JP2023022097A - 移植用細胞集団及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は網膜組織の移植に適した細胞集団及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明は、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を含む、移植用細胞集団及びその製造方法を提供する。【解決手段】双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を含む、移植用細胞集団であって、前記双極細胞制御遺伝子は、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子であり、前記双極細胞制御遺伝子は、該双極細胞制御遺伝子にコードされるタンパク質の機能を消失させるように改変されており、前記網膜系細胞は網膜前駆細胞を含み、前記網膜系細胞は、前記網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を全細胞数の１０％以上含む、移植用細胞集団を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、移植用細胞集団及びその製造方法に関する。

近年、マウス生体の正常な網膜において、適切な分化段階の視細胞前駆細胞を移植すると、機能的に生着することが報告され（非特許文献１）、網膜色素変性等の視細胞の変性疾患に対する移植治療の可能性が示された。

自己組織化培養による多能性幹細胞から立体網膜組織への分化誘導方法が多数報告されており、層構造を有する立体網膜組織を製造し移植することが可能になりつつある。例えば、多能性幹細胞から多層の網膜組織を得る方法（非特許文献２及び特許文献１）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、得られた凝集体を基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することによって、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献３及び特許文献２）、及び、多能性幹細胞の凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することによって網膜組織を得る方法（非特許文献４及び特許文献３）等が報告されている。更に、多能性幹細胞から分化誘導された網膜組織を対象に移植すると、その後、移植片は生着し分化成熟することが報告されている一方、移植片の機能的生着が十分ではないことも報告されている（非特許文献５）。

一方で、生体における網膜組織に含まれる網膜系細胞の発生又は分化に関与する遺伝子がいくつか報告されている。

例えば、ＩＳＬ１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １，Ｉｓｌｅｔ－１）遺伝子は、すい臓、心臓、神経等において発現しており、網膜特異的なＩＳＬ１遺伝子欠失マウスでは、生体内において桿体双極細胞、錐体双極細胞、アマクリン細胞、ガングリオン細胞が変性死することが報告されている（非特許文献６）。

また、ＢＨＬＨＥ２３（ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ ｆａｍｉｌｙ， ｍｅｍｂｅｒ ｅ２３）遺伝子は、すい臓、脳、網膜等において発現しており、ＢＨＬＨＥ２３遺伝子欠失マウスでは、生体内において桿体双極細胞が変性死することが報告されている（非特許文献７）。

国際公開第２０１１／０５５８５５号 国際公開第２０１３／０７７４２５号 国際公開第２０１５／０２５９６７号

Ｎａｔｕｒｅ，４４４，２０３－２０７，（２００６） Ｎａｔｕｒｅ，４７２，５１－５６，（２０１１） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１０（６），７７１－７８５，（２０１２） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６，６２８６，（２０１５） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２，６６２－６７４，（２０１４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２７（４６），１２７０７－２０，（２００７） Ｎｅｕｒｏｎ，４３（６），７７９－９３，（２００４）

本発明が解決しようとする課題は、網膜組織の移植に適した移植用細胞集団及びその製造方法を提供することにある。

本発明者らは、移植片の網膜組織における双極細胞を減少させることで、網膜組織の移植後の機能的生着が改善することを見出した。すなわち、本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、野生型のゲノムを持つ網膜系細胞と比較して、後述する双極細胞制御遺伝子が改変されたゲノムを持つ網膜系細胞は、双極細胞へは十分に分化及び成熟しないが視細胞へは問題なく分化及び成熟すること、及び、上記網膜系細胞を含む移植用細胞集団（網膜組織等）を移植に用いることによって、移植片由来の視細胞とホスト側の双極細胞との接触の割合が向上し、該網膜組織の移植後の機能的生着が改善しうることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に関する。
［１］双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を含む、移植用細胞集団。
［２］細胞懸濁液又は細胞凝集体の形態である、上記［１］に記載の移植用細胞集団。
［３］上記双極細胞制御遺伝子が、転写制御因子をコードする遺伝子である、上記［１］又は［２］に記載の移植用細胞集団。
［４］上記双極細胞制御遺伝子が、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子である、上記［３］に記載の移植用細胞集団。
［５］上記ＩＳＬ１遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、上記［４］に記載の移植用細胞集団：
（１）配列番号１、４又は７で示される塩基配列、
（２）配列番号１、４又は７で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
［６］上記ＢＨＬＨＥ２３遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、上記［４］又は［５］に記載の移植用細胞集団：
（１）配列番号１０又は１３で示される塩基配列、
（２）配列番号１０又は１３で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
［７］上記双極細胞制御遺伝子の改変が当該遺伝子の欠失を含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載の移植用細胞集団。
［８］上記網膜系細胞が、多能性幹細胞由来である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の移植用細胞集団。
［９］上記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、上記［８］に記載の移植用細胞集団。
［１０］上記網膜系細胞が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１又は複数の細胞を含む、上記［１］～［９］のいずれかに記載の移植用細胞集団。
［１１］上記網膜系細胞が、Ｃｈｘ１０陽性細胞、Ｃｒｘ陽性細胞及びリカバリン陽性細胞から選択される１又は複数の細胞を含む、上記［１０］に記載の移植用細胞集団。
［１２］上記移植用細胞集団において、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数の合計が全細胞数の１０％以上である、上記［１０］又は［１１］に記載の移植用細胞集団。
［１３］上記視細胞、又は上記網膜前駆細胞若しくは上記視細胞前駆細胞から移植後に誘導される視細胞の、移植後の機能的生着率が改善される、上記［１０］～［１２］のいずれかに記載の移植用細胞集団。
［１４］移植用細胞集団の培養物であって、
（１）上記［１］～［１３］のいずれかに記載の移植用細胞集団と、
（２）上記移植用細胞集団の生存能力を維持するために必要な媒体と、
を含む、培養物。
［１５］下記工程（１）及び（２）を含む、網膜系細胞を含む移植用細胞集団の製造方法：
（１）多能性幹細胞の双極細胞制御遺伝子を改変して、上記双極細胞制御遺伝子が改変された上記多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで得る工程、
（２）工程（１）で得られた上記多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで上記網膜系細胞に分化誘導し、上記網膜系細胞を含む移植用細胞集団を得る工程。
［１６］上記網膜系細胞を含む移植用細胞集団が、細胞懸濁液又は細胞凝集体の形態である、上記［１５］に記載の製造方法。
［１７］上記双極細胞制御遺伝子が、転写制御因子をコードする遺伝子である、上記［１５］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］上記双極細胞制御遺伝子が、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子である、上記［１７］に記載の製造方法。
［１９］上記ＩＳＬ１遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、上記［１８］に記載の製造方法：
（１）配列番号１、４又は７で示される塩基配列、
（２）配列番号１、４又は７で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
［２０］上記ＢＨＬＨＥ２３遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、上記［１８］又は［１９］に記載の製造方法：
（１）配列番号１０又は１３で示される塩基配列、
（２）配列番号１０又は１３で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
［２１］上記双極細胞制御遺伝子の改変が当該遺伝子の欠失を含む、上記［１５］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］上記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、上記［１５］～［２１］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］上記網膜系細胞が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１又は複数の細胞を含む、上記［１５］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］上記網膜系細胞が、Ｃｈｘ１０陽性細胞、Ｃｒｘ陽性細胞及びリカバリン陽性細胞から選択される１又は複数の細胞を含む、上記［２３］に記載の製造方法。
［２５］上記網膜系細胞を含む移植用細胞集団において、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数の合計が全細胞数の１０％以上である、上記［２３］又は［２４］に記載の製造方法。
［２６］上記視細胞、又は、上記網膜前駆細胞若しくは上記視細胞前駆細胞から移植後に誘導される視細胞の、移植後の機能的生着率が改善される、上記［２３］～［２５］のいずれかに記載の製造方法。
［２７］上記［１］～［１３］のいずれかに記載の移植用細胞集団の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患又は網膜組織の損傷状態の治療方法。
［２８］上記［１］～［１３］のいずれかに記載の移植用細胞集団を有効成分として含有する、網膜組織の障害に基づく疾患又は網膜組織の損傷状態の治療のための医薬組成物。
［２９］細胞シートの形態である、上記［２８］に記載の医薬組成物。
［３０］上記［１］～［１３］のいずれかに記載の移植用細胞集団を含有する、網膜組織の障害に基づく疾患又は網膜組織の損傷状態の治療薬。
［３１］細胞シートの形態である、上記［３０］に記載の治療薬。

本発明によれば、網膜組織の移植に適した移植用細胞集団及びその製造方法を提供することが可能となる。

Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植してから４０～５０日後における移植部位での桿体双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞の割合を示すグラフである。 Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植してから４０～５０日後又は９０～１００日後におけるホスト桿体双極細胞と移植視細胞との接触長の割合を示すグラフである。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植してから４０～５０日後における移植部位での桿体双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞の割合を示すグラフである。 Ｂｈｌｈｂ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植してから３０日目～５０日目における移植部位でのホスト双極細胞と移植視細胞とのシナプス接続を示す写真である。 Ｂｈｌｈｂ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織（分化誘導開始後２９日目の組織）を免疫染色した後の共焦点顕微鏡写真である。 （上段）ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのデザインを示す模式図、（中段）ＩＳＬ１遺伝子の欠失を確認するアガロースゲル電気泳動の写真、及び、（下段）樹立したヒトＥＳ細胞株（ＩＳＬ１遺伝子欠失株）の写真である。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって切断されたＩＳＬ１遺伝子の部位を示す図である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を網膜に分化させたことを示す写真である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株由来の網膜における、視細胞前駆細胞の存在を示す写真である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株由来の網膜において、ＩＳＬ１タンパク質が発現していないことを示す写真である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株由来の網膜が網膜変性ラットに移植された後、生着したことを示す写真である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を分化させた網膜を移植してから２４０～２６０日後における移植部位での双極細胞及びアマクリン細胞の割合を示す写真である。 ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を分化させた網膜を移植してから２４０～２６０日後における移植部位での双極細胞及びアマクリン細胞の割合を示すグラフである。

１．網膜系細胞を含む移植用細胞集団について
本発明の一態様は、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を含む、移植用細胞集団を提供する。野生型のゲノムを持つ網膜系細胞と比較して、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞は、双極細胞へは十分に分化及び成熟しないが、視細胞へは問題なく分化及び成熟する。そのため、上記網膜系細胞を含む移植用細胞集団を移植に用いることによって、移植片由来の視細胞とホスト側の双極細胞との接触の割合が向上し、該網膜組織の移植後の機能的生着が改善しうる。以下詳細に説明する。

１－１．移植用細胞集団
本発明における「移植用細胞集団」とは、移植のために準備され、移植のために用いられる細胞集団を意味する。

本発明における「細胞集団」とは、同一種類の又は異なる種類の細胞が２以上存在している集団を意味する。好ましくは、細胞集団は培地等の媒体中に存在する。細胞集団は、細胞懸濁液及び細胞凝集体を含み、細胞懸濁液又は細胞凝集体の形態であることが好ましい。

本発明における「細胞懸濁液」とは、同一種類の又は異なる種類の複数の細胞を浮遊状態で含む媒体を意味する。浮遊状態とは、好ましくは、媒体中に存在する細胞の大多数（例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上）が、相互に解離し、持続的な物理的接触をすることなく存在している状態をいう。媒体中に存在する細胞の一部（例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下又は５％以下）の細胞は、細胞凝集体等として存在していてもよい。

