KR20190082296A - 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 망막 조직의 이식에 적합한 세포 집단 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법을 제공한다.

Description

이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법
본 발명은 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
근년, 마우스 생체의 정상적인 망막에 있어서, 적절한 분화 단계의 시세포 전구 세포를 이식하면, 기능적으로 생착하는 것이 보고되어(비특허문헌 1), 망막 색소 변성 등의 시세포의 변성 질환에 대한 이식 치료의 가능성이 나타났다.
자기 조직화 배양에 의한 다능성 줄기 세포로부터 입체 망막 조직으로의 분화 유도 방법이 다수 보고되어 있으며, 층 구조를 갖는 입체 망막 조직을 제조하여 이식하는 것이 가능해지고 있다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포로부터 다층의 망막 조직을 얻는 방법(비특허문헌 2 및 특허문헌 1), 균일한 다능성 줄기 세포의 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 중에서 형성시켜, 얻어진 응집체를 기저막 표품의 존재하에서 부유 배양한 후, 혈청 배지 중에서 부유 배양함으로써, 다층의 망막 조직을 얻는 방법(비특허문헌 3 및 특허문헌 2), 및 다능성 줄기 세포의 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양함으로써 망막 조직을 얻는 방법(비특허문헌 4 및 특허문헌 3) 등이 보고되어 있다. 또한, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 망막 조직을 대상에게 이식하면, 그 후 이식편은 생착하여 분화 성숙되는 것이 보고되어 있는 한편, 이식편의 기능적 생착이 충분하지 않은 것도 보고되어 있다(비특허문헌 5).
한편, 생체에 있어서의 망막 조직에 포함되는 망막계 세포의 발생 또는 분화에 관여하는 유전자가 몇가지 보고되어 있다.
예를 들어, ISL1(Insulin gene enhancer protein 1, Islet-1) 유전자는, 췌장, 심장, 신경 등에 있어서 발현되고 있으며, 망막 특이적인 ISL1 유전자 결실 마우스에서는, 생체 내에 있어서 간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포, 아마크린 세포, 강글리온 세포가 변성사하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6).
또한, BHLHE23(basic helix-loop-helix family, member e23) 유전자는, 췌장, 뇌, 망막 등에 있어서 발현되고 있으며, BHLHE23 유전자 결실 마우스에서는, 생체 내에 있어서 간체 쌍극 세포가 변성사하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7).
국제 공개 제2011/055855호 국제 공개 제2013/077425호 국제 공개 제2015/025967호
Nature, 444, 203-207, (2006) Nature, 472, 51-56, (2011) Cell Stem Cell, 10(6), 771-785, (2012) Nature Communications, 6, 6286, (2015) Stem Cell Reports, 2, 662-674, (2014) J Neurosci, 27(46), 12707-20, (2007) Neuron, 43(6), 779-93, (2004)
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 망막 조직의 이식에 적합한 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 이식편의 망막 조직에 있어서의 쌍극 세포를 감소시킴으로써, 망막 조직의 이식 후의 기능적 생착이 개선되는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 거듭한 바, 야생형 게놈을 갖는 망막계 세포와 비교하여, 후술하는 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 게놈을 갖는 망막계 세포는, 쌍극 세포에는 충분히 분화 및 성숙하지 않지만 시세포에는 문제없이 분화 및 성숙하는 것, 및 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단(망막 조직 등)을 이식에 사용함으로써, 이식편 유래의 시세포와 호스트측의 쌍극 세포의 접촉 비율이 향상되어, 해당 망막 조직의 이식 후의 기능적 생착이 개선될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단.
[2] 세포 현탁액 또는 세포 응집체의 형태인, 상기 [1]에 기재된 이식용 세포 집단.
[3] 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 전사 제어 인자를 코딩하는 유전자인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 이식용 세포 집단.
[4] 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 유전자인, 상기 [3]에 기재된 이식용 세포 집단.
[5] 상기 ISL1 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는, 상기 [4]에 기재된 이식용 세포 집단:
(1) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
[6] 상기 BHLHE23 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는, 상기 [4] 또는 [5]에 기재된 이식용 세포 집단:
(1) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
[7] 상기 쌍극 세포 제어 유전자의 개변이 당해 유전자의 결실을 포함하는, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단.
[8] 상기 망막계 세포가 다능성 줄기 세포 유래인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단.
[9] 상기 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포인, 상기 [8]에 기재된 이식용 세포 집단.
[10] 상기 망막계 세포가, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단.
[11] 상기 망막계 세포가, Chx10 양성 세포, Crx 양성 세포 및 리커버린 양성 세포로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는, 상기 [10]에 기재된 이식용 세포 집단.
[12] 상기 이식용 세포 집단에 있어서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계가 전체 세포수의 10％ 이상인, 상기 [10] 또는 [11]에 기재된 이식용 세포 집단.
[13] 상기 시세포, 또는 상기 망막 전구 세포 혹은 상기 시세포 전구 세포로부터 이식 후에 유도되는 시세포의, 이식 후의 기능적 생착율이 개선되는, 상기 [10] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단.
[14] 이식용 세포 집단의 배양물로서,
(1) 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단과,
(2) 상기 이식용 세포 집단의 생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체
를 포함하는 배양물.
[15] 하기 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포의 쌍극 세포 제어 유전자를 개변하여, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 상기 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 얻는 공정,
(2) 공정 (1)에서 얻어진 상기 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 상기 망막계 세포로 분화 유도하고, 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 얻는 공정.
[16] 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단이, 세포 현탁액 또는 세포 응집체의 형태인, 상기 [15]에 기재된 제조 방법.
[17] 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 전사 제어 인자를 코딩하는 유전자인, 상기 [15] 또는 [16]에 기재된 제조 방법.
[18] 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 유전자인, 상기 [17]에 기재된 제조 방법.
[19] 상기 ISL1 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는, 상기 [18]에 기재된 제조 방법:
(1) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
[20] 상기 BHLHE23 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는, 상기 [18] 또는 [19]에 기재된 제조 방법:
(1) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
[21] 상기 쌍극 세포 제어 유전자의 개변이 당해 유전자의 결실을 포함하는, 상기 [15] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[22] 상기 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포인, 상기 [15] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[23] 상기 망막계 세포가, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는, 상기 [15] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[24] 상기 망막계 세포가, Chx10 양성 세포, Crx 양성 세포 및 리커버린 양성 세포로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는, 상기 [23]에 기재된 제조 방법.
[25] 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단에 있어서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계가 전체 세포수의 10％ 이상인, 상기 [23] 또는 [24]에 기재된 제조 방법.
[26] 상기 시세포, 또는 상기 망막 전구 세포 혹은 상기 시세포 전구 세포로부터 이식 후에 유도되는 시세포의, 이식 후의 기능적 생착율이 개선되는, 상기 [23] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[27] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단의 유효량을, 이식을 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료 방법.
[28] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료를 위한 의약 조성물.
[29] 세포 시트의 형태인, 상기 [28]에 기재된 의약 조성물.
[30] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 이식용 세포 집단을 함유하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료약.
[31] 세포 시트의 형태인, 상기 [30]에 기재된 치료약.
본 발명에 따르면, 망막 조직의 이식에 적합한 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은, Bhlhb4 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고 나서 40 내지 50일 후에 있어서의 이식 부위에서의 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는, Bhlhb4 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고 나서 40 내지 50일 후 또는 90 내지 100일 후에 있어서의 호스트 간체 쌍극 세포와 이식 시세포의 접촉 길이의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 3은, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고 나서 40 내지 50일 후에 있어서의 이식 부위에서의 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4는, Bhlhb4 유전자 또는 ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고 나서 30일째 내지 50일째에 있어서의 이식 부위에서의 호스트 쌍극 세포와 이식 시세포의 시냅스 접속을 나타내는 사진이다.
도 5는, Bhlhb4 유전자 또는 ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직(분화 유도 개시 후 29일째의 조직)을 면역 염색한 후의 공초점 현미경 사진이다.
도 6a는, (상단) ISL1 유전자의 기능을 결실시키기 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 디자인을 나타내는 모식도, (중단) ISL1 유전자의 결실을 확인하는 아가로오스 겔 전기 영동의 사진, 및 (하단) 수립한 인간 ES 세포주(ISL1 유전자 결실주)의 사진이다.
도 6b는, CRISPR/Cas9 시스템에 의해 절단된 ISL1 유전자의 부위를 나타내는 도면이다.
도 7a는, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 망막으로 분화시킨 것을 나타내는 사진이다.
도 7b는, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주 유래의 망막에 있어서의, 시세포 전구 세포의 존재를 나타내는 사진이다.
도 7c는, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주 유래의 망막에 있어서, ISL1 단백질이 발현되지 않은 것을 나타내는 사진이다.
도 8은, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주 유래의 망막이 망막 변성 래트에 이식된 후, 생착된 것을 나타내는 사진이다.
도 9a는, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 분화시킨 망막을 이식하고 나서 240 내지 260일 후에 있어서의 이식 부위에서의 쌍극 세포 및 아마크린 세포의 비율을 나타내는 사진이다.
도 9b는, ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 분화시킨 망막을 이식하고 나서 240 내지 260일 후에 있어서의 이식 부위에서의 쌍극 세포 및 아마크린 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
1. 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단에 대하여
본 발명의 일 형태는, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 제공한다. 야생형 게놈을 갖는 망막계 세포와 비교하여, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포는, 쌍극 세포에는 충분히 분화 및 성숙하지 않지만, 시세포에는 문제없이 분화 및 성숙한다. 그 때문에, 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 이식에 사용함으로써, 이식편 유래의 시세포와 호스트측의 쌍극 세포의 접촉의 비율이 향상되고, 해당 망막 조직의 이식 후의 기능적 생착이 개선될 수 있다. 이하 상세하게 설명한다.
1-1. 이식용 세포 집단
본 발명에 있어서의 「이식용 세포 집단」이란, 이식을 위해 준비되어, 이식을 위해 사용되는 세포 집단을 의미한다.
본 발명에 있어서의 「세포 집단」이란, 동일한 종류의 또는 상이한 종류의 세포가 2 이상 존재하고 있는 집단을 의미한다. 바람직하게는, 세포 집단은 배지 등의 매체 중에 존재한다. 세포 집단은 세포 현탁액 및 세포 응집체를 포함하고, 세포 현탁액 또는 세포 응집체의 형태인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「세포 현탁액」이란, 동일한 종류의 또는 상이한 종류의 복수의 세포를 부유 상태로 포함하는 매체를 의미한다. 부유 상태란, 바람직하게는 매체 중에 존재하는 세포의 대다수(예를 들어, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상)가 서로 해리되어, 지속적인 물리적 접촉을 하지 않고 존재하고 있는 상태를 말한다. 매체 중에 존재하는 세포의 일부(예를 들어, 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하 또는 5％ 이하)의 세포는, 세포 응집체 등으로서 존재하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「세포 응집체」(Cell Aggregate)란, 복수의 세포끼리가 접착되어 덩어리를 형성하고 있는 것이면 특별히 한정은 없으며, 예를 들어 배지 등의 매체 중에 분산되어 있던 세포가 집합되어 형성한 덩어리를 말한다. 세포 응집체는 조직 및 세포 시트를 포함한다.
본 발명에 있어서의 「세포 시트」란, 적어도 이차원의 방향으로 생물학적 결합을 갖는 단일 또는 복수의 세포로 구성되는 단층 또는 중층의 구조체를 말한다. 세포 시트는, 접착 배양한 세포 또는 세포 응집체로부터 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 잘라내어 용이하게 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「조직」이란, 형태 또는 성질이 균일한 1종류의 세포, 또는 형태 또는 성질이 다른 복수 종류의 세포가, 일정한 패턴으로 입체적으로 배치된 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 의미한다. 조직으로서는, 예를 들어 망막 조직을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「망막 조직(Retinal tissue 또는 Retinal organoid)」이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 1종류 또는 복수 종류의 망막계 세포가, 층상으로 입체적으로 배열된 조직을 의미한다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인 지는, 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 발현의 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「망막층」이란, 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 상피층, 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「시세포층」이란, 망막층의 1종이며, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포)를 많이 포함한다(예: 시세포층에 존재하는 시세포의 핵의 수로 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％ 이상) 망막층을 의미한다.
1-2. 망막계 세포
본 발명에 있어서의 「망막계 세포(Retinal cell)」란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 세포 또는 그의 전구 세포를 의미한다. 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포(RPE), 모양체 주연부 세포, 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등), 망막 전구 세포 등의 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
「성숙한 망막계 세포」란, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포(RPE), 모양체 주연부 세포 등이 분화된 세포를 의미한다. 「미성숙한 망막계 세포」란, 성숙한 망막계 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 망막 전구 세포 등)를 의미한다.
시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러 글리아 전구 세포, 망막 색소 상피 전구 세포란, 각각 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포를 말한다.
본 발명에 있어서의 「망막 전구 세포」란, 시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러 글리아 전구 세포, 망막 색소 상피 전구 세포 등의 어느 미성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포이며, 최종적으로 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포 등의 어느 성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포를 말한다.
망막계 세포의 존재는, 망막계 세포의 마커(이하, 「망막계 세포 마커」라고 하는 경우가 있음)의 발현의 유무에 의해 확인할 수 있다. 망막계 세포 마커의 발현의 유무, 또는 세포 집단 또는 조직에 있어서의 망막계 세포 마커 양성 세포의 비율은, 당업자라면 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 시판되고 있는 항체를 사용한 플로우 사이토메트리, 면역 염색 등의 방법에 의해 특정한 망막계 세포 마커 양성 세포의 수를 구하고, 이것을 전체 세포수로 나눔으로써 확인할 수 있다.
망막계 세포 마커로서는, 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx(「Rax」라고도 말한다.), PAX6 및 Chx10, 시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1, 쌍극 세포에서 발현하는 Chx10, PKCα 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌, 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘, 성숙 시세포(간체 시세포 및 추체 시세포)에서 발현하는 리커버린, 간체 시세포에서 발현하는 Nrl 및 로돕신, 추체 시세포에서 발현하는 Rxr-gamma, S-Opsin 및 M/L-Opsin, 뮐러 글리아 세포에서 발현하는 GS 및 GFAP, 망막 색소 상피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 모양체 주연부 세포에서 발현하는 Rdh10 및 SSEA1 등의 단백질을 들 수 있다.
「양성 세포」란, 특정한 마커를 세포 표면 상 또는 세포 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 「Chx10 양성 세포」란, Chx10 단백질을 핵 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다.
1-3. 쌍극 세포 제어 유전자
본 발명에 있어서의 「쌍극 세포 제어 유전자」란, 망막 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 및/또는 쌍극 세포에 발현하는 유전자이며, 쌍극 세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사, 또는 시세포와 시냅스 형성하는 기능에 관여하지만, 시세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사 및 기능에는 관여하지 않는 유전자를 말한다. 따라서, 쌍극 세포 제어 유전자를 개변함으로써, 쌍극 세포의 분화 부전, 변성사, 기능 부전 등을 야기하지만, 시세포는 정상적인 기능을 유지하는 망막 전구 세포 등을 준비할 수 있다. 바람직하게는, 쌍극 세포 제어 유전자는 쌍극 세포 전구 세포 및/또는 쌍극 세포에 있어서 발현하고, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포에 있어서 발현이 확인되지 않는 유전자이다.
일 형태에 있어서, 쌍극 세포 제어 유전자는, 쌍극 세포 전구 세포 및/또는 쌍극 세포에 발현하는 유전자이며, 쌍극 세포의 성숙에 관여하지만, 시세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사 및 기능에는 관여하지 않는 유전자를 말한다. 바람직하게는, 쌍극 세포 제어 유전자는 쌍극 세포 전구 세포 및/또는 쌍극 세포에 있어서 발현하고, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포에 있어서 발현이 확인되지 않는 유전자이다. 「쌍극 세포의 성숙」이란, 쌍극 세포 전구 세포로부터 쌍극 세포로 분화가 진행되어, 시세포와의 시냅스 형성이 가능해지는 것을 의미한다. 쌍극 세포의 성숙은, 쌍극 세포의 마커인 Chx10 단백질, PKCα 단백질, L7 등의 발현을 면역 조직학적 해석, 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해 확인할 수 있다.
일 형태에 있어서, 쌍극 세포 제어 유전자는, 전술한 기능(쌍극 세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사, 또는 시세포와 시냅스 형성하는 기능)에 관여하는 전사 인자, 구체적으로는 당해 기능을 유지 또는 항진하는 전사 인자를 코딩하는 유전자를 포함한다. 쌍극 세포 제어 유전자는, 바람직하게는 전사 인자를 코딩하는 유전자이다.
전사 인자는 전사 제어에 관여하는 기능을 가진 영역(도메인)을 포함한다. 예를 들어, 전사 인자는 특징적인 DNA 결합 영역(호메오 도메인(homeo domain), 징크 핑거 도메인(zinc finger domain), 염기성 류신 지퍼 도메인(basic leucine zipper domain), 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 도메인(basic-helix-loop-helix domain) 등)을 포함한다. 일 형태에 있어서, 전사 인자는 추가로 전사 제어 코팩터 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 특정한 유전자가 전사 인자를 코딩하는 유전자 인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 특징적인 DNA 결합 영역을 포함하는지 여부에 의해 판단하는 것이 가능하다.
망막 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 및/또는 쌍극 세포에 발현하는 유전자는, 당업자라면 주지된 방법에 의해 동정할 수 있다. 일 형태에 있어서, 태아기 또는 성체기에서, 쌍극 세포 또는 망막 전구 세포에서 발현하는 유전자를, 유전자 발현 해석(예를 들어, 마이크로어레이 해석) 및/또는 조직학적인 해석(예를 들어, 면역 염색 해석, 계내(in situ) 하이브리다이제이션법)으로 검출할 수 있다.
쌍극 세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사, 또는 시세포와 시냅스 형성하는 기능에 관여하지만, 시세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사 및 기능에는 관여하지 않는 유전자는, 당업자라면 주지된 방법 또는 공지된 정보에 의해 동정할 수 있다. 일 형태에 있어서 상기 유전자가, 쌍극 세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사, 또는 시세포와 시냅스 형성하는 기능, 및 시세포의 분화, 성숙, 생존, 증식, 대사 및 기능에 부여하는 효과를, 유전자 도입법(예. 일렉트로포레이션법, 리포펙션법)에 의해 제작한 유전자 개변 세포주 및/또는 유전자 개변 동물에서 검증하면 된다.
구체적인 일 형태로서, 망막 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 또는 쌍극 세포에 발현하는 유전자를, 유전자 발현 해석(예를 들어, 마이크로어레이 해석)에 의해 스크리닝하고, 공지된 정보(ISL1 유전자 등에 대한 유전자 서열의 상동성, 기능, 보존된 기능 도메인 등)에 의해, 상술한 기능에 관여하는 유전자를 쌍극 세포 제어 유전자의 후보 유전자로서 선별할 수 있다. 바람직한 양태로서는, 쌍극 세포 전구 세포 또는 쌍극 세포에 발현하지만 시세포 전구 세포 및 시세포에 발현하지 않는 유전자를, 쌍극 세포 제어 유전자의 후보 유전자로서 선별한다. 또한, 다른 바람직한 형태로서는, 전사 인자를 코딩하는 유전자를, 쌍극 세포 제어 유전자의 후보 유전자로서 선별한다. 전사 인자를 코딩하는 유전자는, 상술한 보존된 도메인 등에 의해 선별할 수 있다. 이들 쌍극 세포 제어 유전자의 후보 유전자의 선별법을 조합할 수도 있다. 예를 들어, 쌍극 세포 전구 세포 또는 쌍극 세포에 있어서 발현하지만 시세포 전구 세포 및 시세포에 발현하지 않는 유전자이며, 전사 인자를 코딩하는 유전자를, 쌍극 세포 제어 유전자의 후보 유전자로서 선별할 수 있다.
