WO2011016261A1 - 分化細胞由来多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents

分化細胞由来多能性幹細胞の樹立方法 Download PDF

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stem cells
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有未 松崎
邦透 新部
暁 森川
洋 馬渕
永井　康夫
岡野　栄之
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学校法人慶應義塾
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a method for establishing differentiated cell-derived pluripotent stem cells, and a differentiated cell-derived pluripotent stem cell established by the method.
  • embryonic stem cells have been selected by selecting cells that express the Fbx15 gene from cells in which the Oct3 / 4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, and c-Myc gene have been introduced and expressed in somatic cells such as fibroblasts.
  • somatic cells such as fibroblasts.
  • induced pluripotent stem cells established using Fbx15 gene expression as an indicator (hereinafter also referred to as induced pluripotent stem cells or iPS cells) were very similar to ES cells in terms of cell morphology, proliferation ability, differentiation ability, etc. There were some differences from ES cells in properties such as gene expression patterns and DNA methylation patterns. Therefore, when cells were selected using the expression of Nanog gene as an index, iPS cells with pluripotency similar to ES cells were established (Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. (2007). “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. ”. Nature 448: 313-317). However, the establishment of iPS cells is inefficient, and the establishment efficiency of iPS cells depends on various factors such as genetic background, and therefore iPS cells cannot necessarily be established from all animals.
  • An object of the present invention is to provide a method that can efficiently establish excellent differentiated cell-derived pluripotent stem cells.
  • the method for producing differentiated cell-derived pluripotent stem cells includes a step of establishing from mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cell may be a mouse-derived cell selected with Sca-1 + PDGFR ⁇ + (hereinafter also referred to as P ⁇ S), or a human-derived cell selected with CD271 + CD90 +. Good.
  • the mesenchymal stem cells are preferably derived from bone marrow or peripheral blood.
  • the differentiated cell-derived pluripotent stem cell according to the present invention is a cell produced using a mesenchymal stem cell.
  • Nanog-EGFP transgenic mice were introduced the Nanog-GFP-IRES-Puro r from the isolated mesenchymal stem cells (P ⁇ S), bone progenitor cells (OB), fibers GFP + and DsRed ⁇ cells from the total number of colonies obtained when the nuclear reprogramming factor is introduced into each of the blasts (TTF) (above) and further selected with puromycin.
  • P ⁇ S mesenchymal stem cell isolated from a transgenic mouse introduced with Oct4-GFP, a nuclear reprogramming factor.
  • 3 is a graph showing the number of colonies of GFP + and GFP ⁇ obtained when introduced in a time series.
  • Example of this invention it is a table
  • Example of the present invention it is a graph showing the number of human ES cell-like colonies appearing in each dish 21 days after seeding 5 ⁇ 10 5 iPS cells obtained from human mesenchymal stem cells or human fibroblasts. .
  • it is a photograph which shows the result of having performed alkaline phosphatase dyeing
  • it is a table
  • a mesenchymal stem cell has CFU-F (fibroblast colony forming unit) activity, and to osteoblasts, bone cells, and adipocytes. It is a cell having pluripotency.
  • the mesenchymal stem cells can be differentiated into chondrocytes, muscle cells, stromal cells, tendon cells, and the like depending on the differentiation induction conditions.
  • the mesenchymal stem cells can be obtained by preparing a cell population containing mesenchymal stem cells and selecting mesenchymal stem cells with a marker. The specific method will be described below.
  • a cell population containing mesenchymal stem cells is prepared by flow cytometry or affinity chromatography. Since this cell population is subsequently subjected to a selection operation based on the expression of a surface antigen, it is preferable to separate individual cells in the preparation process and remove unnecessary cells.
  • the material for obtaining this cell population is not particularly limited, but it may be embryo-derived, fetal-derived or adult-derived, and may be derived from any animal species such as mouse and human. I do not care. Specific examples include bone marrow, peripheral blood (including peripheral blood after G-CSF administration), placenta and the like. In addition, what is necessary is just to use bone marrows, such as a spine, a sternum, and an iliac bone.
  • this material is a cell mass involving mesenchymal stem cells, such as bone marrow, for dissociating the contained cells
  • the material may be subjected to physical treatment such as pipetting or chemical treatment using an enzyme or the like.
  • enzymes conventionally used such as trypsin and collagenase can be used, but treatment with collagenase is preferred.
  • red blood cells are mixed in the material as in the case of obtaining a target cell population from peripheral blood, it is preferable to lyse the red blood cells in advance.
  • a hypotonic solution for example, water etc.
  • a cell population containing mesenchymal stem cells is prepared by appropriately treating the material to be used.
  • the marker molecule is not particularly limited, but in humans, CD10, CD13, CD73 (ecto-5 'nucleotidase, SH3, SH4), CD105 (endoglin, SH2), CD166 (ALCAM), CD271 (LNGFR), CD140b (PDGFR - ⁇ ), CD340 (HER-2 / erbB2), CD349 (frizzled-9), CD90 (Thy-1) etc. can be used as positive markers, CD34, CD45, CD235a etc.
  • CD271 LNGFR
  • CD90 Thy-1
  • Sca-1, CD29, CD44, CD81, CD106, CD140a (PDGFR- ⁇ ), CD140b (PDGFR- ⁇ ) and the like as positive markers, CD11b, CD31, CD34, CD45, CD48, CD90, CD117, CD135 Can be used as negative markers (BaddooaddM. Et al.,. Characterization of mesenchymalystem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem.,.
  • CD271 + CD90 + cells in mesenchymal stem cells for example, humans, using these markers is not particularly limited.
  • CD271 LNGFR
  • NGF neurotrophin
  • BDGF BDGF
  • NT-3, NT-4 neurotrophin
  • affinity using protein purified by expressing any ligand in vitro is not particularly limited.
  • CD271 + cells can be selected by chromatography, it is preferable to use antibodies and select by flow cytometry from the viewpoint of simplicity.
