CN101631862A - 修饰微生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有较高的蛋白质或多肽分泌生产能力的微生物以及使用该微生物产生蛋白质或多肽的方法。本发明涉及一种修饰微生物，其已经被基因修饰以使SecA的60－80个羧基末端氨基酸缺失。

Description

修饰微生物

技术领域

本发明涉及用于产生有用的蛋白质或多肽的微生物，以及产生该蛋白质或多肽的方法。

背景技术

微生物用于工业生产多种有用物质，包括食品，如酒精饮料、味噌、和酱油，还包括氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素、糖类、脂质和蛋白质。这些物质具有广泛的应用，诸如食品、药物、洗涤剂、化妆品和其他日用品、以及作为多种化学产品的原料。

在微生物中，革兰氏阳性细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌具有非常高的分泌多种胞外酶的能力，诸如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶。实际上，目前在工业中应用许多由杆菌产生的胞外酶。由细菌作为分泌物产生某些蛋白质的有用之处在于，例如，分泌的蛋白质通常具有其天然结构，并且因此分泌的蛋白质可很容易被纯化。因此，改善此类细菌株以便增加特定分泌性蛋白质的分泌和产生量是非常有意义的。

位于原核生物的外膜和周质间隙的许多蛋白质通过Sec转位机构介导而通过细胞质膜。建立了一种由SecY/SecE/SecG组成的异三聚体膜蛋白复合体、和与SecD/SecF/YajD异三聚体膜蛋白复合体弱结合的外周结合的二聚SecA制成的跨膜通道，并且该蛋白借助于来自SecA的ATP水解产生的能量转位而通过膜。已知如果细菌是大肠埃希氏杆菌，则通过分子伴侣SecB识别前分泌蛋白质，并且传递至细胞质膜表面上的SecA。在枯草杆菌中仍然没有识别出与分子伴侣SecB同源的因子，但相信枯草杆菌具有SRP(信号识别粒子)，特征性地参与跨真核生物的内质网膜的转位、以及分泌蛋白质从SRP向SecA的移交。已经显示枯草杆菌的SecA由两个结构域组成，N结构域和C结构域，N结构域具有ATP结合位点I(ABS I)和信号肽结合位点，C结构域具有参与SecA二聚作用并且与SecY相互作用的位点、以及与大肠埃希氏杆菌的SecB结合位点同源的区域，并且ATP结合位点II(ABS II)以与两个结构域排列的方式存在。

到目前为止，已有报道遗传修饰，诸如蛋白酶的删除(非专利文件1)、PrsA产生的增加(非专利文件2)、SecD/SecE/SecDF的过度表达(专利文件1)、以及SecG的过度表达(专利文件2)，作为用于增加蛋白质的分泌产生的技术。

然而，对于使SecA的一些氨基酸残基缺失以增加蛋白质的分泌产生还没有报道。

[非专利文件1]Olmos-Soto J，Contreras-Flores R.Genetic systemconstructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis(构建为在枯草杆菌中过度产生和分泌胰岛素原的遗传系统).Appl.Microbiol.Biotechnol.2003 Sep；62(4)：369-73。

[非专利文件2]Vitikainen M，Hyyrylainen HL，Kivimaki A，Kontinen VP，Sarvas M.Secretion of heterologous proteins in Bacillussubtilis can be improved by engineering cell components affectingpost-translocational protein folding and degradation(通过设计影响转位后蛋白质折叠和降解的细胞成分能够改善在枯草杆菌中分泌异源蛋白质).J Appl Microbiol.2005；99(2)：363-75。

[专利文件1]WO99/04007

[专利文件2]WO99/04006

发明内容

本发明具有下列1)至3)方面。

1)一种微生物，其被基因修饰以使secA的60-80个羧基末端氨基酸缺失；

2)一种重组体微生物，其通过将编码异源蛋白质或多肽的基因导入修饰微生物株中而构建；以及

3)一种使用重组体微生物产生蛋白质或多肽的方法。

附图说明

图1a是SAN819和SAN780株的secA基因位点周围的基因组结构的视图；

图1b是确认在SAN819和SAN780株中表达的SecA的大小的电泳图谱；

图2a是构建干扰素表达载体的方法的视图；

图2b是被导入干扰素表达载体pHKK3201中的枯草杆菌淀粉酶AmyE信号肽和pro序列、以及干扰素-α成熟区的融合蛋白的结构的视图；

图3a是显示通过Western印迹，在将pHKK3201导入宿主株SAN780和SAN819中后产生的干扰素-α的检测结果的视图；1道：当亲代168株为宿主时；2道：当ASN780株为宿主时；3道：当ASN819株为宿主时；

图3b是图3a的实验结果的图解形式；基于Western印迹的条带强度比较相对的IFNα蛋白质量。野生型株中IFNα的量设定为100％，误差条代表标准偏差；以及

图4是显示通过Western印迹，在将pHKK3202导入宿主株SAN780和SAN819中后产生的干扰素-β的检测结果的视图；1道：当亲代168株为宿主时；2道：当ASN780株为宿主时；3道：当ASN819株为宿主时。

具体实施方式

本发明涉及提供具有较高的蛋白质或多肽分泌产生能力的微生物、以及使用该微生物产生蛋白质或多肽的方法。

本发明人检验了杆菌中分泌性蛋白质转位机构的组成，并且发现当基因被修饰以使20-30或60-80、特别是60-80个SecA的羧基末端氨基酸缺失时，分泌产生的能力提高，并且此基因修饰的微生物可用于产生蛋白质和多肽。

SecA是涉及分泌性蛋白质分泌至细菌细胞外部的因子。当使SecA缺失时，不仅蛋白质的产生减少，而且细胞本身也会死亡。因此，SecA被认为是分泌机制的基本因子。因此，当使SecA的一些氨基酸残基缺失时，细菌分泌产生蛋白质的能力提高这一发现是非常出人意料的。