또한, 예를 들어 선별한 유전자를 개변한 다능성 줄기 세포로부터 망막 조직을 제조하고, 조직학적인 해석을 행함으로써, 쌍극 세포 제어 유전자인 것을 검증할 수 있다.
쌍극 세포 제어 유전자로서, 예를 들어 쌍극 세포의 성숙에 관여하는 ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자 등의 쌍극 세포에 발현하는 전사 인자를 코딩하는 유전자, 및 이들 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 「실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 특정한 서열 번호로 나타나는 염기 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 특정한 서열 번호로 나타나는 염기 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 특정한 서열 번호로 나타나는 아미노산 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다. 본 정의에 해당하지 않는 경우(예: 서열 동일성이 80％ 미만)에도, 오르소로그, 서브타입, 아이소폼 또는 변이체로서 실질적으로 동질의 기능을 갖고 있는 것이 공지된 유전자는, 「실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」에 포함된다.
본 발명에 있어서 「실질적으로 동질의 기능」이란, 예를 들어 생리학적으로 또는 약리학적으로 보아, 그 성질이 정성적으로 동일한 것을 의미하고, 기능의 정도, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.
본 발명에 있어서의 염기 서열 또는 아미노산 서열의 「서열 동일성」이란, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 2개의 염기 서열을 얼라인시킨 경우의 최적인 얼라인먼트(바람직하게는 해당 알고리즘은 최적인 얼라인먼트를 위해 서열의 한쪽 또는 양쪽으로의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것이다.)에 있어서의, 오버랩되는 전체 염기 서열 또는 전체 아미노산 서열에 대한 동일한 염기 또는 아미노산의 비율(％)을 의미한다. 염기 서열 또는 아미노산 서열의 「서열 동일성」은, 당업자라면 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「오르소로그」란, 진화 계통상 동일한 선조로부터 파생한, 유사성이 높은 다른 동물종에서 유래되는 유전자 또는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서의 「서브타입」이란, 유전자의 상동성이 높고, 유사한 기능을 갖는 단백질군을 의미한다.
본 발명에 있어서의 「아이소폼」이란, 단백질의 입체 구조는 상이하지만, 실질적으로 동질의 기능을 갖는 유전자 또는 단백질을 의미한다. 복수의 아이소폼은, 동일한 DNA에서 유래되는 스플라이싱 변이체인 경우도 있으며 다른 DNA에서 유래하는 경우도 있다.
본 발명에 있어서의 「변이체」란, 특정한 서열 번호로 나타나는 염기 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 갖는 유전자를 말한다.
특정한 유전자와 「실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 게재된 유전자의 염기 서열로부터 판단할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「유전자」란, 염색체 상에 존재하고 있는 염기 서열이며, 특정한 단백질을 코딩하는 영역(개시 코돈으로부터 시종 코돈까지를 포함하는 영역이며, 인트론을 포함할 수 있음) 및 그의 전후하는 영역(프로모터, 인핸서, 사일렌서, 터미네이터 등의 영역)의 염기 서열을 의미한다. 그의 전후하는 영역의 범위는, 유전자에 따라서 상이하지만, 예를 들어 50bp, 100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 1000bp, 2000bp이다. 즉, 유전자의 개변이란, 특정한 단백질을 코딩하는 영역의 개변뿐만 아니라, 그 전후의 영역의 개변도 포함한다.
이하, ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자에 대하여 설명한다.
ISL1(Insulin gene enhancer protein 1, ISL LIM homeobox 1, Islet-1) 유전자는 공지된 유전자이다. ISL1 유전자로서, 서열 번호 1(Genbank Accession No.: 3670(NC_000005.10))로 나타나는 염기 서열, 또는 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열에 포함되는 엑손 부분을 포함하는 염기 서열(예를 들어, 서열 번호 2에 나타나는 염기 서열(Genbank Accession No.: NM_002202.2)) 및 이 엑손 부분과 실질적으로 동일한 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도, ISL1 유전자의 범주이다. 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열의 549번째 내지 1598번째에 대응하는 염기 서열로 코딩되는 ISL1 단백질은, 서열 번호 3(Genbank Accession No.: NP_002193.2)으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 및 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다.
인간 ISL1 유전자의 오르소로그로서, 서열 번호 4(Genbank Accession No.: 16392(NC_000079.6))로 나타나는 염기 서열을 갖는 마우스 ISL1 유전자가 알려져 있다. 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열, 또는 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다. 또한, 서열 번호 4에 나타나는 염기 서열에 포함되는 엑손 부분을 포함하는 염기 서열(예를 들어, 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열(Genbank Accession No.: NM_021459.4)) 및 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다. 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열의 267번째 내지 1316번째에 대응하는 염기 서열로 코딩되는 마우스 ISL1 단백질은, 서열 번호 6(Genbank Accession No.: NP_067434.3)으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열 및 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다.
인간 ISL1 유전자의 인간 서브타입으로서, 서열 번호 7(Genbank Accession No.: 64843(NC_000015.10))로 나타나는 염기 서열을 갖는 인간 ISL2 유전자가 알려져 있다. 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열, 또는 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다. 또한, 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열에 포함되는 엑손 부분을 포함하는 염기 서열(예를 들어, 서열 번호 8에 나타나는 염기 서열(Genbank Accession No.: NM_145805)) 및 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다. 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열의 161번째 내지 1240번째에 대응하는 염기 서열로 코딩되는 ISL2 단백질은, 서열 번호 9(Genbank Accession No.: NP_665804.1)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열 및 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 ISL1 유전자의 범주이다.
「서열 번호 1과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 당해 유전자가 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열과, 또는 당해 유전자의 엑손이 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열과, 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
「서열 번호 4와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 당해 유전자가 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열과, 또는 당해 유전자의 엑손이 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
「서열 번호 7과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 당해 유전자가 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과, 또는 당해 유전자의 엑손이 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
ISL1 단백질은 호메오도메인형 전사 인자이며, LIM1과 LIM2와 2개의 LIM 도메인과 Lhx3 결합 도메인, 그리고 DNA 결합 도메인을 갖고 있으며, 쌍극 세포의 성숙에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다.
따라서, 「서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는」이란, DNA와의 결합능을 가지고, 유전자의 전사를 정 또는 부로 제어하는 기능을 갖고 있는 것을 의미한다.
「서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」, 즉 ISL1 유전자로서, 구체적으로는 이하의 (1) 또는 (2)를 들 수 있다:
(1) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
여기서, 「1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열」이란, 일례로서 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의해, 결실, 부가, 삽입 또는 치환되기 전의 염기 서열에 대하여 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 들 수 있다. 「1 또는 복수의 염기」의 구체적인 개수로서는, 예를 들어 1 내지 100개, 1 내지 50개, 1 내지 30개, 1 내지 10개, 1 내지 수(2, 3, 4 또는 5)개이다. 결실, 부가, 삽입 또는 치환은 복수를 조합해도 된다.
본 발명의 일 형태에 있어서 ISL1 유전자는, 인간이라면 염색체상 「5q11.1」 또는 「15q24.3」, 마우스라면 염색체상 「13D2.3」에 위치하는 유전자이다. 다른 동물종에 있어서의 ISL1 유전자(오르소로그)의 염색체 위치는, 당업자라면 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 게재된 유전자의 염기 서열을 기초로 판단할 수 있다.
ISL1 유전자는, 바람직하게는 인간 ISL1 유전자 또는 마우스 ISL1 유전자이다.
BHLHE23(basic helix-loop-helix family, member e23) 유전자는 공지된 유전자이다. BHLHE23 유전자로서, 서열 번호 10(Genbank Accession No.: 128408(NC_000020.11))으로 나타나는 염기 서열, 또는 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 10에 나타나는 염기 서열에 포함되는 엑손 부분을 포함하는 염기 서열(예를 들어, 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열(Genbank Accession No.: NM_080606)) 및 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 인간 BHLHE23 유전자의 범주이다. 서열 번호 11로 나타나는 염기 서열의 262번째 내지 987번째의 염기로 코딩되는 BHLHE23 단백질은, 서열 번호 12(Genbank Accession No.: NP_542173.2)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열 및 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 BHLHE23 유전자의 범주이다.
인간 BHLHE23 유전자의 오르소로그로서, 서열 번호 13(Genbank Accession No.: 140489(NC_000068.7))으로 나타나는 염기 서열을 갖는 마우스 BHLHE23 유전자(Bhlhb4 유전자)가 알려져 있다. 서열 번호 13으로 나타나는 염기 서열, 또는 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자도 BHLHE23 유전자의 범주이다. 또한, 서열 번호 13에 나타나는 염기 서열에 포함되는 엑손 부분을 포함하는 염기 서열(예를 들어, 서열 번호 14에 나타나는 염기 서열(Genbank Accession No.: NM_080641.5)) 및 이것과 실질적으로 동일한 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 BHLHE23 유전자의 범주이다. 서열 번호 14로 나타나는 염기 서열의 158번째 내지 829번째의 염기로 코딩되는 마우스 Bhlhb4 단백질은, 서열 번호 15(Genbank Accession No.: NP_542372.2)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열 및 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 엑손으로서 포함하는 유전자도 BHLHE23 유전자의 범주이다.
「서열 번호 10과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 당해 유전자가 서열 번호 10으로 나타나는 염기 서열과, 또는 당해 유전자의 엑손이 서열 번호 11로 나타나는 염기 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
「서열 번호 13과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」란, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 또한 당해 유전자가 서열 번호 13으로 나타나는 염기 서열과, 또는 당해 유전자의 엑손이 서열 번호 14로 나타나는 염기 서열과 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 유전자, 또는 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 약 80％ 이상(바람직하게는 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상)의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
BHLHE23 단백질은 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(Basic helix-loop-helix)형 전사 인자이며, DNA 결합 도메인과 헬릭스-루프-헬릭스 도메인을 갖고 있으며, 쌍극 세포의 성숙에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다.
따라서, 「서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 갖는」이란, DNA와의 결합능을 가지고, 유전자의 전사를 정 또는 부로 제어하는 기능을 갖고 있는 것을 의미한다.
「서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자」, 즉 BHLHE23 유전자로서, 구체적으로는 이하의 (1) 또는 (2)를 들 수 있다:
(1) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열,
(2) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
(a) DNA 결합능을 갖는 것,
(b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
(c) 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
여기서, 「1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열」이란, 일례로서 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의해, 결실, 부가, 삽입 또는 치환되기 전의 염기 서열에 대하여 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 들 수 있다. 「1 또는 복수의 염기」의 구체적인 개수로서는, 예를 들어 1 내지 100개, 1 내지 50개, 1 내지 30개, 1 내지 10개, 1 내지 수(2, 3, 4 또는 5)개이다. 결실, 부가, 삽입 또는 치환은 복수를 조합해도 된다.
본 발명의 일 형태에 있어서, BHLHE23 유전자는, 인간 염색체 상의 「20q13.33」 또는 마우스 염색체 상의 「2103.34cM」에 위치하는 유전자이다. 다른 동물종에 있어서의 BHLHE23 유전자(오르소로그)의 염색체 위치는, 당업자라면 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 게재된 유전자의 염기 서열을 기초로 판단할 수 있다.
BHLHE23 유전자는, 바람직하게는 인간 BHLHE23 유전자 또는 마우스 BHLHE23 유전자이다.
1-4. 유전자 개변
본 발명에 있어서의 「유전자 개변」 및 「유전자의 개변」이란, 특정한 유전자에 대하여 1 또는 복수의 염기를 부가, 삽입, 결실, 치환 등 시킴으로써, 특정한 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키는 것을 의미한다. 즉, 유전자 개변은 유전자의 결실을 포함한다. 특정한 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키는 한, 부가, 삽입, 결실, 치환 등 시키는 염기의 수 및 염기의 위치(인핸서, 프로모터, 인트론 등도 포함함), 그리고 유전자 개변의 방법은 구애받지 않는다.
본 발명의 일 형태로서, 쌍극 세포 제어 유전자의 개변에는, 쌍극 세포 제어 유전자(예: ISL1 유전자 또는 BHLHE23 유전자)의 인핸서 및 프로모터를 유지하면서, 그의 하류의 단백질을 코딩하는 서열(엑손 및 인트론)을 특수 서열로 치환하는 것도 포함된다. 특수 서열에는, 예를 들어 자살 유전자, 생존 제어 유전자, 증식 제어 유전자, 분화 제어 유전자 및 대사 제어 유전자(이하, 「자살 유전자 등」이라고 하는 경우가 있음), 또는 쌍극 세포 제어 유전자의 발현을 억제할 수 있는 마이크로 RNA, 쌍극 세포 제어 유전자와 동일 또는 상동성의 핵산 서열을 포함하는 안티센스 RNA 및 쌍극 세포 제어 유전자의 논코딩 RNA를 코딩하는 유전자(이하, 「마이크로 RNA 유전자 등」이라고 하는 경우가 있음) 등이 포함된다. 자살 유전자 등으로서, 아포토시스 유도 인자 등의 유전자를 들 수 있다. 마이크로 RNA 유전자 등으로서, 별도의 쌍극 세포 제어 유전자에 대한 마이크로 RNA 등을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 쌍극 세포 제어 유전자의 프로모터 하에서 이들 유전자를 발현시킴으로써, 예를 들어 쌍극 세포 특이적인 세포사의 유도, 또는 치환된 유전자와는 다른 쌍극 세포 제어 유전자의 발현 억제도 행할 수 있다. 즉, 쌍극 세포가 유도되는 과정에서 쌍극 세포 제어 유전자가 발현되는 점에서, 쌍극 세포 제어 유전자가 발현하는 시기에 동일한 인핸서 및 프로모터의 하류에 삽입된 자살 유전자 등이 발현됨으로써, 쌍극 세포를 세포사로 유도할 수 있다. 또한, 마이크로 RNA 유전자 등을 발현시킴으로써, 쌍극 세포 제어 유전자의 mRNA의 기능을 억제할 수 있다.
또한, 특수 서열은, 다능성 줄기 세포의 내재성의 쌍극 세포 제어 유전자 자체와 치환되어도 되고, 당해 쌍극 세포 제어 유전자를 유지한 채, 다능성 줄기 세포의 게놈 중 쌍극 세포 제어 유전자의 인핸서 및 프로모터의 하류에 도입되어 있어도 된다. 이 경우, 특수 서열이 기능할 수 있는 위치라면, 도입 위치에 특별히 한정은 없는다. 바람직하게는, 당해 쌍극 세포 제어 유전자 자체를 치환하지 않고, 특수 서열이 도입된다.
일 형태에 있어서, 유전자 개변으로서, 당해 유전자가 실질적으로 기능하지 않게 되는 게놈 편집을 들 수 있다. 「실질적으로 기능하지 않게 되는 게놈 편집」으로서는, 당해 유전자가 변이형이 되고, 야생형이 갖고 있던 기능을 상실시키는 변이의 도입(예를 들어, 프레임 시프트 등의 논센스 변이 등), 당해 유전자의 발현량이 감소하는 게놈 편집 등을 들 수 있다.
일 형태에 있어서, 「유전자의 발현량이 감소하는 게놈 편집」으로서는, 게놈 중의 유전자의 발현량 제어 서열을 개변하는 것 등을 들 수 있다. 당해 발현량 제어 서열로서는, 인핸서 및/또는 프로모터를 들 수 있다. 예를 들어, 유전자의 인핸서 및/또는 프로모터는, 쌍극 세포 제어 유전자의 상류 서열, 하류 서열, 및/또는 유전자 내(예를 들어 인트론 영역)에 존재한다.
본 발명에 있어서의 「유전자 결실」 및 「유전자의 결실」이란, 특정한 유전자에 대하여 염기를 결실시킴으로써, 특정한 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키는 것을 의미한다. 특정한 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키는 한, 결실시키는 염기의 수 및 염기의 위치(인핸서, 프로모터, 인트론 등도 포함함), 그리고 유전자 결실의 방법은 구애받지 않는다. 예를 들어, 마우스 및 인간의 ISL1 유전자의 경우에는 제1 및 제2 엑손을 결실시킴으로써, 마우스 Bhlhb4 유전자의 경우에는, 단백 번역 영역의 개시 코돈을 포함하는 전후의 서열(예: 약 150 염기)을 결실시킴으로써, 각각의 유전자를 결실시킬 수 있다. 예를 들어, 일부의 엑손(예: 제1 엑손 또는 제2 엑손)을 결실시킴으로써, 또는 단백 번역 영역의 개시 코돈을 포함하는 복수의 염기(1 내지 단백 번역 영역의 전체 염기, 예: 10 내지 500염기, 100 내지 300염기 또는 약 150염기)를 결실시킴으로써 당해 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 초기화전 체세포, 다능성 줄기 세포 또는 망막계 세포에 대하여 유전자 개변을 행할 수 있다. 유전자 개변된 망막계 세포를 얻는 방법으로서는, 유전자 개변된 다능성 줄기 세포(유전자 개변된 체세포를 초기화하여 얻어지는 다능성 줄기 세포를 포함한다.)로부터 분화 유도하는 방법, 및 망막계 세포에 대하여 유전자 개변을 행하는 방법을 들 수 있다. 바람직하게는, 다능성 줄기 세포에 대하여 유전자 개변이 행해진다.
본 발명에 있어서의 「유전자 개변된 다능성 줄기 세포」란, 분화 다능성이 유지되는 한도에 있어서 유전자 개변이 행해진 다능성 줄기 세포를 의미한다. 일 형태에 있어서, 「유전자 개변된 다능성 줄기 세포」란, 분화 다능성 및 증식능(자기 복제능)이 유지되는 한도에 있어서, 유전자 개변이 행해진 다능성 줄기 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 개변되는 유전자는 쌍극 세포 제어 유전자이지만, 추가로 다른 유전자가 개변되어 있어도 된다. 일 형태로서, 특정한 세포의 존재를 확인할 목적으로, 특정한 세포 마커 유전자를, 형광 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하는 것 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
유전자 개변된 다능성 줄기 세포 또는 망막계 세포는, 예를 들어 상동 재조합 기술을 사용함으로써 제작할 수 있다. 염색체 상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993); 바이오매뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 배아 줄기 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, 요도샤(1995) 등에 기재된 방법을 사용하여 행할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 개변하는 표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 단리하고, 단리된 게놈 DNA를 사용하여, 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟팅 벡터를 제작한다. 제작된 타겟팅 벡터를 줄기 세포에 도입하고, 표적 유전자와 타겟팅 벡터 사이에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 염색체 상의 유전자가 개변된 줄기 세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 단리하는 방법으로서는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems제), Universal Genome Walker Kits(CLONTECH제) 등을 사용함으로써, 표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 단리할 수도 있다. 게놈 DNA 대신에 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수도 있다. 당해 폴리뉴클레오티드는, PCR법으로 해당하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 취득할 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟팅 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993); 바이오매뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 배아 줄기 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, 요도샤(1995); 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다. 타겟팅 벡터는 리플레이스먼트형 또는 인서션형 중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 선별 방법으로서는, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 또는 폴리 A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다.
선별한 세포주 내로부터 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리다이제이션법, PCR법 등을 들 수 있다.
또한, 게놈 편집에 의해, 유전자 개변된 다능성 줄기 세포 또는 망막계 세포를 제조할 수도 있다. 게놈 편집(Genome Editing)이란, 징크 핑거 시스템, CRISPR/Cas9 시스템 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALEN)) 등의 기술에 의해, 유전자 특이적인 파괴 또는 리포터 유전자의 노크인 등을 행하는 유전자 개변 기술이다.
