KR20040003053A - Ｖｓｖ-ｇ 슈도타입화 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 사용한 영장류 배아 줄기세포로의 유전자 도입 - Google Patents

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Abstract

수포성 구내염 바이러스(VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질로 슈도타입화된 원숭이 면역부전 바이러스 벡터(SIV)를 사용하여 영장류 유래 배아 줄기세포에 높은 효율로 유전자를 도입하는 것에 성공하였다. 본 발명은 영장류 배아 줄기세포로의 유전자 도입을 위한 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터를 사용한 영장류 유래 배아 줄기세포로의 유전자 도입은 영장류에 있어서의 발생학적 연구, 질환연구, 임상응용, 실험모델 등에 유용하다. 또한, 배아 줄기세포로부터 목적으로 하는 분화세포 또는 분화조직을 얻는 데 유용한, 조직 또는 세포의 특이적 분화를 행하기 위한 유전자나 시약의 어세이나 스크리닝에 유용하다.

Description

ＶＳＶ-Ｇ 슈도타입화 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 사용한 영장류 배아 줄기세포로의 유전자 도입{Gene transfer into primate emborynic stem cells using VSV-G pseudo type simian immunodeficiency virus vector}
배아 줄기세포(이하, ES세포라고도 한다)란 다분화능과 자기복제능을 갖는 미분화세포이다. 또한, ES세포는 손상 후의 조직 수복력을 갖는 것이 시사되어 있다. 이 때문에, ES세포는 각종 질환의 치료용 물질의 스크리닝, 재생의료분야에 있어서 유용하다고 하여 활발히 연구되고 있다. 특히 원숭이 유래의 ES세포는 마우스의 ES세포에 비해 보다 인간에 근접하기 때문에, 인간 질환의 모델로 이용하는데 있어서 적합하여 기대되고 있다.
장래, ES세포를 각종 질환치료나 손상치료에 응용해 나가기 위해서는 ES세포의 유전자 조작이 매우 중요해진다. ES세포의 증식능이나 분화능 등의 세포특성이나 약제감수성 등을 변경하기 위해서는, ES세포의 게놈에 안정한 유전자 도입이 필요해지는 경우가 많다. 안정한 유전자 도입을 위해서는 숙주 게놈에 삽입되는 레트로바이러스 벡터가 일반적으로 사용된다. ES세포와 같이 증식·분화를 반복하는 세포를 표적으로 하는 경우, 도입 유전자가 게놈에 삽입되지 않으면 세포가 분열할 때마다 벡터가 희석되어 버리기 때문이다. 그러나, 유전자 도입에 종래 널리 사용되고 있는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus; MoMLV)에 유래하는 레트로바이러스 벡터로는 마우스 ES세포로의 유전자 도입효율이 낮은 데다가(수% 정도), 그 유전자 발현은 시간이 경과될수록 감소한다. 최근, 마우스 줄기세포 바이러스(MSCV) 유래의 레트로바이러스 벡터를 사용하여 마우스 ES세포로의 유전자 도입효율 개선이 도모되었지만(50% 이상), 시간이 경과될수록 유전자 발현이 감소되는 문제는 해결되지 않았다(Cherry, S. R. et al. Mol. Cell Biol. 20:7419, 2000). 최근, 게놈에 삽입되는 또 다른 하나의 벡터인 렌티바이러스 벡터를 사용하면, 마우스 ES세포에 더욱 효율적으로(80% 이상) 유전자를 도입할 수 있는 것으로 나타났다(Hamaguchi, I. et al. J. Virol. 74:10778, 2000). 그러나, 이 보고에서 도입 유전자 발현의 관찰기간이 수일 내지 2주간 정도로 짧아 도입 유전자의 장기 발현에 대해서는 기재되어 있지 않다.
이상의 ES세포로의 유전자 도입의 보고는 모두 마우스 ES세포를 사용한 것이다. 영장류 ES세포로의 유전자 도입에 관한 보고문헌은 지금으로서는 전무하다. 다만, 학회 발표에서, 영장류 ES세포로의 유전자 도입은 마우스 ES세포로의 유전자 도입에 비해 더욱 곤란한 것으로 지적되고 있을 뿐이다. 영장류 ES세포로의 유전자 도입효율은 예를 들면, MoMLV 벡터에서는 1% 전후, MSCV 벡터에서는 5~10% 전후로 언급되고 있다(IMSUT Symposium for Stem Cell Biology, Tokyo, Japan 2000; Key Stone Sympoia, Pluripotent Stem Cells: Biology and Applications, Durango,Colorado, USA, 2001).
본 발명은 영장류 배아 줄기세포로의 유전자 도입을 위한 원숭이 면역부전 바이러스 벡터에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명은 영장류 ES세포로의 유전자 도입을 위한 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 벡터를 사용한 영장류 ES세포로의 유전자 도입은 인간을 포함하는 영장류에 있어서의 발생학적 연구, 질환연구, 임상응용, 실험모델 등에 유용하다. 또한, ES세포로부터 목적으로 하는 분화세포 또는 분화조직을 얻는 데 유용한, 조직 또는 세포의 특이적 분화를 행하기 위한 유전자나 시약의 어세이나 스크리닝에 유용하다.
본 발명자 등은 영장류 ES세포에 유전자를 도입할 수 있는 벡터를 개발하고, 이를 사용하여 효율적으로 외래 유전자를 영장류 ES세포에 도입하는 방법을 확립하기 위해서, 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV) 벡터를 사용하여 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질에 의해 슈도타입화된 SIV 벡터가 영장류 ES세포에 유의하게 높은 효율로 유전자를 도입하는 능력을 갖는 것을 발견하였다. 원숭이 ES세포에 대한 VSV-G 슈도타입화 SIV 벡터의 유전자 도입효율은 마우스 ES세포와 비교하여 수배~10배 이상 높았다(도 8). SIV 벡터의 ES세포로의 형질도입 효율은 다중감염도(MOI)에 의존하여 증가하고, 높은 MOI에서는 거의 모든 ES세포에 유전자가 도입되었다(도 5). CMV 프로모터의 하류에 연결된 리포터유전자를 포함하는 SIV 벡터가 도입된 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이 ES세포에 있어서 도입 유전자는 장기간 안정하게 발현하여, 2개월 후에도 발현 레벨의 저하는 거의 보이지 않았다(도 6).
이와 같이, 본 발명자 등은 영장류 ES세포에 유전자를 도입할 수 있는 슈도타입화 SIV 벡터를 개발하고, 이를 사용하여 영장류 ES세포에 유전자를 도입하는 방법을 확립하는 것에 성공하였다. 본 발명은 영장류 ES세포로의 유전자 도입을 위한 원숭이 면역부전 바이러스 벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는
(1) VSV-G로 슈도타입화되어 있는, 영장류 배아 줄기세포로의 유전자를 도입하기 위한 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터,
(2) (1)에 있어서, 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 agm주 유래인 벡터,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 자기 불활성화형인 벡터,
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 영장류가 구세계 영장류 긴꼬리 원숭이과(Cercopithecidae) 마카카속(Macaca)인 벡터,
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 외래 유전자를 발현 가능하게 보유하는 벡터,
(6) (5)에 있어서, 외래 유전자가 녹색 형광단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제로부터 선택되는 단백질을 코드하는 유전자인 벡터,
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를영장류 배아 줄기세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 세포에 유전자를 도입하는 방법,
(8) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 도입된 영장류 배아 줄기세포,
(9) (8)의 영장류 배아 줄기세포의 증식 및/또는 분화에 의해 생성된 세포,
(10) ES세포의 증식 또는 분화에 대한 유전자 도입의 효과를 검출하는 방법으로서,
(a) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 벡터를 영장류 배아 줄기세포에 도입하는 공정,
(b) 상기 배아 줄기세포의 증식 또는 분화를 검출하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 「바이러스 벡터」란 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 가리킨다. 「원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 벡터」란 벡터가 SIV 골격을 갖는 것을 가리킨다. 「SIV 골격을 갖는」이란 상기 벡터를 구성하는 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 SIV 게놈에 기초하는 것을 말한다. 예를 들면, 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 SIV 게놈 유래의 패키징 시그날 서열을 갖는 벡터는 본 발명에 있어서 SIV 바이러스 벡터에 포함된다. 본 발명에 있어서 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV)에는 SIV의 모든 주(株) 및 서브타입이 포함된다. SIV 단리주로서는 SIVagm, SIVcpz, SIVmac,SIVmnd, SIVsm, SIVsnm, SIVsyk 등을 예시할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 「재조합」 바이러스 벡터란 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 바이러스 벡터를 말한다. 바이러스 게놈을 코드하는 DNA와 패키징세포를 사용하여 구축한 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터에 포함된다.
VSV-G 슈도타입화 벡터란 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질을 갖는 벡터를 말한다. VSV-G 단백질은 임의의 VSV주에 유래하는 것이어도 된다. 예를 들면, 인디아나(Indiana) 혈청형주(J. Virology 39: 519-528 (1981)) 유래의 VSV-G 단백을 사용할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, VSV-G 단백질은 천연 유래의 단백질로부터 하나 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가 등에 의해 개변되어 있어도 된다. VSV-G 슈도타입화 벡터는 바이러스 생산시에 VSV-G 단백질을 공존시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, VSV-G 발현벡터의 트랜스펙션이나 숙주 염색체 DNA에 삽입한 VSV-G 유전자로부터의 발현 유도에 의해, 패키징세포 내에서 VSV-G를 발현시킴으로써 이 세포로부터 생산되는 바이러스 입자가 VSV-G로 슈도타입화된다. VSV-G 단백질은 한 종류의 당단백이 안정한 3량체를 형성하여 막 위에 존재하기 때문에, 정제과정에서의 벡터 입자의 파괴가 일어나기 어려워 원심에 의한 고농도 농축이 가능해진다(Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13, 1995).
본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 단백질로서, 인간세포에 감염하는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질이 바람직하다. 이와 같은 단백질로서는특별히 제한되지 않지만, 레트로바이러스의 암포트로픽(amphotropic) 엔벨로프 단백질 등을 들 수 있다. 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스(MuLV) 4070A주 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 또한, MuMLV 10A1 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수도 있다(예를 들면, pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)). 또한, 헤르페스 바이러스과의 단백질로서는, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스의 gB, gD, gH, gp85 단백질, EB 바이러스의 gp350, gp220 단백질 등을 들 수 있다. 헤파드나(Hepadna) 바이러스과의 단백질로서는 B형 간염 바이러스의 S 단백질 등을 들 수 있다.
원숭이 면역부전 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)는 원숭이에 있어서의 HIV 유사 바이러스로서 발현되어, HIV와 함께 Primates Lentivirus 그룹을 형성하고 있다(이도 에이지, 하야미즈 마사노리, 원숭이 면역부전 바이러스의 유전자와 감염·병원성. 단백질 핵산 효소: Vol.39, No.8. 1994). 이 그룹은 또한 크게 4개의 그룹으로 분류되어, 1) 인간에 있어서 후천성 면역부전 증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)의 원인인 HIV-1과 침팬지로부터 분리된 SIVcpz를 포함하는 HIV-1 그룹, 2) 수티 만가베이(Sooty Mangabey)Cercocebus atys로부터 분리된 SIVsmm과 붉은털 원숭이Macaca mulatta로부터 분리된 SIVmac 및 인간에 대해 저빈도이지만 병원성을 나타내는 HIV-2(Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997)로 된 HIV-2 그룹, 3) 아프리카 녹색 원숭이Cercopithecus aethiops로부터 분리된SIVagm으로 대표되는 SIVagm 그룹, 4) 맨드릴(Mandrill)Papio sphinx로부터 분리된 SIVmnd로 대표되는 SIVmnd 그룹으로 되어 있다.