通过使用本发明的修饰微生物可有效地产生目标蛋白质或多肽，并且蛋白质或多肽可以很容易地从培养液中回收。因此，本发明可用于工业生产目标蛋白质或多肽。

在本发明中，使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))来测定氨基酸序列和碱基序列的同一性。为了更具特异性，使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software Development)的同源性搜索程序，并且进行分析，采用单位大小来比较为2的(ktup)参数，以计算同源性。

本发明的微生物(宿主微生物)可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，只要它具有编码SecA的基因，但优选革兰氏阳性细菌，因为它们具有通过分泌向细胞外产生蛋白质的能力。其中，优选杆菌属，并且特别优选枯草杆菌，因为其全部基因组信息是可获得的，并且遗传工程和基因组工程技术已经被很好地建立。

在本发明的修饰微生物中，要修饰的目标基因是编码SecA的基因。

SecA是涉及细菌中的蛋白质转运通路的因子(蛋白质)之一。其连同跨膜通道(SecY/SecE/SecG)具有向细菌细胞外分泌分泌性蛋白质的功能。枯草杆菌SecA(841个氨基酸，分子量95.3KDa)由两个结构域组成，N结构域和C结构域。N结构域具有ATP结合位点I(ABSI)和信号肽结合位点。C结构域具有参与SecA二聚作用并且与SecY相互作用的位点，以及与大肠埃希氏杆菌的SecB结合位点同源的区域，并且ATP结合位点II(ABS II)已知以与两个结构域排列的方式存在。

枯草杆菌SecA和功能上与其等价的蛋白质可以被列举为本发明中适于修饰的SecA的实例，并且编码枯草杆菌SecA或功能上与其等价的蛋白质的基因可以被列举为编码SecA的基因的实例。

更具体地，“枯草杆菌SecA或功能上与其等价的蛋白质”是指下面(A)至(C)中所述的蛋白质。

(A)具有SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质，并且其还具有与SecA相同的功能；和

(C)具有与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质，并且其还具有与SecA相同的功能。

在此，“SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或数个氨基酸”包括缺失、取代或添加一个或数个，优选1-10个氨基酸的氨基酸序列，并且此处“添加”包括在两个末端添加1至数个氨基酸。

在此，“与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列”优选是具有90％或更高同一性、更优选95％或更高同一性、并且甚至更优选99％或更高同一性的氨基酸序列。

此外，“具有与SecA相同的功能”是指具有实际上与SecA的功能相同的功能，诸如与SecA类似的ATP酶活性、以及与SecY/SecE复合体结合的能力。

在此，“编码枯草杆菌SecA或功能上与其等价的蛋白质的基因”是指编码上面(A)至(C)中所述的蛋白质的基因。但更优选地，它代表下面(a)至(c)所述的基因。

(a)具有SEQ ID NO：1所代表的碱基序列的DNA；

(b)在严格条件下与具有与SEQ ID NO：1所代表的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交，并且还编码与SecA具有相同功能的蛋白质的DNA；和

(c)具有与SEQ ID NO：1所代表的碱基序列具有80％或更高同一性的碱基序列，并且还编码与SecA具有相同功能的蛋白质的DNA。

在此，在分子克隆-实验室手册第三版(Molecular Cloning-ALABORATORY MANUAL THIRD EDITION)[Joseph Sambrook，DavidW.Russell，Cold Spring Harbor LaboratoryPress]中描述的方法可被引用为“严格条件”的实例。例如，其可以是使用探针在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)、0.5％SDS和5xDenhardt溶液、和100mg/mL鲱鱼精DNA的溶液中，在65℃的恒温下进行8-16h杂交的条件。

在此，“与SEQ ID NO：1所代表的碱基序列具有80％或更高同一性的碱基序列”优选地是具有90％或更高同一性、更优选95％或更高同一性、并且甚至更优选99％或更高同一性的碱基序列。

DNA可从天然来源获得。但有可能使用已知的技术来制备，诸如定点突变诱导。例如，其可通过使用突变诱导试剂盒[Mutant-superExpress Km Kit(Takara)]，使用定点突变诱导的方法导入突变来制备。

编码枯草杆菌SecA的基因序列(SEQ ID NO：1)已经登载在JAFAN(Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(日本枯草杆菌功能分析网络)(BSORF DB)，http://bacillus.genome.ad.jp/，2006年1月18日更新)，且编码非枯草杆菌SecA的基因，诸如大肠埃希氏杆菌，列举在Colibri(http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)数据库中。大量的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的基因组登载在TIGER(http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi)。

在本发明中要缺失的SecA的羧基末端氨基酸的数目为20-30或60-80。优选使60-80个氨基酸缺失。

在枯草杆菌中，SecA由841个氨基酸组成(SEQ ID NO：2)。优选从SEQ ID NO：2删除氨基酸820(含)至841(含)(也称为N819)，或删除氨基酸781(含)至841(含)(也称为N780)。更优选删除氨基酸781(含)至841(含)(N780)。

枯草杆菌SecA在其羧基末端具有CTD区(C-末端区结构域；见J.B.C.(2004)279(21)，p22490-22497)。CTD区的22个C-末端氨基酸构成与大肠埃希氏杆菌的SecB结合位点同源的区域，并且CTD区在其N-末端具有由61个氨基酸组成的区域，称为CTL区(C-末端末端连接子；见Science(2002)297(5589)，p2018-2026)。在枯草杆菌中，在此区中发生与Ffh(54同源物，SRP 54同源物)的结合，Ffh是信号识别粒子(SRP)的组分。附带地，CTL的与Ffh结合的区域对应的区域位于氨基酸781-819的区域中。

因此，本发明的基因修饰包括单一地或组合地删除上述区域或与其同源的区域，并且优选基因修饰删除Ffh结合区域或与该Ffh结合区域同源的区域。

在本发明中，可使用例如同源重组的方法作为修饰编码SecA的基因的方法。换句话说，含部分目标基因的DNA片段可在适当的质粒载体中克隆，并且由此获得的环状重组体质粒可随后被掺入进亲代微生物的细胞中。然后，通过在作为目标基因的一部分的区域处的同源重组，亲代微生物的基因组中secA基因的目标片段可被切掉而缺失。