징크 핑거 시스템에서는, 일반적으로 징크 핑거 모티프라고 불리는 DNA에 특이적으로 결합하는 도메인과, 제한 효소인 FokI로 구성된 인공 키메라 단백질을 사용하여, 표적 유전자를 인식하여 절단한다. 2개의 인공 키메라 단백질이 근접하는 표적 서열에 결합하면, DNA 절단 도메인이 이량체를 형성하고, DNA를 절단한다. 절단된 DNA는, 상동 재조합 또는 비상동 말단 연결에 의해 수복되지만, 이 때에 목적 유전자가 개변된다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템에서는, 일반적으로 Cas9(DNA 절단 효소)의 발현 벡터 또는 mRNA 혹은 Cas9 단백질과, 폴리메라아제 III 프로모터 등의 제어 하에서 가이드 RNA를 발현하는 발현 벡터 또는 가이드 RNA 자체를, 세포 중에 도입한다. 가이드 RNA는, 표적 게놈 서열에 상보적인 RNA(crRNA)와 tracrRNA의 융합 RNA일 수 있다. 표적 게놈 서열의 3' 말단에 프로토스페이서 근접 모티프(PAM-서열 NGG)가 존재하면, Cas9가 DNA 이중쇄를 해리시키고, 가이드 RNA에 의해 타깃 서열을 인식하여 양쪽쇄를 절단하고, 절단 부위가 수복되는 과정에서 변이가 도입된다.
전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는, 식물 병원균 크산토모나스 종(Xanthomonas spp.)이 생산하는 TAL 이펙터를 사용한 시스템이다. TALEN은, 일반적으로는 TAL 이펙터의 DNA 결합 도메인과 FokI 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인을 융합한 인공 뉴클레아제이다. DNA 결합 도메인은 34아미노산 잔기의 반복 서열을 포함하고, 1리피트가 표적 DNA의 1염기를 인식한다. 반복 서열 중의 12, 13번째 아미노산 잔기는 반복 가변 이잔기(repeat variable di-residues(RVD))라고 불리고, 이 서열에 의해 표적 염기가 결정된다. 2조의 TALEN 분자가 게놈 상의 특정한 서열 상에서 마주 향하도록 TALEN을 설계함으로써, TALEN 페어는 표적 서열 상에서 FokI 도메인이 2량체화하고, 뉴클레아제 활성을 나타낸다. 절단된 DNA 2중쇄는 세포 내재의 기구에 의해 수복되지만, 그 과정에서 변이가 도입된다. TALEN에 의한 게놈 편집을 행하는 경우에는, TALEN의 발현 벡터 또는 mRNA를 세포 내에 도입한다.
1-5. 다능성 줄기 세포
본 발명에 있어서 「줄기 세포」란, 분화능 및 분화능을 유지한 증식능(특히 자기 복제능)을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화 능력에 따라서, 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 「다능성 줄기 세포」란, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한 3배엽(외배엽, 중간층, 내배엽) 및/또는 배 체외 조직에 속하는 세포 계보 모두로 분화될 수 있는 능력(분화 다능성(pluripotency))을 갖는 줄기 세포를 말한다. 「복능성 줄기 세포」란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직 또는 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 「단능성 줄기 세포」란, 특정한 조직 또는 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포는, 수정란, 클론배, 생식 줄기 세포, 조직 내 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포로서는, 배아 줄기 세포(ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포(Embryonic germ cell), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포(mesenchymal stem cell; MSC)로부터 얻어지는 Muse 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell) 및 생식 세포(예를 들어 정소)로부터 제작된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는 1981년에 처음으로 수립되어, 1989년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배아 줄기 세포가 수립되었으며, 재생 의학에도 이용되고 있다. 배아 줄기 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포 상 또는 LIF(백혈병 억제 인자)를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기 세포의 제조 방법은, 예를 들어 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고, 또한 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 재생 의사 과학 연구소로부터 입수 가능하다. 인간 배아 줄기 세포인 Rx::GFP주(KhES-1주 유래)는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소로부터 입수 가능하다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포주 및 D3 세포주는, 각각 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소 및 ATCC로부터 입수 가능하다.
배아 줄기 세포의 하나인 핵 이식 배아 줄기 세포(ntES 세포)는, 핵을 제거한 난자에 체세포의 핵을 이식하여 만든 클론배로부터 수립할 수 있다.
EG 세포는, 원시 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에 있어서의 「인공 다능성 줄기 세포」란, 체세포를 공지된 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써, 다능성을 유도한 세포이다. 구체적으로는 섬유아세포, 또는 말초혈 단핵구 등이 분화된 체세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc(c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, Lin28 및 Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합 중 어느 발현에 의해 초기화하여, 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합으로서는, (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc(c-Myc 또는 L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포는 2006년 야마나카 등에 의해 마우스 세포에서 수립되었다(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 인공 다능성 줄기 세포는 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되고, 배아 줄기 세포와 동일하게 다능성과 자기 복제능을 갖는다(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
인공 다능성 줄기 세포는, 유전자 발현에 의한 직접 초기화로 제조하는 방법 이외에도, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 유도할 수도 있다(Science, 2013, 341, pp.651-654).
또한, 주화된 인공 다능성 줄기 세포를 입수하는 것도 가능하며, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포, 1231A3 세포 등의 인간 인공 다능성 세포주가, 교토 대학에서 입수 가능하다. 주화된 인공 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포가, 교토 대학에서 입수 가능하다.
인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에 사용되는 체세포로서는, 특별히 한정은 없지만, 조직 유래의 섬유아세포, 혈구계 세포(예를 들어, 말초혈 단핵구(PBMC), T 세포), 간 세포, 췌장 세포, 장 상피 세포, 평활근 세포 등을 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 몇종류의 유전자의 발현에 의해 초기화하는 경우, 유전자를 발현시키기 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 상기 수단으로서는, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터)를 사용한 감염법, 플라스미드 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피소멀 벡터)를 사용한 유전자 도입법(예를 들어, 인산칼슘법, 리포펙션법, 레트로넥틴법, 일렉트로포레이션법), RNA 벡터를 사용한 유전자 도입법(예를 들어, 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법), 단백질의 직접 주입법(예를 들어, 바늘을 사용한 방법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법) 등을 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포는, 피더 세포 존재 하 또는 피더 세포 비존재 하(피더 프리)에서 제조할 수 있다. 피더 세포 존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에는, 공지된 방법으로 미분화 유지 인자 존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 피더 세포 비존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에 사용되는 배지로서는, 특별히 한정은 없지만, 공지된 배아 줄기 세포 및/또는 인공 다능성 줄기 세포의 유지 배지, 또는 피더 프리로 인공 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지를 사용할 수 있다. 피더 프리로 인공 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지로서는, 예를 들어 에센셜(Essential) 8 배지(E8 배지), 에센셜 6 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, 안정화 에센셜(Stabilized Essential) 8 배지, StemFit 배지 등의 피더 프리 배지를 들 수 있다. 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 예를 들어 피더 프리로 체세포에, 센다이바이러스 벡터를 사용하여, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc의 4 인자를 유전자 도입함으로써, 인공 다능성 줄기 세포를 제작할 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는, 바람직하게는 배아 줄기 세포 또는 인공 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에 사용하는 다능성 줄기 세포는 포유 동물의 다능성 줄기 세포이며, 바람직하게는 설치류(예, 마우스, 래트) 또는 영장류(예, 인간, 원숭이)의 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스 다능성 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포이다.
복능성 줄기 세포로서는, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포(조직성 줄기 세포, 조직 특이적 줄기 세포 또는 체성 줄기 세포라고도 불림)를 들 수 있다.
2. 이식용 세포 집단의 배양물에 대하여
본 발명의 일 형태는 이식용 세포 집단의 배양물로서, (1) 상기 이식용 세포 집단과, (2) 상기 이식용 세포 집단의 생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체를 포함하는 배양물을 제공한다.
본 발명에 있어서의 「배양물(culture)」이란, 생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체 및 세포 집단을 포함하고, 더 첨가하거나 또는 세포 집단으로부터 산생된 생물학적 물질을 포함해도 되는 액체를 의미한다. 생물학적 물질로서는, 예를 들어 사이토카인, 케모카인 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 「생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체」로서는, 배지, 생리학적 완충 용액 등을 들 수 있지만, 망막 전구 세포 등의 망막계 세포를 포함하는 세포 집단이 생존하는 한 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다. 일례로서, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제한 배지를 들 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글라스고우(Glasgow) MEM(GMEM) 배지, 개선된 MEM 징크 옵션(Improved MEM Zinc Option) 배지, IMDM 배지, 미디엄(Medium) 199 배지, 이글(Eagle) MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, 피셔스(Fischer's) 배지 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다.
3. 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 제조 방법에 대하여
본 발명의 일 형태는, 하기 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포의 쌍극 세포 제어 유전자를 개변하여, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 얻는 공정,
(2) 공정 (1)에서 얻어진 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 망막계 세포로 분화 유도하고, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 얻는 공정.
본 명세서에 있어서, 「다능성 줄기 세포의 쌍극 세포 제어 유전자를 개변」이란, 초기화전 체세포에 있어서 쌍극성 세포 제어 유전자를 개변한 후, 초기화전 체세포를 초기화함으로써, 개변된 쌍극 세포 제어 유전자를 갖는 다능성 줄기 세포를 제작하는 양태도 포함한다.
공정 (1)에서 얻어진 세포 집단은, 당업자라면 주지된 방법으로 보존하는 것이 가능하다. 보존된 세포 집단은, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 얻기 위한 원재료 또는 제조 중간체이다. 본 발명의 일 형태로서, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포의 원재료 또는 제조 중간체를 제공한다.
공정 (1)에서 얻어진 세포 집단을 보존하는 방법의 예로서, 동결 보존을 들 수 있다. 동결 보존하는 방법은, 일반적으로 세포를 동결 보존하는 방법으로서 공지된 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 공정 (1)에서 얻어진 세포 집단을 DMSO, 글리세린 등의 동해 보호제를 포함하는 배지에 현탁하여 동결 보존할 수 있다. 또한, 시판되는 세포 동결 보존액[StemCellBanker(Zenoaq사, 등록 상표)]을 사용할 수도 있다. 동결 보존에 의해 세포 집단의 장기 보존이 가능하다.
본 발명의 일 형태로서, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 얻기 위한 원재료 또는 제조 중간체로서의, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단의 마스터 셀 뱅크 또는 워킹 셀 뱅크를 제공한다.
즉, 공정 (1)에서 얻어진 세포의 확대 배양을 거친 후에, 동결 보존함으로써 마스터 셀 뱅크를 제작할 수 있다. 또한, 마스터 셀 뱅크로부터 융해시킨 세포를 확대 배양함으로써, 워킹 셀 뱅크를 제작할 수도 있다. 마스터 셀 뱅크 및 워킹 셀 뱅크를 제작하는 데 있어서는, 세포의 계대수는 적은 쪽이 바람직하다.
여기서, 「마스터 셀 뱅크」란, 모든 제조용 세포 시드의 기초가 되는 종주를 확대 배양에 의해 증식시켜, 복수의 앰플에 분주한 것을 말한다. 또한, 「워킹 셀 뱅크」란, 마스터 셀 뱅크의 1개 또는 복수개로부터 기면(起眠)한 세포를 확대 배양에 의해 증식시켜, 복수의 앰플에 분주한 것을 말한다.
본 발명의 일 형태로서, 하기 공정 (i) 내지 (iii)을 포함하는, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포의 원재료 또는 제조 중간체(예를 들어, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단의 마스터 셀 뱅크)의 제조 방법을 제공한다:
(i) 다능성 줄기 세포의 쌍극 세포 제어 유전자를 개변하여, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포의 세포 집단을, 인비트로에서 얻는 공정,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 다능성 줄기 세포의 세포 집단을 배양에 의해 증식시키는 공정,
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 다능성 줄기 세포의 세포 집단을 동결 보존하는 공정.
동결 보존한 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포의 세포 집단(마스터 셀 뱅크 또는 워킹 셀 뱅크를 포함함)을 융해 후, 공정 (2)에 제공하는 것도 가능하다. 당업자라면 주지된 방법으로 동결 세포를 융해할 수 있다. 비동결 혹은 동결 또는 동결 후 재융해한 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포의 세포 집단도 또한 본 발명의 일 형태이다.
즉, 본 발명의 다른 일 형태는, 하기 공정 (iv) 및 (v)를 포함하는, 망막계 세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법이다:
(iv) 동결 보존된, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포의 세포 집단을 융해하는 공정,
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 망막계 세포로 분화 유도하고, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 얻는 공정.
이하, 공정 (1) 및 (2)에 대하여 상세하게 설명한다.
3-1. 공정 (1)에 대하여
공정 (1)에 있어서의 다능성 줄기 세포로서, 바람직하게는 iPS 세포 또는 ES 세포를 들 수 있다.
여기서, iPS 세포 또는 ES 세포의 제조 방법에는 특별히 한정은 없고, 상술한 바와 같이 당업자에게 주지된 방법으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 피더 세포 비존재 하(피더 프리)에서 제조를 행한다.
본 발명에 있어서 「피더 세포 비존재 하(피더 프리)에서 제조를 행한다」란, 피더 세포 비존재 하에서 배양하는 것이다. 피더 세포 비존재 하란, 예를 들어 피더 세포를 첨가하지 않은 조건, 또는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는(예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3％ 이하, 바람직하게는 0.5％ 이하) 조건을 들 수 있다.
공정 (1)에서는 필요에 따라서 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양을 행해도 된다. 유지 배양 또는 확대 배양은 당업자에게 주지된 방법으로 실시할 수 있지만, 바람직하게는 피더 프리로 행한다.
상기 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양에서 사용되는 배지는, 유지 배양 또는 확대 배양이 가능한 한 한정되지 않는다. 피더 프리 조건 하에서는, 미분화 유지 배양을 가능하게 하기 위해 미분화 유지 인자를 포함하는 배지를 사용하지만, 많은 합성 배양지가 개발 및 시판되고 있으며, 이들을 사용할 수 있다. 예를 들어 에센셜 8(Life Technologies사제) 배지, S-medium(DS 파마바이오메디칼사제), StemPro(Life Technologies사제, 등록 상표), hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9; 105(36): 13409-14), mTeSR1(STEMCELL Technologies사제), mTeSR2(STEMCELL Technologies사제), TeSR-E8(STEMCELL Technologies사제), StemFit(아지노모또사제, 등록 상표)를 들 수 있다.
공정 (1)에 있어서의 유전자 개변은, 상술한 바와 같이 당업자에게 주지된 방법으로 실시할 수 있다.
당업자라면, 쌍극 세포 제어 유전자의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키기 위해서, 쌍극 세포 제어 유전자를 어떻게 개변할 지 결정할 수 있다.
쌍극 세포 제어 유전자의 발현 또는 기능을 소실 또는 감약시키기 위한 일 형태로서, 쌍극 세포 제어 유전자의 유전자 결실을 들 수 있고, 이 양태에서는 쌍극 세포 제어 유전자의 염기 서열의 일부 또는 전부를 결실시킨다. 염기 서열의 일부 결실로서, 전사 개시 코돈을 포함하는 영역 또는 단백질의 기능에 중요한 영역을 일부 결실시키는 것을 들 수 있다. 유전자 결실된 다능성 줄기 세포를 선별하기 위해서, 예를 들어 약제 내성 유전자 또는 형광 단백질에 의해 쌍극 세포 제어 유전자의 염기 서열의 일부 또는 전부를 치환할 수도 있다.
당업자라면, 유전자가 개변되어 있는 것을 용이하게 확인할 수 있다. 일 형태로서 서든 블롯법, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, 시퀀싱 등을 들 수 있다.
당업자라면, 유전자 개변된 다능성 줄기 세포를 선별할 수 있다. 일 형태로서, 유전자 개변 시에 네오마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자, 또는 GFP 등의 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하고, 약제 또는 GFP의 형광에 의해 유전자 개변된 세포의 선별을 행하는 방법을 들 수 있다.
공정 (1)에서 얻어지는 유전자 개변을 행한 다능성 줄기 세포는, 공정 (2)로 옮겨가기 전에, 그의 생존 상태 및 분화 다능성이 유지되는 한, 유지 배양, 확대 배양, 보존, 또는 기타 처리에 부칠 수 있다.
유지 배양, 확대 배양 및 보존은, 상술한 방법 등의 당업자에게 주지된 방법으로 실시할 수 있다.
동결 보존된 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우에는, 공정 (1)을 당해 동결 세포를 융해하는 공정으로 치환해도 된다.
당업자라면, 주지된 방법으로 동결 보존한 세포를 융해시키고, 공정 (2)에 제공할 수 있다. 일 형태에 있어서는, 동결 보존된 세포의 융해 후, 해당 세포의 유지 배양 또는 확대 배양을 행해도 된다.
3-2. 공정 (2)에 대하여
공정 (1)에서 얻어진 세포 집단으로부터, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 얻는 방법의 구체예에 대하여 설명한다. 상기 공정 (2)의 분화 유도 방법으로서는, 예를 들어 WO2011/055855, WO2012/173207, WO2013/077425, WO2015/025967, WO2016/063985, WO2016/063986, PLoS One. 2010 Jan 20; 5(1): e8763., Stem Cells. 2011 Aug; 29(8): 1206-18., Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun 10; 111(23): 8518-23, Nat Commun. 2014 Jun 10; 5: 4047에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않고, 당업자에게 공지된 방법으로 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단 또는 망막 조직으로 분화 유도하는 기타 방법에 제공할 수도 있다.
공정 (2)의 일 형태로서, 하기 공정 (A) 내지 (C)에 의해 망막계 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(A): 공정 (1)에서 얻어진 유전자 개변된 다능성 줄기 세포의 세포 집단을, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(B): 공정 (A)에서 얻어진 세포 응집체를, 기저막 표품을 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하는 공정,
(C): 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, 혈청 배지 중에서 부유 배양하는 공정.
본 방법은, 예를 들어 WO2013/077425에도 개시되어 있으며, 보다 상세하게는 WO2013/077425를 참조하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 증식 인자)이 혼입되어 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
이러한 무혈청 배지로서, 시판되고 있는 KSR(Life Technologies사제, 상품명)을 적량(예를 들어, 체적 퍼센트로 약 0.5％ 내지 약 30％, 바람직하게는 약 1％ 내지 약 20％) 첨가한 무혈청 배지를 사용해도 된다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, CKI-7(N-(2-아미노에틸)-5-클로로-이소퀴놀린-8-술폰아미드), IWR-1-endo(IWR1e) 등은 공지된 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이며, 시판품 등을 적절히 입수 가능하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서 바람직하게는 IWR1e가 사용된다.
사용되는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 줄기 세포의 응집체가 형성되는 농도이면 된다. 예를 들어 IWR1e의 경우, 약 0.1μM 내지 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 10μM, 보다 바람직하게는 약 3μM의 농도로 배지에 첨가한다.
Wnt 시그널 경로 저해 물질은, 부유 배양 개시 전에 무혈청 배지에 첨가해도 되고, 또한 부유 배양 개시 후 몇일 이내(예를 들어, 5일 이내)에 무혈청 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, Wnt 시그널 경로 저해 물질은 부유 배양 개시 후 5일 이내, 보다 바람직하게는 3일 이내, 가장 바람직하게는 부유 배양 개시와 동시에, 무혈청 배지에 첨가한다. 또한, Wnt 시그널 경로 저해 물질을 첨가한 상태에서, 바람직하게는 부유 배양 개시 후 18일째까지, 보다 바람직하게는 12일째까지 부유 배양한다.
응집체를 형성시키는 실험적인 조작으로서는, 예를 들어 웰의 작은 플레이트(96웰 플레이트) 또는 마이크로포어 등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 집어넣는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 원심함으로써 세포를 응집시키는 방법 등을 들 수 있다.
세포 응집체를 형성시킬 때의 다능성 줄기 세포의 세포수는, 줄기 세포의 균일한 응집체를 형성 가능한 세포수인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 96웰 마이크로웰 플레이트를 사용하는 경우, 1웰당 약 1×103 내지 약 5×104세포, 바람직하게는 약 3×103 내지 약 3×104세포, 보다 바람직하게는 약 5×103 내지 약 2×104세포, 가장 바람직하게는 9×103세포 전후가 되도록 조제한 액을 첨가하고, 플레이트를 정치하여 세포 응집체를 형성시킨다.
