KR101258633B1

KR101258633B1 - 토끼 출혈병변이주 바이러스 혈구응집용 항원 및 유전자 재조합불활화백신의 제조방법

Info

Publication number: KR101258633B1
Application number: KR1020100097724A
Authority: KR
Inventors: 양동군; 오윤이; 조수동; 송재영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-10-07
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2013-04-29
Also published as: KR20120036055A

Abstract

본 발명은 토끼 출혈병변이주 바이러스 혈구응집용 항원 및 유전자 재조합불활화백신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 토끼 출혈병변이주 바이러스 혈구응집용 항원은 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자로부터 얻어진 유전자재조합 베큘로바이러스를 조직배양세포에 접종하여 생성되는 것이 특징이다.
또 하나의 본 발명인 유전자 재조합 불활화백신의 제조방법은 토끼 출혈병 변이주의 VP60 유전자를 pGEM-T 벡터에 1차 클로닝하는 단계와, 상기 1차 클로닝 후 pBuleBacHis4.5 벡터에 2차 클로닝하여 유전자재조합 베큘로바이러스를 생성하는 단계와, 상기 생성된 유전자재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 접종하여 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자 재조합 단백질을 얻어내는 단계와, 상기 얻어낸 단백질에서 혈구응집능을 갖는 항원을 분리해내는 단계와, 상기 분리된 항원을 불활화 하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 기존의 간 조직 유제액보다 10배 이상의 혈구응집용 항원을 생산함과 동시에 국내에서 유행하고 있는 토끼 출혈병변이주를 예방하기 위한 토끼 출혈병 유전자재조합불활화백신의 제조방법이 제공된다.

Description

토끼 출혈병변이주 바이러스 혈구응집용 항원 및 유전자 재조합불활화백신의 제조방법{ANTIGEN FOR HEMAGGLUTINATION OF RABBIT HAMORRHAGIC DISEASE VARIANT VIRUS USING RECOMBINANT VP60 BACULOVIRUS AND METHOD OF RECOMBINANT INACTIVATED VACCINE}

본 발명은 토끼 출혈병변이주 바이러스를 이용하여 유전자재조합 베큘로바이러스를 생성하였으며, 이를 이용한 혈구응집용 항원 및 유전자재조합 불활화백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토끼 출혈병 변이주의 중요 유전자인 VP60 유전자를 클로닝 하여 유전자재조합 베큘로바이러스를 생성하여 혈구응집용 항원으로 제작하였을 때 기존의 생산한 항원보다 곤충세포 내에서 10배 이상의 항원을 생산할 수 있으며, 최근 유행하고 있는 토끼 출혈병변이주를 예방하기 위한 유전자재조합불활화 백신의 제조방법에 관한 것이다.

한국에서 토끼는 약 8천 농가에서 30만두 정도가 사육되고 있으며, 이러한 토끼는 주로 고기와 가죽을 얻기 위해 사육되고 있다.

토끼 출혈병(Rabbit Haemorrhagic disease : RHD)은 토끼의 질병 중 가장 치명적인 질병이고, 야생 및 집토끼에 감염하며, 칼리시바이러스에 속하는 토끼 출혈병바이러스에 의해 일어난다.

1984년 중국에서 토끼 출혈병이 최초로 보고된 이후에 1985년도부터 한국의 토끼에 발병하여 1986년도에는 울릉도와 제주도를 제외한 전국에서 발생하여 막대한 경제적 손실을 초래하였다.

1990년 초반에 간유제액을 불활화 하여 제조한 토끼 출혈병 조직백신이 개발되어 토끼 농가에 사용되었음에도 최근까지 지속적으로 토끼 출혈병이 검출되고 있다.

이 토끼 출혈병바이러스는 주로 간의 괴사와 파종성혈관내 응고를 일으켜 토끼를 폐사시키는 것으로 알려져 있다.

토끼 출혈병의 전파는 감염된 토끼와 밀접한 접촉 혹은 오염된 모피를 통해서 주로 일어난다.

토끼 출혈병에 감염된 토끼는 노출 후 12 ~ 36시간 이내에 급격한 발열과 함께 갑작스런 폐사가 일어난다.

