KR101322757B1 - 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 핵산 - Google Patents

면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 핵산 Download PDF

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Abstract

인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열과 상기 서열에 의해 발현의 제어가 가능한 형태로 배치된 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하는 핵산, 및 해당 핵산을 세포로 도입하는 것을 특징으로 하는, 인간 면역 결핍 바이러스 복제가 억제되는 세포의 제조 방법 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.

Description

면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 핵산{NUCLEIC ACID FOR TREATMENT OR PREVENTION OF IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION}
본 발명은 면역 결핍 바이러스의 감염에 기인하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 핵산 작제물에 관한 것이다.
인간 면역 결핍 바이러스(human Immunodeficiency virus; HIV)는 CD4 분자를 발현하는 세포, 예를 들면 T세포를 감염시켜, 상기 세포를 파괴한다. 이 때문에, HIV로 감염된 인간의 체내에는 CD4 양성 T세포(헬퍼 T세포) 수의 감소와 세포성 면역의 저하가 일어난다. 마침내 중증의 면역 결핍 상태에 빠져, 카리니 폐렴과 같은 기회 감염이 발병한다. 이 상태는 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immunodeficiency syndrome; AIDS)이라고 칭해지고 있다.
HIV 감염의 치료 방법으로서 HIV 생활환 주기를 차단하는 항바이러스제(역전사 효소 저해제, 프로테아제 저해제 등)나 백신의 개발이 진행되고 있고, 몇몇의 항바이러스제가 벌써 실용화되고 있다. 그러나, 변이 빈도가 높은 HIV에서는 감염된 개체 내에서 상기 약제의 효과가 미치지 않은 변이체가 출현하는 일이 있으므로, 반드시 특효약으로 완성되는 경우는 없다. 다른 접근인, RNA 데코이나 리보자임과 같은 핵산, 트랜스도미넌트 변이 단백질이나 세포 내 항체와 같은 단백질을 유효 성분으로서 HIV의 증식을 저지하는 유전자 치료약을 개발하는 시도도 아직 완성된 상황은 아니다.
또한, HIV가 감염된 세포에 특이적으로 세포사를 일으키게 할 방법이 고안 되고 있다(예를 들어, 특허 문헌 1, 비특허 문헌 1, 2, 3). 상기 방법은 HIV 유래의 LTR 프로모터의 하류에 세포 독성을 나타내는 산물을 코드하는 유전자를 삽입하는 것이지만, 지금까지 임상적으로 응용된 예는 알려지지 않았다. 특허 문헌 2(미국 특허 5837510호)에는 상기 세포 독성을 나타내는 산물로서 리보뉴클레아제를 사용하는 것이 기재되어 있지만, 리보뉴클레아제에 의한 HIV 감염 세포의 세포사는 확인되어 있지 않다. 또한, 대표적인 리보뉴클레아제인 인간 간장 유래의 리보뉴클레아제(RNase 1)는 세포질에 존재하는 리보뉴클레아제·억제제에 의해 저해되는 것으로 공지되어 있고(비특허 문헌 4), 상기 목적에 적합하다고는 말할 수 없다.
몇몇의 원핵생물의 플라스미드는 숙주 세포에서 플라스미드를 유지하기 위하여 플라스미드가 탈락시킨 숙주를 죽이는 PSK(post-segregation killing)의 기능을 가지고 있다고 보고되어 있다. 이러한 플라스미드에는 독소-항독소 유전자가 존재한다. 항독소는 세포 내에서 독소와 결합한 독소를 불활성화시키지만, 항독소는 프로테아제에 의해 분해되기 쉽고, 항독소가 프로테아제에 의해 분해되면, 안정한 독소가 활성화된다. 이러한 독소-항독소 유전자는 대부분의 원핵생물의 염색체에도 존재하고, 다양한 스트레스에 대응하며, 세포예정사에 작용한다. 이러한 독소의 기능은 아직 모두 밝혀지지 않았지만, mazE-mazF계의 독소인 MazF(비특허 문헌 5), pemI-pemK계의 독소인 PemK(비특허 문헌 6)는 모두 서열 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 독소를 이용하여 mRNA를 분해하고, 상기 독소를 절단하는 서열을 미리 제거해 둔 목적의 단백질을 코드하는 mRNA에서만 번역을 수행하게하여 고순도의 목적의 단백질을 수득할 방법이 제안되고 있다(특허 문헌 3).
특허 문헌 1: 미국 특허 번호 제 5554528호 특허 문헌 2: 미국 특허 번호 제 5837510호 특허 문헌 3: WO 2004/113498호
비특허 문헌 1: Hum. Gene Therapy, 2: 53-61 (1991) 비특허 문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:365-369 (1994) 비특허 문헌 3: Hum. Gene Therapy, 10:103-112 (1999) 비특허 문헌 4: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:10407-10412 (1998) 비특허 문헌 5: Molecular Cell, 12:913-920 (2003) 비특허 문헌 6: J. Biol. Chem., 279:20678-20684 (2004)
본 발명은 상기 종래 기술의 관점에서 행해진 것이고, 본 발명의 주요 목적은 유효성이 높은 HIV 감염의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 유도되는 전사 조절 서열의 하류에 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입한 핵산 작제물이 도입된 세포에서, HIV의 감염에 의해 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현이 유도되어, 세포 내의 mRNA가 분해되는 것과, 이 결과, 상기 세포에서 HIV의 복제와 다른 세포로의 감염을 방지할 수 있는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은,
[1] 인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열과 상기 서열에 의해 발현의 제어가 가능한 형태로 배치된 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하는 핵산,
[2] Tat 단백질 및/또는 Rev 단백질에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열을 함유하는 [1]의 핵산,
[3] 인간 면역 결핍 바이러스의 LTR 하류에 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 배치되어 있는 [1]의 핵산,
[4] 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 뉴클레오티드 서열 특이적으로 RNA를 절단하는 활성을 갖는 [1]의 핵산,
[5] 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 MazF 단백질인 [1]의 핵산,
[6] 벡터에 함입되어 있는 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항 기재의 핵산.
[7] [1]~[6] 중의 핵산을 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는, 인간 면역 결핍 바이러스의 복제를 억제하는 세포의 제조 방법,
[8] 세포가 T세포 또는 T세포 전구체를 포함하는 세포 집단인 [7]의 방법,
[9] 핵산이 바이러스 벡터에 의해 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 [7] 의 방법,
[10] 레트로 바이러스 벡터 또는 아데노 바이러스 벡터에 의해 핵산이 세포로 도입되는 [9]의 방법,
[11] [1] ~ [6] 중의 핵산을 세포로 도입하는 것을 특징으로 하는, 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 세포 내에서 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 복제를 억제하는 것이 가능한 핵산 작제물이 제공된다. 상기 핵산 작제물은, HIV 감염의 치료에 유용하다.
도 1은 HIV 감염 세포의 배양 상청액의, HIV 유래의 단백질양을 나타내는 도면이다.
도 2는 HIV 감염 세포의 배양 상청액의, HIV 유래의 단백질양을 나타내는 도면이다.
도 3은 HIV 감염 세포의 배양에 있어서, 생존 세포 수의 경시적인 변화를 나타내는 도면이다.
본 발명의 핵산 작제물은, 인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열과 상기 서열에 의해 발현의 제어가 가능한 형태에 배치된 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자로 구성되어 있다.
인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열에는 특별한 한정은 없지만, 예를 들면, HIV의 Tat 단백질에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열을 사용할 수 있다. Tat 단백질은 HIV의 LTR 프로모터의 작용에 의해 전사가 개시되는 RNA 내에 존재하는 TAR(trans-activation responsive element) 서열에 결합함으로써 하류의 전사를 활성화시킴으로, 본 발명에서는 전사 개시점 하류의 TAR 영역의 뉴클레오티드 서열을 갖는 전사 조절 서열이 사용될 수 있다. 특히 매우 적합하게는, HIV의 LTR이나, 상기 LTR에 적절한 변이를 실시한 전사 조절 서열이 사용된다. 상기 변이로서는, 예를 들면 프로모터 내에 존재하는 숙주 세포 유래의 전사 인자와의 결합 부위가 결실되거나 Tat 특이적인 전사에 불필요한 영역의 결실이 예시된다. 전자의 변이에 의해, 숙주 세포 유래 전사 인자에 의한, HIV 감염과는 무관한 전사 수준을 저하시키는 것이 가능하다. 이러한 전사 조절 서열의 변이에 대해서는, 예를 들면 비특허 문헌 2에 기재되어 있다. 또한, 후자의 변이로서 LTR의 U5 영역이나 TAR 서열보다 하류의 영역(R 영역의 일부 및 U5 영역)의 결실이 예시된다. 이러한 결실 LTR을 갖는 본 발명의 핵산은 해당 핵산을 보유하는 고-역가의 레트로 바이러스 벡터를 제조할 경우에 유리하다.