다능성 줄기 세포의 응집체가 형성된 것은, 세포 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그의 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 그리고 그의 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그의 동기성, 그리고 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초하여, 당업자라면 판단하는 것이 가능하다.
기저막 표품으로서는, 그 위에 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포를 파종하여 배양한 경우에, 상피 세포와 같은 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 여기서, 「기저막 구성 성분」이란, 동물의 조직에 있어서 상피 세포층과 간질 세포층 등 사이에 존재하는 얇은 막상을 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 표품은, 예를 들어 기저막을 개재하여 지지체 상에 접착되어 있는 기저막 형성능을 갖는 세포를, 해당 세포의 지질 용해능을 갖는 용액, 알칼리 용액 등을 사용하여 제거함으로써 제작할 수 있다. 바람직한 기저막 표품으로서는, 기저막 성분으로서 시판되고 있는 상품(예를 들어 Matrigel(이하, 「마트리겔」이라고 하는 경우가 있음)), 또는 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자(예를 들어, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산 프로테오글리칸, 엔탁틴 등)를 포함하는 것을 들 수 있다.
사용되는 기저막 표품의 양으로서는, 예를 들어 Matigel을 사용하는 경우에는, 바람직하게는 배지의 체적을 기준으로 하여, 1/20 내지 1/200의 양, 보다 바람직하게는 1/100 전후의 양을 들 수 있다. 기저막 표품은, 줄기 세포의 배양 개시 시에 이미 배지에 첨가되어 있어도 되지만, 바람직하게는 부유 배양 개시 후 5일 이내, 보다 바람직하게는 부유 배양 개시 후 2일 이내에 무혈청 배지에 첨가된다.
혈청은, 예를 들어 소 혈청, 송아지 혈청, 소태아 혈청, 말 혈청, 새끼말 혈청, 말태아 혈청, 토끼 혈청, 새끼토끼 혈청, 토끼 태아 혈청, 및 인간 혈청 등 포유 동물의 혈청 등을 사용할 수 있다.
혈청의 첨가는, 부유 배양 개시 후 7일째 이후, 보다 바람직하게는 9일째 이후, 가장 바람직하게는 12일째에 행한다. 혈청은 체적 퍼센트로 약 1 내지 30％, 바람직하게는 약 3 내지 20％, 보다 바람직하게는 10％ 전후(예를 들어, 5％ 내지 15％)의 농도가 되도록 첨가한다.
공정 (2)의 다른 일 형태로서, 하기 공정 (D), (E) 및 (F)를 포함하는 방법에 의해 망막계 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
(D): 공정 (1)에서 얻어진, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 비존재 하에서 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 그리고 2) 미분화 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(E): 공정 (D)에서 배양한 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지 중에서 부유 배양함으로써, 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(F): 공정 (E)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 추가로 부유 배양하는 공정.
본 방법은, 예를 들어 WO2016/063985에도 개시되어 있으며, 보다 상세하게는 WO2016/063985를 참조하는 것이 가능하다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이란, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는 시그널 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내고, 구체적으로는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 등), 노달/액티빈(Nodal/Activin) 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, A-83-01 등) 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질(예: LDN193189, 도르소모르핀(Dorsomorphin) 등)을 들 수 있다. 이들 물질은 시판되고 있으며 입수 가능하다.
소닉·헤지호그(이하, 「Shh」라고 기재하는 경우가 있다.) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 PMA(Purmorphamine), SAG(Smoothened Agonist) 등을 들 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어, SB431542는 통상 0.1 내지 200μM, 바람직하게는 2 내지 50μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 통상 0.05 내지 50μM, 바람직하게는 0.5 내지 5μM의 농도로 사용된다. LDN193189는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 300nM의 농도로 사용된다. SAG는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 700nM의 농도로 사용된다. PMA는 통상 0.002 내지 20μM, 바람직하게는 0.02 내지 2μM의 농도로 사용된다.
공정 (D)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 배지로서 미분화 유지 인자를 포함하는 상기 피더 프리 배지를 사용하면 된다.
공정 (D)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 피더 세포를 대신하는 발판을 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해서, 적절한 매트릭스를 발판으로서 사용해도 된다. 발판으로서 사용할 수 있는 매트릭스로서는, 라미닌(Nat Biotechnol 28, 611-615, (2010)), 라미닌 단편(Nat Commun 3, 1236, (2012)), 기저막 표품(Nat Biotechnol 19, 971-974, (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란황산 프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴(Vitronectin) 등을 들 수 있다.
공정 (D)에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양 시간은, 공정 (E)에 있어서 형성되는 세포 응집체의 질을 향상시키는 것이 가능한 범위라면 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 144시간이다. 일 형태에 있어서, 배양 시간은 바람직하게는 2 내지 96시간, 보다 바람직하게는 6 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 더욱 바람직하게는 18 내지 28시간(예, 24시간)이다.
무혈청 배지의 준비 및 세포 응집체의 형성은, 상술과 동일하게 실시할 수 있다.
일 형태에 있어서, 공정 (E)에 있어서 사용되는 배지는, 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 상술한 것을 상술한 농도로 사용할 수 있다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 부유 배양 개시 시부터 배지에 포함된다. 배지에는, ROCK 저해제(예, Y-27632)를 첨가해도 된다. 배양 시간은 예를 들어 12시간 내지 6일간이다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 또는 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는 BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R&D Systems사로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 와코 쥰야쿠로부터 입수 가능하다.
사용되는 배지로서는, 예를 들어 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지(바람직하게는 무혈청 배지)를 들 수 있다. 무혈청 배지, 혈청 배지는 상술한 바와 같이 준비할 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 인간 BMP4 단백질의 경우에는, 약 0.01nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 1nM 내지 약 10nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5nM(55ng/mL)의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (D)의 부유 배양 개시부터 약 24시간 후 이후에 배지에 첨가되어 있으면 되고, 예를 들어 부유 배양 개시 후 수일 이내(예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가되어 있으면 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 후 1일째 내지 15일째 사이, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째 사이, 가장 바람직하게는 3일째에 배지에 첨가한다.
상기 공정 (A) 내지 공정 (F)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한 CO2 농도는, 예를 들어 약 1％ 내지 약 10％, 바람직하게는 약 5％이다.
상기 공정 (C) 또는 공정 (F)에 있어서의 배양 기간을 변동시킴으로써 각종 분화 단계의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 즉, 미성숙한 망막계 세포(예: 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포)와 성숙한 망막계 세포(예: 시세포)를 다양한 비율로 포함하는 망막계 세포를 제조할 수 있다. 공정 (C) 또는 공정 (F)의 배양 기간을 연장시킴으로써, 성숙한 망막계 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
상술한 방법으로 얻은 망막계 세포의 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하 또는 비존재 하에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 3일간 내지 6일간 정도의 기간 배양 후, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 30일간 내지 60일간 정도 배양함으로써, 모양체 주연부 유사 구조체를 제조할 수도 있다.
모양체 주연부 유사 구조체란, 모양체 주연부와 유사한 구조체이다. 「모양체 주연부(ciliary marginal zone; CMZ)」로서는, 예를 들어 생체 망막에 있어서 망막 조직(구체적으로는, 신경 망막)과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직이며, 또한 망막의 조직 줄기 세포(망막 줄기 세포)를 포함하는 영역을 들 수 있다. 모양체 주연부는 모양체 테두리(ciliary margin) 또는 망막 테두리(retinal margin)라고도 불린다. 모양체 주연부는, 망막 조직으로의 망막 전구 세포 또는 분화 세포의 공급 및 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로서는, 예를 들어 Rdh10 유전자(양성), Otx1 유전자(양성) 및 Zic1(양성)을 들 수 있다.
Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 GSK3β 저해제(예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO), CHIR99021, 켄파울론(Kenpaullone))를 들 수 있다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM의 농도로 첨가한다.
FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 SU-5402, AZD4547, BGJ398 등을 들 수 있다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
상술한 방법에 의해, 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 제조할 수 있지만, 이들 방법에 한정되지 않는다.
공정 (2)에 의해 얻어지는 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단에 있어서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계가 전체 세포수의 10％ 이상(바람직하게는 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상 또는 90％ 이상)이면 된다. 또한, 공정 (2)에 의해 얻어지는 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 배양을 계속한 경우(예: 공정 (2)의 개시 120일 이후), 또는 공정 (2)에 의해 얻어지는 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 생체에 이식한 경우, 인비트로 또는 이식된 레시피언트의 망막에 있어서, 신경 망막층이 형성되고, 신경 망막층을 구성하는 세포가 증대된다. 이 단계에서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계는, 전체 세포수의 30％ 이상(바람직하게는 40％ 이상, 또는 50％ 이상)이면 되고, 쌍극 세포 전구 세포, 추체 쌍극 세포 및 간체 쌍극 세포의 세포수의 합계는, 전체 세포수의 30％ 이하(바람직하게는 20％ 이하, 10％ 이하 또는 5％ 이하)여도 된다. 또한, 아마크린 세포의 세포수에 대한 쌍극 세포의 세포수의 비율이 감소된다(예: 70％ 이하, 60％ 이하, 50％ 이하).
본 발명의 일 형태로서, 망막 전구 세포는 Chx10 양성 세포이며, 시세포 전구 세포는 Crx 양성 세포이며, 시세포는 리커버린 양성 세포이다.
공정 (2)에서 얻어진 세포 집단 중의 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 비율은, 당업자라면 주지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 일 형태로서, 면역 염색 또는 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해, Chx10 양성 세포, Crx 양성 세포, 리커버린 양성 세포가 포함되는 비율을 측정하는 것이 가능하다.
당업자라면, 쌍극 세포 제어 유전자의 개변이 유지되고 있는 것을 주지된 방법, 예를 들어 상술한 방법에 의해 확인할 수 있다.
쌍극 세포로 분화되지 않은 것, 또는 쌍극 세포가 변성사되어 있는 것은, 예를 들어 면역 염색 또는 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해, 쌍극 세포의 마커인 PKCα, Chx10 등의 발현 유무에 의해 확인할 수 있다.
쌍극 세포가 기능 부전에 빠져 있는 것은, 면역 조직학적 해석 또는 전기 생리학적 해석 등의 방법으로 확인할 수 있고, 예를 들어 시세포와의 시냅스 접속 또는 신경 발화를 관찰할 수 없는 경우에, 쌍극 세포가 기능 부전에 빠져 있다고 판단할 수 있다.
또한, 정상적인 시세포가 유도되고 있는 것은, 예를 들어 면역 염색 또는 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해, 시세포의 마커인 리커버린 등의 발현의 유무에 의해 확인할 수 있다.
상술한 세포의 유무 및 그들의 비율은, 이식 후의 조직으로부터 확인할 수도 있다.
4. 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 이식에 대하여
상술한 방법 등에 의해 제조한 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단은, 이식을 필요로 하는 대상(예: 포유 동물)에 이식할 수 있고, 당해 이식에 의해 대상의 시기능을 개선할 수 있다. 대상이 될 수 있는 포유 동물로서는, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 등을 들 수 있다.
망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단은, 세포 응집체의 형태로 이식할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 망막 조직을, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 적절한 크기로 세절하고, 시트제(세포 시트)로 한 후에 이식할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 세포 응집 덩어리로부터 잘라낸 세포 시트(예를 들어 직경 300㎛, 높이 50㎛)를 시세포가 변성되어 있는 영역의 면적에 따라서, 1매 내지 복수매 이식하는 것을 들 수 있다. 당업자라면, 그의 변성사되어 있는 영역의 면적에 따라서, 세포 시트의 매수를 선택할 수 있다. 또한, 제조한 망막계 세포에, 효소 처리 또는 피펫팅 등의 조작을 행하여, 세포 현탁액의 형태로서 이식할 수도 있다.
망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단은, 바람직하게는 의약 조성물로 조제하기 위해, 이식한다.
세포 현탁액의 이식은, 예를 들어 주사 바늘을 사용하여 망막 아래에 이식하는 방법으로 실시된다. 세포 시트의 이식은, 예를 들어 안구의 일부를 절개하고, 절개 부위를 통해서, 손상 부위 또는 병변 부위에 세포 시트를 이식함으로써 실시된다.
이식 후, 생착된 미성숙한 망막계 세포의 적어도 일부는, 대상의 생체 내(눈 안)의 환경 하에서, 성숙한 망막계 세포로 분화 유도된다. 여기서, 「이식 후에 유도되는 시세포」란, 대상의 눈 안에 있어서, 이식 후, 생착된 망막 전구 세포 또는 시세포 전구 세포로부터 분화 유도되는 시세포를 의미한다.
여기서, 본 발명에 있어서의 「생착」이란, 이식된 세포가 생체 내에 장기간(예: 30일 이상, 60일 이상, 90일 이상) 생존하고, 장기 내에 접착되어 머무르는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서의 「기능적 생착」이란, 이식된 세포가 생착되어, 생체 내에서 본래의 기능을 해내고 있는 상태를 의미한다.
시세포의 본래 기능이란, 생체 내에 있어서 쌍극 세포와 접촉하여 시냅스를 형성하고, 시세포에서 변환된 전기 신호를 쌍극 세포에 전달하는 것이다. 따라서, 본 발명에 있어서의 「시세포의 기능적 생착」이란, 이식된 시세포(이식 후에 유도되는 시세포를 포함함)가 호스트측의 쌍극 세포와 접촉하여 시냅스를 형성하고, 시세포에서 변환된 전기 신호가 해당 시냅스를 통해 쌍극 세포에 전달되는 상태로 생착되어 있는 것을 의미한다. 시세포와 쌍극 세포가 시냅스를 형성하고 있는 것은, 시세포측의 시냅스 마커(예: Ctbp2, Basoon, Cacna1f, ELFN1), 또는 쌍극 세포측의 시냅스 마커(예: mGluR6, Cacna1s, TRPM1)를 염색함으로써 확인할 수 있다. 구체적으로는, 면역 염색 등의 방법에 의해, 리커버린 양성 세포(시세포)와 PKCα 양성 세포(쌍극 세포)의 접촉면에 있어서의 상기 시냅스 마커의 염색에 의해, 시냅스 형성을 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서, 이식편의 시세포층이 호스트측의 쌍극 세포를 포함하는 망막층과 접촉한 상태를, 시세포의 기능적 생착으로 간주할 수도 있다(Stem Cells, 31, 1149-1159, (2013)).
본 발명에 있어서의 「접촉」이란, 세포끼리가 물리적으로 근접해 있으며, 시냅스 접속이 시사되는 상태를 가리킨다.
본 발명에 있어서의 「접촉율」이란, 이식한 망막 조직의 긴 직경에 대한, 이식한 망막 조직의 시세포층이 호스트측의 쌍극 세포를 포함하는 망막층과 접촉하고 있는 길이의 비율을 가리킨다.
본 발명에 있어서의 「기능적 생착율」이란, 이식한 세포 중, 기능적 생착을 달성한 세포의 비율을 의미한다. 이식된 시세포의 기능적 생착율은, 상기 접촉율로부터 구할 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조한 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 이식함으로써 이식된 시세포(이식 후에 유도되는 시세포를 포함함)의, 기능적 생착율은 10％ 이상, 바람직하게는 20％ 이상, 보다 바람직하게는 40％ 이상, 더욱 바람직하게는 50％ 이상, 특히 바람직하게는 60％ 이상이다.
이식된 시세포(이식 후에 유도되는 시세포를 포함함)의 생착율 및/또는 기능적 생착율이 높을수록, 이식 후의 시기능의 개선 효과가 높아진다.
따라서, 본 발명은, 이식된 시세포(이식 후에 유도되는 시세포를 포함함)의 생착율 및/또는 기능적 생착율의 개선 방법을 제공한다.
5. 의약 조성물
본 발명은, 상기 제조 방법에 의해 제조되는, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 유효량을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 이식용 세포 집단의 유효량은 투여의 목적, 투여 방법 및 투여 대상의 상황(성별, 연령, 체중, 병상 등)에 따라서 상이하지만, 예를 들어 세포수로서 1×105개 내지 1×107개(예: 1×105개, 1×106개 또는 1×107개)로 할 수 있다.
의약 조성물은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 상기 이식용 세포 집단의 유효량, 및 의약으로서 허용되는 담체를 포함한다.
의약으로서 허용되는 담체로서는, 생리적인 수성 용매(생리 식염수, 완충액, 무혈청 배지 등)를 사용할 수 있다. 필요에 따라서 의약 조성물에는, 이식 의료에 있어서, 이식하는 조직 또는 세포를 포함하는 의약에, 통상 사용되는 보존제, 안정제, 환원제, 등장화제 등을 배합시켜도 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 상기 제조 방법으로 제조되는 상기 이식용 세포 집단을, 적절한 생리적인 수성 용매로 현탁시킴으로써, 세포 현탁액으로서 제조할 수 있다. 필요하다면, 동결 보존제를 첨가하여 상기 이식용 세포 집단을 동결 보존하고, 사용 시에 해동하여, 완충액으로 세정하고, 이식 의료에 사용해도 된다.
본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 이식용 세포 집단을 포함하는 망막 조직을, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 적절한 크기로 세절하여, 시트제로 할 수도 있다.
또한, 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 이식용 세포 집단은, 분화 유도를 행하는 공정 (2)에서 접착 배양을 행함으로써, 시트상으로 성형하여 세포 시트인 시트제로 할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 망막계 세포의 장애에 기초하는 질환의 치료약으로서 유용하다.
6. 치료약 및 치료 방법
본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단은, 망막 조직의 장애(망막 전구 세포 또는 망막계 세포의 장애를 포함함)에 기초하는 질환의 이식 의료에 유용하다. 그래서, 본 발명은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 포함하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환의 치료약을 제공한다. 또한, 본 발명은, 당해 치료약을, 현탁액이나 시트제의 형태로 환자에게 투여(이식)하는 것을 포함하는 치료 방법도 제공한다. 망막 조직의 장애에 기초하는 질환의 치료약으로서, 또는 당해 망막 조직의 손상 상태에 있어서, 해당하는 손상 부위를 보충하기 위해서, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 사용할 수 있다. 이식을 필요로 하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환, 또는 망막 조직의 손상 상태의 환자에게, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 이식하고, 당해 망막계 세포 또는 장애를 받은 망막 조직 자체를 보충함으로써, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환, 또는 망막 조직의 손상 상태를 치료할 수 있다. 망막 조직의 장애에 기초하는 질환으로서는, 예를 들어 안과 질환인 황반 변성증, 노인성 황반 변성, 망막 색소 변성, 녹내장, 각막 질환, 망막 박리, 중심성 장액성 망맥락막증, 추체 디스트로피, 추체 간체 디스트로피 등을 들 수 있다. 망막 조직의 손상 상태로서는, 예를 들어 시세포가 변성사되어 있는 상태 등을 들 수 있다.
이식 의료에 있어서는, 조직 적합성 항원의 차이에 의한 거절 반응이 종종 문제가 되지만, 이식의 레시피언트의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포(예, 인공 다능성 줄기 세포)를 사용함으로써 당해 문제를 극복할 수 있다. 즉, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 다능성 줄기 세포로서, 레시피언트의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포(예, 인공 다능성 줄기 세포)를 사용함으로써, 당해 레시피언트에 대하여 면역학적 자기의 망막 조직 또는 망막계 세포를 제조하고, 이것이 당해 레시피언트에 이식된다.
또한, 레시피언트와 면역이 적합한(예를 들어, HLA형 또는 MHC형이 적합한) 다른 사람의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포(예, 인공 다능성 줄기 세포)로부터, 동종(타가(他家))의 망막 조직 또는 망막계 세포를 제조하여, 이것을 당해 레시피언트에 이식해도 된다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 전혀 아니다.
실시예 1: Bhlhb4 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고, 이식 조직 중의 간체 쌍극 세포를 감소시키는 예
Nrl::eGFP 마우스로부터 수립한 Nrl::eGFP 리포터를 갖는 마우스 iPS 세포(Stem Cells, 31, 1149-1159, (2013), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, pp.3890-3895, (2006))를, Nature biotechnology, 26(2), 215-24, (2008)에 기재된 방법에 준하여 미분화 유지 배양하였다.
