CN105154461A - 一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化效率检测受体蛋白模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组表达、分离纯化人源Fn3蛋白突变体作为N-糖基化效率检测模式蛋白的应用方法。该方法包括以下步骤：Fn3突变体Fn3-Gly-loop重组蛋白基因表达载体构建、将构建的表达载体用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，经抗生素筛选得到阳性克隆，此重组蛋白就含有将被重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop蛋白、Western？Blot法检测Fn3-Gly-loop融合蛋白糖基化效率。本发明在大肠杆菌体内用骨架蛋白Fn3作为受体蛋白，建立适合进行N-糖基化修饰效率研究的模式受体蛋白，可以解决在大肠杆菌体内简单、快速、高效地检测重组蛋白糖基化效率的问题。

Description

一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化效率检测受体蛋白模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组表达、分离纯化人源Fn3蛋白突变体作为N-糖基化效率检测模式蛋白的应用方法。

背景技术

N-糖基化修饰蛋白质是生物体内重要的蛋白质后加工过程。N-糖基化修饰蛋白质能改善药物蛋白理化性质、改善药代动力学特性、提高药效的重要方法。大肠杆菌表达系统自身不能对外源蛋白进行N-糖基化加工修饰。2002年瑞士联邦理工学院Wacker(MarkusAebi教授课题组)首次将空肠弯曲杆菌N-糖基化机制成功引进大肠杆菌中，实现在大肠杆菌体内N-糖基化修饰外源蛋白质，标志着“原核生物重组糖基工程”的到来，开启了大肠杆菌体内表达生产N-糖基化蛋白新纪元。近几年在大肠杆菌体内利用空肠弯曲杆菌N-糖基化修饰系统pgl(proteinglycosylation)生产均一的N-糖蛋白取得了重大进展。研究发现空肠弯曲杆菌寡糖转移酶pglB及寡糖翻转酶pglK都具有宽松的底物识别特异性，使得按照需求在大肠杆菌体内生产目标靶糖蛋白成为可能。目前，在大肠杆菌体内为进一步研究在大肠杆菌体内重建糖基化途径时，如何快速准确的确定其修饰靶蛋白的效率，从而进一步阐明糖基转移酶构效关系已成为研究的关键。

骨架蛋白是指一类构成蛋白质骨架部分的能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。其结构类似抗体可变区，包括氨基酸的组成、序列高度可变的区域及稳定的骨架区。目前这类蛋白已经应用于人工结合蛋白筛选。人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)包含94个氨基酸残基，分子量13.8kD，不含半胱氨酸和二硫键，与人免疫球蛋白的三级结构相似，且具有热稳定性高、在大肠杆菌体内能正确折叠及高效可溶表达等特点；同时三维结构分析显示：Fn3蛋白质由7个反向平行的β折叠构成，按照氨基酸顺序分别为A-G片段。在片段之间形成3个的loop区的位置对应免疫球蛋白的CDR1-3，研究的比较清楚的是包括7个氨基酸残基的BCloop和包括11个氨基酸残基的FGloop。之前报道发现大量的突变发生在这两个loop区，表明这两个loop的变化对骨架蛋白本身稳定性的影响不大。而BCloop比FGloop短且不如其柔韧。但是这两个loop区均位于蛋白分子表面。研究也指出FN3家族中的成员与激素之间的反应是由FGloop和BCloop介导的。这些都表明FGloop和BCloop可以作为结合位点，并受空间构像的影响，推测其适合做N-糖基化效率检测的模式受体蛋白，可以用来研究糖基转移酶与底物结合的构效关系。

发明内容

本发明提供一种应用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立了高效N-糖基化效率检测的受体蛋白模型，应用于简单、快速、高效地在大肠杆菌体内、体外重组糖基工程对靶蛋白修饰效率的检测，应用于原核生物糖基转移酶构效关系的研究。

一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化效率检测受体蛋白模型的方法，包括以下步骤：

1.Fn3突变体Fn3-Gly-loop重组蛋白基因表达载体构建：(1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，用PyMOL软件进行蛋白质模建设计糖基化位置，分别在Fn3蛋白loop区通过编码柔链GGGGS引入编码糖基化位点序列DQNAT。再通过编码柔链GGGGS引入编码6个组氨酸残基碱基序列。(2)根据大肠杆菌密码子偏好性，委托公司合成Fn3-Gly-loop基因，并克隆到pIG6H质周腔表达载体上，形成携带Fn3-Gly-loop基因的表达载体，命名为pIG6H-Fn3-Gly-loop。(3)将以上融合基因Fn3-Gly构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，与携带来源空肠弯曲菌的N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N-糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-(Glc–β1,3-)GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1。

2.将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，经抗生素筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就含有将被重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop蛋白，具体步骤为：将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6；以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在25-35℃、200rpm条件诱导表达24小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g。

