), LIF 를 첨가한 무피더 (feeder cell-free) 세포에 의한 배양에 의해 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서 "다능성 줄기 세포" 란, 시험관내 배양이 가능하고, 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 세포 (3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 유래의 조직) 로 분화할 수 있는 능력 (분화 다능성 (pluripotency)) 을 갖고 있는 줄기 세포를 지칭하며, 배성줄기 세포 (ES 세포) 도 여기에 포함된다. "다능성 줄기 세포" 는, 수정란, 클론 배, 생식줄기 세포, 조직내줄기 세포로부터 수득된다. 또, 체세포에 여러종류의 유전자를 도입함으로써, 배성줄기 세포와 유사한 다능성을 인공적으로 지니도록 한 세포 (인공 다능성 줄기 세포라고도 한다) 도 포함한다. 다능성 줄기 세포는, 자체 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 제조 방법으로서는, 예를 들어 [Cell 131 (5) pp.861-872], [Cell 126 (4) pp.663-676] 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "배성줄기 세포 (ES 세포)" 는, 자기 복제 능력을 갖고 있으며, 다분화능 (즉, 다능성 "pluripotency") 을 갖는 줄기 세포이며, 초기배로부터 유래하는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 배성줄기 세포는, 1981 년에 처음으로 확립되어 1989 년 이후 넉아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998 년에는 인간 배성줄기 세포가 확립되었고, 재생 의학에도 이용되고 있다.
본 발명에 있어서의 "인공 다능성 줄기 세포" 란, 섬유아세포 등과 같은 분화한 세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc 등과 같은 여러 종류의 유전자의 발현에 의해 직접 초기화해 다분화능을 유도한 세포이며, 2006년, 야마나카 등에 의해 마우스 세포로 확립되었다 (Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006, 126(4), p663-676). 2007 년에는 인간 섬유아세포에서도 확립되어 배성줄기 세포와 마찬가지로 다분화능을 갖게 되었다 (Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5), p861-872, Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science. 2007, 318(5858), p1917-1920., Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106).
유전자 개질 다능성 줄기 세포는, 예를 들어, 상동 재조합 기술을 이용해 제공될 수 있다. 개질된 다능성 줄기 세포의 제조를 위해 개질되는 염색체상의 유전자의 예시는 예를 들어, 조직 적합성 항원의 유전자, 신경계 세포의 장해에 근거하는 질환 관련 유전자 등을 포함한다. 염색체상의 표적 유전자의 개질은, 문헌 [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)] 및 [Bio Manual series 8, gene targeting, Production of mutant mouse by using EX cells, YODOSHA Co., Ltd.] 에 기재된 방법을 이용해 실시될 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 개질하려는 표적 유전자 (예를 들어, 조직 적합성 항원의 유전자나 질환 관련 유전자 등) 의 게놈 유전자를 분리하고, 분리한 게놈 유전자를 이용해 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터를 제작한다. 제작한 표적 벡터를 줄기 세포에 도입해, 표적 유전자와 표적 벡터의 사이에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 염색체상의 유전자 개질 줄기 세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 분리하는 방법으로서는, [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)] 등에 기재된 공지된 방법을 언급할 수 있다. 또, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사) 또는 Universal Genome Walker Kits (CLONTECH 사) 등을 사용하여 표적 유전자의 게놈 유전자를 분리할 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은, [Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993); Bio Manual Series 8, gene targeting, Production of mutant mouse by using ES cells, YODOSHA Co., Ltd. (1995)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 또한, 표적 벡터는 임의의 치환형 및 삽입형이며, 선별 방법은 양성 선택, 프로모터 선택, 음성 선별, polyA 선별 등이 될 수 있다.
선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는 게놈 DNA 에 대한 서던 혼성화 방법, PCR 법 등이 언급될 수 있다.
본 발명에 있어서의 "조직" 이란, 형태나 성질이 상이한 복수 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치한 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 지칭한다.
본 발명에 있어서의 "망막 조직" 이란 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 시세포, 수평 세포, 쌍극세포 (bipolar cell), 아마크린 세포 (amacrine cell), 망막절 세포, 이들의 전구 세포 또는 망막 전구 세포 등의 세포 중 둘 이상의 종류가 층을 이루며 입체적으로 배열한 망막 조직을 의미한다. 각각의 세포와 관련하여, 해당 세포가 어느 망막층을 구성하는지 여부는 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
망막 세포 마커의 예시는, 이에 제한되지 않으나 Rax (망막의 전구 세포), PAX6 (전구 세포), nestin (시상하부 뉴런의 전구 세포에서는 발현되지만 망막 전구 세포에서는 발현되지 않는다), Sox1 (시상하부 신경 표피로 발현되어 망막에서는 발현되지 않는다), Crx (시세포의 전구 세포) 등을 포함한다. 특히, 상기 망막층 특이적 뉴런의 마커로서는, Chx10 (쌍극세포), L7 (쌍극세포), Tuj1 (마디 세포), Brn3 (마디 세포), Calretinin (아마크린 세포), Calbindin (수평 세포), Rhodopsin (시세포), Recoverin (시세포), RPE65 (색소 표피 세포), Mitf (색소 표피 세포) Nrl (간상 세포), Rxr-gamma (원추 세포) 등을 들 수 있이, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 "안배형 구조체" 는, 배의 발생 과정에의 안배와 유사한 형상을 나타내는 구조체를 지칭한다. 배의 발생 과정에 있어서 망막의 원시세포는 간뇌의 측면으로부 발생하며, 간뇌로부터의 외측에 주머니 모양으로 불거지며 형성된다. 이 주머니 모양의 표피 구조를 안포라고 한다. 추가로 안포의 최외측 부분 (장래의 신경 망막) 은 점차 안포의 내측에 함입되어, 내외 2 층의 표피로 이루어지는 배장의 조직인 안배를 형성한다. 안배는 그 후 추가로 크게 성장해, 망막 조직을 갖는 망막을 형성한다. 안배형 구조체인지 여부는 당업자이면 현미경, 확대경 등에 의한 관찰로 확인이 가능하다.
본 발명에 있어서 제조되는 안배형 구조체는 단순히 형태적으로 안배모양의 돌기를 나타낼 뿐 아니라, 안배형 구조체를 구성하는 세포로부터의 망막 전구 세포 마커인 Rax 의 고빈도 발현을 나타낸다. 또 안배형 구조체의 외층에는 Mitf 를 발현하는 망막 색소 표피 세포의 층을 나타내며, 내층에는 Chx10 를 발현하는 망막 전구 세포 등 망막 조직을 구성하는 세포가 나타난다. 이와 같은 안배형 구조체는 생체 발생에 있어서의 안배 조직의 구조와 아주 비슷하다.
본 발명에 있어서 "망막층" 은 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 표피층, 시세포층, 외부 경계막, 외부 과립층, 외부 망상층, 내부 과립 층, 내부 망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 안 경계막을 언급할 수 있다.
본 발명에 있어서 "망막층 특이적 신경세포" 는 망막층을 구성하는 세포로서 망막층에 특이적인 신경세포를 의미한다.