本発明における「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して塊を形成しているものであれば特に限定はなく、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいう。細胞凝集体は、組織及び細胞シートを含む。

本発明における「細胞シート」とは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層の構造体をいう。細胞シートは、接着培養した細胞又は細胞凝集体から、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて切り出して容易に作製することができる。

本発明における「組織」とは、形態若しくは性質が均一な一種類の細胞、又は、形態若しくは性質が異なる複数種類の細胞が、一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体を意味する。組織としては、例えば、網膜組織が挙げられる。

本発明における「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ又はＲｅｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する一種類又は複数種類の網膜系細胞が、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。

本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。

本発明における「視細胞層」とは、網膜層の１種であり、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）を多く含む（例：視細胞層に存在する視細胞の核の数で７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上）網膜層を意味する。

１－２．網膜系細胞
本発明における「網膜系細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、毛様体周縁部細胞、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。

「成熟した網膜系細胞」とは、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、毛様体周縁部細胞等の分化した細胞を意味する。「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜前駆細胞等）を意味する。

視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞等のいずれの未成熟な網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟した網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。

網膜系細胞の存在は、網膜系細胞のマーカー（以下、「網膜系細胞マーカー」という場合がある。）の発現の有無によって確認することができる。網膜系細胞マーカーの発現の有無、又は細胞集団若しくは組織における網膜系細胞マーカー陽性細胞の割合は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリー、免疫染色等の手法によって特定の網膜系細胞マーカー陽性細胞の数を求め、これを全細胞数で除することにより確認することができる。

網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（「Ｒａｘ」ともいう。）、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、双極細胞で発現するＣｈｘ１０、ＰＫＣα及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するカルレチニン、水平細胞で発現するカルビンジン、成熟視細胞（桿体視細胞及び錐体視細胞）で発現するリカバリン、桿体視細胞で発現するＮｒｌ及びロドプシン、錐体視細胞で発現するＲｘｒ－ｇａｍｍａ、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ、ミュラーグリア細胞で発現するＧＳ及びＧＦＡＰ、網膜色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、毛様体周縁部細胞で発現するＲｄｈ１０及びＳＳＥＡ１等のタンパク質が挙げられる。

「陽性細胞」とは、特定のマーカーを細胞表面上又は細胞内に発現している細胞を意味する。例えば、「Ｃｈｘ１０陽性細胞」とは、Ｃｈｘ１０タンパク質を核内に発現している細胞を意味する。

１－３．双極細胞制御遺伝子
本発明における「双極細胞制御遺伝子」とは、網膜前駆細胞、双極細胞前駆細胞及び／又は双極細胞に発現する遺伝子であって、双極細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、又は視細胞とシナプス形成する機能に関与するが、視細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、及び機能には関与しない遺伝子をいう。したがって、双極細胞制御遺伝子を改変することによって、双極細胞の分化不全、変性死、機能不全等を引き起こすが、視細胞は正常な機能を保つ網膜前駆細胞等を準備することができる。好ましくは、双極細胞制御遺伝子は、双極細胞前駆細胞及び／又は双極細胞において発現し、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞において発現が認められない遺伝子である。

一態様において、双極細胞制御遺伝子は、双極細胞前駆細胞及び／又は双極細胞に発現する遺伝子であって、双極細胞の成熟に関与するが、視細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、及び機能には関与しない遺伝子をいう。好ましくは、双極細胞制御遺伝子は、双極細胞前駆細胞及び／又は双極細胞において発現し、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞において発現が認められない遺伝子である。「双極細胞の成熟」とは、双極細胞前駆細胞から双極細胞に分化が進み、視細胞とのシナプス形成が可能になることを意味する。双極細胞の成熟は、双極細胞のマーカーであるＣｈｘ１０タンパク質、ＰＫＣαタンパク質、Ｌ７等の発現を免疫組織学的解析、フローサイトメトリー等の手法によって確認できる。

一態様において、双極細胞制御遺伝子は、前述の機能（双極細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、又は視細胞とシナプス形成する機能）に関与する転写因子、具体的には当該機能を維持若しくは亢進する転写因子をコードする遺伝子を含む。双極細胞制御遺伝子は、好ましくは転写因子をコードする遺伝子である。

転写因子は、転写制御に関与する機能を持った領域（ドメイン）を含む。例えば、転写因子は特徴的なＤＮＡ結合領域（ホメオドメイン（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）、塩基性ロイシンジッパードメイン（ｂａｓｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｄｏｍａｉｎ）、塩基性ヘリックスループヘリックスドメイン（ｂａｓｉｃ－ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ ｄｏｍａｉｎ）等）を含む。一態様において、転写因子は更に転写制御コファクター結合ドメインを含む。したがって、特定の遺伝子が転写因子をコードする遺伝子であるか否かは、当業者であれば、例えば特徴的なＤＮＡ結合領域を含むか否かによって判断することが可能である。

網膜前駆細胞、双極細胞前駆細胞及び／又は双極細胞に発現する遺伝子は、当業者であれば、周知の方法によって同定できる。一態様において、胎児期又は成体期で、双極細胞又は網膜前駆細胞で発現する遺伝子を、遺伝子発現解析（例えば、マイクロアレイ解析）及び／又は組織学的な解析（例えば、免疫染色解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）で検出することができる。

双極細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、又は視細胞とシナプス形成する機能に関与するが、視細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、及び機能には関与しない遺伝子は、当業者であれば、周知の方法又は公知の情報によって同定できる。一態様において、上記遺伝子が、双極細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、又は視細胞とシナプス形成する機能、並びに、視細胞の分化、成熟、生存、増殖、代謝、及び機能に与える効果を、遺伝子導入法（例．エレクトロポレーション法、リポフェクション法）によって作製した遺伝子改変細胞株及び／又は遺伝子改変動物で検証すればよい。

具体的な一態様として、網膜前駆細胞、双極細胞前駆細胞又は双極細胞に発現する遺伝子を、遺伝子発現解析（例えば、マイクロアレイ解析）によってスクリーニングし、公知の情報（ＩＳＬ１遺伝子等に対する遺伝子配列の相同性、機能、保存された機能ドメイン等）によって、上述の機能に関与する遺伝子を双極細胞制御遺伝子の候補遺伝子として選別することができる。好ましい態様としては、双極細胞前駆細胞又は双極細胞に発現するが視細胞前駆細胞及び視細胞に発現していない遺伝子を、双極細胞制御遺伝子の候補遺伝子として選別する。また、別の好ましい態様としては、転写因子をコードする遺伝子を、双極細胞制御遺伝子の候補遺伝子として選別する。転写因子をコードする遺伝子は、上述の保存されたドメイン等によって選別することができる。これらの双極細胞制御遺伝子の候補遺伝子の選別法を組み合わせることもできる。例えば、双極細胞前駆細胞又は双極細胞において発現するが視細胞前駆細胞及び視細胞に発現していない遺伝子であって、転写因子をコードする遺伝子を、双極細胞制御遺伝子の候補遺伝子として選別することができる。

更に、例えば、選別した遺伝子を改変した多能性幹細胞から網膜組織を製造し、組織学的な解析を行うことによって、双極細胞制御遺伝子であることを検証することができる。

双極細胞制御遺伝子として、例えば、双極細胞の成熟に関与するＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子等の双極細胞に発現する転写因子をコードする遺伝子、並びに、これらの遺伝子と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明における「実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、特定の配列番号で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、特定の配列番号で示される塩基配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は特定の配列番号で示されるアミノ酸配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。本定義に該当しない場合（例：配列同一性が８０％未満）であっても、オルソログ、サブタイプ、アイソフォーム又は変異体であって実質的に同質の機能を有していることが公知の遺伝子は、「実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」に包含される。

本発明において、「実質的に同質の機能」とは、例えば生理学的に、又は薬理学的にみて、その性質が定性的に同じであることを意味し、機能の程度、タンパク質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。

本発明における塩基配列又はアミノ酸配列の「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。）における、オーバーラップする全塩基配列又は全アミノ酸配列に対する同一塩基又はアミノ酸の割合（％）を意味する。塩基配列又はアミノ酸配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いることができる。

本発明における「オルソログ」とは、進化系統上同一の祖先から派生した、類似性の高い別の動物種に由来する遺伝子又はタンパク質を意味する。

本発明における「サブタイプ」とは、遺伝子の相同性が高く、類似の機能を有するタンパク質群のことを意味する。

本発明における「アイソフォーム」とは、タンパク質の立体構造は異なるが、実質的に同質の機能を持つ遺伝子又はタンパク質を意味する。複数のアイソフォームは、同一のＤＮＡに由来するスプライシングバリアントである場合もあれば、異なるＤＮＡに由来する場合もある。

本発明における「変異体」とは、特定の配列番号で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、１又は複数の塩基が、欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有する遺伝子をいう。

特定の遺伝子と「実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」であるか否かは、当業者であれば、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに掲載された遺伝子の塩基配列から判断することができる。

本明細書において、「遺伝子」とは、染色体上に存在している塩基配列であり、特定のタンパク質をコードする領域（開始コドンから終始コドンまでを含む領域であり、イントロンを含みうる）及びその前後する領域（プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター等の領域）の塩基配列を意味する。その前後する領域の範囲は、遺伝子により異なるが、例えば、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐである。すなわち、遺伝子の改変とは、特定のタンパク質をコードする領域の改変のみならず、その前後の領域の改変も含む。

以下、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子について説明する。

ＩＳＬ１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＩＳＬ ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １、Ｉｓｌｅｔ－１）遺伝子は公知の遺伝子である。ＩＳＬ１遺伝子として、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：３６７０（ＮＣ＿０００００５．１０））で示される塩基配列、又はこれと実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、配列番号１に示される塩基配列に含まれるエクソン部分を含む塩基配列（例えば、配列番号２に示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００２２０２．２））及びこのエクソン部分と実質的に同一の塩基配列をエクソンとして含む遺伝子も、ＩＳＬ１遺伝子の範疇である。配列番号２で示される塩基配列の５４９番目～１５９８番目に対応する塩基配列にコードされるＩＳＬ１タンパク質は、配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿００２１９３．２）で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号３で示されるアミノ酸配列及びこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。

ヒトＩＳＬ１遺伝子のオルソログとして、配列番号４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：１６３９２（ＮＣ＿００００７９．６））で示される塩基配列を有するマウスＩＳＬ１遺伝子が知られている。配列番号４で示される塩基配列、又はこれと実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。また、配列番号４に示される塩基配列に含まれるエクソン部分を含む塩基配列（例えば、配列番号５に示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０２１４５９．４））及びこれと実質的に同一の塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。配列番号５で示される塩基配列の２６７番目～１３１６番目に対応する塩基配列にコードされるマウスＩＳＬ１タンパク質は、配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿０６７４３４．３）で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号６で示されるアミノ酸配列及びこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。