또한, HIV 게놈에 존재하는 RRE(Rev-responsible element)는 HIV 유래의 트랜스 작용 인자인 Rev 단백질과의 상호작용에 의해 단백질의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 3). 또한, gag, pol 유전자 내에 존재하는 INS로 불리는 영역은 Rev 단백질의 비존재 하에서는 HIV의 mRNA의 전사를 억제하지만, 상기 RRE와 Rev 단백질 사이의 상호작용에 의해 이 억제 작용이 해제되는 것으로 알려져 있다[J. Virol., 66:7176-7182 (1992)]. 따라서, 본 발명의 핵산에 외래의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 3' 위치에 이러한 전사 조절 서열을 함입하는 것으로, 상기 핵산에 코드되는 폴리펩테드를 Rev 단백질 의존적으로, 즉 HIV 감염 의존적으로 발현시킬 수 있다.
상기 HIV 유래의 트랜스 작용 인자와 상호작용하는 서열은 해당 서열이 원래 함입되어 있는 기능적 서열, 예를 들면 프로모터와 함께 사용해도 좋고, 이종의 기능적 서열과 조합하여 사용해도 괜찮다. 예를 들면, 본 발명의 핵산의 도입이 바람직한 세포에서 mRNA의 전사를 개시할 수 있는, HIV 유래가 아닌 프로모터와 상기 서열을 조합해 작제된 서열도 본 발명에 사용되는 「전사 조절 서열」에 포함된다.
본 발명의 핵산은 상기 전사 조절 서열에 상기 전사 조절 서열에 의해 발현의 제어가 가능한 형태로 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입함으로써 제조된다.
본 명세서에서, 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성이란, 구성 뉴클레오티드로서 적어도 1 분자의 리보뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥 핵산 중에서 리보뉴클레오티드의 3' 위치의 인산 디에스테르 결합을 가수분해하는 활성을 의미한다. 상기 활성에 의해 가수분해된 핵산은 수산기를 갖는 3'말단과 인산기를 갖는 5'말단, 인산기를 갖는 3'말단과 수산기를 갖는 5'말단, 또는 2', 3'사이클릭 인산염과 수산기를 갖는 5'말단을 생성한다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 2 가닥 핵산, 예를 들면 2 가닥 RNA, RNA-DNA 하이브리드(hybrid) 등을 절단할 수 없는 폴리펩티드를 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 기질 특이성은, 단일 가닥 RNA인 HIV의 게놈을 효율적으로 분해한다는 관점으로부터 본 발명에 적절하다. 특히 매우 적합하게는, RNA를 뉴클레오티드 서열 특이적으로 절단하는 활성을 갖는 것과 리보솜 비의존적으로 mRNA를 분해할 수 있는 것이 본 발명에 사용된다. 상기 폴리펩티드로서는 후술의 MazF나 PemK와 같은, mRNA 인터페라아제(Intereferase)라고 칭해지는 효소가 예시된다(특허 문헌 2).
본 발명에 사용되는 서열 특이성을 가지고, 리보솜 비의존적으로 단일 가닥 RNA를 분해하는 활성을 갖는 폴리펩티드는, 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 미생물 유래의 것일 수 있다. 이 경우, 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자는 미생물의 게놈이나 플라스미드로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 비특허 문헌 4, 5에 기재된 독소-항독소계의 독소를 구성하는 엔도리보뉴클레아제인 MazF나 PemK를 코드하는 유전자를 본 발명에 사용할 수 있다. MazF는 단일 가닥 RNA중의 5'-A/CA-3'의 서열을, PemK는 주로 5'-U/ A(C, A 또는 U)-3'를 절단하는 효소이다. 또한 공지의 데이타베이스로부터 상기 MazF나 PemK의 아미노산 서열 간의 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 선택하고, 이것을 분리하여 본 발명에 사용할 수 있다. 이미 남조류나 고세균을 포함한 다수의 미생물로부터 상기 활성을 갖는 폴리펩티드가 발견되고 있다[바실루스 서브틸리스 168(Bacillus subtilis 168, NP_388347; 5'-U/ACAU-3'), 네이지리아 메닝기티디스 ATCC13090(Neisseria meningitidis ATCC13090, NP_275029; 5'-/ACU-3'), 디이노코쿠스 라디오두란스 R1(Deinococcus radiodurans R1, NP_294385; 5'-UU/CCUUU-3'), 마이코박테리움 보비스 BCG(Micobacterium bovis BCG, NP_855664; 5'-U/CCUU-3'), 노스톡 속 PCC7120(Nostoc sp. PCC7120, NP_487251; 5'-U/ACA-3'), 엔테로코쿠스 페칼리스 V583(Enterococcus faecalis V583, NP_816859; 5'-U/ACAU-3'), 니트로소모나스 유로패아 ATCC19718(Nitrosomonas europaea ATCC19718, NP_841355; 5'-GA/AU-3', 5'-G/AAU-3', 5'-AA/AU-3' 또는 5'-A/AAU-3'), 피로코쿠스 호리코시 ATCC700860(Pyrococcus horikoshii ATCC700860, NP_143082; 5'-U/GG-3', 5'-U/UG-3', 5'-U/GA-3', 5'-A/GG-3' 또는 5'-A/AG-3'): NCBI 단백질 데이터베이스에서 상기 활성을 갖는 폴리펩티드의 수탁 번호 및 해당 폴리펩티드에 의해 인식되고 절단되는 뉴클레오티드 서열을 각각 괄호 안에 나타낸다]. 바람직하게, 본 발명에서는 MazF를 코드하는 유전자를 사용할 수 있다. MazF의 아미노산 서열 및 MazF를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열목록의 서열번호 1, 2에 나타낸다.
상기의 독소-항독소계의 독소를 구성하는 엔도리보뉴클레아제는 인간배아유래 엔도리보뉴클레아제 억제제와 같이, 세포질 엔도리보뉴클레아제 억제제에 의해 저해되는 것이 아니므로(비특허문헌 3), 본 발명에 이용하는데 적당하다. 또한, 상기 엔도리보뉴클레아제가 지속적으로 발현되는 경우, 세포에서는 새로운 단백질의 합성이 일어나지 않기 때문에, 세포는 증식저해를 일으키고, 또한 세포사를 유도한다. 그러나 전기효소는 리포좀을 구성한 상태의 rRNA나 고차구조를 형성하는 tRNA를 분해하지 않기 때문에, 본 발명의 핵산이 도입된 세포에서 HIV RNA가 분해, 억제되고, 상기 엔도리보뉴클레아제의 발현이 종결되면, 세포가 증식능을 회복하는 것이 가능하다. 따라서, HIV가 프로바이러스로서 염색체에 함입된 세포에서도, 바이러스의 복제가 방해된 상태의 세포는 증식능을 유지하고 있다. 상기 엔도리보뉴클레아제의 사용은 생체 내의 T세포 수를 크게 저하시키지 않고 HIV의 복제 및 AIDS 발병을 방지하는 것이 가능하므로 유용하다.
독소-항독소 계의 독소를 구성하는 엔도리보뉴클레아제는 3~7 뉴클레오티드 정도의 짧은 뉴클레오티드 서열을 인식하여 단일 가닥 RNA를 절단하므로, 상기 엔도리보뉴클레아제가 세포 내에서 발현되는 경우에 세포 내의 대부분의 mRNA가 분해된 세포 내에서 단백직 합성 및 세포증식이 저해된다. 또한, HIV의 게놈인 RNA도 절단되기 때문에, HIV의 복제, 세포 외의 방출(발아)도 방지된다. 또한 HIV의 게놈에 코드되어 있는 폴리펩티드의 발현도 저해되므로, 예를 들어, 세포 외로 방출된 Tat 단밸질에 의한 비감염세포의 아포토시스 유도 등도 억제된다.