본 발명에 있어서 "망막 전구 세포" 는 시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포의 임의의 성숙형 망막 세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 지칭한다.
한편, 시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막절 세포 전구 세포는 각각 시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포에 대한 분화를 결정지을 수 있는 전구 세포를 지칭한다.
본 발명에 있어서의 "망막 색소 표피 세포" 는 생체 망막에 있어서 신경 망막 조직의 외측에 존재하는 표피 세포를 의미한다. 망막 색소 표피 세포인지 여부는, 당업자이면, 예를 들어 세포 마커 (RPE65 (색소 표피 세포), Mitf (색소 표피 세포) 등) 의 발현이나, 멜라닌 과립의 존재, 다각형의 특징적인 세포 형태 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지는 동물세포의 배양에 사용되는 기본 배지로부터 제조될 수 있다. 기본 배지의 예시는, BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지,αMEM 배지, DMEM 배지, ham 배지, RPMI 1640 배지, Fischer＇s 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 포함하며, 배지는 동물세포의 배양에 사용할 수 있다면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 "무혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 성장 인자) 이 혼입된 배지는 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 해당하는 것으로 간주한다.
배지는 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 조제의 번잡함을 회피하는 관점에서, 이러한 무혈청 배지로서 시판되는 KSR 를 적당량 (예를 들어, 1 내지 20%) 첨가한 무혈청 배지 (GMEM 또는 DMEM, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 Mix, 1 mM 피루브산 나트륨) 을 사용할 수 있다.
추가로, 무혈청 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트란스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2－메르캅토 에탄올 또는 3＇티올 글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 적절히 함유할 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어, WO 98/30679 에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 추가로, 본 발명 방법을 보다 간편하게 실시하기 위해서, 혈청 대체물은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는 예를 들어, 화학적으로 규정된 Lipid 농축물 (Gibco 사 제조), Glutamax (Gibco 사 제조) 를 언급할 수 있다.
부유 배양에 사용하는 무혈청 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2－메르캅토 에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 "혈청 배지" 는 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 배지는 상기 서술한 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 추가로, 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토 에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "부유 배양" 은 세포 또는 세포 덩어리를 배양 기재 등에 접착시키지 않는 조건으로 배양하는 것을 말한다.
부유 배양에 사용되는 세포 배양기는 "부유 배양" 이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 당업자이면 적절히 결정할 수 있다. 이와 같은 세포 배양기의 예시는 플라스크, 조직배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀을 포함한다. 이러한 세포 배양기는 부유 배양 관점에서 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리) 되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 "영장류" 는 영장류에 속하는 포유류 동물을 의미한다. 영장류의 예시는 레무르 (lemur), 로리스 (loris) 및 츠바이 (Tsubai) 와 같은 원원아목, 원숭이, 유인원, 인간과 같은 진원아목을 포함한다.
＜망막 조직의 제조 방법＞
본 발명의 제 1 국면은 하기 (1) 내지 (3) 의 단계를 포함하는 망막 조직의 제조 방법이다.
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계.
(1) 제 1 단계
다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계에 대해 설명한다.
Wnt 신호전달 경로 저해 물질은 Wnt 에 의해 매개되는 신호 전달을 저재할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않는다. Wnt 신호전달 경로 저해 물질의 예시는 Dkk1, Cerberus 단백직, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 도미넌트 네거티브 티브 Wnt 단백직, CKI-7 (N-(2-아미노에틸)-5-클로로-이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476 (4-{4-(2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미이다졸-2-일}벤즈아미드), IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2 등을 포함한다.
본 발명에 사용되는 Wnt 신호전달 경로 저해 물질의 농도는 다능성 줄기 세포의 응집체가 형성하는 농도이면 된다. 예를 들어 IWR1e 와 같은 통상적인 Wnt 신호전달 경로 저해 물질의 경우에는, 약 0.1μM 내지 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 10μM, 보다 바람직하게는 약 3μM 의 농도로 첨가한다.
Wnt 신호전달 경로 저해 물질은 부유 배양 개시 전에 무혈청 배지에 첨가될 수 있거나, 또는 부유 배양 개시 후 며칠 이내 (예를 들어, 5 일 이내) 에 무혈청 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, Wnt 신호전달 경로 저해 물질은 부유 배양 개시 후 5 일 이내, 보다 바람직하게는 3 일 이내, 가장 바람직하게는 부유 배양 개시와 동시에 무혈청 배지에 첨가한다. 추가로, Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 첨가한 상태로 부유 배양 개시 후 18 일째까지, 보다 바람직하게는 12 일째까지 부유 배양을 실시한다.
제 1 단계에서의 배양 온도, CO2 농도와 같은 배양 조건은 적절히 결정될 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
본 발명에 있어서 "응집체" 는 배지 중에 분산되어 있던 세포가 집합해 형성한 덩어리를 지칭한다. 본 발명에 있어서의 "응집체" 는 부유 배양 개시시에 분산되어 있던 세포가 형성한 응집체와 부유 배양 개시시에 이미 형성되고 있던 응집체를 포함한다.
"응집체를 형성하다" 는, 세포를 집합시켜 세포의 응집체를 형성시켜 부유 배양시킬 때에, "일정 갯수 분산한 줄기 세포를 신속히 응집" 시킴으로써 질적으로 균일한 세포의 응집체를 형성시키는 것을 말한다.
응집체를 형성시키는 실험적인 조작의 예시는, 웰의 작은 플레이트 (96 웰 플레이트) 나 마이크로포어 등을 이용해 작은 공간에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 이용해 단시간 원심하여 세포를 응집시키는 방법 등을 포함한다.
제 1 단계에서 다능성 줄기 세포의 농도는, 다능성 줄기 세포의 응집체를 보다 균일하게, 효율적으로 형성시키도록 당업자가 적절히 설정할 수 있다. 응집체 형성시 다능성 줄기 세포의 농도는, 줄기 세포의 균일한 응집체를 형성할 수 있는 농도라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 96 웰 마이크로 웰 플레이트를 이용해 인간 ES 세포를 부유 배양하는 경우, 웰 당 약 1×103 내지 약 5×104 개의 세포, 바람직하게는 약 3×103 내지 약 3×104 개의 세포, 보다 바람직하게는 약 5×103 내지 약 2×104 개의 세포, 가장 바람직하게는 약 9×103 개의 세포가 되도록 조제한 액을 첨가하고, 플레이트를 정치시키고 응집체를 형성시킨다.
응집체 형성에 필요한 부유 배양 시간은, 세포를 신속히 응집시킬 수 있는 한 사용하는 다능성 줄기 세포에 의해 적절히 결정 가능하지만, 균일한 응집체를 형성하기 위해서는 가능한 한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES 세포의 경우에는, 바람직하게는 24 시간 이내, 보다 바람직하게는 12 시간 이내에 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 응집체 형성 시간은 세포 응집 용구, 원심 조건등을 조정하여 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
다능성 줄기 세포의 응집체가 형성되었는지 여부는, 응집체의 크기 및 세포 갯수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동시성 (synchronism), 응집체 사이에서의 분화 효율 재현성 등을 바탕으로 하여, 당업자가 판단할 수 있다.
