CN106191087A - 一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法 - Google Patents
一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于人骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌Galβ1‑4GlcNAcβ1‑3Galβ1‑3GlcNAc‑类人源糖链的方法。该方法包括以下步骤：包括综合利用流感嗜血杆菌lsg基因簇脂多糖合成机制、空肠弯曲杆菌pgl基因簇N‑糖链合成机制、大肠杆菌体内O抗原糖链合成机制及原核生物转录调控机制等，构建了适用于大肠杆菌K‑12系列菌株表达的重组载体；并在大肠杆菌体内利用人源骨架蛋白Fn3表达展示出类人源糖链。本发明的有益效果是，可以简单、快速、高效制备具有类人源糖链的融合蛋白，为高效低成本大量制备类人源化寡糖及N‑糖基化糖链修饰的药物蛋白提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于人骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc-类人源糖链的方法。本发明能简单、快速、高效制备展示有流感嗜血杆菌类人源糖链Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc-的融合蛋白，即具有人源糖链末端Galβ1-4GlcNAc的糖蛋白复合物，可以进一步应用于大肠杆菌体内多种类人源糖链的研发及大量生产制备。
背景技术
经过糖生物学近二十年的发展，目前人们已经深刻认识到糖链的重要功能：糖链不仅能影响糖蛋白肽链的折叠、聚合、溶解和降解，还参与糖蛋白的分拣(sorting)和投送(trafficking)等细胞过程。糖链参与这些功能的主要机制是其细胞和分子的生物学识别(recognition)，如受体和配体、细胞和间质、细胞和细胞、细胞和病原体等，而大部分机制的透彻研究有赖于大量人源化或类人源糖链的制备。目前糖链的主要制备方法主要有天然产物提取法、化学合成法、酶合成法和微生物发酵法等。然而，天然产物提取法分离纯化过程复杂，需要一些特殊设备，回收率低，容易造成污染；化学合成法反应条件苛刻，需要一些昂贵的金属催化剂，产量也较低；酶合成法对反应的原料要求较高，成本较昂贵；微生物发酵法所用原料较低廉，产量较高，但仍然不适合大规模生产。目前通过对大肠杆菌体内寡糖合成代谢途径进行改造，以构建唾液酸化等类人源寡糖的高产量菌株，已成为国内外研究的热点。但由于一些真核寡糖转移酶在大肠杆体内表达后失去活性，使进一步研究及制备人源化寡糖面临巨大困难。
另一方面一些病原体可以通过在其表面合成宿主细胞糖抗原类似物以逃避宿主免疫系统的攻击，如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)在菌体表面合成的脂寡糖可以使其逃避人免疫系统的攻击。通过对病源体糖抗原糖链合成机制研究，有助于在大肠杆菌体内人源化糖基化合成机制的重建，使大肠杆菌体内糖链生产更加趋于人源化。
流感嗜血杆菌具有酶促合成与人类糖链相同连接方式(GlcNAc-Asn linkage)的糖基转移酶基因，可以酶促Galβ1-4GlcNAc-R(人糖蛋白糖链末端组成)糖链合成，即脂多糖合成lsg基因簇。此基因簇是7.4kb碱基的DNA片段，主要有lsgC、lsgD、lsgE、lsgF糖基转移酶基因组成。这些基因可以单独表达或共表达，并且这些基因可以在大肠杆菌被成功的克隆和表达寡糖。所以深入研究其在大肠杆菌中合成代谢机制与功能将有助于我们利用这些糖基转移酶基因合成我们所需要的复杂糖链，进一步在大肠杆菌体内构建类人源化N-糖基化寡糖合成机制，以期获得适合产业化生产类人源化N-糖基化单链抗体及蛋白药物大肠杆菌工程菌株。
骨架蛋白是一类构成蛋白质骨架部分的能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。来源于一些蛋白质结构非常稳定的结构域。该类蛋白具有高度稳定性和可溶性，易于在大肠杆菌种高水平表达，其中研究非常深入的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)是一种骨架蛋白。Fn3包含94个氨基酸残基，分子量13.8kD，具有非常高的热稳定性，Tm值高达87℃，其热变性过程完全可逆。除此之外，Fn3能够耐受高浓度的尿素；且在室温条件下，pH值在2-11.3的范围内仍然能保持蛋白质的天然构象。总之Fn3蛋白分子量小，易表达纯化；结构简单，易酶解和后续结构解析，非常适合在大肠杆菌表达系统中作为连接糖链的模式蛋白载体。
我们在大肠杆菌体内利用空肠弯曲菌N-糖基化系统修饰模式蛋白Fn3基础上，建立类人源糖蛋白寡糖链合成代谢途径，为唾液酸等人源化修饰N-糖基化药物蛋白合成奠定基础，开辟快速、低成本制备符合体内治疗标准的类人源寡糖修饰蛋白药物新途径。
综上所述本发明通过模仿流感嗜血杆菌其糖链合成机制，在大肠杆菌体内实现类人源糖蛋白寡糖链合成代谢途径的重建：包括综合利用流感嗜血杆菌lsgDEF基因簇脂多糖合成机制、空肠弯曲杆菌pgl基因簇N-糖链合成机制、大肠杆菌体内O抗原糖链合成机制及原核生物转录调控机制等，构建了适用于大肠杆菌K-12系列菌株表达的重组载体；并在大肠杆菌体内利用人源骨架蛋白Fn3表达展示出类人源糖链。即重建类人源N-糖基化表达系统，尝试建立一个使大肠杆菌体内糖基化更加趋于人源性的通用的平台。
发明内容
本发明建立一种基于利用大肠杆菌表达系统表达、分离纯化人骨架蛋白Fn3制备人源糖链末端寡糖链的方法，可以简单、快速、高效制备具有流感嗜血杆菌类人源糖链Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc-的糖蛋白复合物，可以进一步应用于大肠杆菌体内多种类人源糖链的研发和大量生产制备。
一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc-类人源糖链，包括以下步骤：
1、构建带有糖基化修饰位点和6个组氨酸标签的人骨架蛋白Fn3表达载体pIG6-Fn3-Gly，以便进行糖基化修饰和蛋白纯化：
(1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计糖基化修饰位点。根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的c端，选择优化的糖基化位点DQNAT氨基酸序列，即将编码Fn3基因序列的3′端通过编码4个甘氨酸和一个丝氨酸(GGGGS)的柔链与编码天冬氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸(DQNAT)的N-糖基化识别序列融合，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化：采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因，在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基的重组蛋白，命名为Fn3-Gly。
(2)将以上融合基因合成并克隆到质周腔表达载体上，融合的重组蛋白将在大肠杆菌质周腔表达：将上述设计合成的基因Fn3-Gly，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly。
2、整合原核生物寡糖合成机制，在大肠杆菌体内重建糖基化途径。本发明综合利用了流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)lsgDEF基因簇脂多糖合成机制，空肠弯曲杆菌pglB寡糖转移酶和大肠杆菌rfe酶的O糖链合成起始机制。构建具体步骤如下：