HIV 감염의 치료 또는 예방을 위하여, 본 발명의 핵산 작제물은 HIV의 감염 가능성이 있는 세포, 즉 CD4 양성 세포를 포함하는 세포(세포군)로 도입되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에서는 CD4 양성 세포(예를 들어, T세포)나 CD4 양성 세포로 분화할 수 있는 전구체(예를 들어, 조혈간세포), 또는 상기 세포를 함유하는 세포 집단을 표적 세포로 하여 유전자 도입을 실시한다. HIV의 감염을 받을 가능성이 있는 세포에 포괄적으로 상기 핵산 작제물을 도입하는 관점에서 본 발명은 조혈간세포 또는 해당 세포를 함유하는 세포 집단을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포는 CD4양성 세포나 이의 전구체를 함유한다면, 특별한 한정은 없고, 개체에서 채취된 혈액 세포(말초혈세포, 재대혈세포), 골수 세포 또는 상기 세포로부터 공지된 방법으로 분획된 CD4 양성 세포, CD4 양성 세포의 전구체, 조혈간세포 등이 예시된다.
본 발명의 핵산 작제물을 세포로 도입하는 방법에 특별한 한정은 없다. 예를 들어, 본 발명의 핵산을 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터에 함입시킨 후, 적절한 방법으로 세포에 도입하면 좋다. 플라스미드 벡터를 사용하는 경우에는, 인산 칼슘법, 양이온성 지질법, 리포솜법, 일렉트로포레이션법 등의 유전자 도입법을 사용할 수 있다. 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터로 함입하는 경우에는, 각 바이러스에 적절한 조건으로 목적의 세포에 감염시키고, 본 발명의 핵산을 도입하면 좋다. 본 발명의 핵산을 염색체 상에 함입시키는 능력을 갖는 레트로 바이러스 벡터는 본 발명에 매우 적합하다.
레트로 바이러스를 사용하는 구체예에서, 본 발명에 사용되는 레트로 바이러스 벡터에 특별한 한정은 없다. 무제한적인 감염, 유전자 도입을 방지하는 관점에서, 본 발명에는 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터가 매우 적합하다. 해당 벡터는 감염된 세포 중에서 자기 복제가 불가능하게 복제능을 결손시켜, 비병원성이다. 이러한 벡터는 척추동물 세포, 특히, 포유동물세포와 같은 숙주 세포 세포로 침입하여, 그 염색체 DNA 중에, 벡터에 삽입된 외래 유전자를 안정적으로 함입할 수 있다. 공지의 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터로서는 MFG 벡터나 α-SGC 벡터(WO 92/07943), pBabe[Nucleic Acids Research, 18:3587-3596 (1990)], pLXIN(Clontech), pDON-AI(Takara Bio) 등의 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 및 이를 변이시킨 벡터가 예시된다. 상기 레트로 바이러스 벡터로서는 인간면역 결핍 바이러스(HIV) 유래 벡터[야생형 LTR을 갖는 HIV 벡터(예를 들어, 미국 특허 번호 5,665,577) 또는 변이된 LTR을 갖는 HIV 벡터(예를 들어, pLenti6/V5, Invitrogen)], 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV) 유래 벡터[예를 들어, Human Gene Therapy, 11:1863-1874 (2000)]등이 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 레트로 바이러스 벡터는 공지의 방법으로 제조하여, 본 발명에 사용하는 것이 좋다. 제조 방법에 특별한 한정은 없고, 사용하는 레트로 바이러스 벡터에 적절한 레트로 바이러스 생산 세포를 배양하고, 이 배양 상청액을 채취하여 본 발명에 사용하는 것이 가능하다. 상기 레트로 바이러스 생산 세포로는 안정하게 레트로 바이러스 입자를 상청액 중에 생산하는 것 또는 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 트랜스팩션에 의해 한시적으로 레트로 바이러스 입자를 생산하는 것, 모두 무방하다.
상기 레트로 바이러스 생산 세포의 제조에는 공지의 패키징 세포주, 예를 들어, PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86 또는 GP+envAm-12(미국 특허 번호 5,278,056), Psi-Crip[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464 (1988)] 등을 사용해도 좋다. 또한, 트랜스팩션 효율이 높은 293 세포 또는 293 T세포를 이용하여 레트로 바이러스 생산 세포를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명에서 해당 레트로 바이러스 벡터의 게놈이 유래되는 것으로서는 이종의 바이러스 유래의 외피를 갖는 슈도타입(pseudotyped) 패키징으로 제조된 레트로 바이러스를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 몰루니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 기본 원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus; GaLV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 고양이 내포성 바이러스(feline endogenous virus) 유래의 외피나 외피로서 기능하는 단백질을 갖는 슈도타입 레트로 바이러스를 사용하는 것이 가능하다. 또한 당쇄 합성에 관여하는 효소 유전자 등을 도입한 레트로 바이러스 생산 세포를 이용하여 제조된, 당쇄 수식을 받은 단백질을 그 표면에 갖는 레트로 바이러스 벡터도 본 발명에 사용가능하다.
본 발명에서, 상기 각종 벡터, 적합하게는 상기 레트로 바이러스 벡터에 인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열과 상기 전사 조절 서열의 하류에 배치된 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 삽입된다. 또한 상기 유전자의 전사를 제어 하는 오퍼레이터, 인핸서, 터미네이터 등의 서열을 함유할 수 있다. 또한, 상기 유전자와는 독립적으로, 본 발명의 핵산은 유전자가 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자(예를 들면, 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코드하는 유전자, β-갈락토시다아제 또는 루시퍼라아제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코드하는 유전자 등), 리셉터 유전자 등을 가지고 있어도 괜찮다. 또한, 본 발명의 핵산은 유전자 도입 세포로 치료가 완료되었을 경우, 또는 어떠한 부작용이 생겼을 경우에 생체 내의 유전자 도입 세포를 제거하는 목적으로, 자살 유전자를 적재하고 있어도 좋다.
본 발명의 일 구체예에서, 생물 개체에서 채취된 세포에 생체 외에서 벡터를 도입하는 생체 외(ex vivo) 유전자 도입이 사용된다. 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 생체에서 채취된 상기 표적 세포와 바이러스 벡터, 예를 들어 바이러스 생산 세포의 배양 상청액이나 상기 상청액으로부터 정제된 바이러스 벡터를 혼합하고, 적절한 조건으로 배양함으로써 유전자의 도입이 수행된다. 생체 내(in viov)로 유전자 도입이 가능한 벡터, 예를 들면 아데노 바이러스 벡터를 사용하는 경우에, 본 발명의 핵산을 함유하는 벡터를 개체에 직접 투여해도 괜찮다.
레트로 바이러스 벡터를 생체 외 유전자 도입에 사용하는 경우, 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 기능성 물질의 존재 하에 표적 세포에 레트로 바이러스 벡터를 고효율로 감염시킬 수 있다.
레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 기능성 물질을 사용하는 유전자 도입 방법은, 예를 들면 WO 95/26200, WO 97/18318, Nature Medicine, 2:876-882 (1996) 등에 기재되어 있다. 해당 방법으로는 레트로 바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위의 양쪽 모두를 동일 분자 상에 갖는 기능성 물질을 사용하는 방법, 레트로 바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과 표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질의 혼합물을 사용하는 방법이 있으며, 본 발명에는 어느 방법도 사용할 수 있다.
상기 기능성 물질은 레트로 바이러스 결합 활성 및/또는 표적 세포 결합 활성을 갖는 것이면 특별한 한정은 없다. 예를 들면, 피브로넥틴 유래의 헤파린 결합 도메인(헤파린 II 도메인), 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 단편, 상기 폴리펩티드의 유도체나 변이체, 폴리리신, DEAE 덱스트란 등이 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 기능성 물질로서 예시된다. 또한, 표적 세포 결합 활성을 갖는 기능성 물질로는 원하는 표적 세포에 결합하는 능력을 갖는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 세포 결합 활성을 갖는 폴리펩티드(세포 골격 단백질 등), 세포 또는 세포 표면의 생체 분자를 인식하는 항체, 성장 인자, 사이토카인, 당쇄 등이 표적 세포 결합 활성을 갖는 기능성 물질로서 예시된다.
