CN105154462A - 一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化受体蛋白模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种人源Fn3蛋白携带N-糖基化识别位点作为受体蛋白在大肠杆菌体内建立高效的N-糖基化受体蛋白模型的方法。该方法包括以下步骤：构建Fn3-Gly重组蛋白基因表达载体，形成Fn3携带N-糖基化识别位点的重组基因，将该基因克隆到能将重组蛋白分泌到质周腔的表达载体上，该载体表达的重组蛋白可作为研究原核生物N-糖基化受体蛋白模型，用于N-糖基重组研究。本发明可获得热稳定性好、表达量高、便于分离纯化的近100％N-糖基化重组蛋白质，为N-糖基重组工程提供良好的蛋白受体、为原核生物N-糖基重组工程提供受体蛋白模型，为高效地进行N-糖基重组工程后期寡糖链分析和功能研究奠定基础。

Description

一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化受体蛋白模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人源Fn3蛋白携带N-糖基化识别位点作为受体蛋白在大肠杆菌体内建立高效的N-糖基化受体蛋白模型的方法。

背景技术

随着糖生物学的深入研究发展，应用大肠杆菌表达N-糖基化均质性糖蛋白成为目前研究热点之一。目前，利用空肠弯曲杆菌糖基化修饰系统pgl(proteinglycosylation)在大肠杆菌体内成功实现生产均一的N-糖基化蛋白。另外研究发现空肠弯曲菌寡糖转移酶pglB及寡糖翻转酶pglK都具有宽松的底物识别特异性，使得按照需求在大肠杆菌体内定制目标糖蛋白成为可能。但是，目前该系统N-糖基化修饰外源重组蛋白效率低，一般能达到50-70％左右，这给后期糖蛋白分离纯化增加困难，进而对糖蛋白上的重组寡糖分析增加难度。为便于后期研究，急需有一个蛋白模型，既能够高效进行N-糖基化修饰，又能在大肠杆菌体内高效表达，且易于分离纯化。建立这样一个蛋白质N-糖基化受体模型，将为重组糖基研究带来极大的便利。

骨架蛋白是一类构成蛋白质骨架部分的能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。来源于一些蛋白质结构非常稳定的结构域。骨架蛋白包括非抗体的蛋白A、载脂蛋白、人纤维连接蛋白III型结构域(fibronectintypeIIIdomain，Fn3)、锚定蛋白的识别重复区域、硫氧还蛋白等。人纤连蛋白(fibronectin)是一类在细胞外基质和细胞间相互接触中发挥重要作用的大分子糖蛋白。它结构稳定，由三种小的结构域(I、II、III)重复排列组成。人纤连蛋白中包含15个Fn3重复片段。Fn3共有94个氨基酸残基，重组后分子量12.78kD，不含半胱氨酸和二硫键，且具有热稳定性高、在大肠杆菌体内能高效可溶表达并正确折叠等特点。

本研究利用骨架蛋白Fn3作为N-糖基化寡糖受体蛋白，在大肠杆菌体内建立了高效的N-糖基化蛋白受体模型，为进一步研究重组糖基奠定基础。

发明内容

本发明提供一种应用人源骨架蛋白Fn3(fibronectintypeIIIdomain，Fn3)在大肠杆菌体内建立了高效的N-糖基化受体蛋白模型，可以为糖基重组工程提供良好的糖基化受体蛋白。

基于人源骨架蛋白Fn3突变为重组N-糖基化蛋白质受体方法，包括以下步骤：

1.Fn3-Gly重组蛋白基因表达载体构建：(1)在Fn3蛋白基因的3′端通过编码柔链GGGGS序列引入编码N-糖基化识别序列DQNAT碱基序列，(2)并根据大肠杆菌密码子偏好性在编码N-糖基化识别序列DQNAT碱基序列下游，通过编码柔链GGGGS序列引入编码6个组氨酸残基碱基序列，用于重组蛋白分离纯化，(3)将以上编码Fn3-Gly重组基因构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，获得的表达载体命名为pIG6H-Fn3-Gly，与携带来源空肠弯曲菌的N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N-糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-(Glc–β1,3-)GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1。

2.将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜12小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的50毫升的试管中，在25℃条件下，在培养摇床中进行200rpm震动培养，直至细菌浓度OD₆₀₀达到0.4-0.6，加入1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达重组蛋白Fn3-Gly。该重组蛋白将在信号肽引导下进入质周腔。该蛋白即为N-糖基化修饰受体蛋白模型。