ヒトＩＳＬ１遺伝子のヒトサブタイプとして、配列番号７（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：６４８４３（ＮＣ＿００００１５．１０））で示される塩基配列を有するヒトＩＳＬ２遺伝子が知られている。配列番号７で示される塩基配列、又はこれと実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。また、配列番号７に示される塩基配列に含まれるエクソン部分を含む塩基配列（例えば、配列番号８に示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿１４５８０５））及びこれと実質的に同一の塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。配列番号８で示される塩基配列の１６１番目～１２４０番目に対応する塩基配列にコードされるＩＳＬ２タンパク質は、配列番号９（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿６６５８０４．１）で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号９で示されるアミノ酸配列及びこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＩＳＬ１遺伝子の範疇である。

「配列番号１と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、当該遺伝子が配列番号１で示される塩基配列と、又は当該遺伝子のエクソンが配列番号２で示される塩基配列と、約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。

「配列番号４と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、当該遺伝子が配列番号４で示される塩基配列と、又は当該遺伝子のエクソンが配列番号５で示される塩基配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。

「配列番号７と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、当該遺伝子が配列番号７で示される塩基配列と、又は当該遺伝子のエクソンが配列番号８で示される塩基配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は配列番号９で示されるアミノ酸配列に対して約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。

ＩＳＬ１タンパク質は、ホメオドメイン型の転写因子であり、ＬＩＭ１とＬＩＭ２と二つのＬＩＭドメインとＬｈｘ３結合ドメイン、そしてＤＮＡ結合ドメインを有しており、双極細胞の成熟に関与していることが報告されている。

したがって、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有する」とは、ＤＮＡとの結合能を有し、遺伝子の転写を正又は負に制御する機能を有していることを意味する。

「配列番号１、４又は７で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」、すなわちＩＳＬ１遺伝子として、具体的には以下の（１）又は（２）が挙げられる：
（１）配列番号１、４又は７で示される塩基配列、
（２）配列番号１、４又は７で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。

ここで、「１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列」とは、一例として、欠失、付加、挿入又は置換によって、欠失、付加、挿入又は置換される前の塩基配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は複数の塩基」の具体的な個数としては、例えば、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～１０個、１～数（２、３、４又は５）個である。欠失、付加、挿入又は置換は、複数を組み合わせてもよい。

本発明の一態様において、ＩＳＬ１遺伝子は、ヒトであれば染色体上「５ｑ１１．１」又は「１５ｑ２４．３」、マウスであれば染色体上「１３Ｄ２．３」に位置する遺伝子である。他動物種におけるＩＳＬ１遺伝子(オルソログ)の染色体位置は、当業者であれば、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに掲載された遺伝子の塩基配列を基に判断することができる。

ＩＳＬ１遺伝子は、好ましくはヒトＩＳＬ１遺伝子又はマウスＩＳＬ１遺伝子である。

ＢＨＬＨＥ２３（ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ ｆａｍｉｌｙ， ｍｅｍｂｅｒ ｅ２３）遺伝子は公知の遺伝子である。ＢＨＬＨＥ２３遺伝子として、配列番号１０（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：１２８４０８（ＮＣ＿００００２０．１１））で示される塩基配列、又はこれと実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、配列番号１０に示される塩基配列に含まれるエクソン部分を含む塩基配列（例えば、配列番号１１に示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０８０６０６））及びこれと実質的に同一の塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もヒトＢＨＬＨＥ２３遺伝子の範疇である。配列番号１１で示される塩基配列の２６２番目～９８７番目の塩基にコードされるＢＨＬＨＥ２３タンパク質は、配列番号１２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿５４２１７３．２）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号１２で示されるアミノ酸配列及びこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＢＨＬＨＥ２３遺伝子の範疇である。

ヒトＢＨＬＨＥ２３遺伝子のオルソログとして、配列番号１３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：１４０４８９（ＮＣ＿００００６８．７））で示される塩基配列を有するマウスＢＨＬＨＥ２３遺伝子（Ｂｈｌｈｂ４遺伝子）が知られている。配列番号１３で示される塩基配列、又はこれと実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子もＢＨＬＨＥ２３遺伝子の範疇である。また、配列番号１３に示される塩基配列に含まれるエクソン部分を含む塩基配列（例えば、配列番号１４に示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿０８０６４１．５））及びこれと実質的に同一の塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＢＨＬＨＥ２３遺伝子の範疇である。配列番号１４で示される塩基配列の１５８番目～８２９番目の塩基にコードされるマウスＢｈｌｈｂ４タンパク質は、配列番号１５（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿５４２３７２．２）で示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１５で示されるアミノ酸配列及びこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列をエクソンとして含む遺伝子もＢＨＬＨＥ２３遺伝子の範疇である。

「配列番号１０と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、当該遺伝子が配列番号１０で示される塩基配列と、又は当該遺伝子のエクソンが配列番号１１で示される塩基配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。

「配列番号１３と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」とは、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、当該遺伝子が配列番号１３で示される塩基配列と、又は当該遺伝子のエクソンが配列番号１４で示される塩基配列と約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有する遺伝子、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して約８０％以上（好ましくは、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を意味する。

ＢＨＬＨＥ２３タンパク質は、Ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ型の転写因子であり、ＤＮＡ結合ドメインとＨｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘドメインを有しており、双極細胞の成熟に関与していることが報告されている。

したがって、「配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の機能を有する」とは、ＤＮＡとの結合能を有し、遺伝子の転写を正又は負に制御する機能を有していることを意味する。

「配列番号１０又は１３で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子」、すなわちＢＨＬＨＥ２３遺伝子として、具体的には以下の（１）又は（２）が挙げられる：
（１）配列番号１０又は１３で示される塩基配列、
（２）配列番号１０又は１３で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
（ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
（ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
（ｃ）配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。

ここで、「１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列」とは、一例として、欠失、付加、挿入又は置換によって、欠失、付加、挿入又は置換される前の塩基配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は複数の塩基」の具体的な個数としては、例えば、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～１０個、１～数（２、３、４又は５）個である。欠失、付加、挿入又は置換は、複数を組み合わせてもよい。

本発明の一態様において、ＢＨＬＨＥ２３遺伝子は、ヒト染色体上の「２０ｑ１３．３３」、又はマウス染色体上の「２１０３．３４ ｃＭ」に位置する遺伝子である。他動物種におけるＢＨＬＨＥ２３遺伝子(オルソログ)の染色体位置は、当業者であれば、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに掲載された遺伝子の塩基配列を基に判断することができる。

ＢＨＬＨＥ２３遺伝子は、好ましくはヒトＢＨＬＨＥ２３遺伝子又はマウスＢＨＬＨＥ２３遺伝子である。

１－４．遺伝子改変
本発明における「遺伝子改変」及び「遺伝子の改変」とは、特定の遺伝子に対し、１又は複数の塩基を付加、挿入、欠失、置換等させることで、特定の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質の発現又は機能を消失又は減弱させることを意味する。すなわち、遺伝子改変は遺伝子の欠失を含む。特定の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現又は機能を消失又は減弱させる限り、付加、挿入、欠失、置換等させる塩基の数及び塩基の位置（エンハンサー、プロモーター、イントロン等も含む）、並びに遺伝子改変の手法は問わない。

本発明の一態様として、双極細胞制御遺伝子の改変には、双極細胞制御遺伝子(例：ＩＳＬ１遺伝子又はＢＨＬＨＥ２３遺伝子)のエンハンサー及びプロモーターを維持しつつ、その下流のタンパク質をコードする配列（エクソン及びイントロン）を特殊配列に置換することも含まれる。特殊配列には、例えば、自殺遺伝子、生存制御遺伝子、増殖制御遺伝子、分化制御遺伝子及び代謝制御遺伝子（以下、「自殺遺伝子等」という場合がある。）、又は双極細胞制御遺伝子の発現を抑制し得るマイクロＲＮＡ、双極細胞制御遺伝子と同一若しくは相同性の核酸配列を含むアンチセンスＲＮＡ及び双極細胞制御遺伝子のノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子（以下、「マイクロＲＮＡ遺伝子等」という場合がある。）等が含まれる。自殺遺伝子等として、アポトーシス誘導因子等の遺伝子が挙げられる。マイクロＲＮＡ遺伝子等として、別の双極細胞制御遺伝子に対するマイクロＲＮＡ等をコードする遺伝子が挙げられる。双極細胞制御遺伝子のプロモーター下でこれらの遺伝子を発現させることにより、例えば、双極細胞特異的な細胞死の誘導、又は、置換された遺伝子とは異なる双極細胞制御遺伝子の発現抑制も行うことができる。すなわち、双極細胞が誘導される過程で双極細胞制御遺伝子が発現することから、双極細胞制御遺伝子が発現する時期に同一のエンハンサー及びプロモーターの下流に組み込まれた自殺遺伝子等が発現することにより、双極細胞を細胞死に導くことができる。また、マイクロＲＮＡ遺伝子等を発現させることにより、双極細胞制御遺伝子のｍＲＮＡの機能を抑制することができる。

尚、特殊配列は、多能性幹細胞の内在性の双極細胞制御遺伝子自体と置換されてもよいし、当該双極細胞制御遺伝子を維持したまま、多能性幹細胞のゲノム中双極細胞制御遺伝子のエンハンサー及びプロモーターの下流に導入されていてもよい。この場合、特殊配列が機能し得る位置であれば、導入位置に特に限定はない。好ましくは、当該双極細胞制御遺伝子自体を置換することなく、特殊配列が導入される。

一態様において、遺伝子改変として、当該遺伝子が実質的に機能しなくなるゲノム編集が挙げられる。「実質的に機能しなくなるゲノム編集」としては、当該遺伝子が変異型となり、野生型が有していた機能を失わせる変異の導入（例えば、フレームシフト等のナンセンス変異等）、当該遺伝子の発現量が減少するようなゲノム編集等が挙げられる。

一態様において、「遺伝子の発現量が減少するようなゲノム編集」としては、ゲノム中の遺伝子の発現量制御配列を改変すること等が挙げられる。当該発現量制御配列としては、エンハンサー及び／又はプロモーターが挙げられる。例えば、遺伝子のエンハンサー及び／又はプロモーターは、双極細胞制御遺伝子の上流配列、下流配列、及び／又は遺伝子内（例えばイントロン領域）に存在する。

本発明における「遺伝子欠失」及び「遺伝子の欠失」とは、特定の遺伝子に対し、塩基を欠失させることで、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現又は機能を消失又は減弱させることを意味する。特定の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現又は機能を消失又は減弱させる限り、欠失させる塩基の数及び塩基の位置（エンハンサー、プロモーター、イントロン等も含む）、並びに遺伝子欠失の手法は問わない。例えば、マウス及びヒトのＩＳＬ１遺伝子の場合は第１及び第２エクソンを欠失させることにより、マウスＢｈｌｈｂ４遺伝子の場合は、タンパク翻訳領域の開始コドンを含む前後の配列（例：約１５０塩基）を欠失させることにより、それぞれの遺伝子を欠失させることができる。例えば、一部のエクソン（例：第１エクソン又は第２エクソン）を欠失させることにより、又はタンパク翻訳領域の開始コドンを含む複数の塩基（１～タンパク翻訳領域の全塩基、例：１０～５００塩基、１００～３００塩基又は約１５０塩基）を欠失させることにより当該遺伝子を欠失させることができる。