  • mesenchymal stem cells can be selected as living cells by a method using magnetic beads or a method using affinity chromatography.
  • the user determines the type of cell population, the activity of the antibody, how to use the antibody. It can be appropriately selected depending on the above.
  • a dead cell is prepared by reacting a fluorescent dye (for example, PI (propidium iodide)) that stains dead cells with a cell population and removing the cells stained with fluorescence. May be removed.
  • a fluorescent dye for example, PI (propidium iodide)
  • Differentiated cell-derived pluripotent stem cells are germline cells (for example, egg cells, sperm cells, egg progenitor cells, and progenitor cells thereof such as spermatogonia). Alternatively, it is a cell having pluripotency and self-proliferation ability artificially induced by initializing differentiated cells other than undifferentiated cells derived from early embryos (for example, embryonic stem cells). Then, it is established from mesenchymal stem cells.
  • Differentiated cell-derived pluripotent stem cells include, for example, iPS cells created by Yamanaka 4 factors (Takahashi K, Yamanaka S. (2006).
  • the initialization method is not particularly limited, but it is preferably induced to have pluripotency and self-proliferation ability by introducing a nuclear reprogramming factor.
  • an initialization method described in International Publications WO2005 / 080598 and WO2007 / 069666 can be used.
  • the nuclear reprogramming factor is not particularly limited, but preferably includes a combination of gene products of genes selected from each gene group of the Oct gene group, the Klf gene group, and the Sox gene group, in terms of efficiency of iPS cell establishment. Then, it is more preferable to include a combination further including a gene product of a gene group.
  • the genes belonging to the Oct gene group include Oct3 / 4, Oct1A, Oct6, the genes belonging to the Klf gene group include Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, etc., and the genes belonging to the Sox gene group include Sox1 , Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18. Examples of genes belonging to the Myc gene group include c-Myc, N-Myc, and L-Myc.
  • genes are genes that are highly conserved in vertebrates. In this specification, unless an animal name is indicated, it means genes including homologs. Moreover, even if it is a gene which has a variation
  • cytokines and compounds may be added to the medium as cofactors.
  • cytokines in this case include SCF and bFGF, which can be substituted for c-Myc
  • compounds include valproic acid, which can be substituted for c-Myc gene and Klf4 gene.
  • the expression vector is not particularly limited, but a virus vector is preferably used, and a retrovirus vector or a lentivirus vector is particularly preferably used.
  • a nuclear reprogramming factor may be introduced into cells by binding a peptide called Protein Transduction Domain (PTD) to the protein and adding it to the medium (Protein Transduction method).
  • PTD Protein Transduction Domain
  • the factor may be added to the mesenchymal stem cell medium at the stage of preparation of mesenchymal stem cell-derived pluripotent stem cells.
  • cells expressing undifferentiated marker genes such as Fbx15 gene, Nanog gene, Oct gene, etc. are selected from the mesenchymal stem cells into which the nuclear reprogramming factor has been introduced, while the cells remain alive.
  • the method is not particularly limited, for example, a DNA in which a marker gene such as a GFP gene or a galactosidase gene is inserted downstream of the promoter of the Fbx15 gene or Nanog gene is introduced exogenously into the genome of the mesenchymal stem cell, A marker gene such as a GFP gene or a galactosidase gene may be knocked in downstream of the promoter of the endogenous Fbx15 gene or endogenous Nanog gene, and cells expressing those marker genes may be selected.
  • the target cell can be easily selected by selecting with a drug.
  • a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or a puromycin resistance gene
  • the target cell can be easily selected by selecting with a drug.
  • the expression of the endogenous undifferentiated marker gene may be detected by RT-PCR or the like without performing genetic manipulation.
  • a cell population obtained by selecting cells expressing an undifferentiated marker gene from mesenchymal stem cells into which a nuclear reprogramming factor has been introduced is used as a mesenchymal stem cell-derived pluripotent stem cell.
  • mice established with mouse iPS cells (1) mouse mesenchymal stem cells, bone precursor cells, transgenic mice introduced with isolated Nanog-EGFP fibroblasts Nanog-GFP-IRES-Puro r (Okita K. et al. Nature. 2007 vol.448 No.7151 p.313-317), the femur and tibia were isolated and ground in a mortar. The crushed bone was treated with 0.2% collagenase (Wako) (containing DMEM (Gibco) solution, 10 mM HEPES and 1% PS) at 37 ° C. for 1 hour, and then the bone was crushed again. The obtained cell suspension was passed through a cell strainer Falcon 2350 (Falcon) to dissociate the cells.
  • Wako collagenase
  • the cell suspension was centrifuged for 7 minutes at 4 ° C. (280 g) to concentrate the cells and gently washed with 1 mL of water (Sigma) for 5-10 seconds to rupture the erythrocytes. Thereafter, 1 mL of 2-fold concentrated PBS (containing 4% FBS) was added and centrifuged again. The suspension was resuspended with HBSS to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells per mL, and passed through a cell strainer (Falcon).
  • FITC-conjugated anti-Sca-1 antibody isothiocyanate
  • FITC FITC anti-mouse Sca-1
  • APC Allophycocyanin (APC) anti-mouse CD140a (PDGFR ⁇ ) eBioscience
  • P ⁇ S mesenchymal stem cells
  • OB bone precursor cells
  • TTF fibroblasts
  • a tissue tail of transgenic mice Nanog-GFP-IRES-Puro r After washing with HBSS, minced to a length of about 1 cm, a culture dish central portion Set still, MF start (Toyobo). The cells were cultured for 7 to 10 days, the finely cut tissue pieces were removed, and the cells attached to the culture dish were used as fibroblasts (TTF).
  • the cDNAs of these genes are retroviral vectors. It was inserted into pMX-gw by Gateway technology (Takahashi K and Yamanaka S. Cell. 2006 vol.126, No.4 p.663-676).