(2) 제 2 단계
제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계 에 대해 설명한다.
"기저막 제제" 은, 그 위에 기저막을 형성하려는 원하는 세포를 파종해 배양했을 경우에, 표피 세포의 것과 유사한 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 가진 그 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 지칭한다. 여기서, "기저막 구성 성분" 은 동물의 조직에 있어서 표피 세포층과 간질세포층 등 사이에 존재하는 얇은 막 형태의 세포외 매트릭스 분자를 지칭한다. 기저막 제제의 예시는 기저막을 통해 지지체 상에 접착하고 있는 기저막을 형성할 수 있는 세포를, 그 세포의 지질을 용해할 수 있는 용액 또는 알칼리 용액을 이용해 제거하여 제조될 수 있다. 바람직한 기저막 제제의 예시는, 기저막 성분으로 시판되고 있는 상품 (예를 들어 Matrigel (이하, 마트리겔로도 언급함)) 또는, 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 (entactin) 등) 을 포함한다.
Matrigel 은 Engelbreth Holm Swarn (EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. Matrigel 의 주성분은 IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 (entactin) 이다. 이에 추가하여 TGF－β, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자, EHS 종양에 의해 자연적으로 제공되는 성장 인자가 포함된다. Matrigel 의 "성장 인자를 줄인 제품" 은 통상적인 Matrigel 보다 성장 인자의 농도가 낮으며, 그 표준적인 농도는 EGF 가 ＜0.5 ng/ml, NGF 가 ＜0.2 ng/ml, PDGF 가 ＜5 pg/ml, IGF-1 가 5 ng/ml, TGF-β 가 1.7 ng/ml 이다. 본 발명 방법에서 바람직하게는 "성장 인자를 줄인 제품" 이 사용된다.
제 2 단계에서 부유 배양으로 무혈청 배지에 첨가되는 기저막 제제의 농도는, 신경 조직 (예를 들어 망막 조직) 의 표피 구조가 안정적으로 유지되는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 Martigel 을 사용하는 경우에는, 바람직하게는 배양액의 1/20 내지 1/200 의 용적, 보다 바람직하게는 약 1/100 의 용적이다. 기저막 제제는 줄기 세포의 배양 개시시에 이미 배지에 첨가되어 있어도 되지만, 바람직하게는 부유 배양 개시 후 5 일 이내, 보다 바람직하게는 부유 배양 개시 후 2 일 이내에 무혈청 배지에 첨가된다.
제 2 단계에 사용될 무혈청 배지로서는, 제 1 단계에 사용한 무혈청 배지를 그대로 사용할 수도 있고, 새로운 무혈청 배지로 교체할 수도 있다.
제 1 단계에 사용한 무혈청 배지를 그대로 본 단계에 사용하는 경우, "기저막 제제" 을 배지에 첨가할 수 있다.
제 1 단계 및 제 2 단계에서 부유 배양에 사용되는 무혈청 배지는, 상기 서술한 것과 같은 것이면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 조제의 번잡함을 피한다는 점에서, 이러한 무혈청 배지로서 시판되는 KSR (Knockout Serum Replacement) 를 적당량 첨가한 무혈청 배지 (GMEM 또는 DMEM, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 Mix, 1 mM 피루브산 나트륨) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR 의 투여량은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 1 내지 20% 이며, 바람직하게는 2 내지 20% 이다.
제 2 단계에 있어서의 배양 온도, CO2 농도와 같은 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
(3) 제 3 단계
제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지에서 부유 배양하는 제 3 단계에 대해 설명한다.
제 3 단계에 사용되는 혈청 배지로는, 제 2 단계에서 배양에 사용한 무혈청 배지에 혈청을 직접 첨가하여 한 것을 사용해도 되고, 새로운 혈청 배지로 교체해도 된다.
제 3 단계에서 배지에 첨가되는 혈청으로서, 예를 들어 소 혈청, 송아지 혈청, 우태아 혈청, 말 혈청, 망아지 혈청, 말 태아 혈청, 토끼 혈청, 아기 토끼 혈청, 토끼 태아 혈청, 인간 혈청 등 포유 동물의 혈청 등이 사용될 수 있다.
혈청은 부유 배양 개시 후 7 일 후, 보다 바람직하게는 9 일 이후, 가장 바람직하게는 12 일 후에 첨가된다. 첨가되는 혈청 농도는 약 1 내지 30%, 바람직하게는 약 3 내지 20%, 보다 바람직하게는 약 10% 로 첨가한다.
제 3 단계에서 사용되는 혈청-함유 배지는, 상기 서술한 것과 같은 한 특별히 제한되지 않지만, 상기 무혈청 배지 (GMEM 또는 DMEM, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 Mix, 1 mM 피루브산 나트륨) 에 혈청을 첨가한 것을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 혈청 배지로서는, 시판되는 KSR (Knockout Serum Replacement) 를 적당량 첨가한 것을 사용할 수 있다.
제 3 단계에 있어서, 혈청에 추가하여 Shh 신호전달 경로 상에 작용하는 물질을 첨가하는 것으로 망막 조직의 제조 효율을 상승시킬 수 있다.
Shh 신호전달 경로 작용 물질로서는, Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 강화할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않는다. Shh 신호전달 경로 작용 물질의 예시는 Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, SAG 등을 포함한다.
본 단계에 사용되는 Shh 신호전달 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 SAG 과 같은 통상적인 Shh 신호전달 경로 작용 물질의 경우에는, 약 0.1 nM 내지 10μM, 바람직하게는 약 10 nM 내지 1μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM 이다.
이와 같이 하여 제조된 망막 조직은, 응집체의 표면을 덮으면서 존재한다. 본 발명 제조 방법에 의해 망막 조직이 제조되었는지 여부는, 이하의 (4) 에 기재된 면역 염색법 등으로 확인할 수 있다.
또, 응집체의 표면에 존재하는 망막 조직을 핀셋 등을 이용해 응집체로부터 물리적으로 절단하는 것도 가능하다. 이 경우, 각 응집체의 표면에 망막 조직 이외의 신경 조직이 형성되는 경우도 있기 때문에, 응집체로부터 절단한 신경 조직의 일부를 잘라내, 이것을 이용해 (4) 에 기재된 면역 염색법 등으로 확인함으로써, 그 조직이 망막 조직인 것을 확인할 수가 있다.
(4) 망막 조직의 확인 방법
이상의 제 1 단계 내지 제 3 단계를 거치는 것으로, 망막 조직을 제조할 수 있다. 나아가, 이하의 방법에 의해 제 1 단계 내지 제 3 단계에 의해 망막 조직이 제조된 것을 확인할 수 있다.
제 3 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중의 부유 배양에 적용한다. 부유 배양으로 사용되는 세포 배양기는 상기 서술한 것을 포함한다. 부유 배양의 배양 조건, 예컨대 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O2 농도는 예를 들어 20 내지 70%, 바람직하게는 20 내지 60%, 보다 바람직하게는 30 내지 50% 이다.