이 중, SIVagm 및 SIVmnd에서는 자연 숙주에 있어서의 병원성의 보고는 없고(Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; 하야미즈 마사노리, 닛폰린쇼, 47, 1, 1989), 특히 본 실시예에서 사용한 SIVagm의 한 종류인 TYO-1주는 자연 숙주에서도, 사이노몰거스 원숭이Macaca facicularis, 붉은털 원숭이Macaca mulatta에 대한 실험감염에서도 병원성을 나타내지 않는 것이 보고되어 있다(Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), 367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990). SIVagm의 인간에 대한 감염, 발증에 대해서는 보고가 없어, 인간에 대한 병원성은 알려지지 않지만, 일반적으로 영장류에 있어서의 렌티바이러스는 종특이성이 높아 자연숙주로부터 다른 종으로 감염, 발증된 예는 적고, 그 발증도 저빈도 또는 진행이 느린 경향이 있다(Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997). 따라서, SIVagm, 특히 SIVagm TYO-1주를 기본으로 하여 제작한 바이러스 벡터는 HIV-1이나 다른 렌티바이러스를 기본으로 한 벡터와 비교하여 안전성이 높다고 생각되어, 본 발명에 있어서 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 원숭이 면역부전 바이러스 벡터는 다른 레트로바이러스의 게놈 RNA 서열의 일부를 갖고 있어도 된다. 예를 들면, 인간 면역부전 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV), 고양이 면역부전 바이러스 FelineImmunodeficiency Virus(FIV)(Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998), 염소 관절염 뇌염 바이러스 Caprine Arthritis Encephalitis Virus(CAEV)(Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998) 등의 다른 렌티바이러스의 게놈 서열의 일부를 원숭이 면역부전 바이러스의 게놈의 일부로 치환한 키메라 서열을 갖는 벡터도, 본 발명의 원숭이 면역부전 바이러스 벡터에 포함된다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터로서는 LTR(long terminal repeat)에 개변을 가하는 것도 가능하다. LTR은 레트로바이러스에 특징적인 서열이고, 바이러스 게놈의 양 끝에 존재하고 있다. 5' LTR은 프로모터로서 작용하고, 프로바이러스로부터의 mRNA의 전사를 촉진시킨다. 따라서, 바이러스 입자 내에 패키징되는 바이러스 RNA 게놈을 코드하는 유전자 트랜스퍼 벡터의 5' LTR 프로모터 활성을 갖는 부분을 다른 강력한 프로모터로 치환하면, 유전자 트랜스퍼 벡터의 mRNA 전사량이 증대하고, 패키징 효율이 상승하며, 벡터 역가를 상승시킬 가능성이 있다. 더욱이, 예를 들면 렌티바이러스의 경우, 5' LTR은 바이러스 단백질 tat에 의한 전사활성의 증강을 받는 것이 알려져 있고, 5' LTR을 tat 단백질에 의존하지 않는 프로모터로 치환함으로써 패키징 벡터로부터 tat를 제거하는 것이 가능해진다. 또한, 세포에 감염하여 세포 내에 침입한 바이러스 RNA는 역전사된 후, 양 끝의 LTR을 결합시킨 고리형상 구조가 되고, 결합부위와 바이러스의 인테그라제가 공역하여 세포의 감염체 내에 삽입된다. 프로바이러스로부터 전사되는 mRNA는 5' LTR 내의 전사 개시점으로부터 하류, 3' LTR의 polyA 서열까지이고, 5' LTR 프로모터 부분은 바이러스 내에패키징되지 않는다. 따라서, 프로모터를 치환했다고 해도 표적세포의 염색체에 삽입된 부분에는 변화가 없다. 이상의 사실로부터, 5' LTR 프로모터의 치환은 보다 역가가 높고 안전성이 높은 벡터를 제작하는 것으로 이어진다고 생각된다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터의 5'측 프로모터의 치환을 행하여 패키징되는 벡터의 역가를 상승시킬 수 있다.
또한, 3' LTR의 서열을 부분적으로 삭제하고, 표적세포로부터 전장의 벡터 mRNA가 전사되는 것을 방지하는 자기 불활성화형 벡터(Self Inactivating Vector: SIN 벡터)의 제작에 의해 안전성을 상승시키는 것도 가능하다. 표적세포의 염색체에 침입한 렌티바이러스의 프로바이러스는 3' LTR의 U3 부분을 5'말단에 결합시킨 형태가 된다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터의 전사산물은 역전사 후, 표적세포의 염색체에 삽입된 상태에서는 5'말단에 U3이 배치되고, 거기서부터 유전자 트랜스퍼 벡터로부터의 전사산물과 동일한 구조를 갖는 RNA가 전사되게 된다. 만약, 표적세포 내에 렌티바이러스 또는 그와 유사한 단백질이 존재한 경우, 전사된 RNA가 다시 패키징되어 다른 세포로 재감염될 가능성이 있다. 또한, 3' LTR의 프로모터에 의해 바이러스 게놈의 3'측에 위치하는 숙주 유래의 유전자가 발현되어 버릴 가능성이 있다(Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997). 이 현상은 레트로바이러스벡터에 있어서 이미 문제가 되어 회피방법으로서 SIN 벡터가 개발되었다(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10), 3194-8, 1986). 유전자 트랜스퍼 벡터 상의 3' LTR의 U3부분을 결실시킴으로써 표적세포 내에서는 5' LTR이나 3' LTR의 프로모터가 없어지기 때문에, 전장의 RNA나 숙주 유전자의 전사가 일어나지 않는다. 따라서, 내부 프로모터로부터의 목적 유전자의 전사만 행해지게 되어 안전성이 높은 고발현의 벡터로 되는 것이 기대된다. 이와 같은 벡터는 본 발명에 있어서 적합하다. SIN 벡터의 구축은 공지의 방법 또는 실시예 1~4에 기재된 방법 등에 따르면 된다.
레트로바이러스 벡터 등 그 게놈에 LTR 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 유전자치료의 문제점 중 하나가 도입 유전자의 발현이 점점 저하되는 것이다. 이들 벡터는 숙주 게놈에 삽입되면 숙주 측의 메커니즘에 의해 그 LTR이 메틸화되고, 도입 유전자의 발현이 억제되어 버리는 것이 원인의 하나로 생각되고 있다(Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994). 자기 불활성화(SIN)형 벡터에서는, 숙주 게놈에 삽입되면 LTR 서열의 대부분을 잃기 때문에 LTR의 메틸화에 의한 유전자 발현의 감소를 받기 어려운 이점이 있다. 실시예에 나타내는 바와 같이, 유전자 트랜스퍼 벡터의 3' LTR의 U3 영역을 다른 프로모터 서열로 치환하여 제조한 자기 불활성화형 벡터는 영장류 ES세포에 도입 후, 2개월 이상에 걸쳐서 안정한 발현을 유지하는 것이 판명되었다. 이와 같이, LTR U3 영역의 개변에 의해 자기 불활성화하도록 설계된 SIN 벡터는 본 발명에 있어서 특히 적합하다. 구체적으로는, 3' LTR U3 영역의 하나 또는 복수의 염기가 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 벡터는 본 발명에 포함된다. 이 U3 영역은 단순히 결실시켜도 되고, 또는 이 영역에 다른 프로모터를 삽입해도 된다. 이와 같은 프로모터로서는 예를 들면 CMV 프로모터, EF1 프로모터 또는 CAG 프로모터 등을들 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 코드되는 외래유전자는 LTR 이외의 프로모터에 의해 전사되도록 설계하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기와 같이 LTR U3 영역을 비LTR 프로모터로 치환한 경우에는, 이 개변 LTR에 의해 외래 유전자의 발현을 구동하는 것이 바람직하다. 또는 실시예에 나타내는 바와 같이, LTR 영역과는 별개의 위치에 비LTR 프로모터를 배치하고 그 하류에 외래 유전자를 연결함으로써, LTR에 의존하지 않고 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 외래 유전자의 발현을 비LTR 프로모터에 의해 구동하도록 구축된 SIV 벡터는 ES세포에 있어서 그 외래 유전자를 장기간 안정하게 발현하는 것으로 나타났다. 따라서, 외래 유전자의 상류에 비LTR 프로모터가 연결되어 있어, 이 프로모터로부터 상기 외래 유전자가 전사되는 벡터는 본 발명에 있어서 특히 적합하다. 비LTR 프로모터로서는, 예를 들면 CMV 프로모터, EF1 프로모터 또는 CAG 프로모터를 들 수 있고, 특히 CMV 프로모터가 바람직하다. 이와 같은 벡터는 특히 상기의 자기 불활성화(SIN)형 벡터에 있어서 구축함으로써 높은 효과를 발휘한다.
HIV 벡터를 비롯한 렌티바이러스 벡터는 숙주 게놈이 HIV 프로바이러스를 이미 보유하고 있는 경우, 외래 벡터와 내인성 프로바이러스 사이에 재조합이 일어나 복제가능 바이러스가 발생하지 않을까 하는 위험이 지적되고 있다. 이것은 장래 실제로 HIV 감염환자에게 HIV 벡터를 사용할 때에는 아마도 큰 문제가 될 것이다. 이번에 사용한 SIV 벡터는 HIV와의 상동서열은 거의 없는 데다가 바이러스 유래의 서열을 80.6% 제거한 복제불능 바이러스이고, 이러한 위험성은 매우 적어 다른 렌티바이러스 벡터에 비해 안전성이 높다. 본 발명의 SIV 벡터는 바람직하게는, 이 벡터가 유래하는 SIV 게놈 서열의 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상이 제거된 복제불능 바이러스이다.
레트로바이러스 생산에는 숙주세포에서 패키징 시그날을 갖는 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA를 전사시켜, gag, pol 단백질 및 엔벨로프 단백질의 존재하에서 바이러스 입자를 형성시킨다. 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에 코드되는 패키징 시그날 서열은 이 서열에 의해 형성되는 구조를 유지할 수 있도록 가능한 한 길게 삽입하는 것이 바람직한 반면, 상기 벡터 DNA 상의 패키징 시그날과 gag, pol 단백질을 공급하는 패키징 벡터 사이에서 일어나는 재조합에 의한 야생형 바이러스의 출현빈도를 억제하기 위해서는 이들 벡터 사이의 서열의 중복을 최소한으로 할 필요가 있다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 DNA의 구축에 있어서는 패키징 효율 및 안전성 둘 다 만족시키기 위해, 패키징에 필요한 서열을 포함할 수 있는 한 짧은 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 실시예에서 사용한 SIVagm 유래의 패키징 벡터의 경우는 HIV 벡터는 패키징되지 않기 때문에, 사용되는 시그날의 유래로서는 SIV에만 제한된다고 생각된다. 단, HIV 유래의 패키징 벡터를 사용한 경우, SIV 유래의 유전자 트랜스퍼 벡터도 패키징되기 때문에, 재조합 바이러스의 출현빈도를 저하시키기 위해 상이한 렌티바이러스 유래의 유전자 트랜스퍼 벡터와 패키징 벡터를 조합하여 벡터 입자를 형성시키는 것이 가능하다고 생각된다. 이와 같이 제조된 SIV 벡터도 본 발명의 벡터에 포함된다. 이 경우 영장류의 렌티바이러스 사이의 재조합(예를 들면, HIV와 SIV)인 것이 바람직하다.
유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에서는 gag 단백질이 발현되지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 바이러스 gag 단백질은 생체에 있어서 이물질로서 인식되어 항원성이 나타날 가능성이 있다. 또한, 세포의 기능에 영향을 미칠 가능성도 있다. gag 단백질을 발현하지 않도록 하기 위해서는 gag 개시코돈의 하류에 염기의 부가나 결실 등에 의해 격자 이동(frame shift)되도록 개변할 수 있다. 또한, gag 단백질의 코드 영역 일부를 결실시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 바이러스의 패키징에는 gag 단백질의 코드 영역의 5'측이 필요하다고 되어 있다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터에 있어서는 gag 단백질의 C 말단측의 코드 영역을 결실하고 있는 것이 바람직하다. 패키징 효율에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 가능한 한 넓게 gag 코드 영역을 결실시키는 것이 바람직하다. 또한, gag 단백질의 개시코돈(ATG)을 ATG 이외의 코돈으로 치환하는 것도 바람직하다. 치환하는 코돈은 패키징 효율에 대한 영향이 적은 것을 적절히 선택한다. 이것으로 구축된 패키징 시그날을 갖는 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA를 적당한 패키징 세포에 도입함으로써 바이러스 벡터를 생산시킬수 있다. 생산시킨 바이러스 벡터는 예를 들면 패키징 세포의 배양상청으로부터 회수할 수 있다.
패키징 세포에 사용되는 세포로서는 일반적으로 바이러스 생산에 사용되는 세포주이면 제한은 없다. 인간의 유전자치료용으로 사용되는 것을 고려하면 세포의 유래로서는 인간 또는 원숭이가 적당하다고 생각된다. 패키징 세포로서 사용될 수있는 인간 세포주로서는 예를 들면, 293세포, 293T세포, 293EBNA세포, SW480세포, u87MG세포, HOS세포, C8166세포, MT-4세포, Molt-4세포, HeLa세포, HT1080세포, TE671세포 등을 들 수 있다. 원숭이 유래 세포주로서는 예를 들면, COS1세포, COS7세포, CV-1세포, BMT10세포 등을 들 수 있다.