  • the DsRed gene was inserted under the promoter of a retroviral vector. Retroviral and DsRed retroviruses each combination were infected with each cell, measures the number of colonies obtained per 10 4 DsRed + cells was expressed in a bar graph (Fig.
  • iPS cells were established using 4 factors using neural stem cells obtained from transgenic mice into which Oct4-GFP had been introduced (approximately 70 cells per 50,000 cells) (Kim JB, Scholer H R. (2008). “Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors”. Nature vol.454, p.646-50). Therefore, among stem cells, iPS cells can be established at a very high rate by using mesenchymal stem cells, in particular.
  • iPS cell establishment is improved, and even if a method with poor iPS cell establishment efficiency is usually used, such as the introduction of three factors, it is sufficient. A large number of iPS cells can be established.
  • iPS cell lines established using mesenchymal stem cells have acquired undifferentiated properties and are closer to normal cells than iPS cell lines established using other differentiated cells.
  • a solution obtained by adding DNase I to an HBSS + solution (hereinafter referred to as a DNase I HBSS + solution) was warmed in a 37 ° C. constant temperature bath. Vials containing frozen bone marrow were placed in a 37 ° C. thermostat for 1-2 minutes and thawed quickly. Bone marrow cells were suspended in DNase I HBSS + solution and transferred to a 15 mL centrifuge tube. Further, DNaseI HBSS + solution was added until the total volume reached 10 mL, and the mixture was centrifuged (1200 rpm) at room temperature for 7 minutes.
  • HBSS + containing 2 ⁇ g / mL propidium iodide (PI) (Sigma Chemical Co.) was added to the pellet obtained by discarding the supernatant, and suspended at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • PI propidium iodide
  • FACS MoFlo and FACS Vantage equipped with 488 nm argon laser and 600-650 nm RED laser were used.
  • human mesenchymal stem cells are suspended in a growth medium (DMEM: GIBCO11885 + 20% FBS: Hyclone + bFGF + 10 mM HEPES + 1% P / S), and 100 to 8000 cells are seeded in a 35 mm culture dish. And cultured in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator.
  • DMEM GIBCO11885 + 20%
  • FBS Hyclone + bFGF + 10 mM HEPES + 1% P / S
  • fibroblasts obtained by thawing frozen human fibroblasts derived from a 36-year-old Caucasian female purchased from Cell Applications, Inc. were treated with FP medium (DMEM: GIBCO11885 + 10% FBS: BioWest + 1% P / S) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • FP medium DMEM: GIBCO11885 + 10% FBS: BioWest + 1% P / S
  • the medium was replaced with 293FT medium not containing PS, and further cultured for 2 days. Then, the culture supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m filter and concentrated with an ultracentrifuge (25000 rpm, 1.5 hours). . The virus obtained as a precipitate was suspended in DMEM medium and stored at -80 ° C.
  • human reprogramming factor Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc
  • the mixture was added to a medium containing PLAT-E cells and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 . The next day, the medium was replaced with fresh FP medium, and 24 hours later, the culture supernatant containing the retrovirus was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m filter. 4 ⁇ g / mL polybrene was added to the filtrate to obtain a virus solution.