본 단계의 배양 기간은 특별히 제한되지 않지만, 통상 48 시간 이상이며, 바람직하게는 7 일 이상이다.
부유 배양 종료 후, 망막 조직은 응집체를 파라포름알데히드 용액과 같은 고정액을 이용해 고정하고, 동결 절편을 제작 후, 층 구조가 형성되어 있음을 면역 염색법 등에 의해 확인할 수 있다. 망막 조직의 각 층이 상이한 망막 전구 세포 (시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포) 를 포함하여 구성되므로, 층 구조의 형성은 이들 세포에서 발현되는 상기 언급된 마커에 대한 항체를 이용하는 면역염색법으로 확인할 수 있다.
＜안배형 구조체의 제조 방법＞
본 발명의 제 2 국면은, 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 망막 조직을, Shh 신호전달 경로 작용 물질과 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에 부유 배양하는 단계를 포함하는 안배형 구조체의 제조 방법이다. 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 망막 조직으로서는 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 의 제 3 단계에서 배양된 망막 조직을 포함하는 응집체를 사용할 수 있다. 제 2 의 본 발명의 실시양태로서는, 하기 (1) 내지 (4) 의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 안배형 구조체의 제조 방법을 언급할 수 있다：
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계 및
(4) 제 3 단계에서 배양된 응집체를, 각각 Shh 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 4 단계.
여기서, Shh 신호전달 경로 작용 물질로서는, Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 강화할 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않는다. Shh 신호전달 경로 작용 물질의 예시는 Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, SAG 등을 포함한다.
본 발명의 제 2 국면에 사용되는 Shh 신호전달 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 SAG 와 같은 통상적인 Shh 신호전달 경로 작용 물질의 경우에는, 약 0.1 nM 내지 10μM, 바람직하게는 약 10 nM 내지 1μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM 이다.
Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 예시는 Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) 등을 포함한다.
본 발명의 제 2 국면에 사용되는 Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 CHIR99021 과 같은 통상적인 Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 경우에는, 약 0.1μM 내지 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 30μM, 보다 바람직하게는 약 3μM 의 농도이다.
Shh 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질은 부유 배양 개시 12 일 이후 내지 25 일 이전에, 바람직하게는 15 일 이후 내지 18 일 이전에 첨가한다. 상기의 경우, 응집체 형성 단계에서 첨가된 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
부유 배양 개시부터 18 일째 이후에 응집체로부터 안배형 구조체가 돌기 형태로 형성된다. 안배형 구조체인지 여부는 당업자이면 현미경, 확대경 등을 이용한 관찰로 확인이 가능하다.
이와 같이 하여 제조된 안배형 구조체는 외층과 내층의 2 층 구조로 형성된다. 망막 색소 표피 세포는 외층에 존재하고, 망막 전구 세포는 내층에 존재하기 때문에, 예를 들어 이 안배형 구조체의 동결 절편을 제작해, 면역 염색을 실시함으로써, 망막 전구 세포와 망막 색소 표피 세포임을 확인관찰할 수 있다.
나아가, 본 발명 방법에 의해 제조된 안배형 구조체는 응집체로부터 돌기 형태로 형성되므로, 상기 돌기를 응집체로부터 물리적으로 형태적으로 절단하여, 절단한 안배형 구조체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 에 적용하고, FACS 로 분류하여 고순도의 망막 전구 세포를 수득하는 것도 가능하다. 안배형 구조체의 절단 방법은 특별히 제한되지 않고, 줄기 세포의 응집체로부터 미세 핀셋 등을 이용해 용이하게 절단할 수 있다.
＜망막층 특이적 신경세포의 제조 방법＞
본 발명의 제 3 국면은, 영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포에 Notch 신호전달 경로 저해 물질을 접촉시키는 것을 포함하는 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법이다. 본 발명 방법에 의하면, 망막 전구 세포로부터 망막층 특이적 신경세포를 제조할 수 있다.
(영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직의 제조 방법)
망막층 특이적 신경세포의 제조 방법에 사용되는 "영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직" 에 대해 설명한다.
영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직으로서는, 예를 들어 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 망막 조직, 또는 상기 ＜안배형 구조체의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 안배형 구조체로부터 제조되는 망막 조직을 사용할 수 있다.
후자의 경우, 상기 ＜안배형 구조체의 제조 방법＞ 의 제 4 단계에서 형성된 안배형 구조체를 추가로 부유 배양함으로써, 망막 조직을 제조할 수 있다.
안배형 구조체는 상기 서술한 대로 응집체에서 돌기 형태로 형성되므로, 당해 돌기를 응집체로부터 물리적, 형태적으로 절단하여, 분리 및 배양함으로써 고순도의 망막 조직을 수득할 수 있다. 안배형 구조체의 절단 방법은 특별히 제한되지 않으며, 줄기 세포의 응집체로부터 미세 핀셋 등을 이용해 용이하게 절단할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이 제조한 망막 조직 및 안배형 구조체에는 망막 전구 세포가 포함되어 있어, 상기 망막 전구 세포에 Notch 신호전달 경로 저해 물질을 접촉시킴으로써 망막 전구 세포로부터 망막층 특이적 신경세포를 제조할 수 있다.
＜Notch 신호전달 경로 저해 물질＞
다음으로, 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법에 사용되는 Notch 신호전달 경로 저해 물질에 대해 설명한다.
Notch 신호전달 경로 저해 물질은, Notch 에 의해 매개되는 신호 전달을 저해할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. Notch 신호전달 경로 저해 물질의 예시는 Notch 항체, Notch 수용체 안타고니스트, ADAM 저해제, 감마 세크레타아제 저해제 등을 포함한다.
감마 세크레타아제 저해제의 예시는, N-[N-(3,5-디플루오로 펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐 글리신 t-부틸 에스테르 (DAPT) 를 포함한다.
감마 세크레타아제 저해제의 농도는, 망막 전구 세포로부터 시세포 전구 세포 또는 시세포에 대한 분화를 촉진할 수 있는 농도인 한 특별히 제한되지 않는다. 이러한 농도는, 예를 들어 일반적인 감마 세크레타아제 저해제의 경우, 약 0.1 내지 1000μM, 바람직하게는 약 1 내지 100μM, 보다 바람직하게는 약 10μM 일 수 있다.
감마 세크레타아제 저해제는 영장류 다능성 줄기 세포로부터 제조되는 망막 조직 가운데, 영장류 다능성 줄기 세포의 부유 배양 개시 후 15 일 이후 및 200 일 이내에 배지에 첨가된다. 바람직하게는, 감마 세크레타아제 저해제는 분화 유도 20 일 이후 150 일 이내, 보다 바람직하게는 분화 유도 25 일 이후 100 일 이내의 시기에 배지에 첨가된다.
감마 세크레타아제 저해제의 존재하에서의 접착 배양의 기간은 시세포 전구 세포 또는 시세포를 보다 효율적으로 제공할 수 있는 길이일 수 있다. 이러한 기간의 길이는, 예를 들어 약 3 일 이상, 바람직하게는 약 5 내지 100 일, 보다 바람직하게는 약 7 내지 30 일일 수 있다.