3.收集菌体裂解后经WesternBlot法检测糖基化效率；收集菌体提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有N-糖基修饰的重组Fn3-Gly蛋白。该系统可以获得热稳定性好、表达量高、便于分离纯化的近100％N-糖基化重组蛋白质。该系统可以用于大肠杆菌体内糖基重组研究。

本发明的有益效果是，通过本发明可以在大肠杆菌体内建立重组糖基蛋白受体模型，实现简单、快速、高效低成本地成本的大规模生产N-糖基化药物蛋白，有利于改善重组蛋白的理化性质如可溶性，稳定性等。

本发明所述的重组糖基修饰的Fn3-Gly受体蛋白模型还具有广泛的潜在应用领域，如可用于在大肠杆菌体外作为糖基化修饰的受体蛋白，如果转化时不加人含糖基化酶基因簇载体pACYCpgl的质粒，则受体蛋白含有糖基化位点但不被糖基化，在存在糖基供体的情况下通过体外试管中催化反应就可以实现高效率的体外糖基化修饰。本发明所述的重组糖基修饰的Fn3-Gly受体蛋白方法也可通过不同糖基化位点的改造，应用于其他原核生物N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化等重组糖基修饰研究等，为糖基重组工程后期寡糖链分析和功能研究奠定基础。

附图说明

图1是本发明的Fn3-Gly基因结构图。

图2是本发明的pIG6H/Fn3-Gly表达载体结构图。

图3是本发明在诱导温度为25℃时N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly鉴定图。

图4是本发明在诱导温度为30℃时N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly鉴定图。

图5是本发明用IPTG在诱导温度为30℃时N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly鉴定图。

图6是本发明N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化图。

图中：泳道1为标准蛋白质，泳道2为未糖基化的分离纯化的Fn3-Gly，泳道3为分离纯化N-糖基化的Fn3-Gly。

图7是本发明N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化图。

图中：泳道1为未糖基化的分离纯化的Fn3-Gly，泳道2为分离纯化N-糖基化的Fn3-Gly，泳道3为标准蛋白质。

图8是本发明N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化图。

图中：泳道1为分离纯化N-糖基化的Fn3-Gly，泳道2为未糖基化的分离纯化的Fn3-Gly，泳道3为标准蛋白质。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。实施例1

1.本实施例采用人源骨架蛋白纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的3′末端引入编码6个组氨酸残基，在3′末端引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域重组基因Fn3-Gly表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜12小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的50毫升试管中。37℃条件下在摇床中震荡200rpm培养，直至菌体测定浓度OD₆₀₀达到0.4-0.6时，再以1:100接种到100毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)自动诱导培养基中(每升培养基中含有以下各组分：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，甘油5克，葡萄糖0.5克，乳糖2克，磷酸氢二钠7.1克，磷酸二氢钾6.8克，硫酸铵3.3克，硫酸钠0.9克，七水硫酸镁0.25g)，在25℃条件下在摇床中以200rpm条件诱导表达24小时。

4.离心收集菌体，通过WesternBlot方法测定重组蛋白Fn3-GlyN-糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图3所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly，获得100％的N-糖基化Fn3-Gly。

4.通过超声破碎(功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min)进行菌体裂解制备可溶蛋白，并通过镍柱纯化重组蛋白Fn3-Gly。上样缓冲液为pH7.5、500mM的NaCl、10mM的咪唑；洗脱缓冲液pH8.0并添加500mM的NaCl，采取梯度为40、80、120、240、300mM咪唑进行洗脱，经过一步纯化即可获得纯度近100％N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly。

5.N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly经质谱分析，其分子量为14191.0，和理论计算的N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly分子量一致，进一步证明Westernblot的结果正确。

6.Fn3-Gly及N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化，结果见图6，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly。

从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得N-糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。

实施例2

1.本实施例采用人源骨架蛋白纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的3′末端引入编码6个组氨酸残基，在3′末端引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域重组基因Fn3-Gly表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜12小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的50毫升试管中。37℃条件下在摇床中震荡200rpm培养，直至菌体测定浓度OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG，25℃条件下在摇床中以200rpm条件诱导诱导表达3小时后，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析。