  • the medium was treated with 10 mL of human ES medium (500 mL DMEM-F12 (SIGMA D6421) + 125 mL KNOCKOUT Serum Replacement (KSR) (Invitrogen 10828-028) + 6.5 mL L-GLUTAMINE (Invitrogen 25030-081) + 2 6 mL bFGF (4 ng / mL) + 625 ⁇ l 0.1 M 2-MERCAPTOETHANOL + 3.2 mL 0.5% P / S).
  • KSR KNOCKOUT Serum Replacement
  • the medium was changed every other day, and the number of human ES cell-like colonies that appeared in each dish after 21 days was counted (FIG. 5).
  • the mesenchymal stem cells produced significantly more colonies than the fibroblasts in the case of human cells.
  • FIG. 6 shows a photograph of a representative colony.
  • hMSC-iPS and human ES cells were transplanted into the testicular epithelium of SCID mice as immunodeficient mice, and paraffin sections of the cell mass obtained 2 months later were obtained. Prepared and stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 8 from the transplanted iPS cell clone, the differentiation of the three germ layers was confirmed in the same manner as the ES cell, and the obtained human mesenchymal stem cell-derived iPS cells acquired pluripotency. It was shown that

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Abstract

　本発明は、間葉系幹細胞から分化細胞由来多能性幹細胞を樹立することを含み、それによって、効率よく、優良な分化細胞由来多能性幹細胞を樹立することができる。なお、マウス間葉系幹細胞は、Sca-1＋ PDGFRα＋で選別された細胞であることが好ましく、ヒト間葉系幹細胞は、CD271＋CD90＋で選別された細胞であることが好ましい。

Description

分化細胞由来多能性幹細胞の樹立方法
　本発明は、分化細胞由来多能性幹細胞の樹立方法、及びその方法によって樹立された分化細胞由来多能性幹細胞に関する。
　近年、線維芽細胞等の体細胞へOct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、及びc-Myc遺伝子を導入し発現させた細胞から、Fbx15遺伝子を発現する細胞を選択することにより、胚性幹細胞（以下、ES細胞とも称する）に似た多分化能（pluripotency）を有する細胞を得ることができるようになった（Takahashi K, Yamanaka S. (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.” Cell 126: 663-676；国際公開公報WO2007/069666）。再生医療において、このようにして得られる、体細胞由来の多能性幹細胞を用いれば、自己の細胞を移植することができるようになるために、ES細胞より拒絶反応の問題が少ないだろうと考えられている。
　Fbx15遺伝子の発現を指標に樹立された誘導多能性幹細胞（以下、induced pluripotent stem cells又はiPS細胞とも称する）は、細胞形態や増殖能、分化能力などにおいてES細胞と極めて良く似ていたが、遺伝子の発現パターンや、DNAメチル化のパターンなどの性状では、ES細胞と異なる部分もあった。そこで、Nanog遺伝子の発現を指標にして細胞を選択したところ、さらにES細胞に類似した多分化能を持ったiPS細胞が樹立された（Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. (2007). “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.”. Nature 448: 313-317）。
　しかしながら、iPS細胞の樹立は効率が悪く、また、iPS細胞の樹立効率は、遺伝的背景等、様々な要因に依存するため、必ずしも、全ての動物からiPS細胞を樹立できるわけではない。
　本発明は、効率よく、優良な分化細胞由来多能性幹細胞を樹立することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかる、分化細胞由来多能性幹細胞の作製方法は、間葉系幹細胞から樹立する工程を含有する。前記間葉系幹細胞は、Sca-1＋ PDGFRα＋で選別されたマウス由来の細胞（以下、PαSとも称する）であってもよく、CD271＋CD90＋で選別されたヒト由来の細胞であってもよい。前記間葉系幹細胞は、骨髄または末梢血に由来することが好ましい。
　本発明にかかる分化細胞由来多能性幹細胞は、間葉系幹細胞を用いて作製された細胞である。
〈 関連文献とのクロスリファレンス 〉
　なお、本出願は、2009年8月3日出願の日本国出願番号特願2009-181009の優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施例において、（Ａ）Nanog-EGFPを導入されたトランスジェニックマウスNanog-GFP-IRES-Purorから単離された間葉系幹細胞（ＰαＳ）、骨前駆細胞（ＯＢ）、線維芽細胞（ＴＴＦ）のそれぞれに、核初期化因子を導入したときに得られる総コロニー数（上図）と、さらにpuromycinで選択し、得られた耐性コロニーの中から、GFP＋かつDsRed－細胞を選択したときに得られるコロニーの数（下図）を示すグラフ、及び（Ｂ）Oct4-GFPを導入されたトランスジェニックマウスから単離された間葉系幹細胞（ＰαＳ）に、核初期化因子を導入したときに得られるGFP＋及びGFP－のコロニー数を時系列で示すグラフ、である。 本発明の一実施例において、未分化マーカーと導入遺伝子の発現を調べるためのＲＴ－ＰＣＲで用いられたプライマー配列の表である。 本発明の一実施例において、核初期化因子（４因子）を導入したときに得られるクローンにおける未分化マーカー発現と導入遺伝子の発現抑制を、ＲＴ－ＰＣＲで調べた結果を示す図である。 本発明の一実施例において、核初期化因子（３因子）を導入したときに得られるクローンにおける未分化マーカー発現と導入遺伝子の発現抑制を、ＲＴ－ＰＣＲで調べた結果を示す図である。 本発明の一実施例において、ヒト間葉系幹細胞またはヒト線維芽細胞から得られたiPS細胞５ｘ１０５個を播種し、２１日後に各ディッシュに現れたヒトES細胞様コロニー数を示すグラフである。 本発明の一実施例において、ヒト間葉系幹細胞由来のES細胞様コロニーに対しアルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す写真である。 本発明の一実施例において、ヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞に対して、未分化細胞マーカー及び導入遺伝子の発現を調べるためのプライマーを示す表である。 本発明の一実施例において、ヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞に対して、図７に記載のプライマーを用いたRT-PCRによって、未分化細胞マーカー及び導入遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。 本発明の一実施例において、ヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞のテラトーマ形成能を調べるための組織染色像を示す写真である。