(망막층 특이적 신경세포의 확인 방법)
상기 서술한 바와 같이 제조된 망막층 특이적 신경세포를 확인하는 방법으로서 망막층 특이적 신경세포가 시세포, 시세포 전구체, 신경절 세포인 경우를 예로서 설명한다.
제조된 망막층 특이적 신경세포가 시세포 전구 세포 인지의 여부는, 공지된 방법, 예를 들어, 시세포 전구 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 시세포 전구 세포 마커의 예시는 Crx 를 포함한다.
시세포에는 간상 세포 및 원추 세포가 포함된다. 제조된 세포가 시세포인지의 여부는 자체 공지된 방법, 예를 들어 시세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 시세포 마커의 예시는 로돕신 (간상 세포), 적/록 옵신 (원추 세포), 청색 옵신 (원추 세포), 리코베린 (recoverin) (간상 세포, 원추 세포) 등을 포함한다.
추가로, 제조된 망막층 특이적 신경세포가 신경절 세포 인지의 여부는 공지된 방법, 예를 들어 신경절 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 신경절 세포 마커의 예시는 Brn3 을 포함한다.
접착 배양의 종료 후, 망막 조직으로부터 시세포 전구 세포 또는 시세포가 분리될 수 있다. 그러한 분리는 시세포 전구 세포 또는 시세포의 표면 마커에 대한 항체 등을 이용해 자체 공지된 방법 (세포 분류기 (cell sorter) 등) 에 의해 실시할 수가 있다. 추가로, 배양 종료 후 망막 조직으로부터 신경절 세포가 분리될 수 있다. 그러한 분리는 신경절 세포의 표면 마커에 대한 항체 등을 이용해 자체 공지된 방법 (세포 분류기 등)에 의해 실시할 수가 있다. 대안적으로, 다능성 줄기 세포로서 시세포 전구 세포의 마커 (예를 들어 Crx) 를 코드하는 유전자나 시세포의 마커 (예를 들어 리코베린), 신경절 세포의 마커 (Brn3) 에 표지 유전자 (예를 들어 GFP 등의 형광 단백질) 내에 넉 인-프레임 (knock in-frame) 되어 있는 세포를 이용해 그 표지 유전자의 발현을 표식으로 이용해, 자체 공지된 방법 (세포 분류기 등) 에 의해 각각의 세포를 분리할 수 있다.
＜망막 색소 표피 세포의 제조 방법＞
본 발명의 제 4 국면은, 상기 언급된 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 망막 조직을 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 (단, Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는다) 에서 부유 배양하는 단계를 포함하는, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법이다. 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득된 망막 조직으로서는 상기 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 의 제 3 단계에서 배양된 망막 조직을 포함하는 응집체를 사용할 수 있다. 제 4 의 본 발명의 구현예로서, 하기 (1) 내지 (4) 의 단계를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법을 언급할 수 있다：
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계, 및
(4) 제 3 단계에서 배양된 응집체를 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지에서 부유 배양하는 제 4 단계, 여기서 상기 무혈청 배지 및 혈청 배지는 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않음.
여기서, Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 예시는 Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) 등을 포함한다.
본 발명의 제 4 국면에 사용되는 Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 농도는 예를 들어 CHIR99021 와 같은 통상적인 Wnt 신호전달 경로 작용 물질의 경우에는 약 0.1μM 내지 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 30μM, 보다 바람직하게는 약 3μM 의 농도로 첨가한다.
Wnt 신호전달 경로 작용 물질은, 예를 들어 인간 ES 세포를 사용하는 경우, 제조 개시 후 12 일 이후, 가장 바람직하게는 15 일째에 첨가한다. 상기의 경우, 제 1 단계에서 첨가되는 Wnt 신호전달 경로 저해 물질 및 제 3 단계에서 첨가되는 Shh 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지를 사용한다.
본 발명의 제 4 국면에서, 상기 언급된 ＜망막 조직의 제조 방법＞ 에 의해 수득되는 망막 조직 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 Wnt 신호전달 경로 작용 물질과 Activin 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에 배양하는 것이 바람직하다.
Activin 신호전달 경로 작용 물질로서는, Activin 에 의해 매개되는 신호 전달을 증강할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되지 않는다. Activin 신호전달 경로 작용 물질의 예시는 Activin 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Activin A, Activin B, Activin CActivin AB 등), Activin 수용체, Activin 수용체 아고니스트 등을 포함한다.
본 단계에 사용되는 Activin 신호전달 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems 사＃338-AC) 등의 통상적인 Activin 신호전달 경로 작용 물질의 경우, 1 ng/ml 내지 10 ug/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 1 ug/ml, 보다 바람직하게는 약 100 ng/ml 의 농도로 첨가한다.
이와 같이 하여 제조된 망막 색소 표피 세포는 응집체의 표면에 존재하기 때문에, 현미경 관찰 등으로 용이하게 확인이 가능하다. 망막 색소 표피 세포가 존재하는 응집체를 이용해, 예를 들어 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 하여, FACS 를 이용해 선별하는 것으로 고순도의 망막 색소 표피 세포를 수득할 수 있다. 또, 핀셋 등을 이용해 응집체로부터 물리적으로 망막 색소 표피 세포를 절단하여 배양할 수도 있다. 분산 또는 절단한 망막 색소 표피 세포를 접착 조건하에서 배양할 수 있다. 접착 배양의 경우, 세포 접착성 세포 배양기, 예를 들어 세포외 매트릭스 등 (예를 들어, 폴리-D-라이신, 라미닌, 피브로넥틴) 에 의해 코팅 처리된 세포 배양기를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 접착 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 배양 조건은 당업자이면 용이하게 결정할 수 있다. 그러한 경우, 혈청, 공지된 성장 인자, 성장을 촉진하는 첨가제 및 화학 물질 존재 하에 배양이 실시될 수 있다. 공지된 성장 인자의 예시는 EGF, FGF 등을 포함한다. 성장을 촉진하는 첨가제의 예시는 N2 supplement (Invitrogen 사), B27 supplement (Invitrogen 사) 등을 포함한다.
＜망막 조직의 독성 또는 약효 평가용 시약으로서의 사용＞
본 발명의 제 1 내지 제 4 국면에서 제조된 망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 또는 망막 색소 표피 세포는 망막 조직 또는 망막 관련 세포의 장해에 근거하는 질환의 치료약의 스크리닝, 그 밖의 원인에 의한 세포 손상 상태 에 대한 치료약에 대해의 세포 치료용 이식용 재료나 질환 연구 재료, 창약 재료로서 이용 가능하다. 추가로, 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가, 광 독성과 같은 독성 연구, 독성 시험 등에 활용 가능하다.
망막 조직 또는 망막 관련 세포의 장해에 근거하는 질환의 예시는 유기 수은 중독, 클로로퀸 망막증, 망막 색소 변성증, 노인성 황반변성증, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생아 망막증 등을 포함한다.