본 발명의 매우 적합한 구체예의 하나로서, 피브로넥틴 유래의 헤파린 결합 도메인을 함유하는 기능성 물질의 존재 하에 표적 세포로 유전자 도입을 실시하는 방법을 들 수 있다. 상기 기능성 물질은 매우 적합하게는, 세포 접착 도메인과 헤파린 결합 도메인의 양자를 갖는 피브로넥틴 단편이 예시된다. 상기 세포 접착 도메인으로서는 VLA-5 및/또는 VLA-4로의 결합 영역을 갖는 폴리펩티드가 특히 매우 적합하다. 상기 피브로넥틴 단편은, 생체에서 정제된 피브로넥틴으로부터 프로테아제 제한 등의 수단으로 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 레트로넥틴(등록상표)으로서 다카라 바이오사로부터 발매되고 있는 재조합 피브로넥틴 단편은 본 발명에 매우 적합하다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 유용한 세포 조성물의 제조에 유용하다. 또한, 본 발명은 상기 세포 조성물을 사용하는, HIV 감염의 치료 방법 또는 예방 방법도 제공한다. 즉, 본 발명의 핵산이 도입된 세포를 개체에 투여하는 것으로써, 개체 중의 HIV 감염 세포를 감소시키거나 해당 세포에서 HIV의 복제를 억제하는 것이 가능해진다.
본 발명의 핵산이 도입된 CD4 양성 세포나, 본 발명의 핵산이 도입된 CD4 양성 세포의 전구체(조혈간세포 등)로부터 분화한 CD4 양성 세포가 HIV의 감염을 받아 세포 내에 HIV 유래의 트랜스 작용 인자가 생성될 경우에는, 전사 조절 서열의 하류에 위치하는 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현이 유도되기 때문에, 생성된 폴리펩티드에 의해 세포 내의 mRNA가 분해되어 단백질의 생합성이 저해된다. 이 때, HIV의 복제 과정에서 생성되는 RNA 게놈도 분해된다. 상기와 같이, HIV 게놈에 코드 되어 있는 폴리펩티드의 번역 및 HIV 게놈의 복제가 저해되므로, 새로운 감염성 HIV 입자의 생성 및 다른 세포로의 감염이 방지된다.
상기 MazF나 PemK와 같은 독소-항독소계의 독소를 구성하는 엔도리보뉴클레아제는 대응하는 항독소(MazE나 PemI)가 공존하는 경우에 그 활성이 억제된다. 따라서 독소인 엔도리보뉴클레아제 유전자를 본 발명에 사용하는 경우에 항독소 유전자를 병용함으로써, 비 HIV 감염 세포에서, 엔도리보뉴클레아제 활성에 기인하는 세포 독성의 발현을 억제 또는 제어할 수 있다. 상기 일 구체예에서 독소의 활성은, 예를 들어, 비 HIV 감염 세포에서, 적당한 하우스키핑(housekeeping) 유전자(글리세롤알데히드 3-인산 탈수효소 유전자, β-엑틴 유전자 등)의 프로모터 하류에 삽입된 항독소 유전자의 미량의 항독소의 발현에 의한 항독소의 작용으로 억제될 수 있다. 이 세포에 HIV의 감염시, 상기 트랜스 작용 인자의 작용에 의해 독소의 발현이 촉진되어 항독소의 발현량을 초과했을 경우에 처음으로 세포 독성이 발휘된다. 따라서, HIV 감염 세포에 대한 세포 독성의 선택성을 보다 향상시킬 수 있다.
종래 보고되었던 세포 독성을 갖는 단백질(예를 들어, 디프테리아 독소 등)이나 비독성 전구체를 세포 독성 화합물로 활성화시키는 효소(예를 들어, 티미딘 키나아제 등)의 작용에 의해 HIV 감염 세포를 파괴하는 방법에서는 파괴 후의 세포로부터 방출되는 독소나 활성화된 화합물이 비 HIV 감염 세포로 침입하여 세포 독성을 나타낼 가능성이 있지만, 단일 가닥 RNA 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 본 발명의 방법에서는 주위의 세포가 장해를 받을 우려는 적다.
현재는 3~4 종류의 항바이러스 약제(역전사 효소 저해제, 프로테아제 저해제 등)를 병용하는 다중 약제 병용 요법(HAART)이 HIV 감염 치료법의 주류이다. 상기 치료를 실시함으로써, HIV 감염 환자 혈액 중의 HIV량은 현저하게 감소하므로, 임상 증상의 개선을 볼 수 있게 된다. 그러나, 바이러스 입자의 생산을 적극적으로 수행하지 않는 HIV 감염 세포(장기 생존형 감염 세포: 보유 숙주)의 존재 때문에, HIV의 완전한 제거는 곤란하다. 본 발명은 상기 HAART와 조합해 수행하여도 괜찮다.
본 발명의 핵산 작제물이 도입된 세포에서는 Tat의 발현에 따라 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 발현된다. HIV가 프로바이러스로서 염색체에 조합된 세포에 상기 핵산 작제물이 존재하고 있는 경우, 프로바이러스에서 RNA의 전사가 개시되는 곳의 RNA로부터 번역되는 Tat에 의해 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현이 유도되어 HIV 게놈을 포함한 세포 내의 단일 가닥 RNA가 분해된다. 이 결과, 해당 세포에서는 HIV의 복제 및 출아가 저지된다. HIV 유래의 RNA가 분해되어 Tat의 발현이 정지됨과 동시에, 발현되고 있던 Tat가 세포로부터 소실되면 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현도 정지된다. 단일 가닥 RNA에 특이적으로 작용하는 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 본 발명에서는 세포 내의 리보솜이나 tRNA가 파괴되지 않으므로(비특허 문헌 5), 상기 폴리펩테드의 발현의 정지와 함께 통상의 단백질 합성이 재개되기 때문에, 이 시점에서 파괴되어 있지 않은 세포는 증식을 재개한다.
실시예
하기 실시예로서 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예의 범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Tat 발현 플라스미드의 작제
플라스미드 pQBI-tatGFP(Quantum Biotechnologies Inc)의 Tat, sg GFP의 각각을 코드하는 영역을 SacⅡ, EcoRI의 이중 제한으로 제거한 후, 5' 위치에 개시 코돈을 부가하고, 3' 위치에 종결 코돈을 새롭게 부가한 Tat를 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 플라스미드를 pQBI-TAT라고 명명하였다. 상기 플라스미드는 CMV 프로모터/인핸서의 제어 하에 Tat 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드이다.
실시예 2. MazF 발현 플라스미드의 작제
플라스미드 pQBI-LTRgagGFP(Quantum Biotechnologies Inc)에 삽입되어 있는 gag, sgGFP, RRE의 각각을 코드하는 영역을 제한 효소 SalI, XbaI의 이중 제한으로 제거한 후, 여기에 MazF 단백질을 코드하는 화학적으로 합성된 DNA(서열번호 3)를 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 플라스미드를 pQBI-LTRMazFcv1이라고 명명하였다.
상기 플라스미드는 HIV의 5'LTR의 제어 하에 MazF 단백질을 발현하는 것이 가능한 플라스미드이다. 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 나타낸 MazF의 아미노산 서열을 코드하고 동시에, 천연의 MazF의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 MazF 유전자 중에 존재하는 ACA의 뉴클레오티드 서열을 다른 뉴클레오티드 서열로 변환시킨 것이다. 따라서, 이 플라스미드로부터 전사되는 MazF의 RNA는 MazF의 활성에 의해 절단되는 일 없이, 세포 내에서 안정적으로 MazF를 발현시키는 것이 가능하다.
실시예 3. 세포로 플라스미드의 도입
24-웰 콜라겐-코팅 플레이트의 각 웰에 1 × 105개의 인간 293T/17 세포[ ATCC CRL-11268]를 첨가하고 24 시간 동안 배양하였다. 배지에는 10% 우태아혈청(GIBCO)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 시그마)를 사용하였다. 이어서, 각 웰의 세포에 pQBI-LTRMazFcv1(0.25 ㎍), 또는 pQBI-LTRMazFcv1 및 pQBI-TAT의 모두(각 0.25 ㎍)를 도입하였다. 플라스미드의 도입에는 TransIT-293(Mirus)을 사용하고, 첨부된 설명서의 기재에 따라 조작을 수행하였다. 또한, 상기의 조작은 각각 2군 연속으로 실시하고, 대조군으로서 MazF 유전자를 포함하지 않는 pQBI-LTRgagGFP(Quantum Biotechnologies Inc)와 pQBI-TAT(각 0.25 ㎍)를 도입한 군도 설정하였다.