(1)将空肠弯曲杆菌来源的寡糖转移酶基因pglB构建至克隆载体p15ara2，可以在质周腔内将合成的寡糖链转运到骨架蛋白Fn3上，载体命名为p15ara2-pglB；
(2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇基因构建至载体p15ara2-pglB上，实现寡糖的特异性链接。将lsgDEF寡糖合成酶簇基因序列利用SmaI，XholI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg。
(3)利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg。大肠杆菌rfe(又称WecA)合成酶介导二磷酸尿核苷-葡萄糖(UDP-GlcNAc)与十一碳二烯磷酸酯以磷酸二酯键连接，是合成大肠杆菌O-抗原糖链的起始酶；空肠弯曲杆菌pglK翻转酶负责将合成的寡糖链翻转到质周腔内。最终类人源糖链合成基因簇表达载体命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe。并且此系列基因上游整合有阿拉伯糖操纵子来进行转录调控，可以由外源加入的阿拉伯糖数量灵活调控寡糖链与骨架蛋白的代谢平衡。
3、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌菌株中，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，Western Blot检测表达及糖基化情况。
将构建的重组蛋白及糖链基因质周腔表达载体共转化到大肠杆菌工程菌株DH5a，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链。将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达48-96小时，自动诱导培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素(氨苄青霉素或氯霉素)，具体步骤如下：
将构建好的载体pIG6-Fn3和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到3毫升含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9。然后，在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析。
其中，大肠杆菌菌株为K-12型；
LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化钠(NaCl)10g/L；
自动诱导培养基的主要配方如下:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，硫酸铵(NH4)2SO4 66g/L，阿拉伯糖10mmol/L，还包括0.5％甘油(glycerol)，0.05％葡萄糖(glucose),0.2％乳糖(alpha-lactose)。
4、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg。通过Western Blot方法和质谱分析可进一步鉴定重组蛋白的组成。
本发明的有益效果是，可以简单、快速、高效制备具有类人源糖链的融合蛋白，为高效低成本大量制备类人源化寡糖及N-糖基化糖链修饰的药物蛋白提供基础。
本发明所述的糖链重建及展示方法具有广泛的潜在应用领域：可以改善药物蛋白理化性质和药代动力学特性；利用基因工程技术重建寡糖代谢途径，在大肠杆菌体内构建类人源化N-糖基化寡糖合成机制，以期获得适合产业化生产类人源化N-糖基化单链抗体及蛋白药物大肠杆菌工程菌株；并可以系统研究唾液酸、岩藻糖等修饰N-糖基化单链抗体及药物稳定性、体外理化性质及动物模型体内血浆半衰期影响，为制备适合大规模产业化生产适合体内治疗的新型蛋白药物打下基础。不仅如此，该发明还将应用在高效生产其他糖蛋白药物领域，如可以进一步的优化及扩展利用更多的糖基转移酶基因，并且可能具有很大的潜力作为用于生产特定的脂质连接寡糖的一般方法。总之，该发明不仅具有理论研究价值，更具有实际广阔应用前景，对糖蛋白药物研发及糖疫苗生产具有推动作用。
附图说明
图1是本发明的Fn3-Gly基因结构图；
图2是本发明的pIG6-Fn3-Gly的载体结构图；
图3本发明的p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe的载体结构图；
图4是本发明的重组Fn3-Isg蛋白Western blot鉴定图，其中：分别是实施例1、2、3分离纯化的蛋白。图中：M.标准蛋白质；泳道1为未糖基化的分离纯化的Fn3-Gly，泳道2、3、4为分离纯化N-糖基化的Fn3-Isg重组蛋白；
图5为实施例1中分离纯化的重组蛋白Fn3-Isg质谱鉴定图；
图6为实施例2中分离纯化的重组蛋白Fn3-Isg质谱鉴定图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。
实施例一
1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的C端，选择糖基化位点DQNAT氨基酸序列，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化,命名为Fn3-Gly，融合基因结构见图1。
将序列表[002]所示的融合基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly，融合基因结构见图2。
2、整合原核生物寡糖合成机制，在大肠杆菌体内重建糖基化途径。具体步骤如下：(1)将寡糖转移酶基因pglB用NdeI，XholI酶切位点克隆至载体p15ara2，命名为p15ara2-pglB。(2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇用SmaI，XholI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg。(3)利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg，命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe，融合基因结构见图3。
3、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌DH5a菌株中，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，Western Blot检测表达及糖基化情况。