尤其当使用枯草杆菌作为构建本发明的微生物的亲代微生物时，因为有几种已报道的通过同源重组删除目标基因的方法(Mol.Gen.Genet.，223，268，1990等)，因此任一此类方法可用来产生本发明的宿主微生物。

在以下部分，我们更具体地描述使用通过重组DNA技术制备的DNA片段删除一部分SecA的方法。

用于删除部分SecA的DNA片段是其中secA基因的3′端的基因区被部分修饰的基因序列。在各端至少有一个限制性内切酶识别位点。使用这些限制性内切酶位点和含这些限制性内切酶位点的引物通过标准方法可制备DNA片段，例如，通过PCR扩增使用枯草杆菌基因组DNA作为模板。而且，DNA片段的3′端引物具有在编码作为缺失目标的SecA蛋白C-末端区的基因上游紧接的编码终止密码子的插入基因序列。

为了构建质粒，此片段在例如pDH88等的整合载体的多克隆位点处插入，使得能够通过可遗传转化的革兰氏阳性细菌样枯草杆菌的遗传转化进行同源重组。

通过将质粒导入枯草杆菌或类似物，并且进行同源重组，我们可获得其中质粒被插入染色体中的菌株(SecA部分缺失的菌株)。由此获得的菌株的染色体上的基因组结构图示在图1a中。在具有插入物的菌株中，由于位于待删除的区域之前的终止密码子，在染色体上表达的SecA蛋白的翻译中途停止。因此，只有缺少SecA的C-末端区的所需蛋白可被表达。

可通过将编码所需异源蛋白质或多肽的基因导入由此获得的修饰微生物的菌株中，获得本发明的重组体微生物。

对要通过本发明的重组体微生物产生的目标蛋白质或多肽没有特别的限制。例如，其可以是生理学活性肽，或用于洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学产品、医用和诊断产品等中的工业酶。

生理学活性肽的实例包括由例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、和流感病毒的致病病毒的基因组编码的蛋白质，和G-蛋白结合受体、生长因子(血小板生长因子、血液干细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、神经生长/营养因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等)、肿瘤坏死因子、干扰素、白介素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、白蛋白和人生长激素。

工业用酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、和连接酶/合成酶，且更适合地，水解酶如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶。

被导入进本发明的微生物中的目标蛋白质或多肽的基因优选地在其上游侧具有与基因的转录以及随后的翻译和分泌有关的控制区。换句话说，其优选具有选自包括启动子和转录起始点的转录起始控制区、包括核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始区、和分泌信号肽区的一个或多个适当地组合的区。

在此，转录起始控制区是包括启动子和转录起始点的区，并且核糖体结合位点是对应于Shine-Dalgarno(SD)序列的位点(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463(1974))，该位点与起始密码子一起形成翻译起始控制区。

含有所需异源蛋白质或多肽的基因的上述DNA片段、和适当的质粒载体组合以形成重组质粒。本发明的重组体微生物可通过将此重组质粒通过普通的遗传转化技术导入进宿主微生物细胞中而获得。本发明的重组体微生物也可通过直接将结合有与宿主微生物的基因组同源的适当区域的上述DNA片段引入至宿主微生物的基因组中来获得。

使用本发明的重组体微生物产生所需蛋白质或多肽可采取以下步骤：将细菌菌株接种在含有可同化碳和氮源以及其他必需组分的培养基中，通过普通的微生物培养方法培养，并且在培养后收获并纯化蛋白质或多肽。如在后面所述的实施例中所证明的，与使用具有未基因修饰的SecA的微生物的情况相比，目标蛋白质或多肽的生产率增加。

下面，我们将更详细地描述构建本发明的重组体微生物的方法、以及使用该重组体微生物产生蛋白质的方法。

实施例

使用的细菌菌株、质粒和培养基

(1)使用的细菌菌株

枯草杆菌株Marburg 168trpC2(Kunst等人，Nature 1997)

枯草杆菌株SAN819(N819)；抗性标记(氯霉素)

枯草杆菌株SAN780(N780)；抗性标记(氯霉素)

大肠埃希氏杆菌株C600(Takara Bio)

大肠埃希氏杆菌株JM109(Takara Bio)

(2)质粒

pDH88；Henner等人(Proc Natl Acad Sci USA.1984 Jan 81(2)：439-43)，抗性标记(氨苄青霉素和氯霉素)

pHKK1101；抗性标记(氨苄青霉素和氯霉素)，用于产生部分删除SecA的菌株的重组载体(SAN819株)

pHKK1002；抗性标记(氨苄青霉素和氯霉素)，用于产生部分删除SecA的菌株的重组载体(SAN780株)

pWH1520；MoBiTec，抗性标记(氨苄青霉素和四环素)

pHKK3200；抗性标记(氨苄青霉素和四环素)，插入基因(淀粉酶AmyE信号肽和pro区)

pHKK3201；抗性标记(氨苄青霉素和四环素)，插入基因(淀粉酶AmyE信号肽和pro区以及IFNα成熟区的融合蛋白)

pHKK3202；抗性标记(氨苄青霉素和四环素)，插入基因(淀粉酶AmyE信号肽和pro区以及IFNβ成熟区的融合蛋白)

(3)培养基

L培养基；细菌用胰蛋白胨(Difco)1％，酵母提取物(Difco)0.5％，NaCl(Wako)0.5％

2×L培养基：细菌用胰蛋白胨(Difco)2％，酵母提取物(Difco)1％，NaCl(Wako)1％

使用的抗生素的浓度为15μg氯霉素和50μg氨苄青霉素。使用终浓度为0.6％的木糖用于诱导pWH1520中存在的木糖启动子。以100μM的终浓度使用异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。