플라스미드가 도입된 세포를 37℃, 5% CO2로 48 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 현미경 하에서 세포를 관찰했는데, 대조군으로서 설정한 pQBI-LTRgagGFP와 pQBI-TAT를 도입한 군에서는 pQBI-LTRgagGFP와 pQBI-TAT를 동시에 도입하는 것으로 GFP 단백질의 발현이 확인되었으므로, LTR의 프로모터 활성이 TAT 의존적으로 유도되고 있는 것이 확인되었다. 또한, pQBI-LTRMazFcv1만이 도입된 웰에서는 대조군과의 차이는 인정되지 않았지만, pQBI-LTRMazF와 pQBI-TAT를 동시에 도입한 군에서는 대조와 비교하여 분명한 세포 증식의 억제가 인정되었다. 이는 pQBI-L TRMazF에서의 MazF의 발현이 Tat 단백질 의존적으로 일어나는 것을 나타낸다. 즉, Tat 단백질 유도성 LTR의 제어 하에 MazF 유전자가 배치된 작제물에 의해 HIV 감염 세포의 증식이 억제될 수 있다는 것이 시사되었다.
실시예 4. 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 작제
(1) MazF 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pSIN - HLTR - MazF 의 작제
실시예 1에서 제조된 플라스미드 pQBI-LTRMazFcv1를 제한 효소 StuI 및 XbaI으로 절단하고, HIV-LTR 지배 하에 MazF가 발현되는 발현 카셋트(약 1340 bp)를 획득하고, DNA Blunting Kit(다카라 바이오)으로 평활화하였다.
레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pDON-AI(다카라 바이오)의 LTR 프로모터 활성을 소실시키기 위하여, 3'LTR의 U3 영역의 NheI 부위에서 SacI 부위까지 삭제하여 재작제하고, LTR 프로모터 활성이 소실된 자기-비활성 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pSIN을 수득하였다. pSIN의 PmeI 부위를 절단하고, 알칼라인 포스파타아제 E. coli C75(다카라 바이오)를 이용해 탈인산화시키고, 상기 발현 카셋트를 DNA li gation kit Mighty Mix(다카라 바이오)를 이용해 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 플라스미드를 pSIN-HLTR-MazF라고 명명하였다.
(2) MazF 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMTD3 - U3R - MazF 및 pMTD 3-U3TAR-MazF의 작제
pMT 벡터[Gene Therapy, 11:94-99 (2004)]의 3'LTR의 U3 영역에 대하여, 해당 영역 43~309번째의 뉴클레오티드에 해당하는 부분을 결손시킨 플라스미드 벡터 pMTD3를 작제하였다. 내부 프로모터로서 사용되는 HIV의 U3-R 영역 및 U3-TAR 영역은 각각 실시예 4-(1)에서 제조된 플라스미드 pSIN-HLTR-MazF를 주형으로 한 PCR로 수득하였다. U3-R 영역의 증폭에 이용된 프라이머, 5'HIV1 U3, 3'HIV1 R의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열 번호 4, 5에 나타낸다. U3-TAR 영역의 증폭에는 상기 5'HIV1 U3와 서열 번호 6 기재의 뉴클레오티드 서열의 프라이머, 3'HIV1 TAR를 조합하여 사용하였다. 둘의 PCR 증폭 단편을 MluI, BamHI으로 제한하고 pMTD의 MluI/BamHI 사이트 사이에 삽입하여, 2 종류의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMTD3-U3R 및 pMTD3-U3TAR를 작제하였다.
MazF를 코드하는 유전자는 상기의 플라스미드 pSIN-HLTR-MazF를 주형으로 하여 PCR로 수득하였다. 증폭에 이용된 2종류의 프라이머, 5'MazF, 3'MazF의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 7, 8에 나타낸다. 수득한 증폭 단편을 BglII, BamHI으로 제한하여 pMTD3-U3R, pMTD3-U3TAR의 BamHI 사이트에 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 MazF 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드를 각각 pMTD3-U3R-MazF 및 pMTD3-U3TAR-MazF라고 명명하였다.
(3) 대조군 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 작제
대조군으로서 사용하기 위하여, pMTD3-U3R에 형광 단백질인 eGFP를 코드하는 유전자가 삽입된 발현 플라스미드를 작제하였다. 즉, 플라스미드 pGemT-Easy-eGFP[J. Gene Med., 6:724-733 (2004)]에서 BamHI 및 BglII 제한으로 자른 eGFP 유전자를 포함하는 DNA 단편을 pMTD3-U3R의 BamHI 사이트에 삽입하고 eGFP 발현 플라스미드인 pMTD3-U3R, pMTD3-U3TAR의 BamHI 사이트에 삽입하여 2종류의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMTD3-U3R-GFP 및 pMTD3-U3TAR-GFP를 작제하였다.
실시예 5. MazF 발현 CEM - SS 세포주의 확립
(1) GaLV 슈도타입 바이러스를 제조하기 위하여 사용되는 외피 발현 플라스미드는 하기와 같은 조작으로 작제하였다. 우선, GaLV 바이러스의 외피 단백질을 코드하는 DNA 단편을 PG13 세포(ATCC CRL-10686)에서 제조한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 증폭에 이용된 2종류의 프라이머, 5'KpnI, 3'ClaI의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9, 10에 나타낸다. 양친화성 외피 발현 플라스미드인 pVM-AE[Gene Therapy, 10:706-711 (2003]를 KpnI, ClaI로 제한하고, 외피 단백질을 코드하는 영역 중 R 펩티드 부분을 제외한 부분을 제거한 플라스미드 단편을 제조하였다. 상기의 증폭 단편을 KpnI, ClaI로 제한한 것을 이 플라스미드 단편으로 삽입하여, GaLV 외피 발현 플라스미드, pVM-GeR를 수득하였다.
(2) 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM를 넣은 6 cm 지름의 플레이트에 2 × 106개의 293 T세포를 넣고, 4 ㎍의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드(실시예 4에서 제조된 플라스미드의 하나), 4 ㎍의 패키징 플라스미드 pVM-GP[Gene Therapy, 10:706-711 (2003)], GaLV 외피 발현 플라스미드 pVM-GeR을 이용하여 인산 칼슘법으로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 개시 6 시간 후에 배지를 신선한 것으로 교환하고 배양을 계속하였다. 2일 후, 배양 상청액을 모아 0.45 ㎛의 필터로 여과 하고, 이 여과액을 바이러스 상청액으로서 하기의 실험에 사용하였다.
CEM-SS세포는 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640(Life Technologies)에서, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양하였다. 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰 내의 CEM-SS세포(5 × 105개/2 ㎖ 배지)에 대하여, 실시예 6-(1)에서 작제한 각각의 레트로 바이러스 벡터(바이러스 상청액) 1 ㎖ 및 최종 농도 8 ㎍/㎖의 폴리브렌을 첨가하고, 플레이트를 CR322 원심분리기(Jouan)를 사용하여, 25℃, 2800 rpm으로 99분간 원심분리하여, 세포로의 레트로 바이러스 벡터의 흡착을 촉진시켰다. 원심 분리 후의 세포를 37℃, 5% CO2 존재 하에서 2 시간 동안 배양한 후, 세포를 T25 플라스크로 옮겨 37℃, 5% CO2 존재 하에서의 배양을 계속하였다. 2일 후, 유전자가 도입된 세포를 1 mg/㎖의 제네티신(G418)으로 선별함으로써, 각 바이러스에서 형질전환된 다클론성 세포주를 생산하였다.