벡터가 보유하는 외래유전자로서는 특별히 제한은 없어, 단백질을 코드하는 핵산이어도 되고, 또한 예를 들면, 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이어도 된다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 인공적인 단백질로서는 예를 들면, 다른 단백질과의 융합 단백질, 도미넌트 네가티브 단백질(수용체의 가용성 분자 또는 막결합형 도미넌트 네가티브 수용체를 포함한다), 결실형 세포접착분자 및 가용형 세포표면분자 등이어도 된다. 또한, 외래 유전자로서는 유전자의 도입효율이나 발현 안정성 등을 평가하기 위한 마커 유전자이어도 된다. 마커 유전자로서는 예를 들면, 녹색 형광단백질(이하, GFP라고도 한다), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 등을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 특히, GFP를 코드하는 유전자가 바람직하다.
본 발명의 슈도타입 바이러스 벡터는 실질적으로 순수하도록 정제할 수 있다. 정제방법은 필터여과, 원심분리 및 칼럼정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 벡터용액을 0.45 ㎛의 필터로 여과한 후, 42500×g, 90분, 4℃에서 원심을 행함으로써 벡터를 침전·농축할 수 있다.
본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는 필요에 따라 약학적으로 허용되는 목적으로 하는 담체 또는 매체와 적절히 조합하여 조성물로 할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체」란, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하고, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 구체적으로는 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 배양액, 혈청, 인산완충 생리식염수(PBS) 등과 적절히 조합하는 것을 생각할 수 있다. 더욱이, 그 외에도 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 시약 또는 의약으로서 유용하다. 예를 들면, ES세포에 대한 유전자 도입시약으로서, 또는 유전자치료를 위한 의약으로서 본 발명의 조성물을 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터를 인간을 포함하는 영장류의 ES세포에 접촉시킴으로써, 상기 벡터가 포함하는 핵산을 상기 ES세포에 도입할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 벡터를 영장류 ES세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 세포에 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 VSV-G 슈도타입화되어 있는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터의 영장류 ES세포로의 유전자 도입을 위한 사용에 관한 것이다. 도입의 대상이 되는 영장류 ES세포에 특별히 제한은 없어, 예를 들면 목적으로 하는 원숭이 ES세포를 사용할 수 있다. 전세계에 약 200 종류의 원숭이가 알려져 있다. 고등 영장류는 이하의 2그룹으로 크게 나누어진다.
(1) 신세계 영장류(New World Primates)
마모셋 원숭이(Callithrix jacchus)가 널리 알려져 실험용 영장류의 하나로서 사용되고 있다. 신세계 영장류의 발생은 배(胚) 또는 태반의 구조가 구세계 영장류의 것과 상이한 면도 있지만, 기본적으로는 유사하다.
(2) 구세계 영장류(Old World Primates)
구세계 영장류는 인간에 매우 근접한 영장류이다. 붉은털 원숭이(Macaca mulatta)나 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)가 알려져 있다. 일본 원숭이(Macaca fuscata)는 사이노몰거스 원숭이와 동일한 속(마카카속)이다. 구세계 영장류의 발생은 인간의 발생에 매우 유사하다.
본 발명에 사용되는 「원숭이」란 영장류, 구체적으로는 신세계 영장류 및 구세계 영장류를 말한다. 본 발명의 벡터에 의한 유전자 도입의 대상이 되는 원숭이 유래의 ES세포로서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 마모셋 원숭이 ES세포(Thomson, J. A. et al., Biol. Reprod. 55, 254-259, (1996)), 붉은털 원숭이 ES세포(Thomson, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7844-7848, (1995)), 사이노몰거스 원숭이 ES세포(실시예 참조) 등을 들 수 있다. 구세계 영장류는 인간에 매우 근접한 영장류이고, 또한 인간의 발생에 유사하기 때문에, 인간에 가까운 질환모델이나 각종 질환치료제의 스크리닝 시스템으로서 이용되는 것이 기대된다. 따라서, 본 발명의 벡터의 도입대상으로서는 구세계 영장류가 바람직하고, 특히 일본 원숭이, 붉은털 원숭이, 사이노몰거스 원숭이 등의 마카카속의 원숭이 유래의 ES세포가 바람직하다.
영장류로부터의 ES세포의 조제는 공지의 방법 또는 실시예에 기재된 방법에 따라서, 또는 이에 준하여 행할 수 있다. 예를 들면, 포배기 배아(blastocyst)를 발생시키고, 이것으로부터 ES세포를 얻을 수 있다[예를 들면, 국제공개 제96/22362호 팜플렛 등 참조]. 구체적으로는 예를 들면, 포배기 배아로부터 얻어지는 내부세포 덩어리를 피더세포(feeder cell) 상 또는 백혈구 증식억제인자[LIF, 분화저해인자(DIF)라고도 표기된다] 중에서 배양함으로써 ES세포를 수립할 수 있다.
피더세포로서는 임신 12일~16일째인 마우스 태아의 섬유아세포의 초대 배양세포, 마우스 태아 섬유아세포주인 STO세포 등을 마이토마이신 C나 X선으로 처리하여 얻어진 세포 등을 들 수 있다. 이러한 마우스 유래의 피더세포는 대량으로 조제할 수 있는 점에서 실험 등에 유리하다. 피더세포의 제작은 예를 들면, 후술하는 실시예에 기재된 방법 등에 의해 행할 수 있다. 피더세포는 예를 들면, MEM 배지(Minimum Essential Medium Eagle)를 사용하여 젤라틴 코팅한 배양용기에 파종한다. 피더세포는 배양용기를 빈틈없이 덮을 정도까지 파종하면 된다. 내부세포 덩어리는 피더세포가 파종된 배양용기 중의 MEM 배지를 ES세포 배양용 배지(실시예 6의 표 3 참조)로 교환한 피더세포 상에 파종한다.
본 발명의 벡터를 사용한 영장류 ES세포로의 유전자 도입에 있어서는 그 조작은 상기 벡터를 영장류 ES세포에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법에 의해 행해진다. 즉, 예를 들면, 유전자를 도입하고자 하는 ES세포를 피더세포로 덮인 배양접시에 파종하고, 여기에 SIV 벡터를 첨가한다. 이 때, 예를 들면, 8 ㎍/㎖ 정도의 폴리브렌(polybrene)을 동시에 첨가함으로써 도입효율을 향상시킬 수 있다. 도입시의 MOI(다중감염도) (세포당 감염바이러스 입자수)는 예를 들면, 0.1~1000, 보다 바람직하게는 1~100, 더욱 바람직하게는 2~50(예를 들면 5~10)으로 행할 수 있다. 통상, 벡터 첨가를 복수회 행하지 않아도, 1회의 벡터 첨가에 의해 대부분의 ES세포로 유전자를 도입할 수 있다. 본 발명의 벡터에 있어서는 레트로넥틴을 사용하지 않아도 매우 높은 유전자 도입효율을 얻어질 수 있다는 이점을 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 VSV-G 슈도타입 바이러스 벡터가 도입된 영장류 ES세포, 및 상기 세포의 증식 및/또는 분화에 의해 생성된 세포에 관한 것이다. ES세포의 분화 유도는 예를 들면, 사이토카인 등의 공지의 분화·증식인자나 세포외 매트릭스 등의 기질 첨가, 다른 세포와의 공배양, 개체로의 이입 등에 의해 행할 수 있다(니와 히토시 「ES세포의 분화운명결정기구」 단백질 핵산 효소 45: 2047-2055, 2000; Rathjen, P. D. et al., Reprod. Fertil. Dev. 10: 31-47, 1998).
예를 들면, 배체(胚體)외 조직 기원의 세포종의 분화유도는 이하와 같은 방법으로 행할 수 있다.
배체외 내배엽 배양체(embryoid body) 형성
영양 외배엽 Oct-3/4 발현억제
또한, 미분화세포 기원의 세포종의 분화유도법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다:
원시 외배엽 배양체 형성
HepG2 배양상청
외배엽 기원의 세포종의 분화유도법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다:
신경세포 배양체 형성 + 레티노인산 처리
배양체 형성 + bFGF
배양체 형성 + 레티노인산 처리 + Sox2 양성세포의
선별
아교세포 배양체 형성 + 레티노인산 처리
배양체 형성 + bFGF
상피세포 배양체 형성
신경능선세포(neural crest cell) 등에 기원을 갖는 세포종의 분화유도법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다:
색소세포 배양체 형성
OP9 + ST2 + 덱사메타손 + SOL
스테로이드 생산세포 SF1 과잉발현
중배엽 기원의 세포종의 분화유도법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다:
혈액(줄기)세포 배양체 형성 + IL-3 + IL-6 + 피더세포
OP9 + 피더세포
flk1 양성세포의 선별
혈관 내피세포 flk1 양성세포의 선별
파골세포 배양체 형성 + 레티노인산 처리
심근세포 배양체 형성
배양체 형성 + αMHC 양성세포의 선별
골격근세포 배양체 형성
평활근세포 배양체 형성
배양체 형성 + DMSO
지방세포 배양체 형성 + 레티노인산 처리 + 인슐린 + T3
내배엽 기원의 세포종의 분화유도법으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다:
인슐린 생산세포 배양체 형성
본 발명의 슈도타입 바이러스 벡터에 의해 유전자 도입한 ES세포, 및 상기 ES세포로부터 분화된 세포, 조직, 장기 등은 각종 약제의 어세이나 스크리닝에 유용하다. 예를 들면, 영장류 ES세포로의 유전자 도입을 통하여, 조직 또는 세포, 특히 바람직하게는 영장류 유래의 조직 또는 세포의 특이적 분화를 행하기 위한 유전자나 약제 등의 효과를 평가하거나 스크리닝할 수 있다. 본 발명에는 조직 또는 세포의 특이적인 분화를 행하기 위한 유전자 또는 약제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 ES세포의 증식 또는 분화에 대한 유전자 도입의 효과를 검출하는 방법으로서, (a) 본 발명의 벡터를 영장류 ES세포에 도입하는 공정, (b) 상기 ES세포의 증식 또는 분화를 검출하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 벡터의 ES세포로의 도입은 본 발명의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 목적으로 하는 영장류 ES세포에 접촉시키는 공정에 의해 실시할 수 있다. ES세포의 증식은 세포수의 계수(計數)나 MTT 어세이 등의 미토콘드리아 활성의 측정 등의 공지의 방법에 의해 검출할 수 있다. 또한 ES세포의 분화는 공지의 분화 마커 유전자의 발현의 검출, 또는 세포나 조직 등의 형태학적 또는 생화학적 측정 등에 의해 검출할 수 있다(니와 히토시 「ES세포의 분화운명결정기구」 단백질 핵산 효소 45:2047-2055, 2000; Rathjen, P. D. et al., Reprod. Fertil. Dev. 10: 31-47, 1998). 도입 벡터에는효과를 검출하고자 하는 목적으로 하는 외래 유전자를 보유시킬 수 있다. 또한, 예를 들면 음성대조군 등으로서, ES세포로의 벡터 자신의 도입에 의한 효과를 검출하는 경우에 있어서는 외래 유전자를 포함하지 않는 벡터를 사용할 수 있다. 상기의 검출방법을 사용하여, 영장류 ES세포의 증식 또는 분화에 영향을 미칠 수 있는 유전자를 평가하거나 스크리닝하는 것이 가능하다. 스크리닝은 상기 검출방법의 공정 (a) 및 (b)에 이어서, (c) 상기 ES세포의 증식 또는 분화를 조절하는 활성을 갖는 도입 유전자를 선택하는 공정을 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법도 상기 본 발명의 유전자 도입의 효과를 검출하는 방법에 포함된다.
이러한 방법을 사용한 스크리닝의 일례로서 영장류 ES세포로부터 기능세포를 분화시키는 유전자의 스크리닝을 들 수 있다.
예를 들면, 영장류 ES세포로부터 췌장 β세포를 분화시킬 때에 있어서, 유전자 A, B, C, D, E 중 어느 것이 필요한지, 어떤 조합이 가장 적합한지, 또한 어떤 순서로 유전자 도입하는 것이 가장 적절한지를 조사할 때에는 이들 유전자를 영장류 ES세포에 효율적이고 또한 간단하게 도입하는 기술이 유용하다. 본 벡터는 그러한 요구를 충족시킨다. 예를 들면, 유전자 A, B, C, D, E를 발현하는 본 발명의 벡터를 구축하고, 이들을 각종 조합이나 순서로 영장류 ES세포 또는 그 분화세포에 도입한다. 유전자가 도입된 세포의 분화를 검출함으로써, 유전자 도입의 효과를 알 수 있다.