实施例1

构建部分删除SecA的质粒和菌株

(1)用于产生部分删除SecA的菌株的重组载体

为了产生枯草杆菌SAN819株，首先，secA基因的3′端的360bp片段使用枯草杆菌168株的染色体作为模板，secAC-01(gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg(SEQ ID NO：3)，大写字母代表HindIII)和secAC-02(gatcagaTCTAGAttaaatctcagctttcatcacaaa(SEQ ID NO：4)，大写字母代表XbaI，下划线字母代表插入的终止密码子)作为引物，通过PCR进行扩增。随后，扩增的片段在pDH88的HindIII-XbaI位点插入以构建pHKK1001。类似地，为了产生枯草杆菌SAN780株，使用引物secAC-03(gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg(SEQ ID NO：5)，大写字母代表HindIII)和secAC-04(gatcagaTCTAGAttagatatcaaccactttgcgaac(SEQ ID NO：6)，大写字母代表XbaI，下划线字母代表插入的终止密码子)构建pHKK1002。

(2)产生部分删除SecA的菌株

枯草杆菌SAN819株通过将质粒pHKK1001 Campbell插入进枯草杆菌168株的染色体中而获得(图1a)。也通过类似方法使用质粒pHKK1002获得SAN780株。通过Southern杂交分析确认这些质粒正确地分别插入进SAN819和SAN780的染色体中。在SAN819株和SAN780株中表达的SecA的大小也使用抗SecA抗体进行确认(图1b)。

(3)对部分删除SecA的菌株的生长的作用

在(2)中产生的SAN819株和SAN780株中观察对生长的作用。L液体培养基、L平板培养基和2×L液体培养基用于培养(在所有情况中均加入IPTG至100μM的终浓度)。在30℃、37℃和47℃下进行培养。

结果显示在所有的检测条件下，枯草杆菌SAN819株和SAN780株的生长与亲代菌株，即枯草杆菌168株相当。

当不加入IPTG时，由于位于secA下游的prfB基因(其与secA形成操纵子)的作用，生长被抑制。

这些事实表明作为SecA的C-末端区的CTD(C-末端区结构域)对枯草杆菌的生长不是必不可少的。

实施例2

异源蛋白质的表达

(1)构建用于表达异源蛋白质的载体

异源蛋白质分泌至细胞外需要信号序列。因此，产生具有枯草杆菌淀粉酶(amyE)蛋白质的信号序列和pro序列的、用于表达分泌性蛋白质的基本载体pHKK3200。为了产生pHKK3200，amyE基因信号序列的175bp编码区和pro序列使用枯草杆菌168株的染色体作为模板，以及amyESF-1(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa(SEQ ID NO：7)，大写字母代表SpeI)和amyESR-2(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc(SEQID NO：8)，大写字母代表KpnI)作为引物，进行PCR扩增，并且扩增产物被插入进pWH1520的SpeI-KpnI位点中。

为了产生干扰素-α表达质粒，含ifnα基因成熟区的521bp片段使用pORF5-hIFN-α(InvivoGen)作为模板，以及ifnaF(ggccGGTACCctcctggtgctcagctgc(SEQ ID NO：9)，大写字母代表KpnI)和ifnaR(ggccGGATCCttttcattccttacttct(SEQ ID NO：10)，大写字母代表BamHI)作为引物，进行PCR扩增，并且插入至pHKK3200的KpnI-BamHI位点中，从而构建pHKK3201(图2a)和b))。

通过类似的步骤，使用pORF-hIFN-β(InvivoGen)作为模板，以及ifnbF(ggccGGTACCatgagctacaactt(SEQ ID NO：11)，大写字母代表KpnI)和ifnbR(ggccGGATCCagctcagtttcggaggta(SEQ ID NO：12)，大写字母代表BamHI)作为引物，产生干扰素-β表达质粒pHKK3202。

(2)产生其中已插入异源蛋白质表达载体的菌株

在(1)中产生的干扰素-α表达载体pHKK3201和干扰素-β表达质粒pHKK3202，通过遗传转化法分别插入至SAN780株和SAN819株中，以获得插入干扰素表达载体的菌株。

通过感受态法(competent method)使用SPI和SPII培养基进行遗传转化，并且取在含15μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基中生长的细菌菌株作为转化株。

(3)培养

使用2×L培养基(2％胰蛋白胨(Difco)、1％酵母提取物(Difco)、1％NaCl)。当需要时加入四环素(Wako)至15μg/mL的终浓度。培养基中接种2％预培养物，并且在30℃下培养直至细胞增殖的中期(OD660＝0.3)，加入木糖至0.6％的终浓度，并继续进行培养。开始培养后24h分离细菌细胞并获得培养液。

含干扰素的样品通过Western印迹进行分析，并且测定检测到的条带的密度，并用于比较。

(4)分泌性蛋白质(干扰素(IFN))的确认

1)Western印迹

使用半干系统(Bio-Rad)进行Western印迹。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，它们转移至Immobilon PVDF膜(Millipore)上。使用ECL检测系统(Amersham，现在为GE Healthcare)检测蛋白质。

使用的抗干扰素-α和抗干扰素-β抗体是PeproTech EC LTD的产品。使用的HRP-标记的二抗是Amersham(现在是GE Healthcare)的产品。

2)测定干扰素活性

培养24h后已通过离心去除细胞的培养液用作含干扰素的样品。在开始培养后，当OD660变为0.3时加入木糖至0.6％的终浓度，用于诱导干扰素。使用动物细胞测定培养液中干扰素的生理学活性。此实验测定委托给Mitsubishi BCL进行。通过此实验中使用的干扰素表达载体的作用所分泌的干扰素具有生理学活性。