＜망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 또는 망막 색소 표피 세포의 이식용 생체 재료로서의 사용＞
본 발명의 제 1 내지 제 4 국면에 의해 제조된 망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 또는 망막 색소 표피 세포는 세포 손상 상태에 있어서, 당해 세포나, 장해를 받은 조직 자체 보충을 위한 (예를 들어, 이식 수술에 사용하는) 이식용 생체 재료로서 사용할 수 있다. 이식 방법의 예시는 후술의 실시예에 기재된 방법을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
이하의 비교예 및 실시예에 의해 본 발명 제조 방법을 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 지나지 않고, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
(RAX 넉인 (knock-in) 인간 ES 세포의 확립)
망막 전구 세포의 마커 유전자의 하나인 RAX 유전자 좌에 GFP 를 넉인한 인간 ES 세포주를 제조했다.
인간 ES 세포주 (KhES-1 쿄토 대학에서 확립한 인간 ES 세포주) 의 게놈 DNA상 RAX 유전자를 특이적으로 절단하는 Zinc Finger Nuclease (ZFN) 를 Sigma Aldrich 사로부터 구입했다. 단일 세포화한 인간 ES 세포를 이용해, 전기영동법에 따라, ZFN-코딩 mRNA 및 GFP 및 약제 선택 유전자인 네오마이신 내성 유전자를 보유한 넉인 벡터를 함께 도입해, 미토마이신 C 로 처리한 네오마이신 내성 마우스 섬유아세포 상에 플레이팅했다. 플레이팅 다음날부터 배지에 G418 를 첨가해, 약제 선택을 실시했다. 수득된 내성 클론의 콜로니를 픽업해 배양을 계속해 PCR 법 또는 서던 블랏법에 의해 넉인 세포를 선별해, RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포주를 확립했다.
비교예 1：인간 ES 세포를 사용한 망막 조직의 제조 (Matrigel 첨가 조건)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포 (KhES-1 유래) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006" "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지로 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 그 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 인 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 이후 부유 배양을 계속하면서 정기적으로 형광 현미경 관찰을 실시했다.
그 결과, 부유 배양 개시 25 일째까지 형광 현미경 관찰을 실시했는데, 망막 전구 세포가 유도된 것을 나타내는 GFP 발현 세포가 약간 발견되었다 (도 1A, B).
비교예 2：인간 ES 세포를 사용한 망막 조직의 제조 (Nodal 신호전달 경로 저해제 및 Matrigel 첨가 조건)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포 (KhES-1 유래) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum ReplacementInvitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조에는, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지로 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 그 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Nodal 신호전달 경로 저해 물질 (10μM SB431542) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 인 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 이후 부유 배양을 계속하면서 부유 배양 개시 18 일째에 형광 현미경 관찰 및 FACS 를 사용한 GFP 발현 세포의 비율 확인을 실시했다.
그 결과, GFP 발현 세포가 다소 발견되었다 (도 1C, D).
비교예 3：인간 ES 세포를 사용한 망막 조직의 제조 (Wnt 신호전달 경로 저해제 및 Matrigel 첨가 조건)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포 (KhES-1 유래) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양하고, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조를 위해, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지로 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 그 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 이후 부유 배양을 계속 하면서 부유 배양 개시 18 일째에 형광 현미경 관찰 및 FACS 를 사용한 GFP 발현 세포의 비율 확인을 실시했다.
그 결과, 비교예 1 및 2 에 비해, 분명하게 GFP 발현 세포가 증가했다 (도 1E, F).
실시예 1: 인간 ES 세포를 사용한 망막 조직의 제조 (Wnt 신호전달 경로 저해제 및 Matrigel, 혈청 첨가 조건)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포 (KhES-1 유래) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al.Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양하고, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조를 위해, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 을 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지로, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 추가로, 부유 배양 개시 12 일째에 용적 당 1/10 양의 우태아 혈청을 첨가했다. 이후, 부유 배양을 계속해, 부유 배양 개시 18 일째에 형광 현미경 관찰 및 FACS를 사용한 GFP 발현 세포의 비율 확인을 실시했다. 동시에 혈청을 첨가하지 않는 비교예 3 의 조건에서도 실험을 실시했다.
비교예 3 의 조건에서는 GFP 발현 세포의 비율은 3.2% (도 2A, B, 도 3A) 인것에 비해, 혈청을 첨가한 조건에서는 다수의 GFP 발현 세포가 출현했다 (도 2C, D). FACS 에 의한 분석에서 GFP 양성 세포의 비율은 30% 초과였 (도 3B).
실시예 2： 인간 ES 세포를 사용한 망막 조직의 제조 (Wnt 신호전달 경로 저해제 및 Matrigel, 혈청 및 Shh 시그널 작용 물질 첨가 조건)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포(KhES-1 유래)를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양하고, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (KnockoutSerumReplacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조를 위해, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지로, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는 G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 개시 12 일째에 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청 및 Shh 신호전달 경로 작용 물질 (100 nM SAG) 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 개시 18 일째에 FACS를 이용해 GFP 발현 세포의 비율을 조사했다.
혈청과 동시에 Shh 신호전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것으로 인해 매우 많은 GFP 발현 세포가 출현했다 (도 2E, F). FACS 에 의한 분석에서 GFP 발현 세포의 비율은 70% 이상에 이는 것으로 나타났다.
비교예 3 에 비해, 혈청을 첨가하는 실시예 1 의 조건에서는 GFP 발현 세포의 비율이 약 10 배 상승했고, 추가로 혈청과 Shh 신호전달 경로 작용 물질을 동시에 첨가하는 실시예 2 의 조건에서는 GFP 발현 세포의 비율이 24 배 정도 상승하는 것을 알 수 있었다 (도 3D).
실시예 3：망막 조직의 형성 확인
(방법)
실시예 2 및 3 에서 제조한 GFP 발현 세포가 있는 응집체에 대해 망막 조직 형성의 확인을 실시했다. 부유 배양 개시 18 일째부터 DMEM/F12 배지에 N2 supplement, 10%(v/v) 우태아 혈청, 0.5μM 레티노익산을 첨가한 혈청 배지를 이용해, 40% O2 조건하에서 부유 배양을 실시했다. 이후, 응집된 덩어리를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정해, 동결 절편을 제작 후, 면역 염색법으로 조직 구조를 확인했다.
그 결과, 부유 배양 개시 60 일째에 최하층에는 Brn3 및 TuJ1 양성의 신경절 세포, 최외층 및 중간층에 Crx 및 Recoverin 양성의 시세포 전구 세포, 최외층의 Brn3 양성 세포와 최하층의 Brn3 양성 세포의 사이에 Chx10 양성의 쌍극세포 등의 인터뉴런 전구 세포가 정연하게 층을 이루어 배열되어 있음이 밝혀졌다 (도 4A, B, C). 나아가, 126 일째까지 부유 배양을 계속 하면, Crx 및 Recoverin 양성의 시세포 전구 세포는 최외층에 집적해, 간상 세포에서 특이적에 발현하는 Nrl 를 발현하는 세포 또는 원추 세포에서 특이적에 발현하는 Rxr-gamma 를 발현하는 세포가 관찰되었다. 추가로, 중간층에 있어서 수평 세포 및 아마크린 세포의 전구 세포 마커인 Ptf1a 를 발현하는 세포가 관찰되었다 (도 4D, E, F, G, H, I). 이러한 결과로부터, 인간 ES 세포로부터 고효율에 망막 조직이 제조 가능한 것으로 나타났다.