또한, 예를 들면 유전자를 체내에 투여하는 유전자치료에 있어서 부작용의 예견에 본 발명의 벡터를 이용하는 것도 유용하다.
유전자 X의 각 장기나 조직으로의 독성이나 부작용은 마우스나 원숭이 개체로의 투여실험에서 어느 정도는 파악할 수 있다. 그러나 유전자 X가 각 조직 줄기세포에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지는 지금까지의 방법으로는 검출할 수 없다. 이 유전자 X는 어느 특정의 조직 줄기세포로부터 기능세포로의 분화를 방해할 가능성이 있다. 예를 들면, 간장 줄기세포의 분화를 방해하는 경우는 간염을 앓았을 때나 간염절제술을 시행했을 때 비로소 그 방해가 명확해진다. 즉 유전자 X에 의해 간장 줄기세포의 분화가 방해되어 필요할 때 간장의 재생이 진행되지 않는 심각한 사태가 일어날 수 있다. 이러한 문제는 통상의 동물실험에서 반드시 예견할 수는 없다. 본 벡터를 사용하면, 매우 효율적으로 유전자 X를 영장류 ES세포로 도입할 수 있고, 이 유전자 도입 ES세포를 여러 조직 줄기세포나 또한 기능세포까지 분화시킴으로써, 유전자 X의 안전성을 여러 분화단계에서 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 벡터를 이용한 어세이 또는 스크리닝은 영장류, 특히 인간이나 원숭이에 있어서의 발생학적 연구, 질환연구, 임상응용, 실험모델 등에 유용하고, 또한 목적으로 하는 분화세포 또는 분화조직을 얻는 데 유용한 유전자 및 시약을 스크리닝할 수 있다고 하는 우수한 효과를 발휘한다.
상기의 스크리닝 방법에 있어서, ES세포로부터 목적으로 하는 조직 또는 세포로의 특이적 분화는 예를 들면, 목적으로 하는 조직 또는 세포에 특이적인 마커의 발현을 지표로 하여 평가할 수 있다. 상기 목적으로 하는 조직 또는 세포에 특이적인 마커로서는 조직 또는 세포 특이적 항원을 들 수 있고, 예를 들면, 신경계 전구세포의 마커로서는 중간경(中間徑) 필라멘트인 네스틴(nestin) 등을 들 수 있다. 이러한 특이적 마커는 상기 마커에 대한 항체를 사용하여 관용의 ELISA, 면역 염색 등에 의해 검출해도 되고, 상기 마커를 코드하는 핵산을 사용하여 관용의 RT-PCR, DNA 어레이 하이브리다이제이션 등에 의해 검출해도 된다. 또한 「핵산」이란, 게놈 DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 등을 의미한다. 본 스크리닝법에 의해 얻어진 유전자 및 시약은 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터가 도입된 ES세포, 및 상기 ES세포로부터 분화된 분화세포 또는 분화조직도 본 발명의 범위에 포함된다. 분화세포 및 분화조직은 상기 조직 또는 세포에 특이적인 마커의 발현, 형태학적 특징의 관찰에 의해 동정할 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 영장류의 임의의 유전성 질환의 유전자치료에도 응용할 수 있다. 대상이 되는 질환은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대상이 될 수 있는 질환과 그 단일원인 유전자로서는 고셔병(Gaucher disease)에 있어서는 β-세레브로시다제(제20염색체), 혈우병에 있어서는 혈액응고 제8인자(X염색체) 및 혈액응고 제9인자(X염색체), 아데노신데아미나제 결손증에 있어서는 아데노신데아미나제, 페닐케톤뇨증에 있어서는 페닐알라닌 히드록실라제(제12염색체), Duchenne형 근디스트로피에 있어서는 디스트로핀(X염색체), 가족성 고콜레스테롤 혈증에 있어서는 LDL 리셉터(제19염색체), 낭포성 섬유증에 있어서는 CFTR 유전자의 염색체로의 삽입 등을 들 수 있다. 이들 이외의 복수의 유전자가 관여하고 있다고 생각되고 있는 대상질환으로서는 알츠하이머, 파킨슨병 등의 신경 변성질환, 허혈성 뇌장애, 치매 또는 에이즈 등의 난치성 감염증 등이 고려된다.
또한, 유전자 도입한 ES세포로부터 분화된 세포, 조직, 장기를 질환치료를 위해 사용하는 것도 고려할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 결손이나 부족에 의해 발증하는 질환에 대해서, 영장류 ES세포의 염색체에 해당 유전자를 도입하고, 이를 체내에 이식함으로써 결손하는 유전자를 보충하고, 체순환하는 효소, 성장인자 등의 부족을 보충하는 치료를 고려할 수 있다. 또한, 장기이식에 관련하는 유전자치료에 관해서는 인간 이외의 동물 도너의 조직적합성 항원을 인간형으로 바꾸는 것을 고려할 수 있다. 이것으로, 이종이식의 성공률을 높이는 응용이 가능해진다.
또한, 본 벡터를 사용하여 유전자를 도입한 ES세포가 원숭이 유래의 것인 경우, 당해 ES세포를 질환모델 원숭이에 이식함으로써, 인간 질환의 치료모델로서 유용한 시스템을 제공할 수 있다. 인간 질환의 모델로서 여러 질환모델 원숭이가 알려져 있고, 예를 들면, 인간의 파킨슨병모델 원숭이는 인공적으로 작출가능하고, 인간의 당뇨병의 충실한 모델로서는 자연발증의 당뇨병 원숭이가 많이 사육되고, 또한 원숭이의 SIV 감염증이 인간의 HIV 감염증의 충실한 모델로서 잘 알려져 있다. 이러한 질환에 있어서, 인간 ES세포를 사용한 임상응용을 행하기 전에, 전임상 시험으로서 원숭이 ES세포를 질환모델 원숭이에 이식하는 시스템은 매우 유용하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 원숭이 면역부전 바이러스 클론 SIVagmTY01을 사용한 렌티바이러스 벡터 시스템의 개요를 나타내는 도면이다.
도 2는 5' LTR의 프로모터 서열인 U3 영역을 다른 프로모터 서열로 치환한SIVagm 유전자 트랜스퍼 벡터의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 SIVagm 유전자 트랜스퍼 벡터의 3' LTR의 U3 영역을 다른 프로모터 서열로 치환한 벡터의 구조와, 이것이 표적세포에서 역전사된 결과 생성된다고 예상되는 5' LTR의 U3프로모터 영역의 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 EGFP를 리포터로서 갖는 SIN 벡터(pGCL3L/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3' LTRΔU3)의 구조를 나타낸 도면이다("SIN-GFP/SIV", 또는 "SIN CMV EGFP"라고도 약기한다). 3' U3를 제거하고, 자기 불활성 벡터(Self-Inactivating vector; SIV vector)화하였다.
도 5는 SIV 벡터에 의해 EGFP 유전자를 도입한 ES세포(CMK-1주)에 있어서 EGFP 발현의 시간경과를 나타내는 도면이다. 가로축은 유전자 도입 당일을 일수 0으로 하여 그 후의 일수를 나타낸다. 세로축은 CMK-1에 있어서 EGFP 발현세포의 비율(%)을 나타낸다. CMK-1의 유전자 도입효율은 실시예에 기재한 "CMK-1의 유전자 도입효율의 보정식"으로 나타낸 방법에 의해 피더세포 혼입분의 영향을 제외한 숫자를 나타내고 있다. 유전자 도입 2일 후에는 MOI 100에서 90% 이상, MOI 10에서 약 80%, MOI 1에서 약 60%로, MOI 의존성이 매우 높은 유전자 도입효율이 인지되고, 또한 이 높은 유전자 도입효율은 약 2개월 이상 지속되었다.
도 6은 SIV 벡터에 의해 EGFP 유전자를 도입한 ES세포(CMK-1주)에 있어서의 EGFP 평균 형광강도의 시간경과를 나타낸 도면이다. 가로축은 유전자 도입 당일을 일수 0으로 하여 그 후의 일수를 나타낸다. 세로축은 FACS 해석으로 얻어진 EGFP 평균 형광강도(--)를 나타낸다. 약 2개월 이상에 걸쳐서 EGFP 발현세포의 평균 형광강도는 거의 저하되지 않았다.
도 7은 SIV 벡터로 유전자 도입한 ES세포(CMK-1주)의 EGFP 발현의 형광 현미경상을 나타내는 사진이다.
위 패널: 유전자 도입 후 21일 경과(일수 21)한 ES세포의 형광 현미경에 의한 관찰. EGFP 형광을 발하고 있는 CMK-1이 섬형상으로 떠올라 있다.
아래 패널: 유전자 도입 후 62일 경과(일수 62)한 ES세포의 형광 현미경에 의한 관찰. 여전히 EGFP 형광을 발하고 있는 CMK-1이 섬형상으로 떠올라 있다.
도 8은 SIV 벡터에 의한 마우스 및 원숭이 ES세포(CMK-1주)로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 세로축은 피더세포의 혼입분의 영향을 제외한 ES세포의 유전자 도입효율(%)을 나타냈다. 원숭이 ES세포의 유전자 도입효율이 마우스 ES세포의 유전자 도입효율 보다도 높은 것이 인지되었다. SIV를 기본으로 하는 벡터를 사용하는 경우는, SIV가 자연숙주로 하는 원숭이 등의 영장류 세포가 마우스 등의 다른 종의 세포에 비해 효율적으로 유전자 도입되는 것으로 생각된다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 전체를 통하여 인용된 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 삽입된다.
[실시예 1] SIV 벡터의 구축
벡터 시스템의 구축에는 비병원성 아프리카 녹색 원숭이 면역부전 바이러스의 클론인 SIVagmTYO1을 사용하였다. 도 1에 벡터 시스템의 개요를 나타낸다. 뉴클레오티드의 번호는 이하 전부 바이러스 RNA의 전사개시점을 +1로 하여 표기하였다. SIVagmTYO1을 삽입한 플라스미드로서는 pSA212(J. Viol., vol. 64, pp307-312, 1990)를 사용하였다. 또한, 라이게이션 반응은 모두 Ligation High(Toyobo)를 사용하여 첨부설명서에 따라서 행하였다.
a. 패키징 벡터의 구축
우선, vif와 tat/rev의 제1엑손을 포함하는 영역(5337-5770)에 상당하는 DNA 단편을 프라이머 1F(서열번호: 1)와 1R(서열번호: 2)을 사용하여 pSA212를 주형(template)으로 한 PCR에 의해 얻었다. PCR 프라이머에 제한효소부위인 EcoRI 부위를 부가함으로써 DNA 단편의 3' 말단에 EcoRI 부위를 갖는 단편을 제조하였다. PCR 단편을 BglII와 EcoRI에 의해 절단한 후, 아가로스겔 전기영동과 Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)으로 정제하였다. 이상과 같이 하여 얻은 DNA 단편과 gag/pol 영역을 코드하는 DNA 단편(XhoI(356) 부위부터 BglII(5338) 부위까지를 포함한다)을 pBluescript KS+(Stratagene)의 XhoI-EcoRI 부위에 라이게이션하였다. 이어서, Rev responsive element(RRE)와 tat/rev의 제2엑손을 포함하는 영역(6964-7993)에 상당하는 DNA 단편을 PCR로 증폭하였다. 상기의 PCR 단편과 동일하게 프라이머 2F(서열번호: 3)와 2R(서열번호: 4)을 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR에 의해 3' 말단에 NotI 부위를 부가하고, EcoRI와 NotI으로 절단한 후에 정제하여 gag-tat/rev를 삽입한 pBluescript KS+의 EcoRI-NotI 부위에 삽입하였다.