(5)评价分泌量的方法

培养液通过SDS-PAGE进行开发(develop)，蛋白质被印迹在PVDF膜上，并且使用IFNα抗体(PeproTech EC LTD)通过Western印迹法进行检测。通过Western印迹获得的条带的密度使用NIH Image(国立卫生研究院，美国)转变为数值，用于测定分泌量。相对于对照，即，当野生株为宿主时产生的量，当突变株为宿主时产生的量评价为相对值。

(6)结果

由SAN780株和SAN819株产生的干扰素-α的量高于由亲代168株产生的量(图3)。在干扰素-β的产生中也见到类似的提高(图4)。

(7)评价纤维素酶的产生

重组质粒pHY-S237通过原生质体的遗传转化法导入至SAN780株以及作为对照的枯草杆菌168株中。该重组质粒已经通过将编码来源于枯草杆菌KSM-S237株(FERMBP-7875)(见日本专利公开第2000-210081号)的碱性纤维素酶基因的DNA片段(3.1kb)插入至往复载体pHY300PLK的限制性内切酶位点BamHI中而产生。

由此获得的遗传转化株在30℃下在5mL LB培养基中经受震荡培养15h。0.6mL此培养液接种在30mL 2×L麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％氯化钠、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物、以及15ppm四环素)中，并在30℃下震荡培养3天。培养后，通过离心去除细菌细胞，并通过上述专利文献中给出的方法或通过使用p-硝基苯基-p-纤维三糖苷(Seikagaku Corp.)作为底物测定在pH 7.0和30℃温度下的吸光度(420nm)变化，来测定培养液上清液的碱性纤维素酶活性，并且测定细菌细胞外产生的分泌的碱性纤维素酶的量。结果在表1中给出。

[表1]

细菌菌株	SecA	分泌和产生的碱性纤维素酶的量(相对值)
			168株	野生型(1-841)	100
SAN780株	1-780	125

如表1中所示，与168株(野生型)为宿主的对照相比，当SAN780株为宿主时，碱性纤维素酶的分泌产量较高。

                 序列表

<110>花王株式会社

<120>修饰微生物

<130>KS00991

<150>JP 2007-096396

<151>2007-04-02

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2523

<212>DNA

<213>枯草杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2523)

<223>

<400>1

atg ctt gga att tta aat aaa atg ttt gat cca aca aaa cgt acg ctg       48

Met Leu Gly Ile Leu Asn Lys Met Phe Asp Pro Thr Lys Arg Thr Leu

1               5                   10                  15

aat aga tac gaa aaa att gct aac gat att gat gcg att cgc gga gac       96

Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Ala Asn Asp Ile Asp Ala Ile Arg Gly Asp

            20                  25                  30

tat gaa aat ctc tct gac gac gca ttg aaa cat aaa aca att gaa ttt      144

Tyr Glu Asn Leu Ser Asp Asp Ala Leu Lys His Lys Thr Ile Glu Phe

        35                  40                  45

aaa gag cgt ctt gaa aaa ggg gcg aca acg gat gat ctt ctt gtt gaa      192

Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Leu Val Glu

    50                  55                  60

gct ttc gct gtt gtt cga gaa gct tca cgc cgc gta aca ggc atg ttt      240

Ala Phe Ala Val Val Arg Glu Ala Ser Arg Arg Val Thr Gly Met Phe

65                  70                  75                  80

ccg ttt aaa gtc cag ctc atg ggg ggc gtg gcg ctt cat gac gga aat      288

Pro Phe Lys Val Gln Leu Met Gly Gly Val Ala Leu His Asp Gly Asn

                85                  90                  95

ata gcg gaa atg aaa aca ggg gaa ggg aaa aca tta acg tct acc ctg      336

Ile Ala Glu Met Lys Thr Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Ser Thr Leu

            100                 105                 110

cct gtt tat tta aat gcg tta acc ggt aaa ggc gta cac gtc gtg act      384

Pro Val Tyr Leu Asn Ala Leu Thr Gly Lys Gly Val His Val Val Thr

        115                 120                 125

gtc aac gaa tac ttg gca agc cgt gac gct gag caa atg ggg aaa att     432

Val Asn Glu Tyr Leu Ala Ser Arg Asp Ala Glu Gln Met Gly Lys Ile

    130                 135                 140

ttc gag ttt ctc ggt ttg act gtc ggt ttg aat tta aac tca atg tca     480

Phe Glu Phe Leu Gly Leu Thr Val Gly Leu Asn Leu Asn Ser Met Ser

145                 150                 155                 160

aaa gac gaa aaa cgg gaa gct tat gcc gct gat att act tac tcc aca     528

Lys Asp Glu Lys Arg Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Ile Thr Tyr Ser Thr

                165                 170                 175

aac aac gag ctt ggc ttc gac tat ttg cgt gac aat atg gtt ctt tat     576

Asn Asn Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn Met Val Leu Tyr

            180                 185                 190

aaa gag cag atg gtt cag cgc ccg ctt cat ttt gcg gta ata gat gaa     624

Lys Glu Gln Met Val Gln Arg Pro Leu His Phe Ala Val Ile Asp Glu

        195                 200                 205

gtt gac tct att tta att gat gaa gca aga aca ccg ctt atc att tct     672

Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ile Ser

    210                 215                 220

gga caa gct gca aaa tcc act aag ctg tac gta cag gca aat gct ttt     720

Gly Gln Ala Ala Lys Ser Thr Lys Leu Tyr Val Gln Ala Asn Ala Phe

225                 230                 235                 240

gtc cgc acg tta aaa gcg gag aag gat tac acg tac gat atc aaa aca     768

Val Arg Thr Leu Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Thr Tyr Asp Ile Lys Thr

                245                 250                 255

aaa gct gta cag ctt act gaa gaa gga atg acg aag gcg gaa aaa gca     816

Lys Ala Val Gln Leu Thr Glu Glu Gly Met Thr Lys Ala Glu Lys Ala

            260                 265                 270

ttc ggc atc gat aac ctc ttt gat gtg aag cat gtc gcg ctc aac cac     864

Phe Gly Ile Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys His Val Ala Leu Asn His