실시예 4： 인간 ES 세포로부터 제조한 망막 조직의 눈에 대한 이식
안구의 공막절개 후, 공막 절개창으로부터 초자체 중에 주사바늘을 삽입해, 안압을 저하시킨다. 공막 절개창으로부터 망막하강에 세포 이식바늘을 이용해 안내관류액을 주입해, 인공적으로 얕은 망막 박리 상태를 형성한다. 형성한 공간에 세포 이식바늘 또는 세포 시트 이식 디바이스를 이용해 망막 조직을 이식한다.
실시예 5：인간 ES 세포를 사용한 고효율인 안배형 구조체의 제조
(방법)
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포를 이용해, 안배형 구조체를 제조했다.
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포(KhES-1 유래)를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5~10 ng/ml bFGF를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 응집체의 형성에는, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 동안, 부유 배양 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 배양했다. 부유 배양 개시 12 일째에 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지에 부유 응집체를 옮겨, 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청을 첨가해 배양했다. 나아가, 15 일째부터 Wnt 신호전달 경로 작용 물질 (3μM CHIR99021) 및 Shh 신호전달 경로 작용 물질 (100 nM SAG) 을 포함하는 혈청 배지로 부유 배양했다.
(결과)
상기 방법으로 제조시, 부유 배양 개시 14 일째 쯤 응집체의 일부에서 RAX 를 발현하는 것으로 나타난 GFP 양성의 세포 집단이 출현해 (도 5A), 그 후 응집체의 외측에 융기해 (도 5B, C) 추가로 부유 배양을 계속 하면, 명확한 돌기를 형성했다 (도 5D). 게다가 부유 배양을 계속하면, GFP 양성 세포 (망막 전구 세포) 로 구성되는 응집체 상에, 명료한 안배형 구조체가 형성되었다 (도 6). 이 안배형 구조체는 응집체를 현미경 관찰하는 것만으로 분명하게 인식이 가능했다 (도 6A). 응집체 상에 형성된 안배형 구조체에 대해, 이광자 현미경을 이용해 상세하게 관찰을 실시했는데, 외부와 내부의 2 층 구조가 있음을 알게 되었다 (도 6C, D). 상기 안배형 구조체에 대해 동결 절편을 제작해 면역염색을 실시했는데, 외측에 Mitf 를 발현하는 망막 색소 표피 세포의 층이 존재했으며, 그 내측에 Chx10 양성의 신경 망막 전구 세포가 존재하고 있었다 (도 7).
실시예 6： 인간 ES 세포로부터 제조한 안배형 구조체의 눈에 대한 이식
안구의 공막 절개 후, 공막 절개창으로부터 초자체 중에 주사바늘을 삽입해, 안압을 저하시킨다. 공막 절개창으로부터 망막하강에 세포 이식바늘을 이용해 안내관류액을 주입해, 인공적으로 얕은 망막 박리 상태를 형성한다. 형성한 공간에 세포 이식바늘 또는 세포 시트 이식 디바이스를 이용해 배양한 안배형 구조체를 이식한다.
실시예 7： 인간 ES 세포 유래 망막 조직의 Notch 신호에 작용하는 물질 처리
Crx::GFP 넉인 인간 ES 세포 (KhES-1 유래) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (KnockoutSerumReplacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지로 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 또, 부유 배양 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 12 일째에 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청 및 Shh 신호전달 경로 작용 물질 (100 nM SAG) 을 첨가해 부유 배양하는 것으로, 망막 조직을 제조했다. 부유 배양 개시 29 일째의 망막 조직에 Notch 신호 상에 작용하는 물질 (10μM DAPT (감마 세크레타아제 활성 저해제)) 를 첨가해, 부유 배양 개시 41 일째 (첨가 후 12 일째) 에 형광 현미경으로 관찰하고, 부유 배양 개시 43 일째 (첨가 후 14 일째) 에 4% 파라포름알데히드로 고정해 동결 절편을 제조했다. 제조한 동결 절편은 시세포의 마커 유전자의 하나인 Recoverin, 신경절 세포 마커 유전자의 하나인 Brn3 에 대해 면역 염색을 실시해, DAPT 첨가의 유무의 결과를 비교했다.
그 결과, DAPT 를 첨가하지 않는 경우 (도 8 A) 와 비교해, DAPT 를 첨가했을 경우 GFP 발현 세포가 현저하게 증가하고 있었다 (도 8 B). 추가로, 동결 절편의 면역 염색의 결과로부터, DAPT 를 첨가하면 Recoverin 양성 세포가 3 내지 5 배증가하는 것으로 밝혀졌다 (도 8C, D).
이들의 결과는, 시세포의 현저한 증가한 것을 보여준다. 추가로, Brn3 의 면역 염색 결과로부터 신경절 세포도 DAPT 첨가에 의해 증가한 것을 알았다 (도 8E, F).
실시예 8： 냉동-해동 후의 인간 ES 세포 유래 망막 조직의 Notch 시그널 작용 물질 처리
RAX::GFP 넉인 인간 ES 세포(KhES-1 유래)를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조에는 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지로 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는 G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 또, 부유 배양 개시 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 또, 배양 2 일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 개시 12 일째에 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청 및 Shh 신호전달 경로 작용 물질 (100 nM SAG) 을 첨가해 부유 배양하는 것으로, 망막 조직을 제조했다. 제조한 부유 배양 개시 33 일째의 망막 조직을 냉동-해동 후, 부유 배양 개시 38 일째의 망막 조직에 Notch 신호에 작용하는 저해 물질 (10μM DAPT) 을 첨가해, 부유 배양 개시 49 일째 (첨가 후 11일째) 에 형광 현미경 관찰을 실시한 후, 4% 파라포름알데히드 고정해 동결 절편을 제조했다. 제조한 동결 절편은 시세포 마커 유전자의 하나인 Recoverin, 신경절 세포 마커 유전자의 하나인 Brn3 에 대해 면역 염색을 실시해 DAPT 첨가의 유무의 결과를 비교했다.
그 결과, DAPT 를 첨가하지 않는 경우(도 9A) 와 비교해, DAPT 를 첨가했을 경우, GFP 발현 세포가 현저하게 제조되고 있었다 (도 9 B). 추가로, 동결 절편의 면역 염색의 결과로부터, DAPT 를 첨가하면 Recoverin 양성 세포가 5 배 정도 제조되고 있는 것으로 밝혀졌다 (도 9C, D). 이들 결과는, 시세포가 현저하게 제조된 것을 나타내고 있다. 추가로, Brn3 의 면역 염색 결과로부터 신경절 세포도 DAPT 첨가에 의해 제조된다는 것을 알았다 (도 9E, F).