더욱이, 스플라이싱 도너(SD) 부위를 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(서열 3F(서열번호: 5)와 3R(서열번호: 6)). 합성시에 5' 말단에 XhoI 부위, 3' 말단에 SalI부위를 부가하고, 상기의 gag-RRE-tat/rev를 삽입한 pBluescript KS+의 XhoI 부위로 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 XhoI와 NotI에 의해 절단하고, SD~tat/rev를 포함하는 단편을 정제하여 pCAGGS(Gene, vol.108, pp193-200, 1991)의 EcoRI 부위에 XhoI/NotI 링커(서열 4F(서열번호: 7)와 4R(서열번호: 8))를 삽입한 플라스미드의 XhoI-NotI 부위로 삽입하였다. 이상의 방법에 의해 얻어진 플라스미드를 패키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)로서 사용하였다.
b. 유전자 트랜스퍼 벡터의 구축
SIVagmTYO1 유래의 5' LTR 영역(8547-9053 + 1-982, 5' 말단에 KpnI 부위, 3' 말단에 EcoRI부위 부가)은 프라이머 5-1F(서열번호: 9)와 5-1R(서열번호: 10)을, RRE(7380-7993, 5' 말단에 EcoRI 부위, 3' 말단에 SacII 부위 부가)는 프라이머 5-2F(서열번호: 11)와 5-2R(서열번호: 12)을, 3' LTR(8521-9170, 5' 말단에 NotI과 BamHI 부위, 3' 말단에 SacI 부위 부가)은 프라이머 5-3F(서열번호: 13)와 5-3R(서열번호: 14)을 각각 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR에 의해 증폭하였다. pEGFPC2(Clontech) 유래의 CMV 프로모터 영역과 강화 녹색 형광 단백질(이하, EGFP라고도 한다)을 코드하는 영역(1-1330, 5' 말단에 SacII 부위, 3' 말단에 NotI 부위, BamHI 부위 및 번역 정지코돈 부가)을 프라이머 6F(서열번호: 15)와 6R(서열번호: 16)을 사용하여 pEGFPC2를 주형으로 한 PCR에 의해 증폭하였다. 4종류의 PCR 단편을 각각 제한효소 KpnI와 EcoRI, EcoRI와 SacII, BamHI와 SacI, SacII와 BamHI로 절단한 후에 정제하고, pBluescript KS+의 KpnI-SacI 사이에 5' LTR→3' LTR→RRE와 CMV 프로모터 EGFP의 순으로 라이게이션하여 삽입하였다(pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR). 리포터 유전자로서 β-갈락토시다제 유전자를 삽입하기 위해, 상기와 같이 하여 PCR에 의해 제조한 5' LTR 영역과 3' LTR 영역을 포함하는 DNA 단편을 각각 제한효소 KpnI와 EcoRI, NotI과 SacI으로 절단한 후에 정제하고, pBluescript KS+의 KpnI-EcoRI와 NotI-SacI에 각각 삽입한 플라스미드(pBS/5' LTR.U3G2/WT3' LTR) NotI 부위에 pCMV-β(Clontech)의 β-갈락토시다제를 코드하는 영역을 포함하는 NotI 단편(820-4294)을 삽입하였다(pBS/5' LTR.U3G2/β-gal/WT3' LTR). 이어서 플라스미드 pBS/5' LTR.U3G2/β-gal/WT3' LTR의 EcoRI-NotI 부위에, 프라이머 7-1F(서열번호: 17)와 7-1R(서열번호: 18)을 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR에 의해 증폭한 RRE 서열(6964-8177, 5' 말단에 EcoRI부위, 3' 말단에 NotI 부위 부가)을 삽입한(pBS/5' LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3' LTR) 후에 RRE 서열을 EcoRI와 NheI로 절단하고, 프라이머 7-2F(서열번호: 19)와 7-2R(서열번호: 20)을 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR에 의해 증폭한 RRE 서열(7380-7993, 5' 말단에 EcoRI부위, 3' 말단에 NheI 부위 부가)을 삽입하였다. 이상의 방법으로 얻어진 플라스미드(pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/β-gal/WT3' LTR)를 NheI와 SmaI으로 절단하여 평활말단(blunt end)화한 후, pEGFPN2(Clontech) 유래의 CMV 프로모터 영역(8-592, AseI-NheI 단편을 평활말단화)을 삽입하였다(pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR). 평활말단화 반응은 모두 Blunting High(Toyobo)를 사용하여 첨부설명서에 따라서 행하였다. 플라스미드 pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR과 pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR을 각각 KpnI-SacI으로 절단하여 5' LTR- 3' LTR을 포함하는 DNA 단편을 조제하고, pGL3Control(Promega) 벡터의 KpnI-SacI 부위로 삽입하여 유전자 트랜스퍼 벡터(pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR 또는 pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR)로서 사용하였다.
[실시예 2] 5' LTR의 개변
렌티바이러스의 5' LTR의 전사활성은 일반적으로 바이러스 유래의 인자인 Tat 단백질의 존재에 의존하고 있다. 따라서, Tat에 대한 의존성을 해소하기 위해, 또한, 보다 전사활성이 강한 프로모터 서열로 치환함으로써 벡터 역가를 높이기 위해, 5' LTR의 프로모터 서열인 U3 영역을 다른 프로모터 서열로 치환한 SIVagm 유전자 트랜스퍼 벡터를 제작하였다(도 2).
5' LTR의 키메라 프로모터로의 치환은 이하와 같이 하여 행하였다. 5' LTR의 TATA 박스의 하류~gag 영역(9039-9170 + 1-982)을 포함하는 단편을 프라이머 9-1F부터 3F(서열번호: 21~23)와 9R(서열번호: 24)을 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR로 증폭시켰다. 또한, CMVL 프로모터(pCI(Promega) 유래, 1-721), CMV 프로모터(pEGFPN2(Clontech) 유래, 1-568), EF1α 프로모터(pEF-BOS(Nucleic Acids Research, vol.18, p5322, 1990)의 2240-2740), CA 프로모터(pCAGGS의 5-650)를 포함하는 단편을 각각 프라이머 10-1F(서열번호: 25)와 10-1R(서열번호: 26), 10-2F(서열번호: 27)와 10-2R(서열번호: 28), 10-3F(서열번호: 29)와 10-3R(서열번호:30), 10-4F(서열번호:31)와 10-4R(서열번호: 32)을 사용하여 각각 pCI, pEGFPN2, pEF-BOS, pCAGGS를 주형으로 한 PCR로 증폭시켰다. 증폭 후에 5' LTR을 포함하는 단편과 상기의 각 프로모터를 포함하는 단편을 혼합하고, 각각의 프로모터의 5' 측의 프라이머(10-1F(서열번호: 25), 10-2F(서열번호: 27), 10-3F(서열번호: 29), 10-4F(서열번호: 31))와, 5' LTR의 3' 측의 프라이머(9R)를 첨가하고, 더욱이 10사이클의 PCR 반응을 행함으로써 4종류의 프로모터와 5' LTR과의 키메라 프로모터의 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편은 유전자 트랜스퍼 벡터(pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR)의 KpnI-EcoRI 부위에 삽입하였다(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR, pGL3C/CMV.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR, pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR, pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR).
[실시예 3] 3' LTR의 개변
3' LTR의 서열을 부분적으로 제거하여 표적세포로부터 전장의 벡터 mRNA가 전사되는 것을 방지하는, 안전성이 향상된 자기 불활성화(SIN)형 벡터를 구축하였다. 렌티바이러스 벡터에 있어서는 3' LTR 영역에 포함되는 프로모터 서열인 U3 영역이 표적세포 중에서 역전사될 때 5' LTR의 U3 프로모터 영역으로 삽입되기 때문에, 표적세포의 게놈 내에서는 유전자 트랜스퍼 벡터 플라스미드의 3' LTR 영역에 포함된 U3 영역이, 유전자 발현에 관여하는 5' LTR의 U3 프로모터가 되는 것이 명확해져 있다(도 3). 따라서, SIVagm 유전자 트랜스퍼 벡터의 3' LTR의 U3 영역을다른 프로모터 서열로 치환한 벡터를 제작하였다(도 3). 또한, 동시에 표적세포 중에서 5' LTR에 존재하는 프로모터 서열을 결실시킬 수 있는지를 검토하는 것이 가능한, SIVagm 유전자 트랜스퍼 벡터의 3' LTR의 U3 영역을 결실시킨 벡터도 제작하였다.
3' LTR의 U3 프로모터 서열의 개변과 결실은 이하와 같이 행하였다. 3' LTR의 U3을 포함하지 않는 DNA 단편을 프라이머 11F(서열번호: 33)와 11R(서열번호: 34)을 사용하여 pSA212를 주형으로 한 PCR로 증폭하였다. 또한, U3 영역을 다른 프로모터로 치환한 3' LTR은 프라이머 12-1F부터 3F(서열번호: 35~37)와 12R(서열번호: 38)을 사용하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 얻어진 키메라 프로모터를 삽입한 벡터 플라스미드인 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR, pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR, pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR을 각각 주형으로서 PCR로 증폭시켰다. PCR에 의해 얻어진 DNA 단편은 Sa1I과 SacI으로 절단한 후 정제하고, pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3' LTR의 Sa1I-SacI 부위로 삽입하였다(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3' LTRΔU3, pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/CMVL.R, pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/EF1α.R, pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/CAG. R).
또한, EGFP를 리포터로서 갖는 SIN 벡터(pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/ 3' LTRΔU3)(도 4)를 구축하기 위해서, pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3' LTRΔU3의 EcoR1-BamHI 처리에 의해 β-gal을 포함하는 단편을 pEGFP-C2(Clontech)를 주형으로 하여, EGFPFG2Eco(ATCGGAATTCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT/서열번호: 39) 및 EGFPRstoNB(CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC/서열번호: 40)를 프라이머로 한 PCR 산물의 EcoRI-BamHI 단편과 재조합하고, 더욱이 EcoRI-SacII 사이트에 프라이머 5-2F(서열번호: 11) 및 5-2R(서열번호: 12)로 pSA212를 주형으로 하여 증폭한 PCR 산물의 EcoRI-SacII 단편을 재조합하였다.
[실시예 4] SIV의 대량조제
트랜스펙션: 인간태아 신장세포 유래 세포주 293T세포(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, pp8392-8396, 1993)를 1장당 2.5×106이 되도록 15 cm 접시 50장에 파종하고, 10% 비동화(非動化) 소태아 혈청(FCS)첨가 DMEM(GibcoBRL)에서 48시간 배양하였다. 배지량은 15 cm 접시당 20 ml로 하였다. 2일간 배양했을 때, 유전자 트랜스퍼 벡터: pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3' LTRΔU3, 300 ㎍, 패키징 벡터: pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev, 150 ㎍, VSV-G 발현벡터: pVSV-G, 50 ㎍을 OPTI-MEM(Invitrogen) 75 ml에 희석하고, 2 ml의 PLUS시약(Invitrogen)을 넣어 교반한 후 실온에서 15분 정치하였다. 별도로 75 ml의 OPTI-MEM에 3 ml의 LIPOFECTAMINE(Invitrogen)을 혼합하고, 또한 이것을 조금 전의 DNA 혼합액과 혼합하여 15분간 실온에서 정치하였다.
이것을 1장당 10 ml의 OPTI-MEM으로 치환한 293T세포에 3 ml씩 적하하여 3시간 37℃, 10% CO2에서 배양하였다. 20% FCS첨가 DMEM을 10 ml씩 가하여 21시간 배양을 계속하였다. 트랜스펙션 24시간 후 1장당 10% FCS첨가 DMEM 20 ml로 치환하여추가로 24시간 배양하였다.
벡터의 회수 및 농축: 배양상청을 회수하여, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 후 42500G, 90분, 4℃에서 원심을 행하였다. 펠릿은 10 ml의 10 mM MgCl2, 3 mM Spermine, 0.3 mM Spermidine, 100 μM dNTP첨가 TBS에 용해한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 추가로 42500G, 4℃에서 2시간 원심하고, 펠릿을 5% FCS, 2 ㎍/ml 폴리브렌첨가 PBS 1 ml에서 현탁하여 -80℃에서 동결시켜 보존하였다.
[실시예 5] 원숭이의 포배기 배아 제작
ES세포를 수립하는 데 적합한 포배기 배아를 얻기 위해서, 체외수정법 및 현미수정법(顯微授精法)에 의해 수정을 행한 후 체외배양법에 의해 포배기 배아로 발생시키는 조작을 행하였다.
(1) 난소자극법
사이노몰거스 원숭이 암컷(4~15령)에 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH, gonadotropin-releasing hormone)[상품명: 류플린(Leuplin), Takeda Chemical Industries, Ltd.제; 또는 상품명: 스프레큐어(Sprecur), Hoechst Marion Roussel사제] 1.8 mg을 피하 투여하였다. GnRH 투여 2주 후부터 임신한 말의 혈청 고나도트로핀(PMSG)[상품명: 세로트로핀(Serotropin), Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.제]을 25 IU/kg, 인간 폐경기 뇨성 고나도트로핀(hMG)[퍼고날(Pergonal), Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.제] 10 IU/kg 또는 난포자극호르몬(FSH)[페르티놈(Fertinorm), Serono Laboratories사제] 3 IU/kg을 1일 1회 일정시각에 9일간 연속(본 실시예에서는 저녁)으로 근육내 투여하였다. 투여 5일 후에 복강경(외경 3 mm)을 사용하여 난소의 관찰을 행하고, 난포의 발육 유무를 확인하였다.