本発明においては、初期化前体細胞、多能性幹細胞又は網膜系細胞に対して遺伝子改変を行うことができる。遺伝子改変された網膜系細胞を得る方法としては、遺伝子改変された多能性幹細胞（遺伝子改変された体細胞を初期化して得られる多能性幹細胞を含む。）から分化誘導する方法、及び網膜系細胞に対し遺伝子改変を行う方法が挙げられる。好ましくは、多能性幹細胞に対して遺伝子改変が行われる。

本発明における「遺伝子改変された多能性幹細胞」とは、分化多能性が維持される限度において、遺伝子改変が行われた多能性幹細胞を意味する。一態様において、「遺伝子改変された多能性幹細胞」とは、分化多能性及び増殖能（自己複製能）が維持される限度において、遺伝子改変が行われた多能性幹細胞を意味する。

本発明において、改変される遺伝子は双極細胞制御遺伝子であるが、更に他の遺伝子が改変されていてもよい。一態様として、特定の細胞の存在を確認する目的で、特定の細胞マーカー遺伝子を、蛍光タンパク質をコードする遺伝子で置換すること等が挙げられるが、これに限定されない。

遺伝子改変された多能性幹細胞又は網膜系細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることによって作製できる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，胚性幹細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用いて行うことができる。

具体的には、例えば、改変する標的遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離し、単離されたゲノムＤＮＡを用いて、標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターを作製する。作製されたターゲッティングベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲッティングベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することによって、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。

標的遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）等を用いることによって、標的遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することもできる。ゲノムＤＮＡの代わりに、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることもできる。当該ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法で該当するポリヌクレオチドを増幅することによって取得することができる。

標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，胚性幹細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲッティングベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択等の方法を用いることができる。

選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が挙げられる。

また、ゲノム編集によって、遺伝子改変された多能性幹細胞又は網膜系細胞を製造することもできる。ゲノム編集（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ）とは、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術によって、遺伝子特異的な破壊又はレポーター遺伝子のノックイン等を行う遺伝子改変技術である。

Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒシステムでは、一般的にジンクフィンガーモチーフとよばれるＤＮＡに特異的に結合するドメインと、制限酵素であるＦｏｋＩとで構成された人工キメラタンパク質を用いて、標的遺伝子を認識し切断する。２つの人工キメラタンパク質が近接する標的配列に結合すると、ＤＮＡ切断ドメインが２量体を形成し、ＤＮＡを切断する。切断されたＤＮＡは、相同組換え又は非相同末端連結によって修復されるが、この際に目的遺伝子が改変される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムでは、一般的に、Ｃａｓ９（ＤＮＡ切断酵素）の発現ベクター若しくはｍＲＮＡ又はＣａｓ９タンパク質と、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター等の制御下でガイドＲＮＡを発現する発現ベクター又はガイドＲＮＡ自体とを、細胞中に導入する。ガイドＲＮＡは、標的ゲノム配列に相補的なＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡとの融合ＲＮＡであり得る。標的ゲノム配列の３’末端にプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ－配列ＮＧＧ）が存在すると、Ｃａｓ９がＤＮＡ二本鎖を解離させ、ガイドＲＮＡによってターゲット配列を認識して両方の鎖を切断し、切断部位が修復される過程で変異が導入される。

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）は、植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．が生産するＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒを用いたシステムである。ＴＡＬＥＮは、一般的には、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒのＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインとを融合した人工ヌクレアーゼである。ＤＮＡ結合ドメインは３４アミノ酸残基の繰返し配列からなり、１リピートが標的ＤＮＡの１塩基を認識する。繰返し配列中の１２、１３番目のアミノ酸残基はｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＲＶＤ）と呼ばれ、この配列によって標的塩基が決定される。二組のＴＡＬＥＮ分子がゲノム上の特定の配列上で向き合うようにＴＡＬＥＮを設計することで、ＴＡＬＥＮペアは標的配列上でＦｏｋＩドメインが二量体化し、ヌクレアーゼ活性を示す。切断されたＤＮＡ二重鎖は細胞内在の機構によって修復されるが、その過程で変異が導入される。ＴＡＬＥＮによるゲノム編集を行う場合には、ＴＡＬＥＮの発現ベクター又はｍＲＮＡを細胞内に導入する。

１－５．多能性幹細胞
本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜全てに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織又は細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織又は細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）及び生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦ（白血病抑制因子）を含む培地中で培養することによって製造することができる。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ株（ＫｈＥＳ－１株由来）は、国立研究開発法人理化学研究所から入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞株及びＤ３細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びＡＴＣＣから、入手可能である。

胚性幹細胞の一つである核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。

ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することによって製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７，１９９２）。

本発明における「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等によって初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することで、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞、又は末梢血単核球等の分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｌｉｎ２８、及びＥｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現によって初期化して、多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。

人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによってマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１－１０６）。

人工多能性幹細胞は、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等によって体細胞から誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学から入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞及びＦｆ－Ｉ１４細胞が、京都大学から入手可能である。

人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現によって初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。上記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）等が挙げられる。

人工多能性幹細胞は、フィーダー細胞存在下又はフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地、又はフィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｅ８培地）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ－Ｅ８培地、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地等のフィーダーフリー培地を挙げることができる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダーフリーで体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃの４因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。

本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。

本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト又はマウス多能性幹細胞、更に好ましくはヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である。

複能性幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞等の組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）を挙げることができる。

２．移植用細胞集団の培養物について
本発明の一態様は、移植用細胞集団の培養物であって、（１）上記移植用細胞集団と、（２）上記移植用細胞集団の生存能力を維持するために必要な媒体と、を含む、培養物を提供する。

本発明における「培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）」とは、生存能力を維持するために必要な媒体及び細胞集団を含み、更に添加した又は細胞集団から産生された生物学的物質を含んでもよい液体を意味する。生物学的物質としては、例えばサイトカイン、ケモカイン等が含まれるが、これらに限定されない。

本発明における「生存能力を維持するために必要な媒体」としては、培地、生理学的緩衝溶液等が挙げられるが、網膜前駆細胞等の網膜系細胞を含む細胞集団が生存する限りにおいて特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として、調製した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ （ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。

３．網膜系細胞を含む移植用細胞集団の製造方法について
本発明の一態様は、下記工程（１）及び（２）を含む、網膜系細胞を含む移植用細胞集団の製造方法である：
（１）多能性幹細胞の双極細胞制御遺伝子を改変して、双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで得る工程、
（２）工程（１）で得られた多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで網膜系細胞に分化誘導し、網膜系細胞を含む移植用細胞集団を得る工程。

本明細書において、「多能性幹細胞の双極細胞制御遺伝子を改変」とは、初期化前体細胞において双極性細胞制御遺伝子を改変した後、初期化前体細胞を初期化することによって、改変された双極細胞制御遺伝子を有する多能性幹細胞を作製する態様も含む。

工程（１）で得られた細胞集団は、当業者であれば、周知の方法で保存することが可能である。保存された細胞集団は、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を得るための原材料又は製造中間体である。本発明の一態様として、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞の原材料又は製造中間体を提供する。

工程（１）で得られた細胞集団を保存する方法の例として、凍結保存が挙げられる。凍結保存する方法は、一般に細胞を凍結保存する方法として公知の方法であれば特に限定されない。例えば、工程（１）で得られた細胞集団をＤＭＳＯ、グリセリン等の凍害保護剤を含む培地に懸濁し凍結保存することができる。また、市販の細胞凍結保存液［ＳｔｅｍＣｅｌｌＢａｎｋｅｒ（Ｚｅｎｏａｑ社、登録商標）］を用いることもできる。凍結保存によって細胞集団の長期保存が可能である。

本発明の一態様として、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を得るための原材料又は製造中間体としての、双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を含む細胞集団のマスターセルバンク又はワーキングセルバンクを提供する。

すなわち、工程（１）で得られた細胞の拡大培養を経た後に、凍結保存することでマスターセルバンクを作製することができる。更に、マスターセルバンクから融解させた細胞を拡大培養することによって、ワーキングセルバンクを作製することもできる。マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを作製するに当たっては、細胞の継代数は少ない方が好ましい。

ここで、「マスターセルバンク」とは、全ての製造用細胞シードの基になる種株を拡大培養によって増殖させ、複数のアンプルに分注したものをいう。また、「ワーキングセルバンク」とは、マスターセルバンクの一個又は複数個から起眠した細胞を拡大培養によって増殖させ、複数のアンプルに分注したものをいう。

本発明の一態様として、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞の原材料又は製造中間体（例えば、双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を含む細胞集団のマスターセルバンク）の製造方法を提供する：
（ｉ）多能性幹細胞の双極細胞制御遺伝子を改変して、上記双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞の細胞集団を、インビトロで得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた多能性幹細胞の細胞集団を培養によって増殖させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた多能性幹細胞の細胞集団を凍結保存する工程。

凍結保存した双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞の細胞集団（マスターセルバンク又はワーキングセルバンクを含む）を、融解後、工程（２）に提供することも可能である。当業者であれば、周知の方法で凍結細胞を融解することができる。非凍結又は凍結もしくは凍結後再融解した双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞の細胞集団もまた本発明の一態様である。

すなわち、本発明の別の一態様は、下記工程（ｉｖ）及び（ｖ）を含む、網膜系細胞を含む細胞集団の製造方法である：
（ｉｖ）凍結保存された、双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞の細胞集団を融解する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで網膜系細胞に分化誘導し、網膜系細胞を含む移植用細胞集団を得る工程。

以下、工程（１）及び（２）について詳細に説明する。

３－１．工程（１）について
工程（１）における多能性幹細胞として、好ましくはｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞が挙げられる。

ここで、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の製造方法には特に限定はなく、上述のとおり当業者に周知の方法で製造することができる。好ましくは、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造を行う。

本発明において、「フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造を行う」とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えば、フィーダー細胞を添加していない条件、又は、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下、好ましくは０．５％以下）条件が挙げられる。

工程（１）では必要に応じて、多能性幹細胞の維持培養又は拡大培養を行ってもよい。維持培養又は拡大培養は、当業者に周知の方法で実施することができるが、好ましくはフィーダーフリーで行う。

上記多能性幹細胞の維持培養又は拡大培養で用いられる培地は、維持培養又は拡大培養が可能な限り限定されない。フィーダーフリー条件下では、未分化維持培養を可能にするために未分化維持因子を含む培地を用いるが、多くの合成培地が開発及び市販されており、これらを使用することができる。例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）培地、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、登録商標）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｓｅｐ ９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製、登録商標）が挙げられる。

工程（１）における遺伝子改変は、上述した通り当業者に周知の方法で実施することができる。

当業者であれば、双極細胞制御遺伝子の発現又は機能を消失又は減弱させるために、双極細胞制御遺伝子をどの様に改変するか決定することができる。

双極細胞制御遺伝子の発現又は機能を消失又は減弱させるための一態様として、双極細胞制御遺伝子の遺伝子欠失が挙げられ、この態様では、双極細胞制御遺伝子の塩基配列の一部又は全部を欠失させる。塩基配列の一部欠失として、転写開始コドンを含む領域又はタンパク質の機能に重要な領域を一部欠失させることが挙げられる。遺伝子欠失された多能性幹細胞を選別するために、例えば薬剤耐性遺伝子又は蛍光タンパク質によって双極細胞制御遺伝子の塩基配列の一部又は全部を置換することもできる。