3.收集菌体裂解后WesternBlot法检测Fn3-Gly-loop融合蛋白糖基化效率。

该系统可以在大肠杆菌体内简单、快速、高效地检测重组蛋白糖基化效率，便于原核生物糖基转移酶构效关系及大肠杆菌体内糖基重组研究。

本发明的有益效果是，在大肠杆菌体内用骨架蛋白Fn3作为受体蛋白，建立适合进行N-糖基化修饰效率研究的模式受体蛋白，可以解决在大肠杆菌体内简单、快速、高效地检测重组蛋白糖基化效率的问题，继而改善靶蛋白的理化性质如可溶性，稳定性等，最终有利于N-糖基化药物蛋白高效低成本地大规模生产。

本发明所述的重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop模式受体蛋白还具有广泛的潜在应用领域，如可用于在大肠杆菌体外作为重组糖基N-糖基化效率检测的受体蛋白，如果转化时不加人含糖基化酶基因簇载体pACYCpgl的质粒，则受体蛋白含有糖基化位点但不被糖基化，在存在糖基供体的情况下通过体外试管中催化反应就可以实现体外糖基化修饰效率的检测。本发明所述的重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop受体模式蛋白方法也可通过不同糖基化位点的改造，应用于其他原核生物N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化等重组糖基修饰效率及糖基转移酶构效关系的研究。同时Fn3-Gly-loop作为人源蛋白，也可为真核生物糖基重组工程提供高效的糖基化效率检测模式蛋白，从而阐明真核生物糖基转移酶与底物的构效关系。

附图说明

图1是本发明的Fn3-Gly-loop基因结构图；

图2是本发明的pIG6H/Fn3-Gly-loop表达载体结构图；

图3是本发明在诱导温度为25℃时Fn3-Gly-loop蛋白糖基化效率检测图；其中泳道1:Fn3-Gly-loop；2:Fn3-loop。

图4是本发明在诱导温度为30℃时Fn3-Gly-loop蛋白糖基化效率检测图；其中泳道1:Fn3-Gly-loop；2:Fn3-loop。

图5是本发明在诱导温度为35℃时Fn3-Gly-loop蛋白糖基化效率检测图；其中泳道1:Fn3-Gly-loop；2:Fn3-loop。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。实施例1

1.本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基，在FGloop区引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域突变体Fn3-Gly-loop基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly-loop。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6。然后，以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在25℃、200rpm条件诱导表达24小时。在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g。

将获得的重组蛋白Fn3-Gly-loop通过WesternBlot方法测定糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入一抗(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图3所示。

4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly-loop。

实施例2

1.本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基，在FGloop区引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域突变体Fn3-Gly-loop基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly-loop。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6。然后，以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在30℃、200rpm条件诱导表达24小时。在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g。

将获得的重组蛋白Fn3-Gly-loop通过WesternBlot方法测定糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入一抗(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图4所示。

4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly-loop。

实施例3

1.本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基，在FGloop区引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域突变体Fn3-Gly-loop基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly-loop。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜24小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6。然后，以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中，在35℃、200rpm条件诱导表达24小时。在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly。自动诱导培养基的配方如下:每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g。

将获得的重组蛋白Fn3-Gly-loop通过WesternBlot方法测定糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入一抗(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行ECL发光检测，如图5所示。

4.超声破碎大量自动诱导培养(方法同前，试剂按比例扩大)收集的菌体制备可溶蛋白，超声破碎参数为功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min。16000转/分钟离心20min后取上清，然后用镍柱纯化带有His-Tag标签的重组蛋白Fn3-Gly-loop。

本发明实施方式不限此，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

<110>大连大学

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Claims (1)

1.一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化效率检测受体蛋白模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、Fn3突变体Fn3-Gly-loop重组蛋白基因表达载体构建：

1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，用PyMOL软件进行蛋白质模建设计糖基化位置，分别在Fn3蛋白loop区通过编码柔链GGGGS引入编码糖基化位点序列DQNAT，再通过编码柔链GGGGS引入编码6个组氨酸残基碱基序列；

2)根据大肠杆菌密码子偏好性，合成Fn3-Gly-loop基因，并克隆到pIG6H质周腔表达载体上，形成携带Fn3-Gly-loop基因的表达载体，命名为pIG6H-Fn3-Gly-loop；

3)将以上融合基因Fn3-Gly构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，与携带来源空肠弯曲菌的N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N-糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-(Glc–β1,3-)GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1；

(2)、将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，经抗生素筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就含有将被重组糖基修饰的Fn3-Gly-loop蛋白，具体步骤为：

将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有100微克每毫升的氨苄青霉和37微克每毫升的氯霉素的LB固体培养基平板上，每升LB固体培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉，过夜24小时培养，筛选出单克隆后将其接种到含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基，过夜16小时培养；

以1:100接种到10毫升含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基的三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD₆₀₀达到0.6；以1:100接种到100毫升含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的自动诱导培养基中，在25-35℃、200rpm条件诱导表达24小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白Fn3-Gly，自动诱导培养基的配方为：每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g；

(3)、收集菌体裂解后WesternBlot法检测Fn3-Gly-loop融合蛋白糖基化效率。