Bhlhb4 유전자(BHLHE23 유전자의 마우스 오르소로그)의 기능을 결손시키는 방법으로서, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하였다. SpCas9와 표적 서열 sgRNA(서열 번호 16: ccgagctcaagtcgctgtcg, 서열 번호 17: cgcgccttggtgagaaggcg)를 세포 내에서 발현시킴으로써, 표적 서열 부위를 절단할 수 있다. SpCas9와 표적 서열을 조합한 플라스미드를 일렉트로포레이션법(상품명: Nucreofector, Lonza사제)에 의해, 마우스 iPS 세포에 도입하였다. 마우스 iPS 세포에, CRISPR/Cas9와, Bhlhb4 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역을 결실시키도록 설계한 gRNA, 및 퓨로마이신 내성 유전자를 삽입한 플라스미드를 도입하였다. 퓨로마이신을 사용하여 도입 세포를 선택하고, 콜로니를 픽업함으로써 Bhlhb4 유전자 결실주를 수립하였다. Bhlhb4 유전자의 목적 개소가 결실되어 있는지, PCR 및 아가로오스 겔 전기 영동으로, 또는 염기 서열 정보를 읽음으로써 확인하였다.
망막으로의 분화 유도 방법으로서는, 비특허문헌 2에 기재된 방법을 개량한 비특허문헌 5에 기재된 SFEBq법을 사용하였다. 분화 유도 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 마우스 iPS 세포를 효소 처리로 단일 세포로 분산시킨 후, 96웰 플레이트에 3000 세포/웰로 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 0일째 내지 1일째까지 AGN193109(0.1μM, Toronto Research Chemicals사제)를 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하고, 그 후 8일째까지 AGN193109 및 성장 인자 감소 마트리겔(Growth Factor Reduced Matrigel)(2％v/v, BD Biosciences사제)을 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하였다. 또한, 「분화 유도 개시 후 N일째」란, 분화 유도 개시 N일 후(N×24시간 후)로부터 N+1일((N+1)×24시간) 경과 직전까지의 기간을 의미한다(이하 동일함). 배지로서, G-MEM(5％ KSR, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올)을 사용하였다. 분화 유도 개시 후 8일째에, 망막 전구 조직의 상피 구조가 주머니 형상으로 돌출된 안포(眼胞)를, No.11 Blade를 사용하여 세포 덩어리로부터 잘라내고, 40％ O2, 5％ CO2 환경 하, DMEM/F12(N2 supplement, 10％ FBS, 0.5μM 올트랜스레티노산, 1mM L-타우린)의 배지에서 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 15일째에 입체 망막을 잘라내고, 주사기를 사용하여, 시세포 변성 모델인 rd1 마우스의 망막 아래에 이식하였다. 이식 후 분화 30 내지 50일 상당 령(齡)에, 눈 조직을 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 조직 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항PKCα 항체(상품명: Rabbit Anti-Protein Kinase Cα antibody, Sigma사제), 항칼레티닌 항체(상품명: Rabbit Anti-Calretinin Antibody, Millipore사제) 및 항칼빈딘 항체(상품명: Monoclonal Anti Calbindin-D-28K antibody, Sigma사제)를 사용하여, 각각 조직 절편 중의 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포를 염색하고, 이식 후의 그래프트를 평가하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(상품명: TCS SP8, 라이카사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 이식편 중 각각의 세포의 비율을 조사하였다. 그 결과, Bhlhb4 유전자를 결실하지 않은 망막 조직을 이식한 경우에 비해, Bhlhb4 유전자를 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우에는, 간체 쌍극 세포의 비율이 유의미하게 감소하고 있는 것을 알았다(도 1).
실시예 2: Bhlhb4 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고, 호스트 간체 쌍극 세포의 접촉율을 향상시키는 예
Nrl::eGFP 마우스로부터 수립한 Nrl::eGFP 리포터를 갖는 마우스 iPS 세포를, Nature biotechnology, 26(2), 215-24, (2008)에 기재된 방법에 준하여 미분화 유지 배양하였다.
망막으로의 분화 유도 방법 및 이식 방법으로서는, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였다. 이식 후 분화 40일 및 90일 상당 령 전후에, 눈 조직을 PFA 고정하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 조직 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항PKCα 항체(상품명: Rabbit Anti-Protein Kinase Cα antibody, Sigma사제)를 사용하여 조직 절편 중의 간체 쌍극 세포를 염색하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(상품명: TCS SP8, 라이카사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 호스트 간체 쌍극 세포와 eGFP 양성 이식 시세포의 접하는 부분의 길이, 그라프트가 존재하고 있는 부분 전체의 길이에 대한 비율을 조사하였다. 그 결과, Bhlhb4 유전자를 결실하지 않은 망막 조직을 이식한 경우에 비해, Bhlhb4 유전자를 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우, 호스트 간체 쌍극 세포에 접촉하고 있는 그래프트 유래의 시세포 비율이 유의미하게 증가하고 있는 것을 알았다(도 2).
실시예 3: ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고, 이식 조직 중의 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포를 감소시키는 예
Nrl::eGFP 마우스로부터 수립한 Nrl::eGFP 리포터를 갖는 마우스 iPS 세포를, Nature biotechnology, 26(2), 215-24, (2008)에 기재된 방법에 준하여 미분화 유지 배양하였다.
ISL1 유전자의 기능을 결실시키는 방법으로서, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하였다. 마우스 iPS 세포에, CRISPR/Cas9와, ILS1 유전자의 제1 및 제2 엑손을 결실시키도록 설계한 표적 서열(서열 번호 18: tcttcaatagcacgcgggaa, 서열 번호 19: tcctaagccataaagcgctt), 그리고 퓨로마이신 내성 유전자를 삽입한 플라스미드를 일렉트로포레이션법(Nucreofector, Lonza사제)에 의해, 마우스 iPS 세포에 도입하였다. 퓨로마이신을 사용하여 도입 세포를 선택하고, 콜로니를 픽업함으로써 ISL1 유전자 결실주를 수립하였다. ISL1 유전자의 목적 개소가 결실되어 있는지, PCR 및 아가로오스 겔 전기 영동으로, 또는 염기 서열 정보를 읽음으로써 확인하였다.
망막으로의 분화 유도 방법으로서는, 비특허문헌 2에 기재된 방법을 개량한 비특허문헌 5에 기재된 SFEBq법을 사용하였다. 분화 유도 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 마우스 iPS 세포를 효소 처리로 단일 세포로 분산시킨 후, 96웰 플레이트에 3000 세포/웰로 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 0일째 내지 1일째까지 AGN193109(0.1μM)를 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하고, 그 후 8일째까지 AGN193109(0.1μM) 및 성장 인자 감소 마트리겔(2％v/v)을 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하였다. 배지로서, G-MEM(5％ KSR, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올)을 사용하였다. 분화 유도 개시 후 8일째에 안포를 No.11 Blade를 사용하여 잘라내고, 40％ O2, 5％ CO2 환경 하, DMEM/F12(N2 supplement, 10％ FBS, 0.5μM 올트랜스레티노산, 1mM L-타우린)의 배지에서 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 15일째에 입체 망막을 잘라내고, 주사기를 사용하여, 시세포 변성 모델인 rd1 마우스의 망막 아래에 이식하였다. 이식 후 30 내지 50일째에 눈 조직을 PFA 고정하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항PKCα 항체, 항칼레티닌 항체 및 항칼빈딘 항체를 사용하여, 각각 절편 중의 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포를 염색하고, 이식 후의 그래프트를 평가하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(Leica사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 이식편 중 각각의 세포의 비율을 조사하였다. 그 결과, ISL1 유전자를 결실하지 않은 망막 조직을 이식한 경우에 비해, ISL1 유전자를 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우, 간체 쌍극 세포의 비율이 유의미하게 감소하고 있는 것을 알았다(도 3).
실시예 4: 쌍극 세포 제어 유전자의 기능을 결실시킨 마우스 iPS 세포 유래의 망막 조직을 이식하고, 이식 조직 중의 호스트 쌍극 세포와 이식 시세포의 시냅스 접속을 시사하는 예
Nrl::eGFP 마우스로부터 수립한 Nrl::eGFP 리포터를 갖는 마우스 iPS 세포를, Nature biotechnology, 26(2), 215-24, (2008)에 기재된 방법에 준하여 미분화 유지 배양하였다.
Bhlhb4 유전자 또는 ISL1 유전자를 결실시키는 방법으로서, 실시예 1 및 3과 동일한 방법을 사용하였다.
망막으로의 분화 유도 방법으로서는, 비특허문헌 2에 기재된 방법을 개량한 비특허문헌 5에 기재된 SFEBq법을 사용하였다. 분화 유도 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 마우스 iPS 세포를 효소 처리로 단일 세포로 분산시킨 후, 96웰 플레이트에 3000 세포/웰로 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 0일째 내지 1일째까지 AGN193109(0.1μM)를 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하고, 그 후 8일째까지 AGN193109(0.1μM) 및 성장 인자 감소 마트리겔(2％v/v)을 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하였다. 배지로서, G-MEM(5％ KSR, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올)을 사용하였다. 분화 유도 개시 후 8일째에, 안포를 No.11 Blade를 사용하여 잘라내고, 40％ O2, 5％ CO2 환경 하, DMEM/F12(N2 supplement, 10％ FBS, 0.5μM 올트랜스레티노산, 1mM L-타우린)의 배지에서 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 15일째에 입체 망막을 잘라내고, 주사기를 사용하여, 시세포 변성 모델인 rd1 마우스의 망막 아래에 이식하였다. 이식 후 30 내지 50일째에 눈 조직을 PFA 고정하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항PKCα 항체 및 항Ctbp2 항체를 사용하여, 각각 절편 중의 간체 쌍극 세포 및 시세포의 시냅스 말단을 염색하고, 이식 후의 그래프트를 평가하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(Leica사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 이식 조직 중의 호스트 쌍극 세포와 이식 시세포의 시냅스 접속을 평가하였다. 그 결과, BhlhB4 및 ISL1 유전자를 결실한 망막 조직을 이식하였을 때, 호스트의 쌍극 세포와 시냅스 접속하고 있을 가능성이 시사되었다(도 4).
실시예 5: 쌍극 세포 제어 유전자의 기능의 결실에 의한 간체 쌍극 세포, 아마크린 세포 및 수평 세포의 감소를 평가하는 예
Nrl::eGFP 마우스로부터 수립한 Nrl::eGFP 리포터를 갖는 마우스 iPS 세포를, Nature biotechnology, 26(2), 215-24, (2008)에 기재된 방법에 준하여 미분화 유지 배양하였다.
Bhlhb4 유전자 또는 ISL1 유전자를 결실시키는 방법으로서, 실시예 1 및 3과 동일한 방법을 사용하였다.
망막으로의 분화 유도 방법으로서는, 비특허문헌 2에 기재된 방법을 개량한 비특허문헌 5에 기재된 SFEBq법을 사용하였다. 분화 유도 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 마우스 iPS 세포를 효소 처리로 단일 세포로 분산시킨 후, 96웰 플레이트에 3000 세포/웰로 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 0일째 내지 1일째까지 AGN193109(0.1μM)를 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하고, 그 후 8일째까지 AGN193109(0.1μM) 및 성장 인자 감소 마트리겔(2％v/v)을 첨가한 배지 중에서 상기 세포를 배양하였다. 배지로서, G-MEM(5％ KSR, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올)을 사용하였다. 분화 유도 개시 후 8일째에, 안포를 No.11 Blade를 사용하여 잘라내고, 40％ O2, 5％ CO2 환경 하, DMEM/F12(N2 supplement, 10％ FBS, 0.5μM 올트랜스레티노산, 1mM L-타우린)의 배지에서 부유 배양하였다. 분화 유도 개시 후 29일째에, 조직을 PFA 고정하여 수크로오스 치환 후, 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항로돕신 항체(Sigma사제)를 사용하여 성숙 시세포를, 항PKCα 항체(Sigma사제)를 사용하여 간체 쌍극 세포를, 항ISL1 항체(상품명: Anti Islet 1 Antibody, DSHB사제)를 사용하여 아마크린 세포, 수평 세포 및 쌍극 세포를, 항리커버린 항체(상품명: Anti Recoverin Antibody, Millipore사제)를 사용하여 시세포를, 항Chx10 항체(상품명: Anti Chx10 Antibody, Exalpha사제)를 사용하여 쌍극 세포를, 그리고 항GS 항체(상품명: Anti GS Antibody, Millipore사제) 및 항GFAP 항체(상품명: Anti GFAP antibody, dako사제)를 사용하여 뮐러 글리아 세포를 염색하고, 공초점 현미경(TCS SP8, 라이카사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(Leica사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 분화 유도한 망막 조직 중의 각각의 세포 비율을 조사하였다. 그 결과, Bhlhb4 유전자 또는 ISL1 유전자를 결실시킨 iPS 세포 유래의 응집체(응집 덩어리)는, Bhlhb4 유전자 및 ISL1 유전자를 결실하지 않은 응집체와 동등하게, Nrl 양성 간체 시세포, 로돕신 양성의 성숙 시세포, 리커버린 양성의 시세포, GS 양성 및 GFAP 양성의 뮐러 글리아 세포가 관찰되었다. 한편, PKCα 양성의 간체 쌍극 세포, Chx10 양성의 쌍극 세포 및 ISL1 양성 세포는 감소하고 있었다(도 5). 따라서, BhlhB4 유전자 또는 ISL1 유전자를 결실시킨 iPS 세포를, 망막계 세포로 분화되는 조건에서 장기 배양한 경우, 시세포 및 뮐러 글리아 세포에는 영향이 없고, 쌍극 세포 및 ISL1 양성 세포가 유의미하게 감소하고 있음을 알았다(도 5).
실시예 6: ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 수립하는 예
Crx:: Venus 리포터 유전자를 갖도록 유전자 개변한 인간 ES 세포(Kh-ES1주, 비특허문헌 3)를 「Scientific Reports, 4, 3594(2014)」에 기재된 방법에 준하여 피더 프리 조건 하에서 배양하였다. 피더 프리 배지로서는 StemFit 배지(상품명: AK03N, 아지노모또사제)를, 피더 세포를 대신하는 발판으로서는 Laminin511-E8(상품명, 닛삐사제)을 사용하였다.
구체적인 인간 ES 세포의 유지 배양 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 서브컨플렌트(배양 면적의 6할이 세포에 덮이는 정도)가 된 인간 ES 세포(KhES-1주)를 PBS로 세정 후, TrypLE Select(상품명, Life Technologies사제)를 사용하여 단일 세포로 분산하였다. 그 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를, Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632(ROCK 저해 물질, 10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서, 6웰 플레이트(이와키사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4cm2)를 사용한 경우, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포의 파종 세포수는, 1웰당 1.2×104세포로 하였다. 파종한 1일 후에, 배지를, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환하였다. 이 후, 1 내지 2일마다 1회, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지 교환하였다. 그 후, 파종한 6일 후에, 서브컨플렌트가 될 때까지 배양하였다.
망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 제조 방법의 공정 (1)에 있어서의 CRISPR/Cas9 시스템의 도입예로서, 이하의 조작을 행하였다. 먼저, 서브컨플렌트가 된 인간 ES 세포를, PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용하여 단일 세포로 분산하여 회수하였다. 그 후, 일렉트로포레이션법(상품명: Nucreofector, Lonza사제)을 사용하여, 인간 ES 세포에, CRISPR/Cas9와, ISL1 유전자의 제1 및 제2 엑손을 결실시키도록 설계한 gRNA(서열 번호 20: CCAACTCCGCCGGCTTAAAT, 서열 번호 21: GGGAGGTTAATACTTCGGAG), 그리고 퓨로마이신 내성 유전자를 삽입한 플라스미드를 도입하였다.
상기 일렉트로포레이션법에 의해 플라스미드를 도입한 인간 ES 세포를, Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬(이와키사제)에 파종하고, Y27632(ROCK 저해 물질, 10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서, 6웰 플레이트(이와키사제, 배양 면적 9.4cm2)를 사용한 경우, 상기 단일 분산된 인간 ES 세포의 파종 세포수는, 1웰당 1×103세포로 하였다. 파종한 1일 후에, 배지를, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환하였다. 이후, 1일 내지 2일에 1회, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지 교환하였다. 그 후, 파종한 6일 후 또는 서브컨플렌트 1일 전이 될 때까지 배양하였다. 상기 피더 프리 조건 하에서 배양한 서브컨플렌트 1일 전의 인간 ES 세포에, 퓨로마이신을 0.5ng/ml 또는 0.4ng/ml 첨가하고, 플라스미드 도입 세포를 선별하였다. 선별에 의해 살아 남은 콜로니를 픽업하여 유전자 해석함으로써, ISL1 유전자 결실주를 수립하였다(No.16주 및 No.19주, 도 6a의 하단). 콜로니 픽업 시, TrypLE Select에 의해 단일 세포로 분산시킨 후, 그의 절반량을 Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬(이와키사제)에 파종하고, Y27632(10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 나머지 절반량은 유전자 해석용 샘플로서 회수하였다.
픽업한 콜로니의 인간 ES 세포의 ISL1 유전자의 목적 개소가 결실되어 있는지는, PCR 및 아가로오스 겔 전기 영동으로(도 6a의 중단), 그리고 염기 서열 정보를 조사함으로써(도 6b) 확인하였다.
실시예 7: ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 망막으로 분화시키는 예
실시예 6에서 제작한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포(KhES-1주 유래, No.16주 및 No.19주)를 StemFit 배지에서, 서브컨플렌트 1일 전이 될 때까지 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 당해 서브컨플렌트 1일 전의 인간 ES 세포를, SB431542(TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 5μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM)의 존재 하(프리컨디션(Precondition) 처리)에, 1일간 피더 프리 조건 하에서 배양하였다.
실시예 6에서 제작한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포를, PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용하여 세포 분산액 처리하고, 또한 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산시킨 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를, 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(상품명: PrimeSurface 96웰 V 바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.2×104세포가 되도록 100μL의 무혈청 배지에 부유시켜, 27℃, 5％ CO2로 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에, 10％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1×화학적으로 규정된 지질 농도(Chemically defined lipid concentrate)를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다.
부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 상기 무혈청 배지에 Y27632(ROCK 저해 물질, 최종 농도 20μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM 또는 30nM)를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 외래성의 인간 재조합 BMP4(상품명: Recombinant Human BMP-4, R&D사제)를 최종 농도 1.5nM으로 포함하는 배지를 50μL 첨가하였다.
이와 같이 하여 조제된 세포에 대하여, 부유 배양 개시 후 3, 6, 9, 15 및 18일째에, 도립 현미경을 사용하여 명시야 관찰을 행하였다(도 7a). 그 결과, ISL1 유전자가 기능 결실된 인간 ES 세포주에 있어서도, 층 구조를 갖는 세포 응집체가 형성되는 것을 알았다(도 7a).
당해 부유 배양 개시 후 18일째의 응집체를, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질(CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질(SU5402, 5μM)을 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에 1％ N2 supplement가 첨가된 배지)에서 37도, 5％ CO2로, 3 내지 4일간 배양하였다. 그 후, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(DMEM/F12 배지에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 supplement, 0.5μM 레티노산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)에서 장기 배양하였다. 2 내지 4일에 1회, 상기 혈청 배지로 절반량 배지 교환하였다. 부유 배양 개시 후 64 내지 65일째에, 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰하였다(도 7b). 그 결과, ISL1 유전자가 기능 결실된 인간 ES 세포주에 있어서, CRX 양성의 시세포 전구 세포를 갖는 입체 망막이 형성되는 것을 알았다(도 7b).