（１）間葉系幹細胞の単離
　本明細書において、間葉系幹細胞とは、CFU-F（線維芽細胞コロニー形成単位）活性を有し、かつ、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞への多分化能を有する細胞のことである。なお、この間葉系幹細胞は、分化誘導の条件によって、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等へも分化することができる。この間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を調製し、マーカーによって間葉系幹細胞を選別することによって得られる。以下、その具体的な方法を述べる。
　まず、間葉系幹細胞が含まれる細胞集団を、フローサイトメトリーやアフィニティー・クロマトグラフィーによって調製する。この細胞集団は、ひきつづき表面抗原の発現による選別操作がなされるため、この調製過程で、個々の細胞をばらばらに分離し、不必要な細胞を除去しておくことが好ましい。
　この細胞集団を得るための材料は特に限定されないが、胚由来であっても胎児由来であっても成体由来であってもよく、また、マウス、ヒト等どのような動物種に由来しても構わない。具体的には、骨髄や末梢血（G-CSF投与後の末梢血を含む）、胎盤等が挙げられる。なお、骨髄は、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いればよい。
　これらの材料から目的の細胞集団を調製する際、例えば骨髄のように、この材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が使用できるが、コラゲナーゼで処理することが好ましい。解離処理後、完全に個々の細胞に分離せず、細胞塊が残るような場合など、メッシュ等を用いて細胞塊を除去することが好ましい。
　また、末梢血から目的の細胞集団を得る場合のように、材料に赤血球が混入している場合には、予め赤血球を溶血しておくことが好ましい。そのための方法は特に限定されないが、例えば、材料を低張溶液（例えば、水等）で処理すればよい。
　このように、用いる材料に対して適切な処理を行って、間葉系幹細胞が含まれる細胞集団を調製する。
　次に、これらの細胞集団から、適切なマーカー分子を用いて、間葉系幹細胞を単離する。そのマーカー分子は特に限定されないが、ヒトの場合、CD10、CD13、CD73(ecto-5' nucleotidase, SH3, SH4)、CD105(endoglin, SH2)、 CD166(ALCAM)、 CD271(LNGFR)、CD140b(PDGFR-β)、CD340(HER-2/erbB2)、CD349(frizzled-9)、 CD90(Thy-1)等を陽性マーカーとして、CD34、CD45、 CD235a等を陰性マーカーとして用いることができ（Buhring Hans-Jorg, et al, Novel markers for the prospective isolation of human MSC, Annals of the New York Academy of Sciences, annals-1392-000, Haematopoietic Stem Cells VI, 10-Nov-2006.）、これらのマーカーを組み合わせて使用することが好ましいが、CD271(LNGFR)及びCD90(Thy-1)を陽性マーカーとして組み合わせることがより好ましく、細胞集団に血球細胞が含まれている場合には、それらの陽性マーカーに加えてCD45及びCD235aを陰性マーカーとして組み合わせることがさらに好ましい。マウスの場合、Sca-1、CD29、CD44、CD81、CD106、CD140a(PDGFR-α), CD140b(PDGFR-β)等を陽性マーカーとして、CD11b、CD31、CD34、CD45、CD48、CD90、CD117、CD135等を陰性マーカーとして用いることができ（Baddoo M. et al., Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem., vol.89 No.6, p.1235-1249, 2003）、これらのマーカーを組み合わせて使用することが好ましいが、CD140a及びSca-1を陽性マーカーとして組み合わせることがより好ましい (Morikawa S et al., Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med., 206, 2483-2496, 2009)。
　ここで、これらのマーカーを用いて間葉系幹細胞、例えば、ヒトにおいて、CD271+CD90+細胞を選別する方法は、特に限定されない。例えば、CD271(LNGFR)は、ニューロトロフィン（NGF、BDGF、NT-3、NT-4）をリガンドとするレセプターなので、いずれかのリガンドをin vitroで発現させて精製したタンパク質を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによってCD271+細胞を選別することができるが、簡便さの点で、抗体を用い、フローサイトメトリーによって選別するのが好ましい。フローサイトメトリー以外にも、磁気ビーズを用いる方法やアフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法によって、間葉系幹細胞を生細胞のまま選別することが可能である。抗体の種類（モノクローナル抗体かポリクローナル抗体か、IgGかIgMか、抗体分子かFab断片か、等）、及び抗体の濃度に関しては、使用者が、細胞集団の種類、抗体の活性、抗体の使用方法等によって適宜選択することができる。
　なお、これらの方法を用いる前に、予め、死細胞を染色する蛍光色素（例えば、PI（プロピジウムアイオダイド））を細胞集団と反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、死細胞を除去してもよい。
（２）間葉系幹細胞由来多能性幹細胞の作製
　分化細胞由来多能性幹細胞とは、生殖系列にある細胞（例えば、卵細胞、精子細胞、卵原細胞や精原細胞等それらの前駆細胞）または発生初期胚由来の未分化細胞（例えば、胚性幹細胞）以外の分化細胞を初期化することにより、人工的に誘導された多分化能及び自己増殖能を有する細胞のことであり、本願発明では、間葉系幹細胞から樹立される。分化細胞由来多能性幹細胞とは、例えば、山中４因子によって作成されたiPS細胞を含む（Takahashi K, Yamanaka S. (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.” Cell 126: 663-676. ; Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K,Yamanaka S. (2007). “Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors.” Cell 131: 861-872）。