이어서, PMSG, hMG 또는 FSH를 투여하여 난포의 발육이 충분한 것을 확인한 후, 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)[상품명: 푸베로겐(Puberogen), Sankyo Co., Ltd.제] 400 IU/kg을 1회 근육내 투여하였다. hCG 투여 40시간 후에 난자를 채취하였다.
난자 채취는 난소를 복강경(외경 10 mm) 관찰하에서, 약 0.5 ml의 10% SSS(Serum Substitute Supplement, Irvine Scientific Sales Inc.제)를 포함하는 α-MEM(α-Modification of Eagle's Medium, ICD Biomedical Inc.제)용액을 넣은 60 mm의 19G 또는 20G의 카텔린(Cathelin)바늘을 장착한 2.5 ml의 주사통을 사용하여 난포를 천자(穿刺)해 흡인하여 난포액과 함께 난자를 회수함으로써 행하였다.
회수한 직후 실체 현미경하에서 난구세포로 감싸인 성숙난자를 분리하고, 0.3% BSA함유 TALP(이하, BSA/TALP로 나타낸다) 중에 옮겨 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 37℃의 탄산가스 배양기 중에서 3~4시간 전배양(Pre-culture)하였다.
(2) 정자의 채취
(i) 정소 상체로부터의 채취법
사이노몰거스 원숭이 수컷(10~15령)의 정소 상체를 채취한 직후 23G의 바늘을 장착한 1 ml의 주사통을 정관에 삽입하고, 0.3% BSA를 포함하는 BWW(이하, BSA/BWW로 나타낸다)를 천천히 주입하여, 정소 상체 꼬리부분을 절단해 유출되는 정액을 채취하였다.
(ii) 전기자극법에 의한 채취법
i) 직장법
염산케타민+염산크실라진(각각, 5 mg/kg 및 1 mg/kg)으로 사이노몰거스 원숭이 수컷(10~15령)에 마취를 실시하여 드러눕혔다. 전기자극기에 장착한 막대형상 직장 전극에 케라틴 크림을 도포하고, 상기 전극을 상기 원숭이의 직장에 천천히 삽입하였다. 음경을 멸균 생리식염수로 세척하고, 페이퍼 타올 등으로 닦아내어 음경 끝을 시험관(50 ml) 속에 넣었다. 이어서, 전기자극기를 교류전압 5V로 세팅하여 전기를 통하게 하였다. 이를 3~5초간 행한 후 5초간 멈췄다. 이것을 최대 3회까지 반복하였다. 사정이 보였을 때는 그 시점에서 종료하였다. 사정이 보이지 않을 때는 전압을 10V로 하여 동일한 조작을 행하였다. 더욱이, 사정이 보이지 않을 때는 15V, 20V로 실시하였다.
ii) 음경법
무마취하에서, 케이지 전면에 사이노몰거스 원숭이 수컷(10~15령)의 사지를 보정(保定)하여 음경을 보유하기 쉬운 위치에 설치하였다. 수술용 고무장갑을 장착하고, 음경을 무균 생리식염수로 세척하여 페이퍼 타올 등으로 닦아냈다. 전기자극기를 준비하고, 전극을 음경에 세팅하여 클립으로 접속하였다. 전기를 통하게 하는 것은 먼저 직류전압 5V로 1초간격으로 ON-OFF를 반복하면서 서서히 그 간격을 짧게해가는 조작으로 하였다. 사정이 보이지 않을 때는 동일한 조작을 10V, 15V, 20V에서 행하였다. 더욱이, 사정이 보이지 않을 때는 교류로 동일한 조작을 반복하였다.
(3) 정액채취 후의 처리와 동결보존법(Torii, R., Hosoi, Y., Iritani, A., Masuda, Y. and Nigi, H.(1998). Establishment of Routine Cryopreservation of Spermatozoa in the Japanese Monkey(Macaca fuscata), Jpn. J. Fertil., 43(2), 125-131)
직장법 또는 음경법으로 채취한 정액을 37℃ 탄산가스 배양기 내에서 약 30분간 정치하였다. 액상성분만 채취하고, 0.3% BSA함유 BWW(Biggers, Whitten and Wittinghams)(BSA/BWW) 배양액을 약 1~2 ml 가하여 정자용액을 조제한 후, 80% 퍼콜(Percoll)(American Permacia Biotech Inc.제) 2.5 ml와 60% 퍼콜 2.5 ml의 용액 상에 천천히 중층(重層)하였다. 얻어진 것을 1400 rpm으로 20분, 실온에서 원심분리한 후, 시험관 내 바닥부분의 약 0.5 ml를 남기고 상층을 흡인 제거하였다. 더욱이, BSA/BWW를 약 10 ml 첨가하여 가볍게 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 1400 rpm으로 3분, 실온에서 원심분리한 후 바닥부분의 약 0.5 ml를 남기고 상층을 흡인 제거하였다.
얻어진 정자에 정자수 약 5×107~1.0×108개/ml가 되도록 BSA/BWW를 적당량 가하여 정자용액을 조제한 후, 4℃에서 약 60~90분간 정치하였다. 그 후, 빙수 중에서 정자용액의 1/5량의 TTE-G용액[최종농도 12%의 글리세롤을 포함하는 TTE 배지(배지 100 ml 중의 조성: Tes 1.2 g, Tris-HCl 0.2 g, 글루코스 2 g, 락토스 2g, 라피노스 0.2 g, 난황 20 ml, 페니실린-G 10,000 IU, 스트렙토마이신 황산염 5 mg)]을 천천히 적하하여 5분간 정치하였다. 또한, 상기의 TTE-G용액의 적하 및 정치의 조작을 5회 반복하였다.
빙수 중에서 60~90분간 방치한 후, 얻어진 정자용액을 0.25 또는 0.5 ml의 스트로(straw)에 넣었다. 스트로를 액체질소 용기의 상부에서 약 5분간 유지한 후 액체질소 상면에서 추가로 5분간 유지하였다. 상기 스트로를 액체질소 중에 투입하여 보존하였다.
(4) 체외수정용 정자의 조제
액체질소로부터 빼낸 스트로를 일단 실온에서 30초간 유지한 후, 37℃의 온욕 중에 30초간 투입하여 보존 정자용액을 융해하였다. 이어서, 상기 스트로에 1 mM 카페인(Sigma사제)과 1 mM dbC-AMP(Sigma사제)를 함유한 BSA/BWW 10 ml를 가하고, 30분간 37℃의 탄산가스 배양기(5% CO2)에서 인큐베이션하여 수정능 획득을 행하였다.
그 후, 1000 rpm(200×g)으로 2분간 정자용액을 원심분리하여 상청을 버렸다. 이어서, 새로 1 mM 카페인과 1 mM dbC-AMP를 함유한 BSA/BWW 약 0.5~1 ml를 정자에 가하였다. 얻어진 정자용액을 37℃의 탄산가스 배양기(5% CO2)에서 60분간 정치하고, Swim Up한 정자를 모아 정자의 운동성과 정자수를 확인하였다. 이것으로 체외수정용 정자를 얻었다.
(5) 수정방법
1) 체외수정법
플라스틱접시 내의 미네랄오일로 덮인 BSA/BWW의 드롭 50 ㎕ 중에 난구세포로 감싸인 난자 1~5개를 넣었다. 이어서 드롭 중에 5.0×105~1.0×106개(정자)/ml가 되도록 정자 현탁액을 옮겼다. 드롭을 미네랄오일로 덮고, 이어서 매정(媒精)을 행하였다.
그 후, 수정 후의 난자를 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2의 탄산가스 배양기에서 배양하였다. 매정 5시간 후 BWW용액으로부터 TALP용액으로 교환하여 수정을 확인하였다. 그 결과, 약 45%의 높은 수정률로 수정란이 얻어졌다. 수정이 확인된 난자에 대해서, 약 20시간 배양한 후 CMRL-1066용액에 옮겨 배양을 계속하였다.
또한, CMRL-1066용액은 이하와 같이 조제하였다. 10 ml의 A용액[페니실린 G(1000 단위), 겐타마이신 황산염(10 mg/ml) 0.5 ml, CMRL-1066(10×)(NaHCO3및 L-글루타민 없음) 10 ml, NaHCO30.218 g, 젖산나트륨(290mOsmol's stock) 6.7 ml, 물로 100 ml로 맞춤]에 L-글루타민 0.014615 g(1 mM)을 용해시켰다. 이어서, 얻어진 용액을 여과 멸균하였다. 멸균 후의 용액 1 ml에 A용액 9 ml를 첨가하고, 전량 10 ml의 B용액을 얻었다. 피루빈산나트륨 0.0055 g(최종농도 5 mM)을 B용액에 가하고 용해시켜 C용액을 얻었다. C용액 8 ml와 BCS(송아지 혈청) 2 ml를 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 여과 멸균하여 CMRL-1066용액을 얻었다.
2) 현미수정법
(i) 난자의 조제
회수된 난모세포를 미네랄오일(Sigma사제)로 덮인 0.3% BSA 50 ㎕를 포함하는 TALP(BSA/TALP)용액 스팟 중에 모은 후, 약 2~4시간, 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2의 조건하에서 전배양하였다.
난자의 성숙상태를 확인하기 위해, 0.1%의 히알루로니다아제(hyaluronidase, Sigma사제)를 포함하는 TALP-HEPES용액 중에 난모세포 배양물을 1분간 배양한 후, 피펫팅으로 난구세포를 제거하였다. 회수한 난자는 도립 현미경하에서 이하의 클래스-1~4의 4종류로 분류하였다.
클래스-1: 극체(PB)를 갖는 성숙 난자,
클래스-2: PB와 난핵포(GV)가 관찰되지 않는 성숙도상 난자,
클래스-3: GV가 관찰되는 미성숙 난자,
클래스-4: 형상의 변형이 현저하거나, 세포질이 변성, 퇴행적 변화를 나타내고 있는 난자
클래스-1의 난자는 확인한 직후 바로 현미수정에 제공하였다. 클래스-2와 클래스-3의 난자는, 추가로 미네랄오일로 덮인 BSA/TALP용액의 스팟 50 ㎕의 중에 모은 후, 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2의 조건하에서 계속 배양하였다. 배양 24시간 후, 난자의 성숙상태를 확인하였다. 성숙한 난자는 그 시점에서 현미수정에 제공하였다. 남은 미성숙 난자와 클래스-4의 난자는 수정에는 제공하지 않았다.
(ii) 정자의 조제
체외수정에 준한 방법으로 행하였다.
(iii) 현미수정법
현미수정을 Narishige사제의 마이크로 머니퓰레이터(micro-manipulator)를 구비한 올림푸스 IX70 도립 현미경하에서 행하였다.
15 cm 접시에 스팟 1: 희석정자 15 ㎕, 스팟 2: 10% 폴리비닐피롤리돈 PBS 배양액[PVP: 평균분자량 약 360,000, Nacalai Tesque사제] 5 ㎕×3개와 스팟 3: 난자 조작용 TALP-HEPES(최종농도 3 mg/ml BSA)용액 5 ㎕×3개를 순서대로 놓고, 표면을 미네랄오일도 덮어 건조를 방지하여 현미수정용 워킹 필드로 하였다. 또한, 본 실시예에서는 조작온도의 변화에는 유의하지 않아 가온 스테이지를 사용하지 않았지만, 가온 스테이지를 사용해도 된다.
주입용 니들로서는 인간 현미수정용 경사각도 30°니들(외경 7~8 ㎛, 내경 5~7 ㎛, Medi-Con International Co., Ltd.제)을 사용하였다. 상기 니들을 동작 정도(精度)가 높은 알카텔(Alcatel) 시린지에 접속하였다.
난자 유지용 니들로서는 동일하게 인간 현미수정용 경사각도 30°의 니들, 또는 마그네틱 풀러(puller)(상품명: PN-30, Narishige제)에 의해 제작한 외경 약 100 ㎛, 앞쪽 끝의 내경 약 15 ㎛의 니들을 사용하였다. 상기 니들은 2000 ㎕의 에어 타이트(air-tight) 시린지를 장착한 Narishige사제의 인젝터에 접속하였다.