이러한 경우에 토끼는 혈액이 섞인 포말성 비루와 여러 장기에서 출혈성 병변을 나타내며, 특히 간과 폐에 출혈을 나타낸다.

토끼 출혈병을 진단하기 위해서는 감염된 토끼의 간을 유제액에 대한 사람의 0형 혈구응집능(HA), 전자현미경 검사법, 항원 ELISA, Western blotting, RT-PCR 법이 사용되어져 왔다.

또한, 항체를 검출하기 위하여 감염된 간조직의 항원을 이용하여 혈구응집억제가(HI)를 측정하거나, 다양한 종류의 항체 ELISA를 이용하여 검사하고 있다.

한국에서 2006년 이후로 유행하는 토끼 출혈병바이러스는 1988년에 분리된 바이러스와 92.1%의 유전적 상동성을 나타내고 있으며, 1980년대 분리한 토끼 출혈병바이러스(RHDV original)와 다른 토끼 출혈병변이주(RHDVa)로 확인되었다.

한편, 토끼 출혈성바이러스는 일반적인 바이러스와 달리 일반 주화세포(토끼 신장세포 등)에서 증식되지 않기 때문에 종래의 토끼 출혈병바이러스에 대한 혈구응집용 항원을 생산하는 방법은 다음과 같다.

토끼 출혈병 항체 음성 토끼를 선발한 다음 그 토끼에 토끼 출혈병 바이러스를 접종하고 접종된 토끼가 폐사하기 직전에 부검하여 간을 적출하고 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)에 10%가 되도록 유제액을 만든다.

이 토끼 간 유제액을 토끼 출혈병바이러스 혈구 응집용 항원으로 준비한다.

또한, 기존의 토끼 출혈병 불활화백신은 이 간유제액을 0.02% 포르말린 및 0.1M BEI 0.005%를 첨가하여 37℃에서 48시간 동안 반응하여 불활화 한 다음, 40% 알루미늄 하이드록 사이드 겔을 50% 첨가하여 백신을 제조하였다.

그러나, 종래의 방법은 항원 생산 및 백신의 제조과정에서 토끼를 희생시켜야하는 동물복지적인 문제와 제조 과정시 생물학적 오염 등의 위험이 있어 종래의 방법으로는 혈구응집용 항원 및 간 조직을 이용한 백신의 제조가 점점 더 어려워지고 있는 실정이다.

따라서, 목적동물인 토끼를 사용하지 않고 실험실 내에서 유전자재조합 베큘로바이러스와 곤충세포를 이용하여 토끼 출혈성변이주바이러스 항체를 검사하기 위한 혈구응집용 항원 및 유전자재조합 불활화 백신을 제조할 수 있는 방법에 대한 요구가 대두되고 있다.

본 발명에서는 상기의 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 토끼 출혈병변이주바이러스로부터 VP60 유전자를 클로닝하고, 재조합 베큘로바이러스를 작성하여, 곤충세포에 접종하여 수확한 재조합 단백질을 항원으로 생산하였을 때 기존의 간 조직 유제액보다 10배 이상의 혈구응집용 항원을 생산할 수 있는 것과 재조합 베큘로바이러스를 불활화 하여 유전자 재조합불활화 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 토끼 출혈병변이주 바이러스 혈구응집용 항원은 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자(RECOMBINANT VP60 BACULOVIRUS; 수탁번호:KCTC 11756BP)로부터 얻어진 유전자재조합 베큘로바이러스를 조직배양세포에 접종하여 생성되는 것이 특징이다.

상기 토끼 출혈병 변이주바이러스로 KV0801 균주를 사용하는 것이 특징이다.

상기 유전자재조합 베큘로바이러스는 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자를 pGEM-T 벡터에 1차 클로닝하고, 다시 pBluBac 4.5His 벡터에 2차 클로닝하여 생성되는 것이 특징이다.

상기 조직배양세포는 곤충세포 sf-9 cell인 것이 특징이다.