　初期化方法は特に限定されないが、核初期化因子を導入することにより、多分化能及び自己増殖能を有するように誘導することが好ましい。例えば国際公開WO2005/080598やWO2007/069666に記載された初期化方法を用いることができる。なお、これらの刊行物を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
　核初期化因子は、特に限定されないが、Oct遺伝子群、Klf遺伝子群、Sox遺伝子群のそれぞれの遺伝子群から選択された遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含むことが好ましく、iPS細胞樹立の効率という点では、遺伝子群の遺伝子産物をさらに含んだ組み合わせを含むことがより好ましい。Oct遺伝子群に属する遺伝子としては、Oct3/4、Oct1A、Oct6などがあり、Klf遺伝子群に属する遺伝子としては、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5などがあり、Sox遺伝子群に属する遺伝子としては、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18などがある。Myc遺伝子群に属する遺伝子としては、c-Myc、N-Myc、L-Mycなどがある。
　核初期化因子としては、上記組み合わせ以外にも、Oct遺伝子群の遺伝子、Sox遺伝子群の遺伝子に加え、Nanog遺伝子及びlin-28遺伝子を含む組み合わせが挙げられる。また、なお、細胞に導入する場合、上記組み合わせの遺伝子に加え、他にも遺伝子産物を導入してもよく、例えば、不死化誘導因子などが挙げられる。
　これらの遺伝子は、いずれも、脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では、特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、polymorphismを含め、変異を有する遺伝子であっても、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子もまた、含まれるものとする。
　さらに、これら遺伝子の組み合わせに加え、サイトカインや化合物を補助因子として培地に添加しても良い。この場合のサイトカインとして、例えばSCFやbFGFなどが挙げられ、これらは、c-Mycに代替でき、化合物として、例えばバルプロ酸などが挙げられ、これは、c-Myc遺伝子やKlf4遺伝子に代替できる。
＝＝間葉系幹細胞由来多能性幹細胞の調製方法＝＝
　核初期化因子を用いて間葉系幹細胞由来多能性幹細胞を調製するには、核初期化因子が細胞内で機能する蛋白質である場合は、その蛋白質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、間葉系幹細胞に発現ベクターを導入し、細胞内で発現させることが好ましい（遺伝子導入法）。発現ベクターは特に限定されないが、ウイルスベクターを用いることが好ましく、特にレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いることが好ましい。また、Protein Transduction Domain（PTD）と呼ばれるペプチドを蛋白質に結合させ、培地に添加することにより、核初期化因子を細胞内に導入してもよい（Protein Transduction 法）。細胞外に分泌される蛋白質の場合は、間葉系幹細胞由来多能性幹細胞の調製段階で、間葉系幹細胞の培地にその因子を添加すればよい。
　その後、核初期化因子を導入した間葉系幹細胞から、Fbx15遺伝子やNanog遺伝子、Oct遺伝子などの未分化マーカー遺伝子を発現している細胞を、細胞が生きたまま選択する。その方法は特に限定されないが、例えば、Fbx15遺伝子やNanog遺伝子のプロモーターの下流にGFP遺伝子やガラクトシダーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子が挿入されたＤＮＡを、間葉系幹細胞のゲノムに外来的に導入したり、内在性Fbx15遺伝子や内在性Nanog遺伝子のプロモーターの下流にGFP遺伝子やガラクトシダーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をノックインしたりして、それらマーカー遺伝子を発現している細胞を選択すればよい。あるいは、マーカー遺伝子のかわりにネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を用いれば、薬剤で選択することにより容易に目的の細胞を選択することができる。また、遺伝子操作を行わず、内在性の未分化マーカー遺伝子の発現をRT-PCRなどで検出してもよい。また、細胞の形状を未分化性のマーカーに用いてもよい。
　このようにして、核初期化因子を導入した間葉系幹細胞から、未分化マーカー遺伝子を発現している細胞を選択して得られた細胞集団を間葉系幹細胞由来多能性幹細胞として用いる。
[１]マウスiPS細胞の樹立
（１）マウス間葉系幹細胞、骨前駆細胞、線維芽細胞の単離
　Nanog-EGFPを導入されたトランスジェニックマウスNanog-GFP-IRES-Puror（Okita K. et al. Nature. 2007 vol.448 No.7151 p.313-317）を用い、大腿骨と頸骨を単離し、乳鉢で粉砕した。破砕した骨を０．２％コラゲナーゼ（Wako）（DMEM（Gibco）溶液、１０mM　HEPESと１％PSを含有）で３７℃、１時間処理した後、骨を再度破砕した。得られた細胞懸濁液をcell strainer Falcon2350（Falcon）に通して細胞を解離した。この細胞懸濁液を４℃で７分間遠心して（２８０g）細胞を濃縮し、５～１０秒間、１mLの水（Sigma）で軽く洗浄して、赤血球を破裂させた。その後、１mLの２倍濃縮ＰＢＳ（４％ＦＢＳ含有）を加えて再度遠心し、ＨＢＳＳで１mLあたり１x１０６個の細胞濃度になるように再懸濁し、cell strainer（Falcon）に通した。
　得られた細胞懸濁液をＨＢＳＳで洗浄後、遠心し、１mLあたり１x１０７個の細胞濃度になるように再懸濁し、細胞１０６個あたり０．２５μg のFITC結合抗Sca-1抗体（isothiocyanate(FITC) anti-mouse Sca-1(Ly-6A/E)　eBioscience)及び1μg のAPC 結合抗PDGFRα抗体（Allophycocyanin(APC) anti-mouse CD140a(PDGFRα) eBioscience)を加え、氷上で３０分反応させ、FACSで両方の抗原に陽性である細胞を単離し、得られた細胞を間葉系幹細胞（ＰαＳ）とした。また、両方の抗原に陰性である細胞を単離し、得られた細胞を骨前駆細胞(OB)とした。
　また、線維芽細胞（ＴＴＦ）の単離のため、トランスジェニックマウスNanog-GFP-IRES-Purorの尾部の組織をＨＢＳＳで洗浄後、約１cmの長さに細切し、培養皿中央部に静置、ＭＦスタート（東洋紡績）を入れた。７～１０日培養し、細切した組織片を除去し、培養皿に付着した細胞を線維芽細胞（ＴＴＦ）とした。
（３）iPS細胞の作製
　４因子（Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2）または３因子（Oct3/4、Klf4、Sox2）の核初期化因子について、これらの遺伝子のｃＤＮＡをレトロウイルスベクターpMX-gwにGatewayテクノロジーにより挿入した（Takahashi K and Yamanaka S. Cell. 2006 vol.126, No.4 p.663-676）。また、DsRed遺伝子をレトロウイルスベクターのプロモーター下に挿入した。各組み合わせのレトロウイルス及びDsRedレトロウイルスを各細胞に感染させ、DsRed+細胞１０４個あたりに得られたコロニー数を計測し、棒グラフに表した（図１Ａ）。４因子を用いたとき、得られたコロニー数は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、線維芽細胞の３者で有意差は無かったが、３因子を用いたときには、間葉系幹細胞を用いた場合に、有意に多くのコロニーを得ることができた。一般に、３因子でiPS細胞を樹立する場合、４因子を用いる時に比べ、iPS細胞を得られる頻度が極端に下がるが、材料として間葉系幹細胞を用いることによって、iPS細胞の樹立が困難な状況にあっても、高率でiPS細胞を樹立できるようになる。