当業者であれば、遺伝子が改変されていることを容易に確認することができる。一態様として、サザンブロット法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、シークエンシング等が挙げられる。

当業者であれば、遺伝子改変された多能性幹細胞を選別することができる。一態様として、遺伝子改変の際に、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、又はＧＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を導入し、薬剤又はＧＦＰの蛍光によって遺伝子改変された細胞の選別を行う方法が挙げられる。

工程（１）で得られる遺伝子改変を行った多能性幹細胞は、工程（２）に移る前に、その生存状態及び分化多能性が維持される限り、維持培養、拡大培養、保存、又はその他の処理に付すことができる。

維持培養、拡大培養及び保存は、上述の方法等の当業者に周知の方法で実施することができる。

凍結保存された双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を使用する場合には、工程（１）を、当該凍結細胞を融解する工程で置き換えてもよい。

当業者であれば、周知の方法で、凍結保存した細胞を融解し、工程（２）に供することができる。一態様においては、凍結保存した細胞の融解後、該細胞の維持培養又は拡大培養を行ってもよい。

３－２．工程（２）について
工程（１）で得られた細胞集団から、網膜系細胞を含む移植用細胞集団を得る方法の具体例について説明する。上記工程（２）の分化誘導方法としては、例えば、ＷＯ２０１１／０５５８５５、ＷＯ２０１２／１７３２０７、ＷＯ２０１３／０７７４２５、ＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１６／０６３９８６、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０ Ｊａｎ ２０；５（１）：ｅ８７６３．、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２０１１ Ａｕｇ；２９（８）：１２０６－１８．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；１１１（２３）：８５１８－２３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；５：４０４７に開示されている方法が挙げられるがこれらに限定されず、当業者に公知の方法で双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を、網膜系細胞を含む移植用細胞集団又は網膜組織に分化誘導するその他の方法に供することもできる。

工程（２）の一態様として、下記工程（Ａ）～（Ｃ）によって網膜系細胞を含む細胞凝集体を得ることができる。
（Ａ）：工程（１）で得られた遺伝子改変された多能性幹細胞の細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することによって多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する工程、
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、血清培地中で浮遊培養する工程。

本方法は、例えばＷＯ２０１３／０７７４２５にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１３／０７７４２５を参照することが可能である。

本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。

かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品名）を適量（例えば、体積パーセントで、約０．５％～約３０％、好ましくは約１％～約２０％）添加した無血清培地を使用してもよい。

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。例えば、ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロ－イソキノリン－８－スルホンアミド）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが用いられる。

用いられるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成する濃度であればよい。例えばＩＷＲ１ｅの場合、約０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは約１μＭ～１０μＭ、より好ましくは約３μＭの濃度で培地に添加する。

Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始前に無血清培地に添加してもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、５日以内）に無血清培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは３日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に、無血清培地に添加する。また、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質を添加した状態で、好ましくは浮遊培養開始後１８日目まで、より好ましくは１２日目まで浮遊培養する。

凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６ウェルプレート）又はマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法等が挙げられる。

細胞凝集体を形成させるときの多能性幹細胞の細胞数は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な細胞数である限り特に限定されない。例えば９６ウェルマイクロウェルプレートを用いる場合、１ウェルあたり、約１×１０^３～約５×１０^４細胞、好ましくは約３×１０^３～約３×１０^４細胞、より好ましくは約５×１０^３～約２×１０^４細胞、最も好ましくは９×１０^３細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して細胞凝集体を形成させる。

多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、細胞凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現並びにその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、並びに、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき、当業者であれば判断することが可能である。

基底膜標品としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現等を制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層等との間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば、基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液、アルカリ溶液等を用いて除去することで作製することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（以下、「マトリゲル」という場合がある。））、又は、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等）を含むものが挙げられる。

用いられる基底膜標品の量としては、例えばＭａｔｉｇｅｌを用いる場合には、好ましくは培地の体積を基準として、１／２０～１／２００の量、より好ましくは１／１００前後の量を挙げることができる。基底膜標品は、幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは浮遊培養開始後２日以内に無血清培地に添加される。

血清は、例えば、ウシ血清、仔ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、仔ウマ血清、ウマ胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、及びヒト血清等哺乳動物の血清等を用いることができる。

血清の添加は、浮遊培養開始後７日目以降、より好ましくは９日目以降、最も好ましくは１２日目に行う。血清は、体積パーセントで、約１～３０％、好ましくは約３～２０％、より好ましくは１０％前後（例えば、５％～１５％）の濃度になるように添加する。

工程（２）の別の一態様として、下記工程（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）を含む方法によって網膜系細胞を含む細胞凝集体を得ることができる。
（Ｄ）：工程（１）で得られた、双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ｅ）：工程（Ｄ）で培養した双極細胞制御遺伝子が改変された多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することによって、細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｆ）：工程（Ｅ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養する工程。

本方法は、例えばＷＯ２０１６／０６３９８５にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１６／０６３９８５を参照することが可能である。

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーによって伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、ＬＹ－３６４９４７、ＳＢ－５０５１２４、Ａ－８３－０１等）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１等）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例：ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等）を挙げることができる。これらの物質は市販されており入手可能である。

ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」と記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ）等が挙げられる。

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えば、ＳＢ４３１５４２は、通常０．１～２００μＭ、好ましくは２～５０μＭの濃度で使用される。Ａ－８３－０１は、通常０．０５～５０μＭ、好ましくは０．５～５μＭの濃度で使用される。ＬＤＮ１９３１８９は、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～３００ｎＭの濃度で使用される。ＳＡＧは、通常、１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。

工程（Ｄ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、培地として未分化維持因子を含む上記フィーダーフリー培地を用いるとよい。

工程（Ｄ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，６１１－６１５，（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３，１２３６，（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９，９７１－９７４，（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。

工程（Ｄ）における多能性幹細胞の培養時間は、工程（Ｅ）において形成される細胞凝集体の質を向上させることが可能な範囲であれば特に限定されないが、通常０．５～１４４時間である。一態様において、培養時間は好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～４８時間、更に好ましくは１２～４８時間、より更に好ましくは１８～２８時間（例、２４時間）である。

無血清培地の準備及び細胞凝集体の形成は、上述と同様に実施することができる。

一態様において、工程（Ｅ）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを上述の濃度で用いることができる。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例、Ｙ－２７６３２）を添加してもよい。培養時間は例えば、１２時間～６日間である。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４若しくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。

用いられる培地としては、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）が挙げられる。無血清培地、血清培地は上述の通り準備することができる。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトＢＭＰ４タンパク質の場合は、約０．０１ｎＭ～約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１０ｎＭ、更に好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）の濃度となるように培地に添加する。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ｄ）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に培地に添加されていればよく、例えば浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加されていればよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目～１５日目の間、より好ましくは１日目～９日目の間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。

上記工程（Ａ）～工程（Ｆ）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃～約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％～約１０％、好ましくは約５％である。

上記工程（Ｃ）又は工程（Ｆ）における培養期間を変動させることによって、様々な分化段階の網膜系細胞を製造することができる。すなわち、未成熟な網膜系細胞（例：網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞）と成熟した網膜系細胞（例：視細胞）とを様々な割合で含む網膜系細胞を製造することができる。工程（Ｃ）又は工程（Ｆ）の培養期間を延ばすことによって、成熟した網膜系細胞の割合を増やすことができる。

上述した方法で得た網膜系細胞の細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下又は非存在下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で３日間から６日間程度の期間培養後、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で３０日間～６０日間程度培養することによって、毛様体周縁部様構造体を製造することもできる。

毛様体周縁部様構造体とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において網膜組織（具体的には、神経網膜）と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙ ｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌ ｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれる。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞若しくは分化細胞の供給、及び網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）を挙げることができる。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭの濃度で添加する。

ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８等が挙げられる。例えばＳＵ－５４０２の場合、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

上述の方法によって、双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を製造することができるが、これらの方法に限定されない。

工程（２）によって得られる網膜系細胞を含む移植用細胞集団において、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数の合計が全細胞数の１０％以上（好ましくは、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上）であってよい。また、工程（２）によって得られる網膜系細胞を含む移植用細胞集団の培養を継続した場合（例：工程（２）の開始１２０日以降）、又は工程（２）によって得られる網膜系細胞を含む移植用細胞集団を生体に移植した場合、インビトロ又は移植されたレシピエントの網膜において、神経網膜層が形成され、神経網膜層を構成する細胞が増大する。この段階で、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数の合計は、全細胞数の３０％以上（好ましくは４０％以上、又は５０％以上）であってよく、双極細胞前駆細胞、錐体双極細胞及び桿体双極細胞の細胞数の合計は、全細胞数の３０％以下（好ましくは、２０％以下、１０％以下、又は５％以下）であってよい。また、アマクリン細胞の細胞数に対する双極細胞の細胞数の割合が減少する（例：７０％以下、６０％以下、５０％以下）。

本発明の一態様として、網膜前駆細胞はＣｈｘ１０陽性細胞であり、視細胞前駆細胞はＣｒｘ陽性細胞であり、視細胞はリカバリン陽性細胞である。

工程（２）で得られた細胞集団中の網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞の割合は、当業者であれば周知の方法により測定することができる。一態様として、免疫染色又はフローサイトメトリー等の方法によって、Ｃｈｘ１０陽性細胞、Ｃｒｘ陽性細胞、リカバリン陽性細胞の含まれる割合を測定することが可能である。

当業者であれば、双極細胞制御遺伝子の改変が維持されていることを周知の方法、例えば上述した方法によって確認することができる。

双極細胞に分化していないこと、又は双極細胞が変性死していることは、例えば、免疫染色又はフローサイトメトリー等の方法によって、双極細胞のマーカーであるＰＫＣα、Ｃｈｘ１０等の発現の有無によって確認することができる。

双極細胞が機能不全に陥っていることは、免疫組織学的解析又は電気生理学的解析等の方法で確認することができ、例えば、視細胞とのシナプス接続又は神経発火が観察できない場合に、双極細胞が機能不全に陥っていると判断することができる。

また、正常な視細胞が誘導されていることは、例えば、免疫染色又はフローサイトメトリー等の方法によって、視細胞のマーカーであるリカバリン等の発現の有無によって確認することができる。

上述した細胞の有無、及びそれらの割合は、移植後の組織から確認することもできる。

４．網膜系細胞を含む移植用細胞集団の移植について
上述の方法等によって製造した網膜系細胞を含む移植用細胞集団は、移植を必要とする対象（例：哺乳動物）に移植することができ、当該移植によって対象の視機能を改善することができる。対象となりうる哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル等が挙げられる。

網膜系細胞を含む移植用細胞集団は、細胞凝集体の形態で移植することができる。また、本発明の製造方法で得られる網膜組織を、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて適切な大きさに細切し、シート剤（細胞シート）とした後に移植することもできる。例えば、一つの細胞凝集塊から切り出した細胞シート（例えば直径３００μｍ、高さ５０μｍ）を、視細胞が変性している領域の面積に応じて、１枚から複数枚移植することが挙げられる。当業者であれば、その変性死しているに領域の面積に応じて、細胞シートの枚数を選択することができる。更に、製造した網膜系細胞に、酵素処理、又はピペッティング等の操作を行い、細胞懸濁液の形態として移植することもできる。