        275                 280                 285

cat atc aac cag gcc tta aaa gct cac gtt gcg atg caa aag gac gtt     912

His Ile Asn Gln Ala Leu Lys Ala His Val Ala Met Gln Lys Asp Val

    290                 295                 300

gac tat gta gtg gaa gac gga cag gtt gtt att gtt gat tcc ttc acg     960

Asp Tyr Val Val Glu Asp Gly Gln Val ValIle Val Asp Ser Phe Thr

305                 310                 315                 320

gga cgt ctg atg aaa ggc cgc cgc tac agt gag ggg ctt cac caa gcg    1008

Gly Arg Leu Met Lys Gly Arg Arg Tyr Ser Glu Gly Leu His Gln Ala

                325                 330                 335

att gaa gca aag gaa ggg ctt gag att caa aac gaa agc atg acc ttg    1056

Ile Glu Ala Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gln Asn Glu Ser Met Thr Leu

            340                 345                 350

gcg acg att acg ttc caa aac tac ttc cga atg tac gaa aaa ctt gcc     1104

Ala Thr Ile Thr Phe Gln Asn Tyr Phe Arg Met Tyr Glu Lys Leu Ala

        355                 360                 365

ggt atg acg ggt aca gct aag aca gag gaa gaa gaa ttc cgc aac atc     1152

Gly Met Thr Gly Thr Ala Lys Thr Glu Glu Glu Glu Phe Arg Asn Ile

    370                 375                 380

tac aac atg cag gtt gtc acg atc cct acc aac agg cct gtt gtc cgt     1200

Tyr Asn Met Gln Val Val Thr Ile Pro Thr Asn Arg Pro Val Val Arg

385                 390                 395                 400

gat gac cgc ccg gat tta att tac cgc acg atg gaa gga aag ttt aag     1248

Asp Asp Arg Pro Asp Leu Ile Tyr Arg Thr Met Glu Gly Lys Phe Lys

                405                 410                 415

gca gtt gcg gag gat gtc gca cag cgt tac atg acg gga cag cct gtt     1296

Ala Val Ala Glu Asp Val Ala Gln Arg Tyr Met Thr Gly Gln Pro Val

            420                 425                 430

cta gtc ggt acg gtt gcc gtt gaa aca tct gaa ttg att tct aag ctg     1344

Leu Val Gly Thr Val Ala Val Glu Thr Ser Glu Leu Ile Ser Lys Leu

        435                 440                 445

ctt aaa aac aaa gga att ccg cat caa gtg tta aat gcc aaa aac cat     1392

Leu Lys Asn Lys Gly Ile Pro His Gln Val Leu Asn Ala Lys Asn His

    450                 455                 460

gaa cgt gaa gcg cag atc att gaa gag gcc ggc caa aaa ggc gca gtt     1440

Glu Arg Glu Ala Gln Ile Ile Glu Glu Ala Gly Gln Lys Gly Ala Val

465                 470                 475                 480

acg att gcg act aac atg gcg ggg cgc gga acg gac att aag ctt ggc     1488

Thr Ile Ala Thr Asn Met Ala Gly Arg Gly Thr Asp Ile Lys Leu Gly

                485                 490                 495

gaa ggt gta aaa gag ctt ggc ggg ctc gct gta gtc gga aca gaa cga     1536

Glu Gly Val Lys Glu Leu Gly Gly Leu Ala Val Val Gly Thr Glu Arg

            500                 505                 510

cat gaa tca cgc cgg att gac aat cag ctt cga ggt cgt tcc gga cgt     1584

His Glu Ser Arg Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg Ser Gly Arg

        515                 520                 525

cag gga gac ccg ggg att act caa ttt tat ctt tct atg gaa gat gaa     1632

Gln Gly Asp Pro Gly Ile Thr Gln Phe Tyr Leu Ser Met Glu Asp Glu

    530                 535                 540

ttg atg cgc aga ttc gga gct gag cgg aca atg gcg atg ctt gac cgc     1680

Leu Met Arg Arg Phe Gly Ala Glu Arg Thr Met Ala Met Leu Asp Arg

545                 550                 555                 560

ttc ggc atg gac gac tct act cca atc caa agc aaa atg gta tct cgc     1728

Phe Gly Met Asp Asp Ser Thr Pro Ile Gln Ser Lys Met Val Ser Arg

                565                 570                 575

gcg gtt gaa tcg tct caa aaa cgc gtc gaa ggc aat aac ttc gat tcg    1776

Ala Val Glu Ser Ser Gln Lys Arg Val Glu Gly Asn Asn Phe Asp Ser

            580                 585                 590

cgt aaa cag ctt ctg caa tat gat gat gtt ctc cgc cag cag cgt gag    1824

Arg Lys Gln Leu Leu Gln Tyr Asp Asp Val Leu Arg Gln Gln Arg Glu

        595                 600                 605

gtc att tat aag cag cgc ttt gaa gtc att gac tct gaa aac ctg cgt    1872

Val Ile Tyr Lys Gln Arg Phe Glu Val Ile Asp Ser Glu Asn Leu Arg

    610                 615                 620

gaa atc gtt gaa aat atg atc aag tct tct ctc gaa cgc gca att gca    1920

Glu Ile Val Glu Asn Met Ile Lys Ser Ser Leu Glu Arg Ala Ile Ala

625                 630                 635                 640

gcc tat acg cca aga gaa gag ctt cct gag gag tgg aag ctt gac ggt    1968

Ala Tyr Thr Pro Arg Glu Glu Leu Pro Glu Glu Trp Lys Leu Asp Gly

                645                 650                 655

cta gtt gat ctt atc aac aca act tat ctt gat gaa ggt gca ctt gag    2016

Leu Val Asp Leu Ile Asn Thr Thr Tyr Leu Asp Glu Gly Ala Leu Glu

            660                 665                 670

aag agc gat atc ttc ggc aaa gaa ccg gat gaa atg ctt gag ctc att    2064

Lys Ser Asp Ile Phe Gly Lys Glu Pro Asp Glu Met Leu Glu Leu Ile

        675                 680                 685

atg gat cgc atc atc aca aaa tat aat gag aag gaa gag caa ttc ggc    2112

Met Asp Arg Ile Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Glu Glu Gln Phe Gly