　次に、４因子または３因子の核初期化因子を導入した細胞をpuromycin(1.5μg/mL)で選択し、得られた耐性コロニーの中から、GFP＋かつDsRed－細胞を選択した。これらの選択により、Nanogプロモーターが再活性化されていて、レトロウイルスプロモーターにサイレンシングが生じているiPS細胞を選択することができるが、骨前駆細胞(OB)及び線維芽細胞(TTF)で得られたコロニー数は、間葉系幹細胞(PαS)を用いた場合と比べて、有意に減少した（図１Ａ）。従って、間葉系幹細胞を用いてiPS細胞を樹立するほうが、より優れたiPS細胞を得ることが可能になる。
　また、図１Ａに示されるように、トランスジェニックマウスNanog-GFP-IRES-Purorを用いた場合、４因子を使って、１０，０００個あたり約５０個のPurorGFP＋のクローン即ちiPSクローンが得られた。一方、Oct4-GFPが導入されたトランスジェニックマウス（Ohbo.K et al.(2003). "Identification and characterization of stem cells in prepubertal spermatogenesis in mice small star, filled." Dev. Biol. vol.258, p.209-225）の間葉系幹細胞(PαS)を用いて、同様にiPS細胞を樹立した場合、図１Ｂに示すように、４因子の核初期化因子を導入してから１８日目に、１０，０００個あたり約７００個のGFP＋のクローン即ちiPS細胞クローンが得られた。これらの値は、Oct4-GFPが導入されたトランスジェニックマウスから得られた神経幹細胞を用いて、４因子を使ってiPS細胞を樹立した場合（５０，０００個あたり約７０個）(Kim J B, Scholer H R.(2008). “Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors”. Nature vol.454, p.646-50)と比べ、顕著に効率が良いことがわかる。従って、幹細胞の中でも、特に間葉系幹細胞を用いることによって、極めて高率にiPS細胞を樹立することができる。
　このように、iPS細胞の作製に間葉系幹細胞を用いることにより、iPS細胞の樹立効率が向上し、３因子導入のように、通常ならiPS細胞の樹立効率が悪い方法であっても、十分な数のiPS細胞を樹立することができるようになる。
（４）樹立したiPS細胞株における未分化マーカーの発現解析
　間葉系幹細胞、骨前駆細胞、線維芽細胞の各々を用いて得られたＧＦＰ＋の細胞（それぞれ、PαS-iPS、OB-iPS、TTF-iPS と称する）を５クローンずつ単離し、未分化マーカー及び導入した遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲで調べた。用いたプライマーを図２に示し、ＰＣＲの結果を図３及び図４に示す。
　PαS-iPSでは、５クローンとも、調べた未分化マーカー（Eras, Rex1, Dax1, Gdf3, Esg1, Nanog, Sox2, Oct3/4, Klf4, c-Myc）が全て発現し、導入遺伝子（SOX2 Tg, Oct3/4 Tg, Klf4 Tg, c-Myc Tg）が全て発現抑制されていた。しかし、OB-iPS及びTTF-iPSでは、クローンによって、未分化マーカーの発現も導入遺伝子の発現抑制も、かなりのばらつきがあった。
　このように、間葉系幹細胞を用いて樹立したiPS細胞株は、他の分化細胞を用いて樹立したiPS細胞株よりも、未分化性を獲得しており、且つ正常細胞に近い。
[２]ヒトiPS細胞の樹立
（１）ヒト間葉系幹細胞の単離
　ヒト間葉系幹細胞の材料にはCambrex社より購入した骨髄（カタログ番号：2M-125C,2M-125D）を使用した。液体窒素にて凍結保存された骨髄は実験ごとに解凍して使用した。
　はじめに、HBSS+溶液にDNaseIを加えた溶液（以下、DNaseI HBSS+溶液とする）を３７℃の恒温槽にて温めた。凍結骨髄が入ったバイアルを、１－２分間３７℃の恒温槽につけ、すばやく解凍した。骨髄細胞をDNaseI HBSS+溶液にて懸濁し１５mL遠沈管に移した。さらにトータルボリュームが１０mLになるまでDNaseI HBSS+溶液加え、室温で７分間遠心分離（１２００rpm）した。遠心分離後、細胞ペレットを崩さないようにピペットで上清を除去し、新たなDNaseI HBSS+溶液１mLで再懸濁し、２．５～５×１０７cells/mLの濃度になるようにHBSS+で希釈して、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た。
　次に、ヒト骨髄細胞懸濁液１mLに対して、１倍希釈FITC標識抗ヒトCD45抗体（DAKO）を５０μl、１倍希釈FITC標識抗ヒトCD235a（GlycophotinA）抗体（DAKO）を５０μl、１倍希釈PE標識抗ヒトCD271（low- affinity nerve growth factor receptor）抗体（Miltenyi Biotec）を５０μl、及び1倍希釈APC標識抗CD90（Thy-1）抗体（BD Biosciences Pharmingen社）を５０μl加え、氷上にて３０分間インキュベートした。
　その後、この細胞懸濁液に１０mL HBSS+を加え、４℃で７分間遠心分離（１２００rpm）した。上清を捨てて得られたペレットに２μg/mL propidium iodide (PI)（Sigma Chemical Co.)含有HBSS+を入れ、１×１０７cell/mLの濃度になるように懸濁した。この懸濁溶液に対し、滅菌した６０mm以下のナイロンメッシュフィルター（Miltenyi Biotec）を用いて、懸濁液中の細胞塊をとり除き、得られた細胞浮遊液を、各抗体の反応性によりFACSを用いて分画した。FACSには、488nmアルゴンレーザー、600～650nm REDレーザーが搭載されているMoFlo及びFACS Vantageを使用した。
　まず、１×１０５イベント分のデータを取り込み、PI陽性細胞をゲートアウト後、CD45-CD235a-分画にゲートを設定した。そして、横軸をCD90 (Thy-1)と、縦軸をCD271 (LNGFR)とし、共陽性分画にゲートを設定し、CD271+CD90+細胞を回収した。こうして得られた細胞をヒト間葉系幹細胞とした。
　次に、ヒト間葉系幹細胞を増殖培養液（DMEM: GIBCO11885 + ２０％FBS:Hyclone +b FGF+１０mM HEPES +１％P/S）に懸濁し、細胞１００～８０００個を３５mm培養皿に播種し、３７℃ ５％CO2インキュベーターにて培養した。
　なお、対照として、Cell Applications, Inc.より購入した３６歳白人女性由来の凍結ヒト線維芽細胞を解凍して得られた線維芽細胞をFP培地（DMEM: GIBCO11885 + １０％FBS: BioWest +１％P/S）で３７℃ ５％CO2インキュベーターにて培養した。また、対照のヒトES細胞は京都大学作製のKhES1を使用した。
（２）ヒトiPS細胞の作製
＝＝発現ベクターの作製＝＝