실시예 6. HIV 감염
24-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣은, 실시예 5에서 제조된 각 세포주의 세포 2 × 106개(/1 ㎖ 배지)에 다양한 양의 HIV-1 IIIb(p24 단백질양 환산으로, O.2, 2, 20, 200 ng)를 접종하고, 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세정한 후에 1O ㎖의 RPMI(10%의 FBS를 포함한다)으로 현탁시키고 T25 플라스크로 옮겼다. 이 플라스크로부터 계시적으로 채취한 배양 상청액에 대하여 p24의 양을 ELISA법(p24 ELISA kit, PerkinElmer)로 정량하여, HIV의 양을 평가하였다. 실험 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1 및 도 2는 각각 감염 7, 10일 후의 결과이다. 도면에서, CEM-SS는 유전자가 도입되어 있지 않은 CEM-SS세포, 대조군은 pMTD3-U3R-GFP 바이러스로 형질전환된 세포, A, B, C는 각각 pSIN-HLTR-MazF, pMTD3-U3R-MazF 바이러스, pMTD3-U3TAR-MazF 바이러스로 형질전환된 세포에서의 결과를 나타낸다. 세로 축은 p24 단백질량(단위: ng/㎖)이다. 또한, 감염 후 4, 7, 10 일째(4일, 7일, 10일)의 생존 세포 수를 트리판블루 배출 시험으로 계측하였다. 이 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 있어서, 다이아몬드는 유전자가 도입되어 있지 않은 CEM-SS세포, ×는 pMTD3-U3R-GFP 바이러스로 형질전환된 세포, 사각형, 삼각형, 원은 pSIN-HLTR-MazF, pMTD3-U3R-MazF 바이러스, pMTD3-U3TAR-MazF 바이러스로 형질전환된 세포에서의 결과를 나타낸다. 세로 축은 생존 세포 수(단위: 104개)이다.
도 1, 2에 나타낸 바와 같이, MazF 유전자를 함유하는 레트로 바이러스로 형질전환된 세포에서는, 비유전자 도입 CEM-SS세포 또는 대조로서 사용한 MazF 유전자를 함유하지 않는 pMTD3-U3R-GFP 바이러스로 형질전환된 세포와 비교하여 배양 상청액 중의 HIV의 양이 매우 낮은 것이 분명해졌다. 또한, 각 군의 세포의 증식율을 비교하면, 도 3에서 분명해진 것과 같이, MazF 유전자를 함유하는 레트로 바이러스로 형질전환된 세포는 감염 후 7일 이후에 세포 증식율이 향상되고 있는 것으로 나타났다. 이것은, 이러한 세포에서는 HIV에 기인하는 세포사가 억제되고 있다는 것을 시사한다. 또한, pSIN-HLTR-MazF, pMTD3-U3R-MazF 바이러스, pM TD3-U3TAR-MazF 바이러스로 형질전환된 세포에 HIV를 감염시키고, 60일간 배양을 계속하였다. 배양 상청액에서 HIV는 검출되지 않았지만, 세포로부터 추출한 DNA에는 HIV 유래의 DNA가 검출되었으므로, HIV는 프로바이러스로서 세포 내에 유지되고 있는 것으로 나타났다. 이로부터, 본 발명의 핵산으로 형질전환된 세포는 HIV의 감염을 받은 후에도, HIV의 복제와 출아를 방해할 수 있는 상태로 증식되는 것으로 시사된다.
게다가 HIV 접종량을 p24의 양 환산으로 1000 ng까지 증가시키고 동량으로 감염 시험을 실시하고, 감염으로부터 16일 후에 배양 상청액 중의 p24의 양을 측정하였다. 이 경우에도, MazF 유전자를 갖는 각각의 레트로 바이러스 벡터로 형질전환된 세포의 배양 상청액 중의 p24의 양은 비형질전환 세포 및 대조군이 양의 1/1000 이하였다.
실시예 7. 여러 가지의 mRNA 인터페라아제를 Tat 의존적으로 발현시키는 것에 의한 세포 증식의 저해
(l) N. 유로패아 ATCC19718 ( N. europaea ATCC19718 ) 균주 유래 NE1181 유전자의 분리와 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 작제
니트로소모나스 유로패아 ATCC19718(Nitrosomonas europaea ATCC19718) 균주 유래 NE1181 유전자에 코드되어 있는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 NCBI 데이터베이스로부터 입수하였다(accession no. NP_841237 및 NC_004757). NE1181의 뉴클레오티드 서열 정보로부터 폴리펩티드 전장을 코드하는 영역의 DNA를 PCR로 증폭하기 위하여 프라이머 NE1181-F (서열번호 11) 및 프라이머 NE1181-R(서열번호 12)을 각각 합성하였다.
니트로소모나스 유로패아 ATCC19718 균주의 게놈 DNA는 ATCC로부터 입수하였다(ATCC 번호 19718D).
50 ng의 니트로소모나스 유로패아 ATCC19718 균주 게놈 DNA, 프라이머 NE1181-F 및 프라이머 NE1181-R을 사용하여, Pyrobest DNA 합성효소(Takara Bio)를 이용하는 PCR을 수행하여 362 bp의 증폭 DNA 단편을 수득하였다. 이 증폭 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 XhoI로 제한하여 아가로오스 전기 영동에 적용하고, 영동 후의 게놈으로부터 341 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 제한 효소 NdeI 및 XhoI로 제한해 둔 pET21a 벡터(Novagen)에 상기의 341 bp의 DNA 단편을 라이게이션하여 수득한 재조합 플라스미드를 이용하여 E. coli JM109(Escherichia coli JM109) 균주를 형질전환시켰다. 이렇게 하여 수득한 형질전환체의 콜로니로부터 플라스미드를 제조하고, 이의 뉴클레오티드 서열을 확인한 후, 발현 벡터 pET-NE1181이라고 명명하였다.
발현 벡터 pET-NE1181에 삽입시킨 니트로소모나스 유로패아 ATCC19718 균주 유래의 NE1181 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에, 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 14에 각각 나타낸다. 또한, 상기 발현 벡터 pET-NE1181에 있어서 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩티드의 C 말단의 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 8개의 아미노산 서열로 구성되는 히스티딘 태그가 부착된 폴리펩티드가 발현된다. 이는 NE1181로부터 번역된 폴리펩티드가 GAAU 또는 AAAU의 4개의 뉴클레오티드 서열을 확인하여 RNA를 절단하는 기질로서 합성 올리고리보뉴클레오티드를 이용하여 확인되었다.
NE1181 유전자는 그의 mRNA 중에 NE1181 폴리펩티드 자신을 절단하는 인식 서열을 가지기 때문에, 코드하는 아미노산 서열을 변화시키지 않도록 변이를 도입한 상기의 확인 서열을 제거하는 유전자를 인공합성하였다. 이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 나타낸다. 이어서, 실시예 4에서 작제한 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMTD3-U3TAR의 BamHI 자리에 인공합성한 NE1181 유전자를 삽입하였다. 이렇게 하여 작제한 NE1181 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드를 pMTD3-U3TAR-N4라고 명명하였다.
(2) 디이노코쿠스 라디오두란스 R1 ( Deinococcus radiodurans R1 ) 유래의 DR0662의 분리 레트로 바이러스 벡터 플라스미드의 작제 .
D. 라디오두란 R1 ( D. radioduran R1 ) 균주 유래의 DR0662 , M 보비스 BCG (M . bovis BCG ) 균주 유래의 Mb2014c 유사체의 분리와 발현 플라스미드의 작제 .
디이노코쿠스 라디오두란 R1 균주 유래의 DR0662의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 NCBI 데이터베이스에서 입수하였다(accession No. NP_294385 및 NC_001263). DR0662의 뉴클레오티드 서열 정보로부터 폴리펩티드 전장을 코드하는 영역의 DNA를 PCR로 증폭하기 위하여 프라이머 DR0662-F(서열번호 16) 및 프라이머 DR0062-R(서열번호 17)을 각각 합성하였다.
디이노코쿠스 라디오두란 R1 균주의 게놈 DNA는 ATCC로부터 입수하였다(ATCC 번호 13939D). 50 ng의 디이노코쿠스 라디오두란 R1 균주 게놈 DNA, 프라이머 DR0662-F 및 프라이머 DR0062-R을 사용하여, Pyrobest DNA 합성효소(Takara Bio)를 이용하는 PCR을 수행하여 368 bp의 증폭 DNA 단편을 수득하였다. 이 증폭 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 XhoI로 제한하여 아가로오스 전기 영동에 적용하고, 영동 후의 게놈으로부터 347 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 제한 효소 NdeI 및 XhoI로 제한해 둔 pET21a 벡터(Novagen)에 상기의 347 bp의 DNA 단편을 라이게이션하여 수득한 재조합 플라스미드를 이용하여 E. coli JM109 균주를 형질전환시켰다. 이렇게 하여 수득한 형질전환체의 콜로니로부터 플라스미드를 제조하고, 이의 뉴클레오티드 서열을 확인한 후, 발현 벡터 pET-DR0662라고 명명하였다.