스팟 1에서 인간 현미수정의 기준에 따라 운동성이 있는 정자를 선택해 흡인하고, 얻어진 정자를 스팟 2로 옮겨 배출하였다. 스팟 2에 있어서는 PVP의 점성에 의해 정자의 운동성이 저하되었다. 상기 정자 꼬리부분을 주입용 니들로 문질러 막의 일부분을 파괴시켜 정자의 운동을 정지시킨다. 상기 정자를 점성이 높은 용액과함께 흡인하여 스팟 3으로 옮겼다.
성숙난자를 스팟 3에 넣고 유지용 니들을 사용하여, 극체 아래에 있는 염색체가 주입용 니들로 파괴되지 않도록 6시 또는 12시 위치로 고정시켰다. 그 후, 주입용 니들의 앞쪽 끝에 정자를 놓고 상기 정자를 난자에 꽂아 넣었다. 니들이 투명대를 통과한 것을 확인한 후 난세포막을 흡인하였다. 막의 단열이 일어난 것을 확인한 후 주입용 니들 내의 내용물(정자와 난자의 세포질)을 주입하였다. 정자와 난자의 세포질 주입에 관한 일련의 이들 조작을 반복하여 행하였다. 1회의 조작으로 2~3개 난자에 현미수정을 행하지만, 정자나 난세포질에 의해 앞쪽 끝의 안쪽이 더러워진 경우는 스팟 2로 세척한다.
현미수정된 난자를 바로 배양기로 되돌리고, 37℃, 5% O2, 5% CO2, 90% N2의 조건하에서 배양을 개시하였다. 현미수정 직후, 바로 6 cm의 비코팅 배양접시에 CMRL-1066용액의 스팟 50 ㎕를 만들어 이를 파라핀 오일로 덮었다. 또한, 스팟과 기상(氣相)의 평형은 원칙적으로는 3시간 이상 행하였다. 현미수정 후 24시간에 TALP용액으로부터 상기 CMRL-1066용액의 스팟에 옮겨 탄산가스 배양기 중에서 37℃, 5% O2, 5% CO2, 90% N2의 조건하에서 밀봉한 채로 8일간 배양하였다. 그 결과, 약 75~85%의 높은 수정률로 수정란이 얻어졌다.
(6) 배양방법
체외수정 및 현미수정에 있어서, 수정을 확인한 후에는 배양을 행하는 데 있어서 온도와 탄산가스 농도의 급격한 변화를 피하기 위해 인간에게는 통상 행하지않고, 마우스나 토끼 등의 실험동물에서 널리 채용되고 있는 미네랄 오일로 배지를 덮는 미소 현적배양법(hanging microdrop culture)을 채용하였다. 또한, 배양경과를 관찰함으로써 온도나 pH의 변화에 의한 불필요한 스트레스를 부여하는 것을 피하기 위해서, 체외수정에서는 배양개시 후 7일간, 현미수정에서는 배양개시 후 8일간, 포배기 배아의 출현이 예측될 때까지 배양기 문의 개폐를 행하지 않고 밀폐하여 배양을 행하였다.
여기에서 사용한 배양액, 배양온도, 배양기상(培養氣相)은 이하와 같다.
배양액: TALP & CMRL-1066
통상, 마우스에서 사용되는 BWW나 인간에서 사용되는 P1(Nakamedical Inc.제), Blast medium(Nakamedical Inc.제) 및 새로 개발된 HFF(human foilcular fluid, Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.제)를 사용한 결과, 수정과 분할까지는 순조롭게 진행되지만 상실배(桑實胚)까지의 발생에 멈추는 것을 알 수 있다. 수정확인 후 TALP와 CMRL-1066의 배양액과 조합하여 사용함으로써 포배기 배아로의 발생이 보이고, 또한 그 비율은 수정배의 40~46%로 매우 높은 비율로 보이는 것이 판명되었다. 배양기 밖의 조작에서 인산완충액 시스템의 PBS를 사용하지 않고 HEPES완충액 시스템의 TALP를 사용함으로써, 난자로의 악영향을 감소시켰다고 생각된다.
배양온도: 38℃
마우스나 인간에서는 통상 37℃에서 행하지만 이 온도에서는 발생이 느리고, 또한 상실배 이후로의 발생은 전혀 없었다. 따라서, 38.5℃에서 배아배양을 행하는소 등과 마찬가지로 38℃로 약간 높은 온도에서 배양을 행함으로써, 체외수정에서는 7일 후에 현미수정에서는 8일 후에 포배기 배아를 얻었다.
배양기상: 5% CO2, 5% O2, 90% N2
통상 사용되는 5% CO2, 95% 공기의 조건하에서는 상실배까지의 발생에 멈췄지만, 5% CO2, 5% O2, 90% N2에서 배양을 행함으로써 포배기 배아로의 발생률이 높은 비율로 보이게 되었다.
TALP용액 및 TALP-HEPES용액은 하기와 같이 조제하였다.
여기에서, TALP용액 조제 직전에,
피루빈산나트륨 0.5 mM 0.0055 g(100 ml에 대해서)
겐타마이신 황산염(10 mg/ml) 50 ㎍/ml 50 ㎕
BSA 3 mg/ml 0.3 g
을 조제하고, 얻어진 시약을 필터로 여과 멸균하였다. 한편, TALP-HEPES용액 조제 직전에,
피루빈산나트륨 0.1 mM 0.0011 g(100 ml에 대해서)
BSA 3 mg/ml 0.3 g
을 조제하고, 얻어진 시약을 필터로 여과 멸균하였다.
또한, TALP-HEPES용액을 조제할 때 50 ml NaCl과 Na-HEPES(N-2-히드록시에틸 피페라진-N'-2-에탄 설폰산), 페놀 레드, 페니실린 G를 먼저 용해시켰다. 얻어진 용액에 각각의 스톡용액을 규정량 가하고, 마지막으로 NaCl 스톡용액으로 100 ml까지 맞추었다. 이어서, 얻어진 용액의 pH를 1 M NaOH로 pH 7.4로 조정하였다. 젖산나트륨 스톡용액은 원액(60% 시럽)과 물을 1:35로 혼합하였다. 얻어진 혼합물에 1 mg/ml의 페놀 레드를 가한 후 얻어진 용액의 pH를 1 M NaOH로 pH 7.6으로 조정하여 여과 멸균하였다. 얻어진 시약은 4℃에서 1주간 보존 가능하다. NaHPO4·H2O 28 mg은 10 ml의 글루코스용액에 용해시켜 여과 멸균하였다. 얻어진 용액은 4℃에서 1주간 보존 가능하다.
이어서, 표 2에 BWW(Biggers, Whitten and Whittingham)용액의 조성을 나타낸다.
[실시예 6] 원숭이 ES세포 수립법
(1) 피더세포의 제작
12.5일령의 마우스배로부터 얻은 초대배 섬유아세포(이하, MEF라고도 한다)를 10% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 MEM 배지에서 콘플루언트(confluent)될 때까지 초대~3대째 사이에서 배양하였다. 이어서, 최종농도 10 ㎍/ml의 마이토마이신 C(MMC)를 포함하는 MEM 배지에서 MEF를 2~3시간 배양하여 세포분열을 불활성화하였다. 그 후, MMC를 포함하는 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 트립신 처리(0.05% 트립신, 1 mM EDTA)에 의해 세척 후의 세포를 배양접시로부터 채취하여 세포수를 세었다.
젤라틴 코팅한 24웰 배양접시의 각 웰에 2×104개의 MMC 처리된 MEF를 파종하였다.
얻어진 세포에 대해서, 실제로 접시 상에 파종하여 적절한 세포수인 것을 확인한 후에, 마우스 ES세포를 배양하여 성질을 조사하였다. 그 결과, 증식능이 양호하고 미분화상태가 유지되어 있었기 때문에 얻어진 세포가 피더세포로서 적합한 것으로 나타났다. 또한, 3대째 이하(초대~3대째)까지의 배양의 피더세포가 적합하였다.
(2) 원숭이 포배기 배아로부터의 내부세포 덩어리의 분리
투명체 제거를 위해 원숭이 포배기 배아를 최종농도 0.5% 프로나제(Pronase) 또는 타이로드(Tyrode)를 포함하는 M2 배양액[예를 들면, D. M. Glover등 편, DNA Cloning 4 Mammalian Systems A Practical Approach 제2판(1995) 등을 참조할 것]에 옮겨 37℃에서 10분 인큐베이션하였다. 또한, 투명체가 남아 있는 포배기 배아에 대해서, 추가로 37℃에서 5분의 프로나제 처리를 행하였다. 투명제 제거를 확인한 후, 얻어진 포배기 배아를 PBS로 2회 세척하였다.
이어서, 토끼 항 사이노몰거스 원숭이 림프구 혈청을 M16 배양액[상기 DNA Cloning 4 Mammalian Systems A Practical Approach 등을 참조할 것]으로 20배로 희석한 용액 중에 포배기 배아를 옮겨 37℃에서 30분 인큐베이션하였다. 그 후, 얻어진 포배기 배아를 PBS로 3회 세척하였다. 보체(complement)를 M16 배양액으로 50배로 희석한 용액 중에 포배기 배아를 옮겨 37℃에서 30분 인큐베이션하였다. 얻어진 포배기 배아를 PBS로 3회 세척하였다. 포배기 배아의 영양 외배엽을 완전하게 제거할 수 없는 경우는 유리바늘을 사용하여 현미경하에서 물리적으로 영양 외배엽을 제거하였다. 이것으로, 내부세포 덩어리(Inner Cell Mass; ICM)를 분리하였다.
(3) 원숭이 내부세포 덩어리의 배양
(1)에서 얻어진 피더세포를 파종한 24웰 배양접시로부터 MEM 배지를 제거하고, 각 웰에 ES세포 배양용 배지[ES세포 배지, 표 3]를 800 ㎕씩 가하였다.
이어서, (2)에서 얻어진 ICM을 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 1개씩 옮겨 37℃, 5% CO2조건하에 7일간 배양하였다. ICM의 착상을 저해하지 않기 위해서 배양개시 후 3일간은 배지의 교환을 행하지 않고, 매일 현미경하에서 착상상황을 관찰하였다.
배양 7일째에 ICM의 해리를 행하였다. 웰로부터 ES세포 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척하였다. 300 ㎕의 0.25% 트립신/0.02% EDTA를 웰에 가한 직후 제거하였다. 이어서, 24웰 배양접시를 37℃에서 1분 인큐베이션하였다. 현미경하에서세포의 해리를 확인한 후에, 웰에 500 ㎕의 ES세포 배지를 가하여 피펫만(Pipetman)으로 잘 피펫팅하였다.
피더세포를 미리 파종한 새로운 24웰 배양접시의 웰에 상기의 모든 세포를 옮겼다. 300 ㎕의 ES세포 배지를 가하여 800 ㎕의 배양량으로 맞춘 후에, 세포의 파종이 고르게 되도록 잘 혼합하였다. 이틀에 1회, ES세포 배지를 교환하였다. 해리 후, 7일 이내에 ES세포라고 생각되는 세포집단이 증식하여 콜로니로서 출현하기 때문에 매일 관찰하였다.
ES세포의 콜로니가 출현하면 24웰 배양접시 상의 세포를 트립신 처리하여 계대증식을 반복하였다. 그 동안, 매일 또는 이틀에 1회의 빈도로 ES세포 배지를 교환하였다. 그 결과, 사이노몰거스 원숭이 포배기 배아로부터 복수의 ES세포주를 얻었다.
(4) 원숭이 ES세포의 평가
핵형(karyotype):
염색체수가 정상(기원으로 한 원숭이의 염색체수와 동일한 수: 2n=42)인지 여부를 조사하였다. 그 결과, 수립한 ES세포주는 정상의 핵형을 유지하고 있었다.
다분화능:
1×106개의 사이노몰거스 원숭이 ES세포를 8주령의 SCID 마우스의 서경부(groin region)에 피하 주사하였다. 주사 후 5~12주 후에 종기의 형성이 인지되었다. 상기 종기를 Bouin고정액 또는 파라포름알데히드용액으로 고정한 후 얇게 자르고, 헤마톡실린-에오신 염색(HE 염색) 또는 면역 염색을 시행하여 조직학적 검사를 행하였다. 또한, 면역 염색에 있어서는 이용할 수 있는 원숭이 조직특이 항체가 매우 적기 때문에, 인간의 뉴론특이적 에놀라제(NSE), 아교세포(glia) 섬유성 산성 단백(GFAP), S-100 단백 및 데스민(desmin)에 대한 항체를 사용하였다.