　ヒト初期化因子（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）をコードするcDNA、およびレトロウイルスの感染効率を調べるため蛍光蛋白質GFPをコードするGFP遺伝子をpMXレトロウイルスベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、各遺伝子の発現ベクターを用意した。またレトロウイルス単独ではヒト細胞に感染しないため、マウスのレトロウイルス受容体をコードするSlc7a1遺伝子をpLenti6/UbC/V5-DEST (Invitrogen)レンチウイルスベクターに挿入したpLenti6/UbC-Slc7a1を用意した。具体的には、既に公知になっている作製方法（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72.）を用いた。
＝＝レンチウイルスの作製＝＝
　293FT培地（DMEM: GIBCO11885 + １０％FBS:BioWest + ２ mM L-glutamine + １ｘ１０-４M non essential amino acids + １ mM sodium pyruvate + １％ＰＳ）にて培養した293FT細胞 (Invitrogen)をT75フラスコに５．６ｘ１０６個になるように継代し、３７℃ ５％CO2にて一晩培養した。翌日１．５ mL のOPTI-MEMＩ培地（Invitrogen）で９μg のVirapower packaging mix (pLP1, pLP2 及びpLP/VSVG) と３μg のpLenti6/UbC/mSlc7a1 を希釈し、別のチューブで、１．５mL のOPTI-MEMＩ培地と３６μl のFugene 6 (Roche) の混合液とを穏やかに混合し、室温で２０分間静置した。その後、培地をＰＳの入っていない293FT培地９ｍｌと交換し、DNA- FuGene6複合体溶液をディッシュに加え、３７℃ ５％CO2で一晩培養した。２４時間後に培地をＰＳの入っていない293FT培地と交換し、さらに２日培養後、培養上清を０．４５ μmフィルターで濾過し、超遠心機（２５０００ rpm、１．５時間）で濃縮した。沈澱として得られたウイルスはDMEM培地に懸濁し-８０℃保存した。
＝＝レンチウイルスの感染＝＝
　ヒト間葉系幹細胞及びヒト線維芽細胞を、それぞれ１００ mm ディッシュあたり８ｘ１０５個となるように播種し、３７℃ ５％CO2で一晩培養した。翌日レンチウイルス液と各細胞の培地に４μg/mL のポリブレンを加えた混合液を各１００mm ディッシュの培地と交換し６時間培養した。その後、ウイルス液の培養上清を除去し、１０ mL の新鮮な培地と交換した。
＝＝レトロウイルス作製＝＝
　PLAT-E細胞をFP培地にて１００mmディッシュあたり３．６ｘ１０６個播種し、３７℃ ５％CO2で一晩培養した。翌日、２７μlのFugene 6を０．３mLのOPTI-MEMＩ培地に混合し５分間室温で静置した。９μgのヒト初期化因子（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）をコードする遺伝子やGFPのcDNAを挿入したpMXレトロウイルスベクターをそれぞれFugene 6とOPTI-MEMＩ培地との混合液に加えて２０分間室温で静置した。混合液をPLAT-E細胞の入った培地に加えて３７℃ ５％CO2で一晩培養した。その翌日、培地を新鮮なFP培地と交換し、その２４時間後にレトロウイルスを含む培養上清を回収し、０．４５ μmフィルターで濾過した。濾液には４μg/mL のポリブレンを加え、ウイルス溶液とした。
＝＝レトロウイルスの感染＝＝
　レンチウイルス感染済みのヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞をそれぞれ１００ mmディッシュあたり８ｘ１０５個播種し、翌日に上述のウイルス溶液を２ mLずつ混合したものを培地と交換し２４時間培養した。２４ 時間後、培養上清を吸引除去し、１０mL の新鮮な培地と交換し、５日間培養した。
＝＝iPS細胞の樹立＝＝
　このようにしてレトロウイルスを感染させたヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞のそれぞれについて、５ｘ１０５個の細胞を、１００mm ディッシュに用意しておいたmitomycin C 処理済みSNL フィーダー細胞上に播種し、３７℃ ５％CO2で一晩培養した。翌日、培地を１０ mL のヒトES培地（５００ mL DMEM-F12 (SIGMA D6421) + １２５ mL KNOCKOUT Serum Replacement (KSR) (Invitrogen 10828-028) + ６．５mL　L-GLUTAMINE (Invitrogen 25030-081)+ ２．６ mL bFGF (４ng/mL) + ６２５μl ０．１ M 2-MERCAPTOETHANOL +３．２ mL ０．５％P/S）と交換した。その後、培地交換は１日おきに行い、２１日後に各ディッシュに現れたヒトES細胞様コロニー数を計測した（図５）。その結果、マウス細胞の場合と同様に、ヒト細胞の場合でも、間葉系幹細胞によって線維芽細胞よりも有意に多くのコロニーが得られた。
（３）得られたヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞の検証
　得られたES細胞様コロニーを単離し、ヒストファイン（ニチレイバイオサイエンス）を用いて、未分化細胞のマーカーのひとつであるアルカリフォスファターゼ染色を行ったところ、単離した全てのコロニーにおいて染色が確認された。図６に代表的なコロニーの写真を示す。
　次に、ヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞を１１個単離し、未分化細胞マーカー及び導入遺伝子（図ではtg付きで示されている。）の発現を図７に示すプライマーを用いてRT-PCRで確認したところ、図８に示すように、ヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞（hMSC-iPS）において未分化マーカーのNanogの発現が全てのクローンで、hTERTの発現が１１個中８個のクローンで検出できた。なお、導入遺伝子の発現抑制はクローンによってばらつきがあった。
　得られたiPS細胞のテラトーマ形成能をみるために、免疫不全マウスであるSCIDマウスの精巣上皮にhMSC-iPS及びコントロールとしてヒトES細胞を移植し、２ヶ月後に得られた細胞塊のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。その結果、図８に示すように、移植したiPS細胞のクローンからES細胞同様に三胚葉系の分化が確認されたことから、得られたヒト間葉系幹細胞由来iPS細胞は多能性を獲得していることが示された。
　本発明によって、効率よく、優良な分化細胞由来多能性幹細胞を樹立することができる方法を提供することができるようになった。

Claims (5)

  1. 　間葉系幹細胞から樹立する工程を含有することを特徴とする、分化細胞由来多能性幹細胞の作製方法。
  2. 　前記間葉系幹細胞は、Sca-1＋ PDGFRα＋で選別されたマウス由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
  3. 　前記間葉幹細胞は、CD271＋CD90＋で選別されたヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
  4. 　前記間葉系幹細胞は、骨髄または末梢血に由来することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の作製方法。
  5. 　間葉系幹細胞を用いて作製された分化細胞由来多能性幹細胞。
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