이렇게 하여 수득한 발현 벡터 pET-DR066에 삽입시킨 디이노코쿠스 라디오두란 R1 균주 유래의 DR0662 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18에, 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 19에 각각 나타낸다. 또한, 상기 발현 벡터 pET-DR0662 및 pET-Mb2014Hlg에 있어서 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩티드의 C 말단의 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 8개의 아미노산 서열로 구성되는 히스티딘 태그가 부착된 폴리펩티드가 발현된다. 이는 DR066으로부터 번역된 폴리펩티드가 UUCCUUU의 7개의 뉴클레오티드 서열을 확인하여 RNA를 절단하는 기질로서 합성 올리고리보뉴클레오티드를 이용하여 확인하였다.
pET-DR0662를 주형으로 하여 PCR법으로 DR0662 유전자를 수득하고, 실시예 4에서 작제된 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMTD3-U3TAR의 BamHI 사이트에 PCR로 증폭된 DR0662 유전자를 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 DR0662 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드를 pMTD3-U3TAR-D3라고 명명하였다. DR0662 유전자의 증폭에 사용한 프라이머를 서열 번호 20 및 21에 나타낸다.
(3) Tat 발현 레트로 바이러스 벡터의 작제
실시예 1에 기재한 pQBI-Tat를 제한효소 SacII-EcoRV로 제한하고, 평활화한 후 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pDON-AI의 PmeI 부위를 삽입하여, pDON-Tat를 작제하였다. 이어서 pDON-Tat를 BamHI-XhoI로 제한하여 SV40 프로모터 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 제거하고, pIRES2-ZsGreen1(Clontech)으로부터 IRES-ZsGreen 유전자 단편을 수득하여, 앞서 제한 효소로 제한한 pDON-Tat의 Tat 유전자의 하류에 삽입하여, pDON-Tat-ZsGreen를 작제하였다.
10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM를 넣은 6 cm 지름의 플레이트에 G3T-hi세포(다카라 바이오)를 넣고, 10 ㎍의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pDON-Tat-ZsGreen과 Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오)를 이용해 인산 칼슘법으로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 개시 8 시간 후에 배지를 신선한 것으로 교환해 배양을 계속하였다. 트랜스펙션 개시 24 시간 후에 재차 배지를 교환하고, 24 시간 후에 배양 상청액을 모아 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 바이러스 상청액으로서 하기의 실험에 사용하였다. 이 바이러스 벡터 도입 세포로부터는 Tat 단백질 및 녹색 형광 단백질인 ZsGreen이 발현된다.
(4) MazF , NEl181 또는 DR0662 를 코드하는 유전자가 도입된 CEM 세포주의 확립
10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM를 넣은 6 cm 지름의 플레이트에 G3T-hi세포(다카라 바이오)를 넣고, 10 ㎍의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드(pMTD-3-U3TAR-MazF, pMTD3-U3TAR-N4 또는 pMTD3-U3TAR-D3) 및 Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오)를 이용해 인산 칼슘법으로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 개시 8 시간 후에 배지를 신선한 것으로 교환하고 배양을 계속하였다. 트랜스펙션 개시 24 시간 후에 재차 배지를 교환하고, 24 시간 후에 배양 상청액을 모아 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 바이러스 상청액으로서 이하의 실험에 사용하였다.
CEM 세포는 10% FBS를 첨가한 RPMI-1640에서, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양하였다. 표면 미처리 24-웰 플레이트에 레트로넥틴(다카라 바이오)을 프로토콜에 따라 코팅하고, 상기의 바이러스 상청액 0.5 ㎖을 웰에 가하고, 32℃, 2000 × g, 2 시간의 원심 분리로 레트로 바이러스 벡터를 레트로넥틴 코팅 플레이트에 흡착시켰다. 상청액 제거 후, 1 × 105개/㎖로 제조한 CEM 세포 현탁액 1 ㎖을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 24 시간 배양한 후, 유전자 도입된 세포를 1 ㎎/㎖의 제네티신(G418) 함유 배지에서 3주간 배양함으로써, 각 바이러스로 형질전환된 다클론성 세포주를 생산하였다.
(5) MazF , NEl181 및 DR0662 의 발현 유도에 의한 세포 증식의 저해
(1) 표면 미처리 24-웰 플레이트에 레트로넥틴(다카라 바이오)을 프로토콜에 따라 코팅하고, 실시예 8에서 작제된 Tat 발현 레트로 바이러스 벡터 0.5 ㎖을 웰에 첨가하고, 32℃, 2000 × g, 2 시간의 원심 분리로 레트로 바이러스 벡터를 레트로넥틴 코팅 플레이트에 흡착시켰다. 상청액 제거 후, 실시예 9에서 제조된 MazF, NE1181 및 DR0662 발현 CEM 세포주를 각각 1 × 105개/㎖로 제조하고, 웰 당 1 ㎖을 첨가하여 감염을 실시하였다. 대조군으로서는 mRNA 인터페라아제 유전자를 도입하고 있지 않는 CEM 세포를 이용하고, 같은 방식으로 Tat 발현 레트로 바이러스 벡터를 감염시켰다. 감염으로부터 2일 및 15일 후, 유세포 분석기로 ZsGreen 양성율을 측정함으로써, Tat 발현 레트로 바이러스 감염 효율을 측정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, mRNA 인터페라아제 유전자 MazF, NE1181 및 DR0662를 코드하는 유전자가 도입된 CEM 세포에서는 Tat 단백질 의존적으로 유전자가 발현하고, 그 결과 mRNA가 분해에 수반하는 세포사가 유발되어 ZsGreen 양성율이 저하되었다. 이상의 결과로서, MazF와는 상이한 뉴클레오티드 서열 특이성을 갖는 mRNA 인터페라아제의 유전자를 사용했을 경우에도 HIV 감염 세포의 증식을 유사하게 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

ZsGreen 양성세포율(Tat 바이러스 양성세포율, %)
2일 15일
MazF 도입 CEM 6.64 1.38
NE1181 도입 CEM 28.62 15.96
DR0662 도입 CEM 49.51 13.70
CEM 54.31 43.42
실시예 8. MazF 발현에 의한 mRNA 분해와 리보좀 RNA 의 분석
(1) MazF와 형광 단백질 ZsGreen가 1개의 mRNA로부터 발현하는 벡터는 하기의 순서로 작제하였다. 실시예 2에 기재된 pQBI-LTRMazFcv1을 주형으로 하여 PCR법으로 MazF 유전자를 수득하고, pIRES2-ZsGreen1(Clontech)의 SacI-BamHI 사이트에 PCR로 증폭된 MazF 유전자를 삽입하였다. 이렇게 하여 작제된 MazF와 ZsGreen이 동시에 발현하는 플라스미드를 pMazF-IZ라고 명명하였다. MazF 유전자의 증폭에 사용된 프라이머를 서열 번호 22, 23에 나타낸다. 또한, 대조군으로서 pIRES2-ZsGreen1의 SacI-BamHI 사이트에 루시퍼라아제 유전자를 삽입한 플라스미드 pLuc-IZ를 작제하였다.