4.通过WesternBlot方法测定菌体内重组蛋白Fn3-GlyN-糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图4所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly，获得100％的N-糖基化Fn3-Gly。

4.通过超声破碎(功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min)进行菌体裂解制备可溶蛋白，并通过镍柱纯化重组蛋白Fn3-Gly。上样缓冲液为pH7.5、500mM的NaCl、10mM的咪唑；洗脱缓冲液pH8.0并添加500mM的NaCl，采取梯度为40、80、120、240、300mM咪唑进行洗脱，经过一步纯化即可获得纯度近100％N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly。

5.N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly经质谱分析，其分子量为14191.0，和理论计算的N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly分子量一致，进一步证明Westernblot的结果正确。

6.Fn3-Gly及N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化，结果见图7，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly。

从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得N-糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。

实施例3

1.本实施例采用人源骨架蛋白纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。在基因的3′末端引入编码6个组氨酸残基，在3′末端引入编码糖基化位点DQNAT的碱基序列,融合基因结构见图1。将基因通过基因重组构建到pIG6H，载体结构见图2。

2.将序列表所示的人纤维连接蛋白III型结构域重组基因Fn3-Gly表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoRV和HindIII构建到大肠杆菌表达载体pIG6H上，得到重组载体pIG6H-Fn3-Gly。

3.将构建的表达载体及pACYCpgl电击转化CLM37大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB固体培养基(每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉)平板上，过夜12小时培养。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基，过夜16小时培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和氯霉素(37微克每毫升)的LB液体培养基的50毫升试管中。37℃条件下在摇床中震荡200rpm培养，直至菌体测定浓度OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG，30℃条件下在摇床中以200rpm条件诱导诱导表达6小时后，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析。

4.通过WesternBlot方法测定菌体内重组蛋白Fn3-GlyN-糖基化效率。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图5所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly，获得100％的N-糖基化Fn3-Gly。

4.通过超声破碎(功率300W，间隔时间10S，破碎时间10S,总时间20min)进行菌体裂解制备可溶蛋白，并通过镍柱纯化重组蛋白Fn3-Gly。上样缓冲液为pH7.5、500mM的NaCl、10mM的咪唑；洗脱缓冲液pH8.0并添加500mM的NaCl，采取梯度为40、80、120、240、300mM咪唑进行洗脱，经过一步纯化即可获得纯度近100％N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly。

5.N-糖基化的重组蛋白Fn3-Gly经质谱分析，其分子量为14191.0，和理论计算的N-糖基化重组蛋白Fn3-Gly分子量一致，进一步证明Westernblot的结果正确。

6.Fn3-Gly及N-糖基化Fn3-Gly重组蛋白分离纯化，结果见图8，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-Gly。

从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得N-糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。

本发明实施方式不限此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

<110>大连大学

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Claims (1)

1.基于人源骨架蛋白Fn3突变为重组N-糖基化蛋白质受体方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、Fn3-Gly重组蛋白基因表达载体构建：

1)在Fn3蛋白基因的3′端通过编码柔链GGGGS序列引入编码N-糖基化识别序列DQNAT碱基序列；

2)根据大肠杆菌密码子偏好性在编码N-糖基化识别序列DQNAT碱基序列下游，通过编码柔链GGGGS序列引入编码6个组氨酸残基碱基序列，用于重组蛋白分离纯化；

3)将以上编码Fn3-Gly重组基因构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，获得的表达载体命名为pIG6H-Fn3-Gly，与携带来源空肠弯曲菌的N-糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N-糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-(Glc–β1,3-)GalNAc-α1,4-GalNAc–α1,4-GalNAc-α1,3-Bac-β1；

(2)、将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB固体培养基平板上，每升LB固体培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉，过夜12小时培养；

筛选出单克隆后将其接种到含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基，过夜16小时培养，次日，以1:100接种到10毫升含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基的50毫升的试管中，在25℃条件下，在培养摇床中进行200rpm震动培养，直至细菌浓度OD₆₀₀达到0.4-0.6，加入1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达重组蛋白Fn3-Gly，该重组蛋白将在信号肽引导下进入质周腔，该蛋白即为N-糖基化修饰受体蛋白模型。

(3)收集菌体裂解后经WesternBlot法检测糖基化效率；收集菌体提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有N-糖基修饰的重组Fn3-Gly蛋白。