또 하나의 본 발명인 유전자 재조합 불활화백신의 제조방법은 토끼 출혈병 변이주의 VP60 유전자(RECOMBINANT VP60 BACULOVIRUS; 수탁번호:KCTC 11756BP)를 pGEM-T 벡터에 1차 클로닝하는 단계와, 상기 1차 클로닝 후 pBuleBacHis4.5 벡터에 2차 클로닝 하여 유전자재조합 베큘로바이러스를 생성하는 단계와, 상기 생성된 유전자재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 접종하여 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자 재조합 단백질을 얻어내는 단계와, 상기 얻어낸 단백질에서 혈구응집능을 갖는 항원을 분리해내는 단계와, 상기 분리된 항원을 불활화 하는 단계를 포함하여 구성된다.

상기 항원을 불활화하는 단계에서 항원을 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)로 희석한 후 포르말린을 첨가한 다음 37 ℃에서 24시간동안 불활화 하는 것이 특징이다.

상기 불활화 단계 후 에쥬번트를 전체중량을 기준으로 20 중량부를 더 혼합하여 백신을 제조하는 것이 특징이다.

상기 항원 분리단계 시 50 ㎕당 5,000배 이상의 혈구응집능을 갖는 항원을 분리해내어 사용하는 것이 좋다.

본 발명에 따르면, 토끼 출혈병변이주 바이러스를 이용한 유전자재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에서 증식시켜, 세포에서 혈구응집용 항원을 생산하였을 때, 종래의 간유제액에서 생산한 항원보다 10배 이상의 혈구응집용 항원을 생산할 수 있으며, 국내에서 유행하고 있는 토끼 출혈병변이주를 예방하기 위한 토끼 출혈병 유전자재조합불활화백신의 제조방법을 제공할 수 있다.

따라서, 토끼 출혈병변이주바이러스 항체를 측정하기 위하여 살아있는 토끼를 이용하여 혈구 응집성 항원을 생산할 때 발생하는 생물학적 위험과 동물복지를 해결하는 방법이다.

또한, 국내에서 최근 유행하고 있는 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자를 발현하여 토끼 출혈병 유전자재조합불활화 백신을 제조하여 기니픽에서 면역원성을 살펴본 결과, 산술평균 4,000배 이상의 혈구응집억제가를 나타내었으며, 백신의 효능을 확인하기 위하여 토끼에 백신을 접종하고, 공격용 야외 토끼 출혈병 바이러스를 접종하였을 때 방어효능을 나타내었다.

또한, 본 발명에 따르면, 베큘로바이러스에서 발현된 유전자재조합 단백질(VP60)을 혈구응집용 항원으로 생산하였을 때 실험실내에서 항원을 대량으로 생산이 가능하고, 항원함량이 높기 때문에 기존의 방법을 개량할 뿐만 아니라 생물학적 위험을 줄이며, 국내의 현실에 맞는 백신을 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 베큘로바이러스 전이벡터에 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자를 클로닝하고 난 후 XhoI/EcoRI의 제한효소로 절단하여 VP60 유전자를 확인한 사진.
도 2는 본 발명에 사용되는 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자를 이용하여 작성한 유전자재조합 단백질의 혈구응집능을 나타낸 사진.
A : 기존의 토끼 출혈병 간유제액 항원의 혈구응집능(16,384배)
B : 본 발명의 토끼 출혈병 유전자재조합 항원(상층액과 세포를 혼합한 것임)의 혈구응집능(16,384배)
도 3은 기니픽에서 유전자 재조합불활화백신 접종 후 항체가 변화를 나타낸 그래프.
도 4는 유전자재조합 불활화백신을 접종하고 3 주후에 공격접종 토끼의 항체가 변화를 나타낸 그래프.

본 발명에 따른 토끼 출혈병변이주바이러스의 유전자재조합 베큘로바이러스를 이용한 혈구응집용 항원 및 유전자 재조합 불활화백신의 제조방법은 상기 목적에 대한 기술적 구성을 비롯한 작용효과에 관한 사항은 본 발명의 바람직한 실시예가 도시된 아래의 도면을 참조한 상세한 설명에 의해서 명확하게 이해될 것이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.