실시예 9：인간 ES 세포로부터 제조한 망막층 특이적 신경세포의 눈에 대한 이식
안구의 공막 절개 후, 공막 절개창으로부터 초자체 중에 주사바늘을 삽입해, 안압을 저하시킨다. 공막 절개창으로부터 망막하강에 세포 이식바늘을 이용해 안내관류액을 주입해, 인공적으로 얕은 망막 박리 상태를 형성한다. 형성한 공간에 세포 이식바늘 또는 세포 이식 디바이스를 이용해 망막층 특이적 신경세포를 이식한다.
실시예 10：인간 ES 세포를 사용한 고효율인 망막 색소 표피 세포 제조
(방법)
인간 ES 세포 (KhES-1) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 형성에는, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2 로 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 또, 부유 배양 개시 2일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 개시 12 일째에 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청을 첨가해 배양했다. 15 일째부터 Wnt 신호전달 경로 작용 물질 (3μM CHIR99021) 을 포함하는 배지로 부유 배양했다.
(결과)
상기 방법으로 제조했는데, 거의 모든 응집체의 표면에 망막 색소 표피 세포의 집단이 출현했다 (도 10).
실시예 11： 인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포의 제조
(방법)
인간 ES 세포 (KhES-1) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006", "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007" 에 기재된 방법에 따라 부유 배양해, 실험에 사용했다. 배지로서는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20% KSR (Knockout Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/ml bFGF 를 첨가한 것을 사용했다. 부유 배양에 의한 망막 조직의 제조에는, 0.25% 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 이용해 ES 세포를 단일 세포로 분산해, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (SUMILON 스페로이드 플레이트, Sumitomo Bakelite Co.) 의 웰 당 9×10＾3 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이 경우 무혈청 배지로서는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토 에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632, Wnt 신호전달 경로 저해 물질 (3μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 또, 배양 2일째부터 용적 당 1/100 의 양의 Matrigel 을 첨가해 부유 배양했다. 부유 배양 개시 후 12 일째에 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 용적 당 1/10 의 양의 우태아 혈청을 첨가해 배양했다. 15 일째부터 Wnt 신호전달 경로 작용 물질 (3μM CHIR99021) 과 Activin 신호전달 경로 작용 물질 (Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems사＃338-AC) 100 ng/ml) 를 포함하는 배지로 부유 배양했다.
(결과)
상기 방법으로 제조했는데, 거의 모든 응집체의 표면에서 흑색을 나타내는 망막 색소 표피 세포가 출현했다. 나아가, 응집체 표면의 거의 전면이 망막 색소 표피 세포로 덮여 있고 (도 11), 놀랄 만큼 고효율로 망막 색소 표피 세포가 제조되었다.
실시예 12： 인간 ES 세포로부터 제조한 망막 색소 표피 세포의 눈에 대한 이식
안구의 공막 절개 후, 공막 절개창으로부터 초자체 중에 주사바늘을 삽입해, 안압을 저하시킨다. 공막절개창으로부터 망막하강에 세포 이식바늘을 이용해 안내관류액을 주입해, 인공적으로 얕은 망막 박리 상태를 형성한다. 형성한 공간에 세포 이식바늘 또는 세포 시트 이식 디바이스를 이용해 망막 색소 표피 세포를 이식한다.
산업상의 이용 가능성
본 발명에 의하면, 고효율에 망막 조직, 안배형 구조체, 망막층 특이적 신경세포 및 망막 색소 표피 세포를 제조하는 것이 가능하다. 본 발명 제조 방법은 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가나 세포 치료 등을 목적으로 하여 망막 조직을 구성하는 세포군 (시세포, 시신경등) 을 효율적으로 제조하는 것이므로, 조직 구조를 갖는 망막 조직을 사용한 독성 또는 약효 평가나 망막 조직 이식 치료용 이식 재료에 대한 응용을 목적으로 시험 및 치료에 사용될 "조직 재료" 가 되는 망막 조직을 효율적으로 제조한다는 관점에서 매우 유용하다.
본 출원은, 일본에 출원된 일본 특허출원 2011-258209, 일본 특허출원 2011-258210, 일본 특허출원 2011-258211, 일본 특허출원 2011-258212, 일본 특허출원 2012-043080, 일본 특허출원 2012-043081, 일본 특허출원 2012-043082 및 일본 특허출원 2012-043083 을 기초로 하고 있으며, 이들의 내용은 모두 본 명세서에 포함 된다.

Claims (20)

  1. 하기 (1) 내지 (3) 의 단계를 포함하는 망막 조직의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
    (2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계, 및
    (3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계.
  2. 제 1 항의 방법으로 수득된 망막 조직을 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에 부유 배양하는 단계를 포함하는 안배형 (optic-cup-like) 구조체의 제조 방법.
  3. 제 1 항의 방법으로 수득된 망막 조직을, 각각 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 (여기서, 상기 무혈청 배지 및 혈청 배지는 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는다) 중에서 부유 배양하는 단계를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지가 Activin 신호전달 경로 작용 물질을 추가로 함유하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 기저막 제제가 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴 (entactin) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포외 매트릭스 분자인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계 내지 제 3 단계가 넉아웃 혈청 대체물 존재 하에 실시되는 방법.
  9. 영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포에 Notch 신호전달 경로 저해 물질을 접촉시키는 것을 포함하는 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, Notch 신호전달 경로 저해 물질이 감마 세크레타아제 활성 저해 물질인 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, Notch 신호전달 경로 저해 물질이 N-［N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐 글리신 t-부틸 에스테르인 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류가 인간인 방법.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 망막층 특이적 신경세포가 시세포 (photoreceptor) 인 방법.
  14. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 망막층 특이적 신경세포가 신경절 세포 (ganglion cell) 인 방법.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류 다능성 줄기 세포 유래의 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포 (retinal progenitor cell) 가 하기 단계로 제조된 망막 조직에 포함되는 망막 전구 세포인 방법:
    (1) 영장류 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호전달 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양함으로써 영장류 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 단계,
    (2) 제 1 단계에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 2 단계,
    (3) 제 2 단계에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에 부유 배양하는 제 3 단계,
    (4) 제 3 단계에서 배양된 응집체를 각각 Sonic hedgehog 신호전달 경로 작용 물질 및 Wnt 신호전달 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에 또는 혈청 배지 중에 부유 배양함으로써, 안배형 구조체를 형성시키는 제 4 단계, 및
    (5) 제 4 단계에서 형성된 안배형 구조체를 부유 배양하는 단계.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 함유하는 독성 또는 약효 평가용 시약.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포에 피검 물질을 접촉시켜, 그 물질이 그 조직, 그 구조체 또는 그 세포에 미치는 영향을 검정하는 단계를 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가방법.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 함유하는, 망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료제.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 유효량의 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포 이식을 필요로 하는 표적에 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료 방법.
  20. 망막 조직의 장해로 인한 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 조직, 안배형 구조체, 망막 색소 표피 세포 또는 망막층 특이적 신경세포.
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