(2) 인간 293 세포(ATCC CRL-1573)는 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM 배지에서 배양을 수행하였다. 24-웰 콜라겐-코팅 플레이트(Corning)에 2 × 105개/㎖로 제조한 293 세포 현탁액을 웰 당 0.5 ㎖ 파종하고, 24 시간 동안 배양을 수행하였다. 앞서 기재한 pMazF-IZ 및 pLuc-IZ를 TransIT-293(Mirus)을 이용하여 트랜스펙션하고, 24, 48, 72 시간 후에 형광 단백질의 발현을 유세포 분석기 FACS Vantage(Becton Dickinson)로 해석하였다. 또한, 총 RNA를 RNeasy micro(Qiagen)로 회수하였다. 회수된 RNA는 마이크로 전기 영동 장치 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent)로 분석을 수행하였다. 유세포 분석기 해석에 의한 유전자 도입 세포의 형광 강도의 값을 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, pMazF-IZ를 도입한 세포에서는 ZsGreen의 발현이 억제되고 있는 것으로 나타났다. 이것은 발현된 MazF의 작용에 의해 mRNA가 분해되어 ZsGreen의 번역이 억제되었기 때문이라고 생각된다. 한편, 총 RNA의 전기 영동 분석에 의한 28s 및 18s리보좀 RNA의 비율을 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, pMazF-IZ를 도입한 세포와 pLuc-IZ를 도입한 세포의 28s 및 18s 리보좀 RNA의 비율은 동등하고, MazF의 발현에 의해 리보좀 RNA는 분해되지 않은 것으로 나타났다.

ZsGreen 형광 강도
24 시간 후 48 시간 후 72 시간 후
293 세포 2.68 3.67 3.81
pMazF-IZ 도입 293 세포 6.88 15.46 14.2
pLuc-IZ 도입 293 세포 129.44 450.35 583.94

rRNA 비율(28s/18s)
24 시간 후 48 시간 후 72 시간 후
pMazF-IZ 도입 293 세포 2.1 2.0 2.2
pLuc-IZ 도입 293 세포 2.1 2.0 2.3
실시예 9. MazE 에 의한 MazF 활성의 억제
MazF의 항독소인 MazE를 발현하는 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMSN-MazE를 하기의 순서로 작제하였다.
pMT 벡터[Gene Therapy, 11:94-99 (2004)]의 BamHI-XhoI 부위에 서열번호 24로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 MazE 유전자를 삽입하여 pMT-MazE를 작제하였다. pMT-MazE의 XhoI 부위에 pDON-AI로부터 SalI-XhoI으로 제한하여 수득한 SV40 프로모터 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 단편을 삽입하였다. 수득된 MazE 발현 레트로 바이러스 벡터 플라스미드를 pMSN-MazE라고 명명하였다.
10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM를 넣은 6 cm 지름의 플레이트에 G3T-hi세포(다카라 바이오)를 넣고, 10 ㎍의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pMSN-MazE와 Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오)를 이용하여 인산 칼슘법에 의해 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 개시 8 시간 후에 배지를 신선한 것으로 교환하고 배양을 계속하였다. 트랜스펙션 개시 24 시간 후에 재차 배지를 교환하고, 24 시간 후에 배양 상청액을 모아 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 여과액을 MSN-MazE 바이러스 상청액으로 하였다. 표면 미처리 24-웰 플레이트에 레트로넥틴(다카라 바이오)을 프로토콜에 따라 코팅하고, MSN-MazE 바이러스 벡터 0.5 ㎖을 웰에 가하고, 32℃, 2000 g, 2 시간의 원심 분리로 MazE 발현 레트로 바이러스 벡터를 레트로넥틴-코팅 플레이트에 흡착시켰다. 상청액 제거 후, 293 세포를 1 × 105개/㎖로에 제조하고, 웰 당 1 ㎖을 첨가하여 감염을 수행하였다. 37℃, 5% CO2 존재 하에서 24 시간 동안 배양한 후, 유전자가 도입된 세포를 O.5 mg/㎖의 제네티신(G418) 함유 배지에서, 2주간 배양하는 것으로써, MazE를 항상 발현하는 다클론성 세포주 293-MazE를 생산하였다.
실시예 4 기재의 pSIN-HLTR-MazF로부터 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 제거하고 대신으로 하이그로마이신 내성 유전자를 삽입한 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pSINH-HLTR-MazF를 작제하였다.
10% 우태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM를 넣은 6 cm 지름의 플레이트에 G3T-hi세포(다카라 바이오)를 넣고 10 μg의 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pSINH-HLTR-MazF와 Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오)를 이용하는 인산 칼슘법으로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 개시 8 시간 후에 배지를 신선한 것으로 교환하고 배양을 계속하였다. 트랜스펙션 개시 24 시간 후에 재차 배지를 교환하고, 24 시간 후에 배양 상청액을 모아 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 여과액을 SINH-HLTR-MazF 바이러스 상청액으로 하였다. 표면 미처리 24-웰 플레이트에 레트로넥틴(다카라 바이오)을 프로토콜에 따라 코팅하고, SINH-HLTR-MazF 바이러스 벡터 0.5 ㎖을 웰에 가하고, 32℃, 2000 g, 2 시간의 원심 분리로, MazF 발현 레트로 바이러스 벡터를 레트로넥틴-코팅 플레이트에 흡착시켰다. 상청액 제거 후, 293-MazE 세포 및 293 세포를 1 × 105개/㎖로 제조하고, 웰 당 1 ㎖을 첨가하여 감염을 수행하였다. 37℃, 5% CO2 존재 하에서 24 시간 동안 배양한 후, 유전자가 도입된 세포를 0.2 mg/㎖의 하이그로마이신 B 함유 배지에서 2주간 배양함으로써, 다클론성 세포주 293-MazE-Maz F 및 293-MazF를 생산하였다.
표면 미처리 24-웰 플레이트에 레트로넥틴(다카라 바이오)을 프로토콜에 따라 코팅하고, 실시예 8에서 제조된 Tat 발현 레트로 바이러스 벡터 0.5 ㎖을 웰에 가하고, 32℃, 2000 g, 2 시간의 원심 분리로 레트로 바이러스 벡터를 레트로넥틴-코팅 플레이트에 흡착시켰다. 상청액을 제거한 후, 293- MazE- MazF 및 293-MazF 세포주를 1 × 105개/㎖로 제조하고, 웰 당 1 ㎖을 첨가하여 감염을 수행하였다. 대조군으로서 293 세포에도 감염을 수행하였다. 감염으로부터 2일 후 현미경 관찰로 세포 성장을 관찰하였다. 293-MazF 세포에서는 Tat 단백질의 기능에 의해 MazF가 발현하여 세포 증식이 억제되었지만, 293-MazE-MazF 세포에서는 MazF의 작용이 MazE에 의해 중화되어 293 세포와 동등한 성장을 나타내었다. 진핵생물에 대해서도 MazE가 MazF의 항독소로서 작용하는 것으로 나타내었다.
본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염의 치료 및 예방에 유효한 핵산 작제물을 제공한다. 상기 핵산 작제물이 도입된 세포는 HIV의 복제를 억제할 수 있으므로, HIV 감염의 치료 및 예방에 효과를 나타낸다.
서열번호 3 ; MazF를 코딩하는 합성 DNA.
서열번호 4 ; HIV LTR 부분을 증폭하기 위한 프라이머 5'HIV1 U3.
서열번호 5 ; HIV LTR 부분을 증폭하기 위한 프라이머 3'HIV1 R.
서열번호 6 ; HIV LTR 부분을 증폭하기 위한 프라이머 3'HIV1 TAR.
서열번호 7 ; MazF를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 5'MazF.
서열번호 8 ; MazF를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 3'MazF.
서열번호 9 ; GaLV 외피를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 5'KpnI.
서열번호 10 ; GaLV 외피를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 3'ClaI.
서열번호 11 ; NE1181 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 NE1181-F.
서열번호 12 ; NE1181 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 NE1181-R.
서열번호 15 ; NE1181 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA.
서열번호 16 ; DR0662 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 DR0662-F.
서열번호 17 ; DR0662 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 DR0662-R.
서열번호 20 ; DR0662 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머프라이머.
서열번호 21 ; DR0662 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머프라이머.
서열번호 22 ; MazF를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머.
서열번호 23 ; MazF를 코딩하는 DNA를 증폭하기 위한 프라이머.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 인간 면역 결핍 바이러스의 트랜스 작용 인자에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열; 및
    상기 서열의 하류에 위치하여 상기 서열에 의해 발현이 조절되는 MazF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산.
  2. 제1항에 있어서, Tat 단백질 또는 Rev 단백질에 의해 전사가 유도되는 전사 조절 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 전사 조절 서열이 인간 면역 결핍 바이러스의 LTR이고, MazF 단백질을 코딩하는 유전자가 상기 인간 면역 결핍 바이러스의 LTR의 하류에 위치하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 핵산이 벡터에 함입되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 삭제
  6. 삭제
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