    690                 695                 700

aaa gag caa atg cgc gaa ttc gaa aaa gtt atc gtt ctt cgt gcc gtt    2160

Lys Glu Gln Met Arg Glu Phe Glu Lys Val Ile Val Leu Arg Ala Val

705                 710                 715                 720

gat tct aaa tgg atg gat cat att gat gcg atg gat cag ctc cgc caa    2208

Asp Ser Lys Trp Met Asp His Ile Asp Ala Met Asp Gln Leu Arg Gln

                725                 730                 735

ggg att cac ctt cgt gct tac gcg cag acg aac ccg ctt cgt gag tat    2256

Gly Ile His Leu Arg Ala Tyr Ala Gln Thr Asn Pro Leu Arg Glu Tyr

            740                 745                 750

caa atg gaa ggt ttt gcg atg ttt gag cat atg att gaa tca att gag    2304

Gln Met Glu Gly Phe Ala Met Phe Glu His Met Ile Glu Ser Ile Glu

        755                 760                 765

gac gaa gtc gca aaa ttt gtg atg aaa gct gag att gaa aac aat ctg    2352

Asp Glu Val Ala Lys Phe Val Met Lys Ala Glu Ile Glu Asn Asn Leu

    770                 775                 780

gag cgt gaa gag gtt gta caa ggt caa aca aca gct cat cag ccg caa    2400

Glu Arg Glu Glu Val Val Gln Gly Gln Thr Thr Ala His Gln Pro Gln

785                 790                 795                 800

gaa ggc gac gat aac aaa aaa gca aag aaa gca ccg gtt cgc aaa gtg    2448

Glu Gly Asp Asp Asn Lys Lys Ala Lys Lys Ala Pro Val Arg Lys Val

                805                 810                 815

gtt gat atc gga cga aat gcc cca tgc cac tgc gga agc ggg aaa aaa    2496

Val Asp Ile Gly Arg Asn Ala Pro Cys His Cys Gly Ser Gly Lys Lys

            820                 825                 830

tat aaa aat tgc tgc ggc cgt act gaa                                2523

Tyr Lys Asn Cys Cys Gly Arg Thr Glu

        835                 840

<210>2

<211>841

<212>PRT

<213>枯草杆菌

<400>2

Met Leu Gly Ile Leu Asn Lys Met Phe Asp Pro Thr Lys Arg Thr Leu

1               5                   10                  15

Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Ala Asn Asp Ile Asp Ala Ile Arg Gly Asp

            20                  25                  30

Tyr Glu Asn Leu Ser Asp Asp Ala Leu Lys His Lys Thr Ile Glu Phe

        35                  40                  45

Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Leu Val Glu

    50                  55                  60

Ala Phe Ala Val Val Arg Glu Ala Ser Arg Arg Val Thr Gly Met Phe

65                  70                  75                  80

Pro Phe Lys Val Gln Leu Met Gly Gly Val Ala Leu His Asp Gly Asn

                85                  90                  95

Ile Ala Glu Met Lys Thr Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Ser Thr Leu

            100                 105                 110

Pro Val Tyr Leu Asn Ala Leu Thr Gly Lys Gly Val His Val Val Thr

        115                 120                 125

Val Asn Glu Tyr Leu Ala Ser Arg Asp Ala Glu Gln Met Gly Lys Ile

    130                 135                 140

Phe Glu Phe Leu Gly Leu Thr Val Gly Leu Asn Leu Asn Ser Met Ser

145                 150                 155                 160

Lys Asp Glu Lys Arg Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Ile Thr Tyr Ser Thr

                165                 170                 175

Asn Asn Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn Met Val Leu Tyr

            180                 185                 190

Lys Glu Gln Met Val Gln Arg Pro Leu His Phe Ala Val Ile Asp Glu

        195                 200                 205

Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ile Ser

    210                 215                 220

Gly Gln Ala Ala Lys Ser Thr Lys Leu Tyr Val Gln Ala Asn Ala Phe

225                 230                 235                 240

Val Arg Thr Leu Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Thr Tyr Asp Ile Lys Thr

                245                 250                 255

Lys Ala Val Gln Leu Thr Glu Glu Gly Met Thr Lys Ala Glu Lys Ala

            260                 265                 270

Phe Gly Ile Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys His Val Ala Leu Asn His

        275                 280                 285

His Ile Asn Gln Ala Leu Lys Ala His Val Ala Met Gln Lys Asp Val

    290                 295                 300

Asp Tyr Val Val Glu Asp Gly Gln Val Val Ile Val Asp Ser Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gly Arg Leu Met Lys Gly Arg Arg Tyr Ser Glu Gly Leu His Gln Ala

                325                 330                 335

Ile Glu Ala Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gln Asn Glu Ser Met Thr Leu

            340                 345                 350

Ala Thr Ile Thr Phe Gln Asn Tyr Phe Arg Met Tyr Glu Lys Leu Ala

        355                 360                 365

Gly Met Thr Gly Thr Ala Lys Thr Glu Glu Glu Glu Phe Arg Asn Ile

    370             375                     380

Tyr Asn Met Gln Val Val Thr Ile Pro Thr Asn Arg Pro Val Val Arg

385                 390                 395                 400

Asp Asp Arg Pro Asp Leu Ile Tyr Arg Thr Met Glu Gly Lys Phe Lys

                405                 410                 415

Ala Val Ala Glu Asp Val Ala Gln Arg Tyr Met Thr Gly Gln Pro Val

            420                 425                 430

Leu Val Gly Thr Val Ala Val Glu Thr Ser Glu Leu Ile Ser Lys Leu

        435                 440                 445

Leu Lys Asn Lys Gly Ile Pro His Gln Val Leu Asn Ala Lys Asn His

    450                 455                 460

Glu Arg Glu Ala Gln Ile Ile Glu Glu Ala Gly Gln Lys Gly Ala Val

465                 470                 475                 480

Thr Ile Ala Thr Asn Met Ala Gly Arg Gly Thr Asp Ile Lys Leu Gly

                485                 490                 495

Glu Gly Val Lys Glu Leu Gly Gly Leu Ala Val Val Gly Thr Glu Arg

            500                 505                 510

His Glu Ser Arg Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg Ser Gly Arg