網膜系細胞を含む移植用細胞集団は、好ましくは医薬組成物に調製のうえ、移植する。

細胞懸濁液の移植は、例えば、注射針を用いて網膜下に移植する方法で実施される。細胞シートの移植は、例えば、眼球の一部を切開し、切開部位を通して、損傷部位又は病変部位に細胞シートを移植することで実施される。

移植後、生着した未成熟な網膜系細胞の少なくとも一部は、対象の生体内（眼内）の環境下において、成熟した網膜系細胞に分化誘導される。ここで、「移植後に誘導される視細胞」とは、対象の眼内において、移植後、生着した網膜前駆細胞又は視細胞前駆細胞から分化誘導される視細胞を意味する。

ここで、本発明における「生着」とは、移植された細胞が生体内に長期間（例：３０日以上、６０日以上、９０日以上）生存し、臓器内に接着して留まることを意味する。

本発明における「機能的生着」とは、移植された細胞が生着し、生体内で本来の機能を果たしている状態を意味する。

視細胞の本来の機能とは、生体内において双極細胞と接触してシナプスを形成し、視細胞で変換された電気信号を双極細胞に伝達することである。したがって、本発明における「視細胞の機能的生着」とは、移植された視細胞（移植後に誘導される視細胞を含む）がホスト側の双極細胞と接触してシナプスを形成し、視細胞で変換された電気信号が該シナプスを介して双極細胞に伝達される状態で生着していることを意味する。視細胞と双極細胞がシナプスを形成していることは、視細胞側のシナプスマーカー（例：Ｃｔｂｐ２， Ｂａｓｏｏｎ、Ｃａｃｎａ１ｆ、ＥＬＦＮ１）、又は双極細胞側のシナプスマーカー（例：ｍＧｌｕＲ６、Ｃａｃｎａ１ｓ、ＴＲＰＭ１）を染色することにより確認できる。具体的には、免疫染色等の手法により、リカバリン陽性細胞（視細胞）とＰＫＣα陽性細胞（双極細胞）の接触面における上記シナプスマーカーの染色により、シナプス形成を確認することができる。本発明において、移植片の視細胞層がホスト側の双極細胞を含む網膜層と接触した状態を、視細胞の機能的生着とみなすこともできる（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，３１，１１４９－１１５９，（２０１３））。

本発明における「接触」とは、細胞同士が物理的に近接しており、シナプス接続が示唆される状態を指す。

本発明における「接触率」とは、移植した網膜組織の長径に対する、移植した網膜組織の視細胞層がホスト側の双極細胞を含む網膜層と接触している長さの割合を指す。

本発明における「機能的生着率」とは、移植した細胞のうち、機能的生着を果たした細胞の割合を意味する。移植された視細胞の機能的生着率は、上記接触率から求めることができる。

本発明に係る方法で製造した網膜系細胞を含む移植用細胞集団を移植することによって移植された視細胞（移植後に誘導される視細胞を含む）の、機能的生着率は１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。

移植された視細胞（移植後に誘導される視細胞を含む）の生着率及び／又は機能的生着率が高いほど、移植後の視機能の改善効果が高くなる。

従って、本発明は、移植された視細胞（移植後に誘導される視細胞を含む）の生着率及び／又は機能的生着率の改善方法を提供する。

５．医薬組成物
本発明は、上記製造方法によって製造される、網膜系細胞を含む移植用細胞集団の有効量を含む、医薬組成物を提供する。移植用細胞集団の有効量は、投与の目的、投与方法、及び投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば、細胞数として、１×１０^５個～１×１０^７個（例：１×１０^５個、１×１０^６個又は１×１０^７個）とすることができる。

医薬組成物は、本発明の製造方法によって製造される上記移植用細胞集団の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。

医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、医薬組成物には、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

本発明の医薬組成物は、上記製造方法で製造される上記移植用細胞集団を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して上記移植用細胞集団を凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いてもよい。

本発明の製造方法で得られる移植用細胞集団を含む網膜組織を、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて適切な大きさに細切し、シート剤とすることもできる。

また、本発明の製造方法で得られる移植用細胞集団は、分化誘導を行う工程（２）で接着培養を行うことによって、シート状に成形し、細胞シートであるシート剤とすることもできる。

本発明の医薬組成物は、網膜系細胞の障害に基づく疾患の治療薬として有用である。

６．治療薬及び治療方法
本発明の製造方法によって製造される網膜系細胞を含む移植用細胞集団は、網膜組織の障害（網膜前駆細胞又は網膜系細胞の障害を含む）に基づく疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の製造方法によって製造される網膜系細胞を含む移植用細胞集団を含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。また、本発明は当該治療薬を、懸濁液やシート剤の形態で患者に投与（移植）することを含む治療方法も提供する。網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、又は、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の製造方法によって製造された網膜系細胞を含む移植用細胞集団を用いることができる。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態の患者に、本発明の製造方法によって製造された網膜系細胞を含む移植用細胞集団を移植し、当該網膜系細胞又は、障害を受けた網膜組織自体を補充することによって、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することができる。網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、眼科疾患である、黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー等が挙げられる。網膜組織の損傷状態としては、例えは、視細胞が変性死している状態等が挙げられる。

移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶反応がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。すなわち、本発明の好ましい態様において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることによって、当該レシピエントについて免疫学的自己の網膜組織又は網膜系細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される。

また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、ＨＬＡ型又はＭＨＣ型が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロ（他家）の網膜組織又は網膜系細胞を製造し、これを当該レシピエントに移植してもよい。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

実施例１：Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植し、移植組織中の桿体双極細胞を減少させる例
Ｎｒｌ：：ｅＧＦＰマウスから樹立したＮｒｌ：：ｅＧＦＰレポーターを持つマウスｉＰＳ細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，３１，１１４９－１１５９，（２０１３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１０３，ｐｐ．３８９０－３８９５，（２００６））を、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６（２），２１５－２４，（２００８）に記載の方法に準じて未分化維持培養した。

Ｂｈｌｈｂ４遺伝子（ＢＨＬＨＥ２３遺伝子のマウスオルソログ）の機能を欠損させる方法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた。ＳｐＣａｓ９と標的配列ｓｇＲＮＡ（配列番号１６：ccgagctcaagtcgctgtcg、配列番号１７：cgcgccttggtgagaaggcg）を細胞内で発現させることにより、標的配列部位を切断することができる。ＳｐＣａｓ９と標的配列とを組み込んだプラスミドをエレクトロポレーション法（商品名：Ｎｕｃｒｅｏｆｅｃｔｏｒ，Ｌｏｎｚａ社製）によって、マウスｉＰＳ細胞に導入した。マウスｉＰＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の開始コドンを含む領域を欠失させるように設計したｇＲＮＡ、及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドと、を導入した。ピューロマイシンを用いて導入細胞をセレクションし、コロニーをピックアップすることで、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子欠失株を樹立した。Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の目的箇所が欠失しているか、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動で、又は塩基配列情報を読むことで確かめた。

網膜への分化誘導方法としては、非特許文献２に記載の方法を改良した非特許文献５に記載のＳＦＥＢｑ法を用いた。分化誘導操作は、以下のように行った。まず、マウスｉＰＳ細胞を酵素処理にて単一細胞に分散させた後、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで浮遊培養した。分化誘導開始後０日目～１日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ，Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を添加した培地中で上記細胞を培養し、その後８日目までＡＧＮ１９３１０９及びＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２％ｖ／ｖ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加した培地中で上記細胞を培養した。なお、「分化誘導開始後Ｎ日目」とは、分化誘導開始Ｎ日後（Ｎ×２４時間後）からＮ＋１日（（Ｎ＋１）×２４時間）経過直前までの期間を意味する（以下同じ）。培地として、Ｇ－ＭＥＭ（５％ ＫＳＲ，０．１ｍＭ 非必須アミノ酸，１ｍＭ ピルベート，０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール）を使用した。分化誘導開始後８日目に、網膜前駆組織の上皮構造が袋状に突出した眼胞を、Ｎｏ．１１ Ｂｌａｄｅを用いて細胞塊から切り出し、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２環境下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１０％ ＦＢＳ，０．５μＭ オールトランスレチノイン酸，１ｍＭ Ｌ－タウリン）の培地で浮遊培養した。分化誘導開始後１５日目に立体網膜を切り出し、注射器を用いて、視細胞変性モデルであるｒｄ１マウスの網膜下へ移植した。移植後分化３０－５０日相当齢に、眼組織をパラホルムアルデヒド固定（ＰＦＡ固定）してスクロース置換した。クライオスタットを用いて、組織切片を作製した。免疫染色によって、抗ＰＫＣα抗体（商品名：Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃα ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社製）、抗カルレチニン抗体（商品名：Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、及び抗カルビンジン抗体（商品名：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ－２８Ｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、それぞれ、組織切片中の桿体双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞を染色し、移植後のグラフトを評価した。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（商品名：ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ社製）を用いて蛍光観察を行い、移植片の中のそれぞれの細胞の割合を調べた。その結果、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子を欠失していない網膜組織を移植した場合と比べて、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子を欠失させた網膜組織を移植した場合には、桿体双極細胞の割合が有意に減少していることが分かった（図１）。

実施例２：Ｂｈｌｈｂ４遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植し、ホスト桿体双極細胞との接触率を向上させる例
Ｎｒｌ：：ｅＧＦＰマウスから樹立したＮｒｌ：：ｅＧＦＰレポーターを持つマウスｉＰＳ細胞を、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６（２），２１５－２４，（２００８）に記載の方法に準じて未分化維持培養した。

網膜への分化誘導方法及び移植方法としては、実施例１と同様の方法を用いた。移植後分化４０日及び９０日相当齢前後に、眼組織をＰＦＡ固定してスクロース置換した。クライオスタットを用いて、組織切片を作製した。免疫染色によって、抗ＰＫＣα抗体（商品名：Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃα ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて組織切片中の桿体双極細胞を染色した。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（商品名：ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ社製）を用いて蛍光観察を行い、ホスト桿体双極細胞とｅＧＦＰ陽性移植視細胞との接する部分の長さの、グラフトの存在している部分全体の長さに対する比率を調べた。その結果、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子を欠失していない網膜組織を移植した場合と比べて、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子を欠失させた網膜組織を移植した場合、ホスト桿体双極細胞に接触しているグラフト由来の視細胞の割合が有意に増加していることが分かった（図２）。

実施例３：ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植し、移植組織中の桿体双極細胞、アマクリン細胞及び水平細胞を減少させる例
Ｎｒｌ：：ｅＧＦＰマウスから樹立したＮｒｌ：：ｅＧＦＰレポーターを持つマウスｉＰＳ細胞を、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６（２），２１５－２４，（２００８）に記載の方法に準じて未分化維持培養した。

ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させる方法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた。マウスｉＰＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と、ＩＬＳ１遺伝子の第１及び第２エクソンを欠失させるように設計した標的配列（配列番号１８：tcttcaatagcacgcgggaa、配列番号１９：tcctaagccataaagcgctt）、並びにピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドとをエレクトロポレーション法（Ｎｕｃｒｅｏｆｅｃｔｏｒ，Ｌｏｎｚａ社製）によって、マウスｉＰＳ細胞に導入した。ピューロマイシンを用いて導入細胞をセレクションし、コロニーをピックアップすることで、ＩＳＬ１遺伝子欠失株を樹立した。ＩＳＬ１遺伝子の目的箇所が欠失しているか、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動で、又は塩基配列情報を読むことで確認した。