ISL1 유전자를 결실시킨 인간 ES 세포를 출발 원료로 하여 제작한, 부유 배양 개시 후 57, 58 및 59일째의 세포 응집체를, 4％ PFA로 고정하고, 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편에 대하여, 항ISL1 항체(상품명: Anti Islet-1 Antibody, DSHB사제)를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 이들 면역 염색된 절편을, 공초점 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, ISL1 유전자를 결실시킨 인간 ES 세포로부터 제작한 세포 응집체에서는, ISL1 단백질이 발현되지 않은 것을 알았다(도 7c).
이들 결과로부터, ISL1 유전자가 기능 부전화된 인간 ES 세포주로부터, 망막 조직을 형성할 수 있는 것, 또한 ISL1 유전자가 기능 부전화된 인간 ES 세포주에 있어서는, ISL1 단백질이 발현되지 않은 것을 알았다.
실시예 8: ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 분화시킨 망막을 이식하고, 그의 생착을 확인하는 예
실시예 6에서 제작한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포(KhES-1주 유래)를 StemFit 배지에서, 서브컨플렌트 1일 전이 될 때까지 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 당해 서브컨플렌트 1일 전의 인간 ES 세포를, SB431542(TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 5μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM)의 존재 하(프리컨디션 처리)에서, 1일간 피더 프리 조건 하에 배양하였다.
실시예 6에서 제작한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포를, PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용하여 분산 처리하고, 또한 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산시킨 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를, 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(상품명: PrimeSurface 96웰 V 바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.2×104세포가 되도록 100μL의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃ 5％ CO2로 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×화학적으로 규정된 지질 농도를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다.
부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 상기 무혈청 배지에 Y27632(최종 농도 20μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM 또는 30nM)를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(상품명: Recombinant Human BMP-4, R&D사제, 최종 농도 1.5nM)를 포함하는 배지를 50μL 첨가하였다.
이와 같이 하여 조제된 세포의 부유 배양 개시 후 6일째에, 배지를 60μL 제거하고, 새롭게 90μL 배지를 첨가하였다. 또한 부유 배양 개시 후 9, 12 및 15일째에 배지를 85μL 제거하고, 새롭게 90μL의 배지를 첨가하였다.
당해 부유 배양 개시 후 18일째의 응집체를, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질(CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질(SU5402, 5μM)을 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에 1％ N2 supplement가 첨가된 배지)에서 37℃, 5％ CO2로, 3 내지 4일간 배양하였다. 그 후, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(DMEM/F12 배지에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 supplement, 0.5μM 레티노산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)에서 장기 배양하였다. 2 내지 4일에 1회 상기 혈청 배지로 절반량 배지 교환하였다. 부유 배양 개시 후 58 내지 65일째에 입체 망막을 잘라내고, 주사기를 사용하여 시세포 변성 모델인 망막 변성 래트의 망막 아래에 이식하였다. 이식 후 1 내지 2개월째에 형광 안저 장치(상품명: MicronIV, Phoenix research사제)를 사용하여, CRX::Venus의 형광을 기초로, 이식편의 생착을 관찰하였다. 그 결과, ISL1 유전자를 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우, ISL1 유전자를 결실시키지 않은 망막 조직과 비교하여 손색없이, 망막 변성 래트의 망막 아래에 생착되어 있었다(도 8). 따라서, ISL1 유전자를 결실시킨 인간 ES 세포로부터 분화 유도시킨 망막 조직은, 이식 후 생착되는 것을 알았다.
실시예 9: ISL1 유전자의 기능을 결실시킨 인간 ES 세포주를 분화시킨 망막을 이식하고, 쌍극 세포의 비율 감소를 확인하는 예
실시예 6에서 제작한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포(KhES-1주 유래)를 StemFit 배지에서, 서브컨플렌트 1일 전이 될 때까지 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 당해 서브컨플렌트 1일 전의 인간 ES 세포를, SB431542(TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 5μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM)의 존재 하(프리컨디션 처리)에, 1일간 피더 프리 조건 하에서 배양하였다.
상기 배양한 ISL1 유전자 결실 인간 ES 세포를 PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용하여 분산 처리하고, 추가로 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산시킨 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(상품명: PrimeSurface 96웰 V 바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.2×104세포가 되도록 100μL의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃ 5％ CO2로 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×화학적으로 규정된 지질 농도를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다.
부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 상기 무혈청 배지에 Y27632(최종 농도 20μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM 또는 30nM)를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(상품명: Recombinant Human BMP-4, R&D사제, 최종 농도 1.5nM)를 포함하는 배지를 50μL 첨가하였다.
이와 같이 하여 조제된 세포의 부유 배양 개시 후 6일째에, 배지를 60μL 제거하고, 새롭게 90μL 배지를 첨가하였다. 부유 배양 개시 후 9, 12 및 15일째에 배지를 85μL 제거하고, 새롭게 90μL의 배지를 첨가하였다.
당해 부유 배양 개시 후 18일째의 응집체를, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질(CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질(SU5402, 5μM)을 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에 1％ N2 supplement가 첨가된 배지)에서 37℃, 5％ CO2로, 3 내지 4일간 배양하였다. 그 후, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(DMEM/F12 배지에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 supplement, 0.5μM 레티노산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)에서 장기 배양하였다. 2 내지 4일에 1회 상기 혈청 배지로, 절반량 배지 교환하였다. 부유 배양 개시 후 58 내지 65일째에, 얻어진 입체 망막 조직을 잘라내고, 주사기를 사용하여 시세포 변성 모델인 망막 변성 래트의 망막 아래에 이식하였다. 이식 후 분화 240 내지 270일 상당 령에 눈 조직을 PFA 고정하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 조직 절편을 제작하였다. 면역 염색에 의해, 항핵 항체(상품명: Anti-Nuclei, Millipore사제), 항Chx10 항체(상품명: Chx10 Antibody, EXalpha사제) 및 항Pax6 항체(상품명: Anti Pax6 antibody, Covance사제)를 사용하여, 각각 조직 절편 중의 인간 세포, 쌍극 세포 및 아마크린 세포를 염색하고, 이식 후의 그래프트를 평가하였다. Islet-1 유전자를 결실하지 않은(와일드 타입) 망막 조직 및 Islet-1 유전자를 결실시킨 망막 조직을, 각각 3 슬라이드씩 염색하고, 1 슬라이드에 대하여 2군데 촬영하였다.
염색한 조직에 대하여, 공초점 현미경(상품명: TCS SP8, 라이카사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하고, 3 절편 2군데의, 이식편 중 인간 세포 유래의 쌍극 세포 및 아마크린 세포의 비율을 조사하였다. 그의 대표적 사진을 도 9a에 나타낸다. 도 9a로부터, 와일드 타입의 망막 조직을 이식한 경우에 비해, Islet-1 유전자 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우에는, Chx10 양성 세포(즉 쌍극 세포)의 비율이 감소하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 그 비율을 수치화한 그래프를 도 9b에 나타낸다. 도 9b로부터도 동일한 결과가 확인되었다. 즉, Islet-1 유전자를 결실하지 않은 망막 조직을 이식한 경우에 비해, Islet-1 유전자를 결실시킨 망막 조직을 이식한 경우에는, 전체 인간 세포에 대한, 아마크린 세포(Am)의 비율은 거의 변함없는 것에 비해, 쌍극 세포(Bp)의 비율이 감소하고 있는 것을 알았다. 이식편 유래(인간 유래)의 쌍극 세포의 비율 감소에 의해, 이식편 유래의 시세포와 호스트측(마우스측)의 쌍극 세포의 접촉의 비율이 향상되어, 해당 망막 조직의 이식 후의 기능적 생착이 개선되어 있는 것이 시사되었다.
본 발명에 따르면, 이식에 적합한 망막 조직을 얻는 것이 가능해진다.
SEQUENCE LISTING <110> Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. RIKEN <120> Cell population for transplantation and method for producing same <130> FP17-0626-00 <150> JP2016-229355 <151> 2016-11-25 <150> JP2017-138142 <151> 2017-7-14 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11607 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaaggaagag gaagaggagg agagggaggc cagagccaga acagcccggc agcccgagct 60 tcgggggaga acggcctgag ccccgagcaa gttgcctcgg gagccctaat cctctcccgc 120 tggctcgccg agcggtcagt ggcgctcagc ggcggcgagg ctgaaatatg ataatcagaa 180 cagctgcgcc gcgcgccctg cagccaatgg gcgcggcgct cgcctgacgt ccccgcgcgc 240 tgcgtcagac caatggcgat ggagctgagt tggagcagag aagtttgagt aagagataag 300 gaagagaggt gcccgagccg cgccgagtct gccgccgccg cagcgcctcc gctccgccaa 360 ctccgccggc ttaaattgga ctcctagatc cgcgagggcg cggcgcagcc gagcagcggc 420 tctttcagca ttggcaaccc caggggccaa tatttcccac ttagccacag ctccagcatc 480 ctctctgtgg gctgttcacc aactgtacaa ccaccatttc actgtggaca ttactccctc 540 ttacagatat gggagacatg ggagatccac caaaaagtaa gaggctattt taccttgtgg 600 ggctcggtgt gctgttcttg tgcggggttc 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cag cag ccc aat gac aaa 1310 Arg Ser Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys 240 245 250 act aat atc cag ggg atg aca gga act ccc atg gtg gct gcc agt cca 1358 Thr Asn Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro 255 260 265 270 gag aga cac gac ggt ggc tta cag gct aac cca gtg gaa gta caa agt 1406 Glu Arg His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser 275 280 285 tac cag cca cct tgg aaa gta ctg agc gac ttc gcc ttg cag agt gac 1454 Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp 290 295 300 ata gat cag cct gct ttt cag caa ctg gtc aat ttt tca gaa gga gga 1502 Ile Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly 305 310 315 ccg ggc tct aat tcc act ggc agt gaa gta gca tca atg tcc tct caa 1550 Pro Gly Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln 320 325 330 ctt cca gat aca cct aac agc atg gta gcc agt cct att gag gca tga 1598 Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala 335 340 345 ggaacattca ttctgtattt 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gagtgacaac tgtattgatg tctactcttc taacaatatc cattcccgcg tgctattgaa 840 gaacgtgctt cacggaaaat atagacatcc cagcgttgct ttaacgcttc tagtcaaaac 900 cttttctttg acatgactta tccataatct tgcctaatga ttatagcaaa gagggaggag 960 ggagaaaaca caaaatgagc gggtttgatt gcgtgctaag cttacaatgt agactattca 1020 aatctgcgtt ttacatatat tccacctccc tttttaaaaa agcgagtcaa ggttttgatg 1080 gcacactcca attaccatcc caaagtgcaa tactctttaa gggaagaaca agaaaaaaaa 1140 aaaaagggaa agaaaaaaat tcttccagaa tacaccctat aagagaacga cactaaaagt 1200 gtgtttatct ctgtaggaag taaacggtta gtcaatcatg catttatttt catttcagaa 1260 aaacgtctga tttccctgtg tgttggttgc ggcaatcaaa ttcacgacca gtatattctg 1320 agggtttctc cggatttgga gtggcatgca gcatgtttga aatgtgcgga gtgtaatcag 1380 tatttggacg aaagctgtac gtgctttgtt agggatggga aaacctactg taaaagagat 1440 tatatcaggt atgccatttt tacagggtta ttttctgaga tttcttggct ctccttgttt 1500 attatttgat gtgcctttgt tttgttttgt tgtttttaga gggagggaga acgtttactt 1560 tagagtgccc agtgtacaag aaatgttttt aaaattaaac tgttgttcat ttcatatctt 1620 tggggggtgg ggtgtcgctg tgtttcataa atttttgttg ataaggtttg ttaatgactc 1680 tttgaatttt tcatacaaaa gattatttcc ctctttaaac ttccctaagg acaacaacaa 1740 aattaaggca aataagttta gggtttcaaa ctttaaaaat tctattttca ctgtatagtt 1800 tatcatctta tttatttttc tcctgtttta tcaatgactt acattatttt gggggctcca 1860 aataaacaga caaaagtttc accaaaggat ttttgaagaa caagtacaaa cattgctccc 1920 tttacttttg gggtgactct tcctttgata aaaaatttta aaaccaaaat aaaatattcc 1980 ttaacgcccc ccccccaaaa aaaaccaccg gaaatttaat ctttttaaat attaaccctt 2040 tggtgatatc taactgcctt ttctttctta tcttatctgg gctgatgaat tagacagagc 2100 agatcaaatt gcccatcatc tgtctgcgaa caattggtat atttaggtaa ttgaacagct 2160 tcctttctca cattaaaatc tagtaactga taaaatgagg gaatcagctg acggacaaga 2220 ccaaaaccag ggaggaggat ctgagctggc ttttgttgca cttttttttt tttcctaatt 2280 tcaagtttct ctgacctacc agtttatatc agaaacttga ctttctacct tagaaagcct 2340 ggtagaattt ctaaaggaaa atgtgtttgt tctaatacaa agcaagatac tgttcccctt 2400 cactgttagg ctggcgatgg cagaaatgta gccgatttta gatttcagag gtggccattg 2460 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ccccagtttt ggcaaccccg ggggccacta tttgccacct 180 agccacagca ccagcatcct ctctgtgggc tattcaccaa ttgtccaacc accatttcac 240 tgtggacatt actccctctt acagat atg gga gac atg ggc gat cca cca aaa 293 Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys 1 5 aaa aaa cgt ctg att tcc ctg tgt gtt ggt tgc ggc aat caa att cac 341 Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His 10 15 20 25 gac cag tat att ctg agg gtt tct ccg gat ttg gag tgg cat gca gca 389 Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala 30 35 40 tgt ttg aaa tgt gcg gag tgt aat cag tat ttg gac gaa agc tgt acg 437 Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr 45 50 55 tgc ttt gtt agg gat ggg aaa acc tac tgt aaa aga gat tat atc agg 485 Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg 60 65 70 ttg tac ggg atc aaa tgc gcc aag tgc agc ata ggc ttc agc aag aac 533 Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn 75 80 85 gac ttc gtg atg cgt gcc cgc tct aag gtg tac cac atc gag tgt ttc 581 Asp Phe Val Met Arg Ala Arg Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe 90 95 100 105 cgc tgt gta gcc tgc agc cga cag ctc atc ccg gga gac gaa ttc gcc 629 Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala 110 115 120 ctg cgg gag gat ggg ctt ttc tgc cgt gca gac cac gat gtg gtg gag 677 Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu 125 130 135 aga gcc agc ctg gga gct gga gac cct ctc agt ccc ttg cat cca gcg 725 Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala 140 145 150 cgg cct ctg caa atg gca gcc gaa ccc atc tcg gct agg cag cca gct 773 Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala 155 160 165 ctg cgg ccg cac gtc cac aag cag ccg gag aag acc acc cga gtg cgg 821 Leu Arg Pro His Val His Lys Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg 170 175 180 185 act gtg ctc aac gag aag cag ctg cac acc ttg cgg acc tgc tat gcc 869 Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala 190 195 200 gcc aac cct cgg cca gat gcg ctc atg aag gag caa cta gtg gag atg 917 Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met 205 210 215 acg ggc ctc agt ccc aga gtc atc cga gtg tgg ttt caa aac aag cgg 965 Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg 220 225 230 tgc aag gac aag aaa cgc agc atc atg atg aag cag ctc cag cag cag 1013 Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln 235 240 245 caa ccc aac gac aaa act aat atc cag ggg atg aca gga act ccc atg 1061 Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met 250 255 260 265 gtg gct gct agt ccg gag aga cat gat ggt ggt tta cag gct aac cca 1109 Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro 270 275 280 gta gag gtg caa agt tac cag ccg ccc tgg aaa gta ctg agt gac ttc 1157 Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe 285 290 295 gcc ttg caa agc gac ata gat cag cct gct ttt cag caa ctg gtc aat 1205 Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn 300 305 310 ttt tca gaa gga gga cca ggc tct aat tct act ggc agt gaa gta gca 1253 Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala 315 320 325 tcg atg tcc tcg cag ctc cca gat aca ccc aac agc atg gta gcc agt 1301 Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser 330 335 340 345 cct att gag gca tga ggaacattca ttcagatgtt ttgttttgtt ttgttttgtt 1356 Pro Ile Glu Ala tttttcccct gttggagaaa gtgggaaatg acgttgaact ccgaaataaa aagtatttaa 1416 cgacccagtc aatggaaact gaatcaagaa atgaacgctc caggaagcgc atgaagtctg 1476 ttctaatgac aaagtgatat ggtagcaaca ctgtgaagac aatcatggga ttttactaga 1536 ataaaaacaa acaaacaaac aaaaccctaa gcccaacata tgctattcaa tgaccttagg 1596 agtacttaaa aaagaaaaag aaaaaaaaaa gagagagaga ccgtttttaa aacgtagagg 1656 atttatattc aaggatctca aaaaatgcgc gttttcattt cactgcacat ctagaggaag 1716 agcagaaaca gagaatttcc tagtccatcc tattctgaat ggtgctgttt ctatattggt 1776 cactgccttg ccaaacagga gctccggcac agagcggaag aaaccagcct cagtgacttg 1836 aaagtgtcct ttcaggaagg cggagctgcg ttggtttgca atgtttttag ttgactttga 1896 caaggggtta cgtgaaattc tgggtctctt aagcatgccc tgtagctggt ttctctttta 1956 cgtttgcctc tcctcccatc cttttctttc cttttcttta tttctcttta caattttttt 2016 gagatccatc ctctatcaag aagtctgaag cgactttaaa ggtttttaaa tttgtattta 2076 aaaaccaact tataaagcat tgcaacaagg ttacctctat tttgccacaa gcgtctcggg 2136 attgtgtttg actcctgtct gtccaagaac ttttccccca aagatgtgta tagttattgg 2196 ttaaaatgac tgttttcgct ctttctggaa ataaagagga aaaaggaaac tttttttgtt 2256 tgctcttgca ttgcaaaaat tataaaagta atttattatt tattgtcagg agacttgcca 2316 cttttcatgt catttgactt tttttttgtt tgctgaagta aaaagaagat aaaggttgta 2376 ccgtggtctt tgaattatat gtctaagttt atgtgttttg tctttttttt ttctttaaat 2436 attatgtgaa atcaaagcgc catatgtaga attatatctt caggactatt tcactaataa 2496 acgtttggca tagataatta aataaacgca 2526 <210> 6 <211> 349 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val 20 25 30 Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys 35 40 45 Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys 50 55 60 Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala 65 70 75 80 Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn Asp Phe Val Met Arg Ala Arg 85 90 95 Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg 100 105 110 Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe 115 120 125 Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly 130 135 140 Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala 145 150 155 160 Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys 165 170 175 Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln 180 185 190 Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala 195 200 205 Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val 210 215 220 Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser 225 230 235 240 Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn 245 250 255 Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg 260 265 270 His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln 275 280 285 Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp 290 295 300 Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly 305 310 315 320 Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro 325 330 335 Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala 340 345 <210> 7 <211> 5753 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gctagtgcgt gttgacgtca tgctgcgtgc gggccggtgc