        515                 520                 525

Gln Gly Asp Pro Gly Ile Thr Gln Phe Tyr Leu Ser Met Glu Asp Glu

    530                 535                 540

Leu Met Arg Arg Phe Gly Ala Glu Arg Thr Met Ala Met Leu Asp Arg

545                 550                 555                 560

Phe Gly Met Asp Asp Ser Thr Pro Ile Gln Ser Lys Met Val Ser Arg

                565                 570                 575

Ala Val Glu Ser Ser Gln Lys Arg Val Glu Gly Asn Asn Phe Asp Ser

            580                 585                 590

Arg Lys Gln Leu Leu Gln Tyr Asp Asp Val Leu Arg Gln Gln Arg Glu

        595                 600                 605

Val Ile Tyr Lys Gln Arg Phe Glu Val Ile Asp Ser Glu Asn Leu Arg

    610                 615                 620

Glu Ile Val Glu Asn Met Ile Lys Ser Ser Leu Glu Arg Ala Ile Ala

625                 630                 635                 640

Ala Tyr Thr Pro Arg Glu Glu Leu Pro Glu Glu Trp Lys Leu Asp Gly

                645                 650                 655

Leu Val Asp Leu Ile Asn Thr Thr Tyr Leu Asp Glu Gly Ala Leu Glu

            660                 665                 670

Lys Ser Asp Ile Phe Gly Lys Glu Pro Asp Glu Met Leu Glu Leu Ile

        675                 680                 685

Met Asp Arg Ile Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Glu Glu Gln Phe Gly

    690                 695                 700

Lys Glu Gln Met Arg Glu Phe Glu Lys Val Ile Val Leu Arg Ala Val

705                 710                 715                 720

Asp Ser Lys Trp Met Asp His Ile Asp Ala Met Asp Gln Leu Arg Gln

                725                 730                 735

Gly Ile His Leu Arg Ala Tyr Ala Gln Thr Asn Pro Leu Arg Glu Tyr

            740                 745                 750

Gln Met Glu Gly Phe Ala Met Phe Glu His Met Ile Glu Ser Ile Glu

        755                 760                 765

Asp Glu Val Ala Lys Phe Val Met Lys Ala Glu Ile Glu Asn Asn Leu

    770                 775                 780

Glu Arg Glu Glu Val Val Gln Gly Gln Thr Thr Ala His Gln Pro Gln

785                 790                 795                 800

Glu Gly Asp Asp Asn Lys Lys Ala Lys Lys Ala Pro Val Arg Lys Val

                805                 810                 815

Val Asp Ile Gly Arg Asn Ala Pro Cys His Cys Gly Ser Gly Lys Lys

            820                 825                 830

Tyr Lys Asn Cys Cys Gly Arg Thr Glu

        835                 840

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，secA和添加的HindIII位点序列的

核苷酸序列设计

<400>3

gatcaagctt cccgggagaa gagcgatatc ttcgg      35

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，secA和添加的XbaI位点序列的核

苷酸序列设计

<400>4

gatcagatct agattaaatc tcagctttca tcacaaa    37

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，secA和添加的HindIII位点序列的

核苷酸序列设计

<400>5

gatcaagctt cccgggagaa gagcgatatc ttcgg      35

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，secA和添加的XbaI位点序列的核

苷酸序列设计

<400>6

gatcagatct agattagata tcaaccactt tgcgaac    37

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，amyE和添加的SpeI位点序列的核

苷酸序列设计

<400>7

ggccactagt cttcaaaaaa tcaaa                 25

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，amyE和添加的KpnI位点序列的核

苷酸序列设计

<400>8

ggccggtacc ctcattcgat ttgttcgc              28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，hIFN alpha和添加的KpnI位点序

列的核苷酸序列设计

<400>9

ggccggtacc ctcctggtgc tcagctgc              28

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Oligo作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，hIFN alpha和添加的BamHI

位点序列的核苷酸序列设计

<400>10

ggccggatcc ttttcattcc ttacttct              28

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，hIFN beta和添加的KpnI位点序列

的核苷酸序列设计

<400>11

ggccggtacc atgagctaca actt        24

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>作为PCR引物的寡核苷酸，由枯草杆菌基因，hIFN beta和添加的BamHI位点序

列的核苷酸序列设计

<400>12

ggccggatcc agctcagttt cggaggta    28

Claims (6)

1.一种修饰微生物，其被基因修饰以使SecA的60-80个羧基末端氨基酸缺失。

2.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中所述羧基末端氨基酸的缺失是Ffh结合区域或与所述Ffh结合区域同源的区域的缺失。

3.根据权利要求1或2所述的修饰微生物，其中所述SecA是在下面(A)至(C)中所述的蛋白质：

(A)通过SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列所代表的蛋白质；

(B)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列所代表且进一步具有与SecA相同的功能的蛋白质；和

(C)与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％或更高的同一性的氨基酸序列所代表且进一步具有与SecA相同的功能的蛋白质。

4.一种重组体微生物，其通过将编码异源蛋白质或多肽的基因导入根据权利要求1至3中任意一项所述的修饰微生物的菌株中而构建。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的修饰微生物或根据权利要求4所述的重组体微生物，其中所述微生物是属于杆菌属的细菌。

6.一种使用根据权利要求4或5所述的重组体微生物产生蛋白质或多肽的方法。

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