網膜への分化誘導方法としては、非特許文献２に記載の方法を改良した非特許文献５に記載のＳＦＥＢｑ法を用いた。分化誘導操作は、以下のように行った。まず、マウスｉＰＳ細胞を酵素処理にて単一細胞に分散させた後、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで浮遊培養した。分化誘導開始後０日目～1日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）を添加した培地中で上記細胞を培養し、その後８日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）及びＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２％ｖ／ｖ）を添加した培地中で上記細胞を培養した。培地として、Ｇ－ＭＥＭ（５％ ＫＳＲ，０．１ｍＭ 非必須アミノ酸，１ｍＭ ピルベート，０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール）を使用した。分化誘導開始後８日目に眼胞をＮｏ．１１ Ｂｌａｄｅを用いて切り出し、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２環境下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１０％ ＦＢＳ，０．５μＭ オールトランスレチノイン酸，１ｍＭ Ｌ－タウリン）の培地で浮遊培養した。分化誘導開始後１５日目に立体網膜を切り出し、注射器を用いて、視細胞変性モデルであるｒｄ１マウスの網膜下へ移植した。移植後３０～５０日目に眼組織をＰＦＡ固定してスクロース置換した。クライオスタットを用いて、切片を作製した。免疫染色によって、抗ＰＫＣα抗体、抗カルレチニン抗体、及び抗カルビンジン抗体を用いて、それぞれ、切片中の桿体双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞を染色し、移植後のグラフトを評価した。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて蛍光観察を行い、移植片の中のそれぞれの細胞の割合を調べた。その結果、ＩＳＬ１遺伝子を欠失していない網膜組織を移植した場合と比べて、ＩＳＬ１遺伝子を欠失させた網膜組織を移植した場合、桿体双極細胞の割合が有意に減少していることが分かった（図３）。

実施例４：双極細胞制御遺伝子の機能を欠失させたマウスｉＰＳ細胞由来の網膜組織を移植し、移植組織中のホスト双極細胞と移植視細胞のシナプス接続を示唆する例
Ｎｒｌ：：ｅＧＦＰマウスから樹立したＮｒｌ：：ｅＧＦＰレポーターを持つマウスｉＰＳ細胞を、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６（２），２１５－２４，（２００８）に記載の方法に準じて未分化維持培養した。

Ｂｈｌｈｂ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子を欠失させる方法として、実施例１及び３と同様の方法を用いた。

網膜への分化誘導方法としては、非特許文献２に記載の方法を改良した非特許文献５に記載のＳＦＥＢｑ法を用いた。分化誘導操作は、以下のように行った。まず、マウスｉＰＳ細胞を酵素処理にて単一細胞に分散させた後、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで浮遊培養した。分化誘導開始後０日目～1日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）を添加した培地中で上記細胞を培養し、その後８日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）及びＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２％ｖ／ｖ）を添加した培地中で上記細胞を培養した。培地として、Ｇ－ＭＥＭ（５％ ＫＳＲ，０．１ｍＭ 非必須アミノ酸，１ｍＭ ピルベート，０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール）を使用した。分化誘導開始後８日目に、眼胞をＮｏ．１１ Ｂｌａｄｅを用いて切り出し、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２環境下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１０％ ＦＢＳ，０．５μＭ オールトランスレチノイン酸，１ｍＭ Ｌ－タウリン）の培地で浮遊培養した。分化誘導開始後１５日目に立体網膜を切り出し、注射器を用いて、視細胞変性モデルであるｒｄ１マウスの網膜下へ移植した。移植後３０～５０日目に眼組織をＰＦＡ固定してスクロース置換した。クライオスタットを用いて、切片を作製した。免疫染色によって、抗ＰＫＣα抗体及び抗Ｃｔｂｐ２抗体を用いて、それぞれ、切片中の桿体双極細胞及び視細胞のシナプス末端を染色し、移植後のグラフトを評価した。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて蛍光観察を行い、移植組織中のホスト双極細胞と移植視細胞のシナプス接続を評価した。その結果、ＢｈｌｈＢ４及びＩＳＬ１遺伝子を欠失した網膜組織を移植した際、ホストの双極細胞とシナプス接続している可能性が示唆された（図４）。

実施例５：双極細胞制御遺伝子の機能の欠失による桿体双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞の減少を評価する例
Ｎｒｌ：：ｅＧＦＰマウスから樹立したＮｒｌ：：ｅＧＦＰレポーターを持つマウスｉＰＳ細胞を、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６（２），２１５－２４，（２００８）に記載の方法に準じて未分化維持培養した。

Ｂｈｌｈｂ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子を欠失させる方法として、実施例１及び３と同様の方法を用いた。

網膜への分化誘導方法としては、非特許文献２に記載の方法を改良した非特許文献５に記載のＳＦＥＢｑ法を用いた。分化誘導操作は、以下のように行った。まず、マウスｉＰＳ細胞を酵素処理にて単一細胞に分散させた後、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで浮遊培養した。分化誘導開始後０日目～1日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）を添加した培地中で上記細胞を培養し、その後８日目までＡＧＮ１９３１０９（０．１μＭ）及びＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２％ｖ／ｖ）を添加した培地中で上記細胞を培養した。培地として、Ｇ－ＭＥＭ（５％ ＫＳＲ，０．１ｍＭ 非必須アミノ酸，１ｍＭ ピルベート，０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール）を使用した。分化誘導開始後８日目に、眼胞をＮｏ．１１ Ｂｌａｄｅを用いて切り出し、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２環境下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１０％ ＦＢＳ，０．５μＭ オールトランスレチノイン酸，１ｍＭ Ｌ－タウリン）の培地で浮遊培養した。分化誘導開始後２９日目に、組織をＰＦＡ固定してスクロース置換後、切片を作製した。免疫染色によって、抗ロドプシン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて成熟視細胞を、抗ＰＫＣα抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて桿体双極細胞を、抗ＩＳＬ１抗体（商品名：Ａｎｔｉ Ｉｓｌｅｔ １ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＤＳＨＢ社製）を用いてアマクリン細胞、水平細胞、及び双極細胞を、抗リカバリン抗体（商品名：Ａｎｔｉ Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて視細胞を、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ Ｃｈｘ１０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｅｘａｌｐｈａ社製）を用いて双極細胞を、並びに、抗ＧＳ抗体（商品名：Ａｎｔｉ ＧＳ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及び、抗ＧＦＡＰ抗体（商品名：Ａｎｔｉ ＧＦＡＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｄａｋｏ社製）を用いてミュラーグリア細胞を、染色し、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ社製）を用いて蛍光観察を行った。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて蛍光観察を行い、分化誘導した網膜組織中のそれぞれの細胞の割合を調べた。その結果、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子を欠失させたｉＰＳ細胞由来の凝集体（凝集塊）は、Ｂｈｌｈｂ４遺伝子及びＩＳＬ１遺伝子を欠失していない凝集体と同等に、Ｎｒｌ陽性桿体視細胞、ロドプシン陽性の成熟視細胞、リカバリン陽性の視細胞、ＧＳ陽性及びＧＦＡＰ陽性のミュラーグリア細胞が観察された。一方で、ＰＫＣα陽性の桿体双極細胞、Ｃｈｘ１０陽性の双極細胞、及びＩＳＬ１陽性細胞は減少していた（図５）。よって、ＢｈｌｈＢ４遺伝子又はＩＳＬ１遺伝子を欠失させたｉＰＳ細胞を、網膜系細胞へ分化する条件で長期培養した場合、視細胞及びミュラーグリア細胞には影響がなく、双極細胞及びＩＳＬ１陽性細胞が有意に減少していること分かった（図５）。

実施例６：ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を樹立する例
Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（Ｋｈ－ＥＳ１株、非特許文献３）を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４ （２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）を、フィーダー細胞に代わる足場としてはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

具体的なヒトＥＳ細胞の維持培養操作は、以下の様に行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株）を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ^２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は、１ウェルあたり１．２×１０^４細胞とした。播種した１日後に、培地を、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１～２日ごとに一回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地で培地交換した。その後、播種した６日後に、サブコンフレントになるまで培養した。

網膜系細胞を含む移植用細胞集団の製造方法の工程（１）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの導入例として、以下の操作を行った。まず、サブコンフレントになったヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞に分散し回収した。その後、エレクトロポレーション法（商品名：Ｎｕｃｒｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、ヒトＥＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と、ＩＳＬ１遺伝子の第１及び第２エクソンを欠失させるように設計したｇＲＮＡ（配列番号２０：CCAACTCCGCCGGCTTAAAT、配列番号２１：GGGAGGTTAATACTTCGGAG）、並びに、ピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドとを導入した。

上記エレクトロポレーション法によってプラスミドを導入したヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュ（イワキ社製）に播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、培養面積９．４ｃｍ^２）を用いた場合、上記単一分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は、１ウェルあたり１×１０^３細胞とした。播種した１日後に、培地を、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１日～２日に一回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地で培地交換した。その後、播種した６日後又はサブコンフレント１日前になるまで培養した。上記フィーダーフリー条件下で培養したサブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞に、ピューロマイシンを０．５ｎｇ／ｍｌ又は０．４ｎｇ／ｍｌ加え、プラスミド導入細胞を選別した。選別によって生き残ったコロニーをピックアップし遺伝子解析することで、ＩＳＬ１遺伝子欠失株を樹立した（Ｎｏ．１６株及びＮｏ．１９株、図６Ａの下段）。コロニーピックアップ時、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔによって単一細胞に分散させた後、その半量をＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュ（イワキ社製）に播種し、Ｙ２７６３２（１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。残りの半量は、遺伝子解析用サンプルとして回収した。

ピックアップしたコロニーのヒトＥＳ細胞のＩＳＬ１遺伝子の目的箇所が欠失しているかは、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動で（図６Ａの中段）、並びに、塩基配列情報を調べることで（図６Ｂ）確かめた。

実施例７：ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を網膜に分化させる例
実施例６で作製したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株由来、Ｎｏ．１６株及びＮｏ．１９株）を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にて、サブコンフレント１日前になるまでフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

実施例６で作製したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、２７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に、１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １－モノチオグリセロール、及び１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ社製）を終濃度１．５ｎＭで含む培地を、５０μＬ添加した。

このようにして調製された細胞について、浮遊培養開始後３、６、９、１５、及び１８日目に、倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図７Ａ）。その結果、ＩＳＬ１遺伝子が機能欠失したヒトＥＳ細胞株においても、層構造を有する細胞凝集体が形成されることが分かった（図７Ａ）。

当該浮遊培養開始後１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７度、５％ＣＯ_２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭレチノイン酸、及び１００μＭタウリンが添加された培地）で長期培養した。２～４日に１回、上記血清培地で半量培地交換した。浮遊培養開始後６４～６５日目に、蛍光顕微鏡を用いて、細胞を観察した（図７Ｂ）。その結果、ＩＳＬ１遺伝子が機能欠失したヒトＥＳ細胞株において、ＣＲＸ陽性の視細胞前駆細胞を有する立体網膜が形成されることが分かった（図７Ｂ）。