将构建的重组蛋白及糖链基因质周腔表达载体共转化到大肠杆菌工程菌株DH5a，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链。将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达48-96小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤如下：将构建好的载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株DH5a，然后将转化子接种到3毫升含有抗生素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到10毫升含有抗生素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9。然后，在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集DH5a菌体，进行下一步分析。LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化钠(NaCl)10g/L。自动诱导培养基的主要配方如下:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，硫酸铵(NH4)2SO4 66g/L，阿拉伯糖10mmol/L，还包括0.5％甘油(glycerol)，0.05％葡萄糖(glucose),0.2％乳糖(alpha-lactose)。
4、通过Western Blot方法测定菌体内重组蛋白Fn3-Gly N-糖基化情况。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图4所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-lsg。
5、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg。
6、N-糖基化的重组蛋白Fn3‐Isg经质谱分析，其分子量为13581.0，和理论计算的N-糖基化重组蛋白Fn3-lsg分子量一致，进一步证明Western blot的结果正确。
从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得带有类人源寡糖链的糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。
实施例二
1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的C端，选择糖基化位点DQNAT氨基酸序列，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化,命名为Fn3-Gly，融合基因结构见图1。
将序列表[002]所示的融合基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly，融合基因结构见图2。
2、整合原核生物寡糖合成机制，在大肠杆菌体内重建糖基化途径。具体步骤如下：(1)将寡糖转移酶基因pglB用NdeI，XholI酶切位点克隆至载体p15ara2，命名为p15ara2-pglB。(2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇用SmaI，XholI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg。(3)利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg，命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe，融合基因结构见图3。
3、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌CLM37菌株中，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，Western Blot检测表达及糖基化情况。
将构建的重组蛋白及糖链基因质周腔表达载体共转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链。将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达48-96小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤如下：将构建好的载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株CLM37，然后将转化子接种到3毫升含有抗生素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到10毫升含有抗生素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9。然后，在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集CLM37菌体，进行下一步分析。
4、通过Western Blot方法测定菌体内重组蛋白Fn3-Gly N-糖基化情况。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图4所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-lsg。
5、.收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg。
6、N‐糖基化的重组蛋白Fn3‐Isg经质谱分析，其分子量为13581.0，和理论计算的N‐糖基化重组蛋白Fn3‐lsg分子量一致，进一步证明Western blot的结果正确。
从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得带有类人源寡糖链的糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。
实施例三
1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)。根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的C端，选择糖基化位点DQNAT氨基酸序列，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化,命名为Fn3-Gly，融合基因结构见图1。
将序列表[002]所示的融合基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly，融合基因结构见图2。
2、整合原核生物寡糖合成机制，在大肠杆菌体内重建糖基化途径。具体步骤如下：(1)将寡糖转移酶基因pglB用NdeI，XholI酶切位点克隆至载体p15ara2，命名为p15ara2-pglB。(2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇用SmaI，XholI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg。(3)利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg，命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe，融合基因结构见图3。
3、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌W3110菌株中，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，Western Blot检测表达及糖基化情况。