ggaatcgctc cttcaactcc 60 gcggggcagt aggagttagt tagcaaagag ccgaggccgg gcgcgcgacc ctcgtccttc 120 tgcccctggc cgcacacttt gcgcacatct ctttttctgc atggtggata ttatttttca 180 ttatcctttt ctgggtgcta tgggtgatca ttccaagagt aagtatttct gtgtgtgtgt 240 ggggtggggt gtgtgtgtat gcttaatatg caaaatttct aatgcagaaa aatgtttagt 300 ggattctaca agtggcttct atttgtcaga atagtttagg agaggaaaaa cgaatgcatg 360 tctcctgcag gactgcttat ctttgggaat cctgttgttt tattttataa gtaaacacta 420 tttctcaagc cggctaggat gacttcgggc tgcgaaatct gcttctgttt tgcgcaaagg 480 caattaggtt tgatttaggg atgtgggttt tttttttttt ggttgttgtt tgtttgcctt 540 tcggtttttc aaagctagga agctttcttt cgcttgctct gggatattta aactaagaaa 600 tgtctgagag gatgagcggg gactgccgaa agacgatgtg tctgtgttgg gataggaggc 660 agccgctgtg agtgggagtg tgtgagcgga aatgccagga cagcaccgtt aggtgttgat 720 atccaggcgt ccgcagtgcc tgtgtattta ctctcttctt agtttcgtgt ttgcgtttag 780 tttcaagaca cgtcgacaaa acgactgtca ttaatgaatg taataacgaa atatttgggg 840 tgggggacag aagaaacctt cagcaatcca caagatactg gtttttcgtt tccaatgccc 900 tggaccttta gagagctcat catctttcct tatggtcgca agtcttgaaa gaaagagcaa 960 gagagcgagc gggttgggtt ggggctggag tagccgaggc cggcctgggt ccgggcagtc 1020 aggcctgacg cggccccgcg cccttccccg gcagagaagc ccgggacggc catgtgcgtg 1080 ggctgcggga gtcagatcca cgaccagttt atcctgcggg tgtcgcccga cctcgagtgg 1140 cacgcggcct gcctcaagtg tgccgagtgc agccagtacc tggacgagac gtgcacgtgc 1200 ttcgtgagag acgggaagac ctactgcaag cgggactatg tcaggtgagg ccggcgggaa 1260 cgcgggctgg gccaccgcgc gcaggggccg gggccgggac tggggatggc ggcctgcccg 1320 cgcgccccgg ccctgcccag ggagaaggcc atccgcatcc cgcacgggtg ccgcagcgct 1380 cccccgggcc cgggaatgcc cgcaggcggg tcaccgcagt ctcctggtgg ccacaaagtg 1440 tcctgggcgc gcgccggagc cgtagcagcc agggagatga gggcggccgc aggcccagcg 1500 ctgacaccgc cgcaccttgg gcccgcaggc tgttcggcat caagtgcgcc aagtgccagg 1560 tgggcttcag cagcagcgac ctggtgatga gggcgcggga cagcgtgtac cacatcgagt 1620 gcttccgctg ctccgtgtgc agccgccagc tgctgcctgg ggacgagttc tcgctgcggg 1680 agcacgagct gctctgccgc gccgaccacg gcctcctgct cgagcgcgcc gcggccggca 1740 gcccgcgcag ccccggcccg cttcccggcg cccgcggcct gcatctgccc ggtaagcgcg 1800 ccggggcctg tgccggggtg agcggggtgt atgtgcgtgc gtgtgtgtag gggtacgctt 1860 gtgtccctaa cgagaagttg tcagttgtgt gtggttccgt ctgccgggat agtgtttttc 1920 tgtatcagtg cggaactgtg tgctgggaac aaggctgtgt gtattctcgt gtgctcggga 1980 gaaactgcgt gtgtatgagt gtgtgagcac ggagaattgt gcagaatcgt gttctccatg 2040 accaggaaca tgcagggcac agtgctagga gcagaagagt ggatgacaac agggaatctt 2100 aagtggtgtc cgtcttgggg cttgtattag gaatttcttg gaggaatatg tgttattgtc 2160 agagggtaag gtttgcccag gggtatgtgt gtaagtaaca cagctccaaa ctgggagctg 2220 ggcaggagct tggtcagcca ggagccaaga acccaacaaa gaggggtttt tgccatcttg 2280 ttttgaggcc cagtttgatg aacaatttag ccaggttctt ctgggggagg gggagtatca 2340 atgcatagtg gactgtcact ggaatattct gggtcctaat cagcagctgc ccagagatgg 2400 ggtctgagtg tataatgggc aggtacggct gaacagaaac agaggtgcct ccaccccagg 2460 caaggcagtt tcccccaggt agccataggc ctgcagcaca gatccgtaga ccaggctggg 2520 cctctgggtg ctgtgtggcc ttgccccgct cctcccctct ctggatcttc acttcctccc 2580 tatagaaaga ggaaactggg ctggatgggc tatttgtaaa tatttgtcca gacctagaaa 2640 ttcgtagagg ggaacataaa ccgaaatggt gcagtacaga tccacggtat atatgggtcg 2700 ggatcaaatg gagatgtgaa atgggagcaa gcgggtattc agtgcacccc catctgggat 2760 ctcggagagg ctcccctttg tttgtttcgg gcttcagggt gcaggctctg gaatcagtca 2820 ctgtttcccc gggatggaga gaacctgggg ccaagcgagg agagtgccag cggctgctca 2880 gcaccttggt cggtgggagg ccactgggct ggggaacctg gagccttgag gaaggagaca 2940 ggggccgaag cccaagggcg ggcaggaagg aactgttgca agccctggag gcccgtccat 3000 aaccgtggat gagtcttcta cacatgtggc ctggccctgt ccaaatgggc tctgaaggag 3060 gggaagggcc ctcgtaggcc cccggcatat tcgcacctcc cacccagtcc cctgggcagc 3120 gcctcgccct gggtccacgt cggtcccttt ccctctccag agtcctgggc aagcctcttt 3180 cctcttcctc tgaaactccg acttcttccg gagggcttcg ctcgttccga gggtcctgcg 3240 actggaggag gcacatccct gagcagccac tccctccccg cagcggcctg tcgccgagct 3300 cccgcgccct gcttgagctc gggagagatc gctgcggggc agtccggccc gggagcgaga 3360 gaaagaacga aaatgcacag ctctctccga gtaaggcgaa cagatggaga ggaagacgaa 3420 caattaaacg aaacaaacag aataaaacag aaacgaaatc gggccccggg gggctgggcc 3480 acccggaggt tgggctcggg gcgggtgggt ggcggcccct cgctaacctc tggcctcacc 3540 ctgtcctggc agacgctggg tcgggccggc agcccgcgtt gcgcccgcac gtgcacaagc 3600 agacggagaa gacgacccgc gtgcggactg tgctgaacga gaagcagctg cacactctgc 3660 ggacctgcta cgccgccaac ccgcggcccg acgctctcat gaaggagcag ctggtggaga 3720 tgaccggcct gagcccgcgg gtcatccgcg tctggttcca gaacaagcgc tgcaaggaca 3780 agaagaaatc cattctcatg aagcagctgc agcagcagca gcacagcgac aagacggtga 3840 gcagccgctg ggccggaggc tcgagtcggg tgggggctgc gcttccgccg cggtatctgc 3900 gtgccctttt ctgggcgagc cctgggagat ccagggagaa ctgggcgctc cagatggtgt 3960 atgtctgtac cttcacagca aggcttccct tggatttgag gcttcctatt ttgtctggga 4020 tcggggtttc tccttgtccc agtggcagcc ccgcgttgcg ggttccgggc gctgcgcgga 4080 gcccaaggct gcatggcagt gtgcagcgcc cgccagtcgg gctggtgggt tgtgcactcc 4140 gtcggcagct gcagaaaggt gggagtgcag gtcttgcctt tcctcaccgg gcggttggct 4200 tccagcaccg aggctgacct atcgtggcaa gtttgcggcc cccgcagatc cccagtggag 4260 aaagagggct cttccgatgc gatcgagtgt gcgcctcccc gcaaagcaat gcagacccta 4320 aatcactcaa ggcctggagc tccagtctca aaggtggcag aaaaggccag acctaactcg 4380 agcacctact gccttctgct tgccccgcag agccttcagg gactgactgg gacgcccctg 4440 gtggcgggca gtcccatccg ccatgagaac gccgtgcagg gcagcgcagt ggaggtgcag 4500 acgtaccagc cgccgtggaa ggcgctcagc gagtttgccc tccagagcga cctggaccaa 4560 cccgccttcc aacagctggt gaggccctgc cctacccgcc ccgacctcgg gactctgcgg 4620 gttggggatt tagccactta gcctggcaga gaggggaggg ggtggccttg ggctgagggg 4680 ctgggtacag ccctaggcgg tgggggaggg ggaacagtgg cgggctctga aacctcacct 4740 cggcccatta cgcgccctaa accaggtctc cctggattaa agtgctcaca agagaggtcg 4800 caggattaac caacccgctc ccccgcccta atccccccct cgtgcgcctg gggacctggc 4860 ctccttctcc gcagggcttg ctctcagctg gcggccggtc cccaagggac actttccgac 4920 tcggagcacg cggccctgga gcaccagctc gcgtgcctct tcacctgcct cttcccggtg 4980 tttccgccgc cccaggtctc cttctccgag tccggctccc taggcaactc ctccggcagc 5040 gacgtgacct ccctgtcctc gcagctcccg gacaccccca acagtatggt gccgagtccc 5100 gtggagacgt gagggggacc cctccctgcc agcccgcgga cctcgcatgc tccctgcatg 5160 agactcaccc atgctcaggc cattccagtt ccgaaagctc tctcgccttc gtaattattc 5220 tattgttatt tatgagagag taccgagaga cacggtctgg acagcccaag gcgccaggat 5280 gcaacctgct ttcaccagac tgcagacccc tgctccgagg actcttagtt tttcaaaacc 5340 agaatctggg acttaccagg gttagctctg ccctctcctc tcctctctac gtggccgccg 5400 ctctgtctct ccacgcccca cctgtgtccc catctcggcc ggcccggagc tcgcccacgc 5460 ggacccccgc cctgccccag ctcagcgctc cctggcggct tcgcccgggc tcctagcggg 5520 gaaaaggaag gggataactc agaggaacag acactcaaac tcccaaagcg catgattgct 5580 gggaaacagt agaaaccaga cttgccttga aagtgtttaa gttattcgac ggaggacaga 5640 gtatgtgagc ctttgccgaa caaacaaacg taagttattg ttatttattg tgagaacagc 5700 cagttcatag tgggacttgt attttgatct taataaaaaa taataacccg ggg 5753 <210> 8 <211> 1918 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (161)..(1240) <400> 8 gctagtgcgt gttgacgtca tgctgcgtgc gggccggtgc ggaatcgctc cttcaactcc 60 gcggggcagt aggagttagt tagcaaagag ccgaggccgg gcgcgcgacc ctcgtccttc 120 tgcccctggc cgcacacttt gcgcacatct ctttttctgc atg gtg gat att att 175 Met Val Asp Ile Ile 1 5 ttt cat tat cct ttt ctg ggt gct atg ggt gat cat tcc aag aag aag 223 Phe His Tyr Pro Phe Leu Gly Ala Met Gly Asp His Ser Lys Lys Lys 10 15 20 ccc ggg acg gcc atg tgc gtg ggc tgc ggg agt cag atc cac gac cag 271 Pro Gly Thr Ala Met Cys Val Gly Cys Gly Ser Gln Ile His Asp Gln 25 30 35 ttt atc ctg cgg gtg tcg ccc gac ctc gag tgg cac gcg gcc tgc ctc 319 Phe Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu 40 45 50 aag tgt gcc gag tgc agc cag tac ctg gac gag acg tgc acg tgc ttc 367 Lys Cys Ala Glu Cys Ser Gln Tyr Leu Asp Glu Thr Cys Thr Cys Phe 55 60 65 gtg aga gac ggg aag acc tac tgc aag cgg gac tat gtc agg ctg ttc 415 Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Val Arg Leu Phe 70 75 80 85 ggc atc aag tgc gcc aag tgc cag gtg ggc ttc agc agc agc gac ctg 463 Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Gln Val Gly Phe Ser Ser Ser Asp Leu 90 95 100 gtg atg agg gcg cgg gac agc gtg tac cac atc gag tgc ttc cgc tgc 511 Val Met Arg Ala Arg Asp Ser Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys 105 110 115 tcc gtg tgc agc cgc cag ctg ctg cct ggg gac gag ttc tcg ctg cgg 559 Ser Val Cys Ser Arg Gln Leu Leu Pro Gly Asp Glu Phe Ser Leu Arg 120 125 130 gag cac gag ctg ctc tgc cgc gcc gac cac ggc ctc ctg ctc gag cgc 607 Glu His Glu Leu Leu Cys Arg Ala Asp His Gly Leu Leu Leu Glu Arg 135 140 145 gcc gcg gcc ggc agc ccg cgc agc ccc ggc ccg ctt ccc ggc gcc cgc 655 Ala Ala Ala Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Pro Leu Pro Gly Ala Arg 150 155 160 165 ggc ctg cat ctg ccc gac gct ggg tcg ggc cgg cag ccc gcg ttg cgc 703 Gly Leu His Leu Pro Asp Ala Gly Ser Gly Arg Gln Pro Ala Leu Arg 170 175 180 ccg cac gtg cac aag cag acg gag aag acg acc cgc gtg cgg act gtg 751 Pro His Val His Lys Gln Thr Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val 185 190 195 ctg aac gag aag cag ctg cac act ctg cgg acc tgc tac gcc gcc aac 799 Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn 200 205 210 ccg cgg ccc gac gct ctc atg aag gag cag ctg gtg gag atg acc ggc 847 Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly 215 220 225 ctg agc ccg cgg gtc atc cgc gtc tgg ttc cag aac aag cgc tgc aag 895 Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys 230 235 240 245 gac aag aag aaa tcc att ctc atg aag cag ctg cag cag cag cag cac 943 Asp Lys Lys Lys Ser Ile Leu Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln His 250 255 260 agc gac aag acg agc ctt cag gga ctg act ggg acg ccc ctg gtg gcg 991 Ser Asp Lys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Thr Gly Thr Pro Leu Val Ala 265 270 275 ggc agt ccc atc cgc cat gag aac gcc gtg cag ggc agc gca gtg gag 1039 Gly Ser Pro Ile Arg His Glu Asn Ala Val Gln Gly Ser Ala Val Glu 280 285 290 gtg cag acg tac cag ccg ccg tgg aag gcg ctc agc gag ttt gcc ctc 1087 Val Gln Thr Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Ala Leu Ser Glu Phe Ala Leu 295 300 305 cag agc gac ctg gac caa ccc gcc ttc caa cag ctg gtc tcc ttc tcc 1135 Gln Ser Asp Leu Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Ser Phe Ser 310 315 320 325 gag tcc ggc tcc cta ggc aac tcc tcc ggc agc gac gtg acc tcc ctg 1183 Glu Ser Gly Ser Leu Gly Asn Ser Ser Gly Ser Asp Val Thr Ser Leu 330 335 340 tcc tcg cag ctc ccg gac acc ccc aac agt atg gtg ccg agt ccc gtg 1231 Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Pro Ser Pro Val 345 350 355 gag acg tga gggggacccc tccctgccag cccgcggacc tcgcatgctc 1280 Glu Thr cctgcatgag actcacccat gctcaggcca ttccagttcc gaaagctctc tcgccttcgt 1340 aattattcta ttgttattta tgagagagta ccgagagaca cggtctggac agcccaaggc 1400 gccaggatgc aacctgcttt caccagactg cagacccctg ctccgaggac tcttagtttt 1460 tcaaaaccag aatctgggac ttaccagggt tagctctgcc ctctcctctc ctctctacgt 1520 ggccgccgct ctgtctctcc acgccccacc tgtgtcccca tctcggccgg cccggagctc 1580 gcccacgcgg acccccgccc tgccccagct cagcgctccc tggcggcttc gcccgggctc 1640 ctagcgggga aaaggaaggg gataactcag aggaacagac actcaaactc ccaaagcgca 1700 tgattgctgg gaaacagtag aaaccagact tgccttgaaa gtgtttaagt tattcgacgg 1760 aggacagagt atgtgagcct ttgccgaaca aacaaacgta agttattgtt atttattgtg 1820 agaacagcca gttcatagtg ggacttgtat tttgatctta ataaaaaata ataacccggg 1880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1918 <210> 9 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Val Asp Ile Ile Phe His Tyr Pro Phe Leu Gly Ala Met Gly Asp 1 5 10 15 His Ser Lys Lys Lys Pro Gly Thr Ala Met Cys Val Gly Cys Gly Ser 20 25 30 Gln Ile His Asp Gln Phe Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp 35 40 45 His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys Ser Gln Tyr Leu Asp Glu 50 55 60 Thr Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp 65 70 75 80 Tyr Val Arg Leu Phe Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Gln Val Gly Phe 85 90 95 Ser Ser Ser Asp Leu Val Met Arg Ala Arg Asp Ser Val Tyr His Ile 100 105 110 Glu Cys Phe Arg Cys Ser Val Cys Ser Arg Gln Leu Leu Pro Gly Asp 115 120 125 Glu Phe Ser Leu Arg Glu His Glu Leu Leu Cys Arg Ala Asp His Gly 130 135 140 Leu Leu Leu Glu Arg Ala Ala Ala Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Pro 145 150 155 160 Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu His Leu Pro Asp Ala Gly Ser Gly Arg 165 170 175 Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys Gln Thr Glu Lys Thr Thr 180 185 190 Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr 195 200 205 Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu 210 215 220 Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln 225 230 235 240 Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Lys Ser Ile Leu Met Lys Gln Leu 245 250 255 Gln Gln Gln Gln His Ser Asp Lys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Thr Gly 260 265 270 Thr Pro Leu Val Ala Gly Ser Pro Ile Arg His Glu Asn Ala Val Gln 275 280 285 Gly Ser Ala Val Glu Val Gln Thr Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Ala Leu 290 295 300 Ser Glu Phe Ala Leu Gln Ser Asp Leu Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln 305 310 315 320 Leu Val Ser Phe Ser Glu Ser Gly Ser Leu Gly Asn Ser Ser Gly Ser 325 330 335 Asp Val Thr Ser Leu Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met 340 345 350 Val Pro Ser Pro Val Glu Thr 355 <210> 10 <211> 1057 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tgattggaca gcagcgaggt cccaccgggc gcctccgcgg cttaaaaccg aagcgggggc 60 gagggggagg tagagcccgc cccctgcgcg tcgcggctgg gagggagagg aggtgggaga 120 gaaggaagag gcggaggagg cagcgggcgc cgaggctctg ggacccgcag gcaagccaga 180 ccgacgcgca gagccgggag cctcatcgca gcggcagcgg cagcggcggg ctcgggccgg 240 cctcgggggc tgctcaccca catgagcatc cgcccacccg gcgagccccc gagcccaggc 300 ggcgcggcca tggccgagct caagtcgctg tcgggggacg cgtacctggc actaagccac 360 ggctacgcgg cggcggctgc gggtctcgcc tacggggcgg cgcgagaacc cgaagcggcc 420 cgcggctacg gcactccggg cccgggcggc gacctccccg cggcgcctgc acctcgcgcc 480 ccagctcagg cggcggagag cagcggcgaa cagagcgggg acgaggacga cgccttcgag 540 cagcggcggc ggcggcgcgg gccagggagc gcggcggacg ggcggcggcg gccgcgagag 600 cagcggtctc tgcggctcag catcaacgcg cgcgagcggc ggcgcatgca cgacctaaac 660 gacgcgctgg acgggctgcg agccgtcatc ccctacgcgc acagcccgtc ggtgcgcaag 720 ctctccaaga tcgccacgct gctgctcgcc aagaactata tcctcatgca ggcgcaggcc 780 ctggacgaga tgcggcgcct ggtggccttc ctcaaccagg gccagggcct ggccgcgccc 840 gtaaacgccg cgcccttgac gcccttcggc caggccactg tgtgcccctt ctccgcaggc 900 gccgccctgg ggccctgccc tgacaagtgc gccgccttct ccgggacgcc ctccgcgctt 960 tgcaaacact gtcacgagaa gccgtgaccg cgcgggcccc cggccctccc gcacgcgtcc 1020 tccgatcgcc cctgtgactg tctctctgcc cggacag 1057 <210> 11 <211> 1057 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (262)..