ＩＳＬ１遺伝子を欠失させたヒトＥＳ細胞を出発原料にして作製した、浮遊培養開始後５７、５８、及び５９日目の細胞凝集体を、４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に対して、抗ＩＳＬ１抗体（商品名：Ａｎｔｉ Ｉｓｌｅｔ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＤＳＨＢ社製）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果、ＩＳＬ１遺伝子を欠失させたヒトＥＳ細胞から作製した細胞凝集体では、ＩＳＬ１タンパク質が発現していないことがわかった（図７Ｃ）。

これらの結果から、ＩＳＬ１遺伝子が機能不全化したヒトＥＳ細胞株から、網膜組織を形成できること、また、ＩＳＬ１遺伝子が機能不全化したヒトＥＳ細胞株においては、ＩＳＬ１タンパク質が発現していないことが分かった。

実施例８：ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を分化させた網膜を移植し、その生着を確認する例
実施例６で作製したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株由来）を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にて、サブコンフレント１日前になるまでフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

実施例６で作製したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて分散処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ^２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ社製、終濃度１．５ｎＭ）を含む培地を５０μＬ添加した。

このようにして調製された細胞の浮遊培養開始後６日目に、培地を６０μＬ除去し、新たに９０μＬ培地を添加した。更に浮遊培養開始後９、１２、及び１５日目に培地を８５μＬ除去し、新たに９０μＬの培地を加えた。

当該浮遊培養開始後１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭレチノイン酸、及び１００μＭタウリンが添加された培地）で長期培養した。２～４日に１回上記血清培地で半量培地交換した。浮遊培養開始後５８～６５日目に、立体網膜を切り出し、注射器を用いて視細胞変性モデルである網膜変性ラットの網膜下へ移植した。移植後１～２か月目に蛍光眼底装置（商品名：ＭｉｃｒｏｎＩＶ、Ｐｈｏｅｎｉｘ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、ＣＲＸ：：Ｖｅｎｕｓの蛍光を基に、移植片の生着を観察した。その結果、ＩＳＬ１遺伝子を欠失させた網膜組織を移植した場合、ＩＳＬ１遺伝子を欠失させていない網膜組織と比較して遜色なく、網膜変性ラットの網膜下に生着していた（図８）。よって、ＩＳＬ１遺伝子を欠失させたヒトＥＳ細胞から分化誘導させた網膜組織は、移植後生着することがわかった。

実施例９：ＩＳＬ１遺伝子の機能を欠失させたヒトＥＳ細胞株を分化させた網膜を移植し、双極細胞の割合減少を確認する例
実施例６で作製したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株由来）を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にて、サブコンフレント１日前になるまでフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

上記培養したＩＳＬ１遺伝子欠失ヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて分散処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ^２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ １－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ社製、終濃度１．５ｎＭ）を含む培地を５０μＬ添加した。

このようにして調製された細胞の浮遊培養開始後６日目に、培地を６０μＬ除去し、新たに９０μＬ培地を添加した。浮遊培養開始後９、１２、及び１５日目に培地を８５μＬ除去し、新たに９０μＬの培地を加えた。

当該浮遊培養開始後１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、１％Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭレチノイン酸、及び１００μＭタウリンが添加された培地）で長期培養した。２～４日に１回上記血清培地で、半量培地交換した。浮遊培養開始後５８～６５日目に、得られた立体網膜組織を切り出し、注射器を用いて視細胞変性モデルである網膜変性ラットの網膜下へ移植した。移植後分化２４０～２７０日相当齢に眼組織をＰＦＡ固定してスクロース置換した。クライオスタットを用いて、組織切片を作製した。免疫染色によって、抗Ｎｕｃｌｅｉ抗体（商品名：Ａｎｔｉ－Ｎｕｃｌｅｉ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ｃｈｘ１０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ ａｌｐｈａ社製）、及び抗Ｐａｘ６抗体（商品名：Ａｎｔｉ Ｐａｘ６ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｏｖａｎｃｅ社製）を用いて、それぞれ、組織切片中のヒト細胞、双極細胞、及びアマクリン細胞を染色し、移植後のグラフトを評価した。Ｉｓｌｅｔ－１遺伝子を欠失していない（ワイルドタイプ）網膜組織及びＩｓｌｅｔ－１遺伝子を欠失させた網膜組織を、それぞれ３スライドずつ染色し、１スライドに対して２か所撮影した。

染色した組織について、共焦点顕微鏡（商品名：ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ社製）を用いて蛍光観察を行い、３切片２か所の、移植片の中のヒト細胞由来の双極細胞及びアマクリン細胞の割合を調べた。その代表的写真を図９Ａに示す。図９Ａから、ワイルドタイプの網膜組織を移植した場合と比べて、Ｉｓｌｅｔ－１遺伝子欠失させた網膜組織を移植した場合には、Ｃｈｘ１０陽性細胞（すなわち双極細胞）の割合が減少していることが確認された。また、その割合を数値化したグラフを図９Ｂに示す。図９Ｂからも同様な結果が確認された。すなわち、Ｉｓｌｅｔ－１遺伝子を欠失していない網膜組織を移植した場合と比べて、Ｉｓｌｅｔ－１遺伝子を欠失させた網膜組織を移植した場合には、全ヒト細胞に対する、アマクリン細胞（Ａｍ）の割合はほぼ変わらないのに対して、双極細胞（Ｂｐ）の割合が減少していることが分かった。移植片由来（ヒト由来）の双極細胞の割合の減少により、移植片由来の視細胞とホスト側（マウス側）の双極細胞との接触の割合が向上し、該網膜組織の移植後の機能的生着が改善していることが示唆された。

本発明によれば、移植に適した網膜組織を得ることが可能となる。

Claims (32)

1. 双極細胞制御遺伝子が改変された網膜系細胞を含む、移植用細胞集団であって、
   前記双極細胞制御遺伝子は、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子であり、
   前記双極細胞制御遺伝子は、該双極細胞制御遺伝子にコードされるタンパク質の機能を消失させるように改変されており、
   前記網膜系細胞は網膜前駆細胞を含み、
   前記網膜系細胞は、前記網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を全細胞数の１０％以上含む、移植用細胞集団。
2. 前記双極細胞制御遺伝子にコードされるタンパク質の前記機能が、転写制御機能である、請求項１に記載の移植用細胞集団。
3. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、前記双極細胞制御遺伝子にコードされる、転写制御機能を有するタンパク質の発現を消失させる改変である、請求項１又は２に記載の移植用細胞集団。
4. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写制御コファクター結合ドメインからなる群から選択される１以上のドメインに対する改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
5. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、タンパク翻訳領域の開始コドンを含む配列を欠失させる改変である、請求項１～４のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
6. 細胞懸濁液又は細胞凝集体の形態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
7. 前記細胞凝集体が網膜組織を含む、請求項６に記載の移植用細胞集団。
8. 前記ＩＳＬ１遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の移植用細胞集団：
   （１）配列番号１、４又は７で示される塩基配列、
   （２）配列番号１、４又は７で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
   （ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
   （ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
   （ｃ）配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
   の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
9. 前記ＢＨＬＨＥ２３遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の移植用細胞集団：
   （１）配列番号１０又は１３で示される塩基配列、
   （２）配列番号１０又は１３で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
   （ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
   （ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
   （ｃ）配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
   の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
10. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が当該双極細胞制御遺伝子の欠失を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
11. 前記網膜系細胞が、多能性幹細胞由来である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
12. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１１に記載の移植用細胞集団。
13. 前記網膜前駆細胞がＣｈｘ１０陽性細胞であり、前記視細胞前駆細胞がＣｒｘ陽性細胞であり、前記視細胞がリカバリン陽性細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
14. 前記視細胞、又は前記網膜前駆細胞若しくは前記視細胞前駆細胞から移植後に誘導される視細胞の、移植後の機能的生着率が改善される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の移植用細胞集団。
15. 移植用細胞集団の培養物であって、
    （１）請求項１～１４のいずれか一項に記載の移植用細胞集団と、
    （２）前記移植用細胞集団の生存能力を維持するために必要な媒体と、
    を含む、培養物。
16. 下記工程（１）及び（２）を含む、網膜系細胞を含む移植用細胞集団の製造方法：
    （１）多能性幹細胞の双極細胞制御遺伝子を、該双極細胞制御遺伝子にコードされるタンパク質の機能を消失させるように改変して、前記双極細胞制御遺伝子が改変された前記多能性幹細胞を含む細胞集団をインビトロで得る工程であって、前記双極細胞制御遺伝子は、ＩＳＬ１遺伝子及びＢＨＬＨＥ２３遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子である、工程、
    （２）工程（１）で得られた前記多能性幹細胞を含む細胞集団を、インビトロで前記網膜系細胞に分化誘導し、前記網膜系細胞を含む移植用細胞集団を得る工程であって、前記網膜系細胞は網膜前駆細胞を含み、前記網膜系細胞は、前記網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を全細胞数の１０％以上含む、工程。
17. 前記双極細胞制御遺伝子にコードされるタンパク質の前記機能が、転写制御機能である、請求項１６に記載の製造方法。
18. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、前記双極細胞制御遺伝子にコードされる、転写制御機能を有するタンパク質の発現を消失させる改変である、請求項１６又は１７に記載の製造方法。
19. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写制御コファクター結合ドメインからなる群から選択される１以上のドメインに対する改変を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
20. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が、タンパク翻訳領域の開始コドンを含む配列を欠失させる改変である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
21. 前記網膜系細胞を含む移植用細胞集団が、細胞懸濁液又は細胞凝集体の形態である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の製造方法。
22. 前記細胞凝集体が網膜組織を含む、請求項２１に記載の製造方法。
23. 前記ＩＳＬ１遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の製造方法：
    （１）配列番号１、４又は７で示される塩基配列、
    （２）配列番号１、４又は７で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
    （ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
    （ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
    （ｃ）配列番号３、６又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
    の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
24. 前記ＢＨＬＨＥ２３遺伝子が、以下の（１）又は（２）で示される塩基配列を有する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の製造方法：
    （１）配列番号１０又は１３で示される塩基配列、
    （２）配列番号１０又は１３で示される塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、付加、挿入又は置換された塩基配列を有し、かつ、配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、
    （ａ）ＤＮＡ結合能を有する、
    （ｂ）遺伝子の転写を制御する機能を有する、
    （ｃ）配列番号１２又は１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識されうる、
    の内少なくとも１つに該当するタンパク質をコードする塩基配列。
25. 前記双極細胞制御遺伝子の改変が当該双極細胞制御遺伝子の欠失を含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の製造方法。
26. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の製造方法。
27. 前記網膜前駆細胞がＣｈｘ１０陽性細胞であり、前記視細胞前駆細胞がＣｒｘ陽性細胞であり、前記視細胞がリカバリン陽性細胞である、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の製造方法。
28. 前記視細胞、又は、前記網膜前駆細胞若しくは前記視細胞前駆細胞から移植後に誘導される視細胞の、移植後の機能的生着率が改善される、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の製造方法。
29. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の移植用細胞集団を有効成分として含有する、網膜組織の障害に基づく疾患又は網膜組織の損傷状態の治療のための医薬組成物。
30. 細胞シートの形態である、請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の移植用細胞集団を含有する、網膜組織の障害に基づく疾患又は網膜組織の損傷状態の治療薬。
32. 細胞シートの形態である、請求項３１に記載の治療薬。

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