将构建的重组蛋白及糖链基因质周腔表达载体共转化到大肠杆菌工程菌株W3110，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链。将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达48-96小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤如下：将构建好的载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株W3110，然后将转化子接种到3毫升含有Amp+Cm(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到10毫升含有抗生素(浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9。然后，在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素(浓度为每毫升培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素)的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析。
4、通过Western Blot方法测定菌体内重组蛋白Fn3-Gly N-糖基化情况。取0.5OD菌用裂解液加热裂解，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上，经过封闭后，加入抗His抗体(1∶3000)进行室温孵育。二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000)孵育清洗后，进行化学发光检测，如图4所示，箭头指向的条带为N-糖基化Fn3-lsg。
5.收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg。
从本实施例来看，该方法可以快速、高效获得带有类人源寡糖链的糖基化蛋白质，为进一步研究重组糖基奠定基础。
本发明实施方式不限此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110> 大连大学
<120> 一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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Claims (1)
1.一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、构建带有糖基化修饰位点和6个组氨酸标签的人骨架蛋白Fn3表达载体pIG6-Fn3-Gly：
(1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计糖基化修饰位点，根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的c端，选择优化的糖基化位点DQNAT氨基酸序列，即将编码Fn3基因序列的3′端通过编码4个甘氨酸和一个丝氨酸的柔链与编码天冬氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸的N-糖基化识别序列融合，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签His-tag，便于分离纯化：采用人纤维连接蛋白III型结构域Fn3蛋白为模式基因，在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基的重组蛋白，命名为Fn3-Gly；
(2)将设计合成的基因Fn3-Gly，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly；
2)、利用流感嗜血杆菌lsg基因簇脂多糖合成机制，空肠弯曲杆菌来源的寡糖转移酶基因pglB寡糖转移酶和大肠杆菌rfe酶的O糖链合成起始机制，构建具体步骤如下：
(1)将pglB构建至克隆载体p15ara2，在质周腔内将合成的寡糖链转运到骨架蛋白Fn3上，载体命名为p15ara2-pglB；
(2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇基因构建至载体p15ara2-pglB上，实现寡糖的特异性链接，将lsgDEF寡糖合成酶簇基因序列利用SmaI，XholI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg；
(3)利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg：大肠杆菌rfe合成酶介导二磷酸尿核苷-葡萄糖与十一碳二烯磷酸酯以磷酸二酯键连接，是合成大肠杆菌O-抗原糖链的起始酶；空肠弯曲杆菌pglK翻转酶负责将合成的寡糖链翻转到质周腔内，最终类人源糖链合成基因簇表达载体命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe；
3)、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌菌株中，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，自动诱导培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素氨苄青霉素和氯霉素，Western Blot检测表达及糖基化情况，具体步骤如下：
将构建好的载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到3毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，氨苄青霉素和氯霉素的浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素，过夜培养；次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9，氨苄青霉素和氯霉素的浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素；在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，青霉素和氯霉素的浓度为每毫升自动诱导培养基含150微克氨苄青霉素、102微克氯霉素，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析；
其中，大肠杆菌菌株为K-12型；
LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L；
自动诱导培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸铵66g/L，阿拉伯糖10mmol/L，还包括0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖；
4)、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg，通过Western Blot方法和质谱分析进一步鉴定重组蛋白的组成。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201610536685.0A CN106191087B (zh) | 2016-07-08 | 2016-07-08 | 一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法 |
Publications (2)
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