그 결과, 상기 종기는 외배엽(뉴론, 아교세포), 중배엽(근육, 연골, 뼈) 및 내배엽(섬모상피, 장관상피) 유래의 세포군으로 구성되는 기형종(teratoma)인 것을 알았다. 또한, 면역조직학적 검사에 있어서, 뉴론은 NSE, 아교세포는 NSE 및 GFAP, 말초신경은 NSE, 연골은 S-100 단백, 근육은 데스민에 대한 항체에 의해 각각 검출되었다. 이상의 결과로부터, 사이노몰거스 원숭이 ES세포가 다분화능(3배엽성 분화능)을 갖는 것이 명확해졌다.
형태학적 특징:
1. 높은 핵/세포질비, 현저한 핵소체, 콜로니 형성을 나타냈다.
2. 마우스 ES세포에 비해 콜로니 형태가 편평하였다.
세포표면 마커의 발현:
ES세포의 특징화에 사용되는 세포표면 마커인 Stage-specific embryonic antigens(SSEA)의 유무를 확실히 하기 위해, SSEA-1(음성대조), SSEA-3, SSEA-4의 각 세포표면 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 이들 항체는 The Developmental Studies Hybridoma Bank of the National Institute of Child Health and Human Development로부터 입수하였다. SSEA의 각 세포표면 마커에 대해서 하기 조작에 의해 평가하였다: 4% 파라포름알데히드로 고정한 세포와 1차항체를반응시켰다. 이어서, 아미노산폴리머에 퍼옥시다제와 2차항체를 결합시킨 표지 폴리머(심플 스테인 PO(Simple Stain PO), Nichirei제)를 반응시킨 후 심플 스테인 DAB용액(Nichirei제)을 가하여 검출하였다. 그 결과, SSEA-1은 검출되지 않고, SSEA-3 및 SSEA-4가 검출되었다.
알칼리 포스파타아제 활성:
Fast-Red TR SaH를 기질로 하고, 알칼리 포스파타아제 활성을 HNPP(로쉐(Roche)사제)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 알칼리 포스파타아제가 검출되었다.
[실시예 7] 원숭이 ES세포의 배양
I) 피더세포의 제작
상기 실시예 6과 동일하게 12.5일령의 마우스배로부터 얻은 MEF를 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 콘플루언트될 때까지, 초대~3대째 사이에서 배양하였다. 이어서, 최종농도 10 ㎍/ml의 MMC를 포함하는 MEM 배지에서 MEF를 2~3시간 배양하여 세포분열을 불활성화하였다. 그 후, MMC를 포함하는 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 트립신 처리(0.05% 트립신, 1 mM EDTA)에 의해 세포를 회수하고 세포수를 세었다.
젤라틴 코팅한 24웰 배양접시의 각 웰에 2×104개의 MMC 처리된 MEF를 파종하였다.
II) 원숭이 ES세포(CMK-1주)의 배양
실시예 6에 따라 ES세포 배지를 조제하였다. 상기 I)에 의해 제작한 피더세포 상에 ES세포의 CMK-1주(이하, CMK-1이라고도 한다)를 파종하였다. 이 때 ES세포는 별개로 해리하지 않고, 5~10개의 세포 덩어리를 파종하듯이 하였다. 배지는 매일 또는 이틀에 1회의 빈도로 교환하였다. 계대는 4~6일마다 행하였다.
계대에 있어서는, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 0.25% 트립신/PBS 또는 0.1% 콜라게나제/DMEM을 가하여 37℃에서 2~10분 인큐베이션하였다. ES세포 배지에서 세포를 현탁하고, 1000 rpm으로 5분간 원심하였다. 이 세포를 1:2~1:4의 비율로 새로 준비한 피더세포 상에 파종하였다. 세포를 보존할 때에는 10~20% DMSO/DMEM 또는 시판의 세포 동결보존액을 사용하였다.
[실시예 8] 원숭이 ES세포(CMK-1주)를 사용한 유전자 도입 실험
<원숭이 ES세포(CMK-1주)로의 유전자 도입>
상기에서 제작한 EGFP를 발현하는 VSV-G 슈도타입화 SIV 벡터[자기 불활성화(SIN)형 벡터](도 4)를 사용하여 원숭이 ES세포로의 유전자 도입을 행하였다. 유효역가(Functional Titer) 1.9×109개/ml의 벡터용액을 사용하였다.
유전자 도입 전날 CMK-1을 7.5×104개/ml가 되도록 피더세포(2.5×105개/ml) 상에 파종하였다. 유전자 도입 당일(일수 0)에 상기에서 조정한 세포를 기준으로 하여 MOI 1, 10, 100이 되도록 상기 SIV 벡터를 ES세포 배지(실시예 6)로희석하였다. 폴리브렌 8 ㎍/ml를 첨가하고, 형질도입은 1회 행하였다. 10시간 후에 배지를 교환하였다. 다음날(일수 1)부터는 5~6일마다 1:3~1:4의 비율로 피더세포 상에 계대하였다.
ES세포(CMK-1주)로의 유전자 도입효율은 FACScan으로 구한 EGFP 발현율로부터 이하의 방법으로 계산하였다. CMK-1은 피더세포 상에서 배양되고 있기 때문에, 트립신으로 회수한 샘플에는 CMK-1과 피더세포가 혼재되고 있다. 또한, SIV 벡터는 CMK-1 뿐만 아니라 마이토마이신 C로 처리한 피더세포에도 유전자 도입이 가능하기 때문에, EGFP 발현세포에는 CMK-1과 피더세포의 두 세포가 포함되어 있다. CMK-1만의 EGFP 발현율은 하기 "1) 피더세포의 EGFP 발현율의 측정" 및 하기 "2) CMK-1과 피더세포의 세포비 측정"을 사용하여, 이하의 보정식에 따라 구하였다.
<CMK-1의 유전자 도입효율의 보정식>
각 FACS 샘플에 있어서의 CMK-1의 EGFP 발현율을 Ec, 피더세포의 EGFP 발현율을 Ef, CMK-1, 피더세포 전체의 EGFP 발현율을 Eb로 한다. CMK-1의 세포수를 c, 피더세포의 세포수를 f로 하면,
f·Ef + c·Ec = (f + c)Eb이므로, 이를 변형하여
Ec = {(f + c)Eb - f·Ef} / c
c / (f + c) = k로 두면
1/k = 1 + f/c이므로, 이를 대입하여
Ec = Eb/k - (1/k - 1)/Ef
= (Eb - Ef)/k + Ef
이로부터
mean Ec = {(Eb - Ef)/n·∑1/ki} + Ef
표준오차 SEM(standard error of means) = 1/n·(∑(Eci- mean)2)1/2
= (Eb - Ef)·(∑(1/ki- 1/n∑1/ki)2)1/2
의 보정식을 얻었다.
1) 피더세포의 EGFP 발현율의 측정
피더세포에만 SIV 벡터를 MOI 1, 10, 100이 되도록 유전자를 도입하고, 상기와 동일한 조건으로 FACS 해석 및 계대를 행하였다.
2) CMK-1과 피더세포의 세포비 측정
CMK-1과 피더세포의 식별은 이하의 방법으로 행하였다. 인간의 항체인 항HLA-ABC 항체(Mouse anti Human HLA-ABC: RPE, Serotec Ltd.)는 마우스세포인 피더세포에는 반응하지 않지만, 사이노몰거스 원숭이세포인 CMK-1에는 반응한다. 이 항체를 CMK-1과 피더세포의 세포 현탁액에 반응시키고, FACS를 사용하여 CMK-1과 피더세포의 세포비를 측정하였다.
SIV벡터에 의한 원숭이 ES세포로의 유전자 도입효율을 측정하였다(도 5). CMK-1로의 유전자 도입효율은 상기의 "CMK-1의 유전자 도입효율의 보정식"으로 나타내는 방법에 의해 피더세포의 혼입분의 영향을 제외하였다. 유전자 도입 2일 후에는 MOI 100에서 90% 이상, MOI 10에서 약 80%, MOI 1에서 약 60%로 MOI 의존성이매우 높은 유전자 도입효율이 인지되고, 또한 이 높은 유전자 도입효율은 약 2개월 이상 지속되었다. 또한, EGFP 유전자가 도입된 CMK-1에 있어서의 평균 형광강도의 시간경과를 조사한 바, 약 2개월 이상에 걸쳐 EGFP 발현세포의 평균 형광강도는 거의 저하되지 않았다(도 6). SIV 벡터에 의해 EGFP 유전자를 도입한 CMK-1("green" ES cell)의 현미경 사진을 도 7에 나타냈다.
[실시예 9] SIV 벡터에 의한 원숭이 ES세포 및 마우스 ES세포로의 유전자 도입효율
SIV 벡터에 의한 유전자 도입효율이 ES세포의 종에 따라 상이한 지의 여부를 검토하기 위해서, 마우스 ES세포(D3주)에 실시예 8과 동일한 방법으로 유전자 도입을 행하였다.
구체적으로는, 유전자 도입 전날 CMK-1을 7.5×104개/ml가 되도록 피더세포(2.5×105개/ml) 상에 파종하였다. 유전자 도입 당일(일수 0)에 상기에서 조정한 세포를 기준으로 하여 MOI가 1, 10, 100이 되도록 상기 EGFP를 발현하는 VSV-G 슈도타입화 SIV 벡터[자기 불활성화(SIN)형 벡터](도 4)를 ES세포 배지(실시예 6)로 희석하였다. 폴리브렌 8 ㎍/ml를 첨가하고, 유전자 도입은 1회만 행하였다. 10시간 후에 배지를 교환하였다. 다음날(일수 1)부터는 5~6일마다 1:3~1:4로 피더세포 상에 계대하였다. 마우스 ES세포(D3주)는 유전자 도입 전날 1×105개/ml의 세포를 거의 같은 수의 피더세포 상에 파종하였다. 피더세포는 CMK-1일 때와 동일한 것을 사용하였다. 파종 다음날에 상기 SIV 벡터를 MOI가 10이 되도록 배지에 첨가하였다. 폴리브렌 8 ㎍/ml를 첨가하고, 유전자 도입은 1회만 행하였다. 다음날(일수 1)부터 1일마다 1:8~1:10으로 피더세포 상에서 계대하였다.
MOI 10으로 형질도입을 행한 각 ES세포에 있어서의 유전자 도입효율을 도 8에 나타냈다. 원숭이 ES세포의 유전자 도입효율이 마우스 ES세포의 유전자 도입효율 보다도 높은 것이 인지되었다(도 8). SIV를 기본으로 하는 벡터를 사용하는 경우는, SIV가 자연숙주로 하는 원숭이 등의 영장류 세포가, 마우스 등의 다른 종의 세포에 비해 효율적으로 유전자 도입되는 것으로 생각된다.
본 발명의 영장류 유래 ES세포 도입용 VSV-G 슈도타입 원숭이 면역부전 바이러스 벡터는 인간을 포함하는 영장류에 있어서의 발생학적 연구, 질환연구, 임상응용, 실험모델에 있어서 유용하다. 또한, 본 발명의 벡터는 ES세포로부터의 조직 또는 세포의 특이적 분화를 제어하는 유전자 및 시약 등의 스크리닝을 가능하게 한다. 이 스크리닝 방법에 의하면 목적으로 하는 분화세포 또는 분화조직을 얻는 데 유용한, 조직 또는 세포의 특이적 분화를 행하기 위한 유전자 및 시약 등을 스크리닝할 수 있다는 우수한 효과를 가져온다.

Claims (10)

  1. VSV-G로 슈도타입화되어 있는, 영장류 배아 줄기세포로 유전자를 도입하기 위한 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 agm주 유래인 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 자기 불활성화형인 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류가 구세계 영장류 긴꼬리 원숭이과 마카카속인 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 외래 유전자를 발현 가능하게 보유하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 외래 유전자가 녹색 형광단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제로부터 선택되는 단백질을 코드하는 유전자인 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 영장류 배아 줄기세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 세포에 유전자를 도입하는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 도입된 영장류 배아 줄기세포.
  9. 제8항의 영장류 배아 줄기세포의 증식 및/또는 분화에 의해 생성된 세포.
  10. ES세포의 증식 또는 분화에 대한 유전자 도입의 효과를 검출하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터를 영장류 배아 줄기세포에 도입하는 공정,
    (b) 상기 배아 줄기세포의 증식 또는 분화를 검출하는 공정
    을 포함하는 방법.
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