(987) <400> 11 tgattggaca gcagcgaggt cccaccgggc gcctccgcgg cttaaaaccg aagcgggggc 60 gagggggagg tagagcccgc cccctgcgcg tcgcggctgg gagggagagg aggtgggaga 120 gaaggaagag gcggaggagg cagcgggcgc cgaggctctg ggacccgcag gcaagccaga 180 ccgacgcgca gagccgggag cctcatcgca gcggcagcgg cagcggcggg ctcgggccgg 240 cctcgggggc tgctcaccca c atg agc atc cgc cca ccc ggc gag ccc ccg 291 Met Ser Ile Arg Pro Pro Gly Glu Pro Pro 1 5 10 agc cca ggc ggc gcg gcc atg gcc gag ctc aag tcg ctg tcg ggg gac 339 Ser Pro Gly Gly Ala Ala Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp 15 20 25 gcg tac ctg gca cta agc cac ggc tac gcg gcg gcg gct gcg ggt ctc 387 Ala Tyr Leu Ala Leu Ser His Gly Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu 30 35 40 gcc tac ggg gcg gcg cga gaa ccc gaa gcg gcc cgc ggc tac ggc act 435 Ala Tyr Gly Ala Ala Arg Glu Pro Glu Ala Ala Arg Gly Tyr Gly Thr 45 50 55 ccg ggc ccg ggc ggc gac ctc ccc gcg gcg cct gca cct cgc gcc cca 483 Pro Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Arg Ala Pro 60 65 70 gct cag gcg gcg gag agc agc ggc gaa cag agc ggg gac gag gac gac 531 Ala Gln Ala Ala Glu Ser Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Asp 75 80 85 90 gcc ttc gag cag cgg cgg cgg cgg cgc ggg cca ggg agc gcg gcg gac 579 Ala Phe Glu Gln Arg Arg Arg Arg Arg Gly Pro Gly Ser Ala Ala Asp 95 100 105 ggg cgg cgg cgg ccg cga gag cag cgg tct ctg cgg ctc agc atc aac 627 Gly Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn 110 115 120 gcg cgc gag cgg cgg cgc atg cac gac cta aac gac gcg ctg gac ggg 675 Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly 125 130 135 ctg cga gcc gtc atc ccc tac gcg cac agc ccg tcg gtg cgc aag ctc 723 Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu 140 145 150 tcc aag atc gcc acg ctg ctg ctc gcc aag aac tat atc ctc atg cag 771 Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln 155 160 165 170 gcg cag gcc ctg gac gag atg cgg cgc ctg gtg gcc ttc ctc aac cag 819 Ala Gln Ala Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Val Ala Phe Leu Asn Gln 175 180 185 ggc cag ggc ctg gcc gcg ccc gta aac gcc gcg ccc ttg acg ccc ttc 867 Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val Asn Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe 190 195 200 ggc cag gcc act gtg tgc ccc ttc tcc gca ggc gcc gcc ctg ggg ccc 915 Gly Gln Ala Thr Val Cys Pro Phe Ser Ala Gly Ala Ala Leu Gly Pro 205 210 215 tgc cct gac aag tgc gcc gcc ttc tcc ggg acg ccc tcc gcg ctt tgc 963 Cys Pro Asp Lys Cys Ala Ala Phe Ser Gly Thr Pro Ser Ala Leu Cys 220 225 230 aaa cac tgt cac gag aag ccg tga ccgcgcgggc ccccggccct cccgcacgcg 1017 Lys His Cys His Glu Lys Pro 235 240 tcctccgatc gcccctgtga ctgtctctct gcccggacag 1057 <210> 12 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ser Ile Arg Pro Pro Gly Glu Pro Pro Ser Pro Gly Gly Ala Ala 1 5 10 15 Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp Ala Tyr Leu Ala Leu Ser 20 25 30 His Gly Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Tyr Gly Ala Ala Arg 35 40 45 Glu Pro Glu Ala Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Pro Gly Pro Gly Gly Asp 50 55 60 Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Arg Ala Pro Ala Gln Ala Ala Glu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Asp Ala Phe Glu Gln Arg Arg 85 90 95 Arg Arg Arg Gly Pro Gly Ser Ala Ala Asp Gly Arg Arg Arg Pro Arg 100 105 110 Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg 115 120 125 Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro 130 135 140 Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu 145 150 155 160 Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln Ala Gln Ala Leu Asp Glu 165 170 175 Met Arg Arg Leu Val Ala Phe Leu Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala 180 185 190 Pro Val Asn Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe Gly Gln Ala Thr Val Cys 195 200 205 Pro Phe Ser Ala Gly Ala Ala Leu Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala 210 215 220 Ala Phe Ser Gly Thr Pro Ser Ala Leu Cys Lys His Cys His Glu Lys 225 230 235 240 Pro <210> 13 <211> 2520 <212> DNA <213> Mouse <400> 13 agagcggccc cggccggcca cgcgccttgg tgagaaggcg caggaagggt ggccggccgg 60 agaggccacg cgcaggcccg gggactgaca gacagctgga caggtggacg cgcccgcagg 120 gcaagaagcc atactgccgt agcgggctcc agaggtcatg gccgagctca agtcgctgtc 180 gggggactcg tacctggcgc tgagccacag ctacacggcg accggccacg cctacgctgc 240 agcgcgcgga ccggagacca cacgcggctt cggtgcatcg ggtccgggtg gcgacctccc 300 ggcggctccc gcttctcgtg tccccgccgc gacggtggag agcagcggcg agcagagcgg 360 cgacgaggac gaagccttcg agaggcggcg gcggcggcga gggtccgggg ttgcggttga 420 cgcacggcgg cggccccggg agcagcgctc gctgaggctc agcatcaacg cgcgcgaacg 480 gcgacgcatg catgacctga acgacgcgct ggacggactg cgcgcagtca tcccctacgc 540 gcacagcccg tcggtgcgca agctctccaa gatagccaca cttctgctgg ccaaaaacta 600 catcctcatg caggcgcagg ccctggagga gatgcggcgc ttggtagcat acctcaacca 660 aggccagggc ctcgcggcgc cggtggccgc cgcgcctcta acgccctttg gccaggcagc 720 gatttacccg ttctcggcgg gcaccgcgct cgggccctgc ccagacaagt gtgccacctt 780 ctcaggatcg ccctcggcgc tttgcaaaca ctgcggcgag aagccctgag ggctccgatc 840 ccctctgcag ccgcctttct atttagactg ttccctgtcc tcgctggcgg gactctatga 900 gaaagcccag tactccgctt acagaactgt tgggtgcaga atgagaagtc cgtctgagaa 960 agccagagag ttggcgctgg actctagacc ctgccgcatc cactgaacta tctcagctaa 1020 aaggctacgg gagtgagcag ttagtgaatg gtcccacatc tgacaggtga ctgcccaagg 1080 ctcaggagcg caggcacaga gcatcgcgct tgaccacatc ctagcgttgg atggggaacc 1140 cagccccttc taagccaact tgcagggcct tgcttgcttc aactagacct gttcctcagg 1200 acgggtgcgg cccctcacct cgggcctctg ttggctccaa gactccagac ccggcctaaa 1260 agcaaaatta cgccgaggtc ctttggagag gtcgtggagg cagacgcagg aagatcccag 1320 gaggtgagct ttacaacgtt ttccaagtct gagcttgttc tgttaacatt cttgcctgcc 1380 cagaggctca ggaaattcaa gccagcctca aaagtctgtg gaaacatctc taaataagcc 1440 tggagcgcca ccgccggcct cctgtgggct gagctgggtt tcacttcttt ctacttgtcc 1500 caaggggact ggtggagccc tcacaacctg ctcagggcta cttgaccctg gagggtcagc 1560 cgaagagtct agtctagctc caggaccaac caagtcccct ctgcgccagt tcgggaactt 1620 ctggaggaag ccgggctacc ggtgagtacc cggtgaggtg ttggactgaa tgggaactgg 1680 tcgctcccca aatcggacca cagcccagaa tcctgccact gtacctagtc tgagccttag 1740 cccgcgcgtc tcagatgttg cctggttttc ctctgtggcc atcagcagct tccgcctcca 1800 tttacccagt tttcttggct ttcattgatg caaagcaaat cgggagaggg ccactgctca 1860 gcaaagcgcc tgtctatagc gcttaacttg aattaacgca ttggaaaagg cccttttgta 1920 tttgcaaaat gacgtgtgtg attaagtctt attcataaag acgtatgctt aatactggtt 1980 tctgctaatt tctatttttt atttcttaag tgtctttccc ctcccctaaa ataatctatt 2040 ttgcacattt caaaacagac tgtttttcaa gttcgcttaa gatgaacagg gaaaactgga 2100 aactcaagtg ttgttagctc tggggtcatt acccactatt atttttcaaa gtcttttatt 2160 tatatttaga cgaggggtag tgtgcagaat aaagtactta aaacttattt ttttaaaaat 2220 atgattaaaa tttaatatca aattaagtgt acatctatga tttgattcat aatttcaatt 2280 gtcagacagt gatactggtt tggaatcctt ctacggcccc aagaaatgct gagattttac 2340 aatggatcca tactccatta agagatgtgt gagttcatac gaaaaatgtg taggagtgtt 2400 gggtggagac acaggggtga tcccaacctg caggaggcag agacaggggc atggggattc 2460 tgagaccagc ctgagcaaca cagggaggct ctcttaggac aagaaaacaa ttaactttga 2520 <210> 14 <211> 2520 <212> DNA <213> mouse <220> <221> CDS <222> (158)..(829) <400> 14 agagcggccc cggccggcca cgcgccttgg tgagaaggcg caggaagggt ggccggccgg 60 agaggccacg cgcaggcccg gggactgaca gacagctgga caggtggacg cgcccgcagg 120 gcaagaagcc atactgccgt agcgggctcc agaggtc atg gcc gag ctc aag tcg 175 Met Ala Glu Leu Lys Ser 1 5 ctg tcg ggg gac tcg tac ctg gcg ctg agc cac agc tac acg gcg acc 223 Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Ser His Ser Tyr Thr Ala Thr 10 15 20 ggc cac gcc tac gct gca gcg cgc gga ccg gag acc aca cgc ggc ttc 271 Gly His Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Gly Pro Glu Thr Thr Arg Gly Phe 25 30 35 ggt gca tcg ggt ccg ggt ggc gac ctc ccg gcg gct ccc gct tct cgt 319 Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro Ala Ala Pro Ala Ser Arg 40 45 50 gtc ccc gcc gcg acg gtg gag agc agc ggc gag cag agc ggc gac gag 367 Val Pro Ala Ala Thr Val Glu Ser Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu 55 60 65 70 gac gaa gcc ttc gag agg cgg cgg cgg cgg cga ggg tcc ggg gtt gcg 415 Asp Glu Ala Phe Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Val Ala 75 80 85 gtt gac gca cgg cgg cgg ccc cgg gag cag cgc tcg ctg agg ctc agc 463 Val Asp Ala Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser 90 95 100 atc aac gcg cgc gaa cgg cga cgc atg cat gac ctg aac gac gcg ctg 511 Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu 105 110 115 gac gga ctg cgc gca gtc atc ccc tac gcg cac agc ccg tcg gtg cgc 559 Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg 120 125 130 aag ctc tcc aag ata gcc aca ctt ctg ctg gcc aaa aac tac atc ctc 607 Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu 135 140 145 150 atg cag gcg cag gcc ctg gag gag atg cgg cgc ttg gta gca tac ctc 655 Met Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Met Arg Arg Leu Val Ala Tyr Leu 155 160 165 aac caa ggc cag ggc ctc gcg gcg ccg gtg gcc gcc gcg cct cta acg 703 Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val Ala Ala Ala Pro Leu Thr 170 175 180 ccc ttt ggc cag gca gcg att tac ccg ttc tcg gcg ggc acc gcg ctc 751 Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ile Tyr Pro Phe Ser Ala Gly Thr Ala Leu 185 190 195 ggg ccc tgc cca gac aag tgt gcc acc ttc tca gga tcg ccc tcg gcg 799 Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala Thr Phe Ser Gly Ser Pro Ser Ala 200 205 210 ctt tgc aaa cac tgc ggc gag aag ccc tga gggctccgat cccctctgca 849 Leu Cys Lys His Cys Gly Glu Lys Pro 215 220 gccgcctttc tatttagact gttccctgtc ctcgctggcg ggactctatg agaaagccca 909 gtactccgct tacagaactg ttgggtgcag aatgagaagt ccgtctgaga aagccagaga 969 gttggcgctg gactctagac cctgccgcat ccactgaact atctcagcta aaaggctacg 1029 ggagtgagca gttagtgaat ggtcccacat ctgacaggtg actgcccaag gctcaggagc 1089 gcaggcacag agcatcgcgc ttgaccacat cctagcgttg gatggggaac ccagcccctt 1149 ctaagccaac ttgcagggcc ttgcttgctt caactagacc tgttcctcag gacgggtgcg 1209 gcccctcacc tcgggcctct gttggctcca agactccaga cccggcctaa aagcaaaatt 1269 acgccgaggt cctttggaga ggtcgtggag gcagacgcag gaagatccca ggaggtgagc 1329 tttacaacgt tttccaagtc tgagcttgtt ctgttaacat tcttgcctgc ccagaggctc 1389 aggaaattca agccagcctc aaaagtctgt ggaaacatct ctaaataagc ctggagcgcc 1449 accgccggcc tcctgtgggc tgagctgggt ttcacttctt tctacttgtc ccaaggggac 1509 tggtggagcc ctcacaacct gctcagggct acttgaccct ggagggtcag ccgaagagtc 1569 tagtctagct ccaggaccaa ccaagtcccc tctgcgccag ttcgggaact tctggaggaa 1629 gccgggctac cggtgagtac ccggtgaggt gttggactga atgggaactg gtcgctcccc 1689 aaatcggacc acagcccaga atcctgccac tgtacctagt ctgagcctta gcccgcgcgt 1749 ctcagatgtt gcctggtttt cctctgtggc catcagcagc ttccgcctcc atttacccag 1809 ttttcttggc tttcattgat gcaaagcaaa tcgggagagg gccactgctc agcaaagcgc 1869 ctgtctatag cgcttaactt gaattaacgc attggaaaag gcccttttgt atttgcaaaa 1929 tgacgtgtgt gattaagtct tattcataaa gacgtatgct taatactggt ttctgctaat 1989 ttctattttt tatttcttaa gtgtctttcc cctcccctaa aataatctat tttgcacatt 2049 tcaaaacaga ctgtttttca agttcgctta agatgaacag ggaaaactgg aaactcaagt 2109 gttgttagct ctggggtcat tacccactat tatttttcaa agtcttttat ttatatttag 2169 acgaggggta gtgtgcagaa taaagtactt aaaacttatt tttttaaaaa tatgattaaa 2229 atttaatatc aaattaagtg tacatctatg atttgattca taatttcaat tgtcagacag 2289 tgatactggt ttggaatcct tctacggccc caagaaatgc tgagatttta caatggatcc 2349 atactccatt aagagatgtg tgagttcata cgaaaaatgt gtaggagtgt tgggtggaga 2409 cacaggggtg atcccaacct gcaggaggca gagacagggg catggggatt ctgagaccag 2469 cctgagcaac acagggaggc tctcttagga caagaaaaca attaactttg a 2520 <210> 15 <211> 223 <212> PRT <213> mouse <400> 15 Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Ser 1 5 10 15 His Ser Tyr Thr Ala Thr Gly His Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Gly Pro 20 25 30 Glu Thr Thr Arg Gly Phe Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro 35 40 45 Ala Ala Pro Ala Ser Arg Val Pro Ala Ala Thr Val Glu Ser Ser Gly 50 55 60 Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Glu Ala Phe Glu Arg Arg Arg Arg Arg 65 70 75 80 Arg Gly Ser Gly Val Ala Val Asp Ala Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln 85 90 95 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His 100 105 110 Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala 115 120 125 His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Met Arg 145 150 155 160 Arg Leu Val Ala Tyr Leu Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val 165 170 175 Ala Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ile Tyr Pro Phe 180 185 190 Ser Ala Gly Thr Ala Leu Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala Thr Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Pro Ser Ala Leu Cys Lys His Cys Gly Glu Lys Pro 210 215 220 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Bhlhb4 <400> 16 ccgagctcaa gtcgctgtcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Bhlhb4 <400> 17 cgcgccttgg tgagaaggcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for mouse ISL1 <400> 18 tcttcaatag cacgcgggaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for mouse ISL1 <400> 19 tcctaagcca taaagcgctt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Human ISL1 <400> 20 ccaactccgc cggcttaaat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Human ISL1 <400> 21 gggaggttaa tacttcggag 20

Claims (31)

  1. 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서, 세포 현탁액 또는 세포 응집체의 형태인 이식용 세포 집단.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 전사 제어 인자를 코딩하는 유전자인 이식용 세포 집단.
  4. 제3항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 유전자인 이식용 세포 집단.
  5. 제4항에 있어서, 상기 ISL1 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는 이식용 세포 집단:
    (1) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열,
    (2) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
    (a) DNA 결합능을 갖는 것,
    (b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
    (c) 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
    중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 BHLHE23 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는 이식용 세포 집단:
    (1) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열,
    (2) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
    (a) DNA 결합능을 갖는 것,
    (b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
    (c) 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
    중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자의 개변이 당해 유전자의 결실을 포함하는 이식용 세포 집단.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막계 세포가 다능성 줄기 세포 유래인 이식용 세포 집단.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포인 이식용 세포 집단.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막계 세포가, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는 이식용 세포 집단.
  11. 제10항에 있어서, 상기 망막계 세포가, Chx10 양성 세포, Crx 양성 세포 및 리커버린 양성 세포로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는 이식용 세포 집단.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 이식용 세포 집단에 있어서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계가 전체 세포수의 10％ 이상인 이식용 세포 집단.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시세포, 또는 상기 망막 전구 세포 혹은 상기 시세포 전구 세포로부터 이식 후에 유도되는 시세포의, 이식 후의 기능적 생착율이 개선되는 이식용 세포 집단.
  14. 이식용 세포 집단의 배양물로서,
    (1) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 이식용 세포 집단과,
    (2) 상기 이식용 세포 집단의 생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체
    를 포함하는 배양물.
  15. 하기 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포의 쌍극 세포 제어 유전자를 개변하여, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 개변된 상기 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 얻는 공정,
    (2) 공정 (1)에서 얻어진 상기 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을, 인비트로에서 상기 망막계 세포로 분화 유도하고, 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 얻는 공정.
  16. 제15항에 있어서, 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단이, 세포 현탁액 또는 세포 응집체의 형태인 제조 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 전사 제어 인자를 코딩하는 유전자인 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자가 ISL1 유전자 및 BHLHE23 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 유전자인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 ISL1 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는 제조 방법:
    (1) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열,
    (2) 서열 번호 1, 4 또는 7로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
    (a) DNA 결합능을 갖는 것,
    (b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
    (c) 서열 번호 3, 6 또는 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
    중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 BHLHE23 유전자가 이하의 (1) 또는 (2)로 나타나는 염기 서열을 갖는 제조 방법:
    (1) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열,
    (2) 서열 번호 10 또는 13으로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1 또는 복수의 염기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 염기 서열을 가지며, 또한 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열이며,
    (a) DNA 결합능을 갖는 것,
    (b) 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 것,
    (c) 서열 번호 12 또는 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 것
    중 적어도 하나에 해당하는 단백질을 코딩하는 염기 서열.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 쌍극 세포 제어 유전자의 개변이 당해 유전자의 결실을 포함하는 제조 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 인공 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포인 제조 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막계 세포가, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 망막계 세포가, Chx10 양성 세포, Crx 양성 세포 및 리커버린 양성 세포로부터 선택되는 1 또는 복수의 세포를 포함하는 제조 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 망막계 세포를 포함하는 이식용 세포 집단에 있어서, 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포의 세포수의 합계가 전체 세포수의 10％ 이상인 제조 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시세포, 또는 상기 망막 전구 세포 혹은 상기 시세포 전구 세포로부터 이식 후에 유도되는 시세포의, 이식 후의 기능적 생착율이 개선되는 제조 방법.
  27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 이식용 세포 집단의 유효량을, 이식을 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료 방법.
  28. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 이식용 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료를 위한 의약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 세포 시트의 형태인 의약 조성물.
  30. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 이식용 세포 집단을 함유하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환 또는 망막 조직의 손상 상태의 치료약.
  31. 제30항에 있어서, 세포 시트의 형태인 치료약.
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