본 발명에서는 토끼 출혈병 변이주바이러스의 중요한 VP60 유전자를 특이 프라이머를 이용하여 pGEM-T 벡터 및 pBluBac4.5His 벡터에 클로닝하고, 유전자재조합 베큘로바이러스를 작성하여, 곤충세포에서 증식하여 수확한 재조합 단백질을 토끼 출혈병변이주바이러스에 대한 항체를 검사하기 위한 혈구응집용 항원을 생산하도록 한 것과, 이 단백질을 불활화 하여 애쥬번트와 혼합하여 유전자재조합 불활화백신을 제조하도록 발명되었으며, 항체음성 토끼를 이용하지 않고 실험실내에서 토끼 출혈병변이주바이러스 항원과 유전자재조합백신을 제조할 수 있도록 하였다.

본 발명의 토끼 출혈병변이주 바이러스의 혈구응집용 항원 및 유전자재조합불활화백신의 제조방법은 아래와 같다.

토끼 출혈병변이주 바이러스의 VP60 유전자재조합 베큘로바이러스를 곤충세포 sf-9 cell에 배양한다.

본 발명에 실시 예로 사용되는 토끼 출혈병 변이주 바이러스의 유전자 재조합 베큘로바이러스는 KV0801 strain에서 유래한 VP60 유전자(염기서열 첨부, 수탁번호 KCTC 11756BP)를 함유하고 있다.

토끼 출혈병변이주 바이러스의 VP60 유전자를 클로닝하기위하여, 유전자 제한효소가 포함된 특이 프라이머(표 1)를 이용하여 1,760 bp의 유전자를 증폭하였다.

증폭한 PCR product를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 XhoI/EcoRI 제한효소로 처리하여 얻은 유전자를 다시 베큘로바이러스 전이벡터인 pBluBac4.5His 벡터에 클로닝하였다.

전이벡터에 클로닝 한 유전자의 확인은 도 1에 나타나있다.

프라이머	유전자 염기서열(5'-3')	증폭산물의 크기
VP60F	CCC TCG AGT GAG GGC AAA GCC GCT AC	1,740 bp
VP60R	CCG AAT TCC TGA CAT AAG AAA ACG CAT TGG TTG TGC C	1,740 bp

토끼 출혈병 변이주바이러스의 VP60유전자를 함유하는 pBlueBac4.5His 플라스미드벡터는 항체반응을 일으키는 세포에서 대량 증식하고 순수 정제하였다.

이 전이벡터가 함유된 플라스미드를 Bac-N-Blue DNA와 함께 곤충세포에 트랜스팩션(transfection)하였다.

3 ~ 4일후에 상층액을 수확하여 유전자 재조합 베큘로바이러스를 순수하게 분리하기 위하여 3번의 아가 오버레일(agar overlay)을 실시하여 순수하게 클로닝하고 VP60reBac으로 명명하였다.

이 VP60reBac 베큘로바이러스를 175 cm² 플라스크에서 90%의 단층이 형성되어 성장한 곤충세포에 0.1 M.O.I 가 되도록 접종하였다.

접종 후 1시간 동안 감작하고 상층액을 버리고 10% FBS가 함유된 Grace 배지를 첨가하고, 27 ℃에서 배양하였다.

접종 후 4 ~ 5일 후 세포변성효과(CPE)가 90% 정도 되었을 때 플라스크에서 상층액을 버리고, 10 ㎖의 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)를 첨가하고 -70 ℃ 냉동고에 넣어 얼렸다.

플라스크를 2회 냉동/해동(freezing/thawing)과정을 반복하고, 3000 rpm에서 15분 동안 원심하여, 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자 재조합 항원으로 사용하였다.

이후 수확한 항원을 사람의 O형 적혈구를 이용하여 혈구응집반응을 실시하였다.

사람 O형 적혈구는 0.6%로 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)에 희석하고, 0.3%의 소 혈청 알부민을 첨가하였다.

이때 50 ㎕ 당 100,000배 이상의 혈구응집능을 보이는 항원만을 선발하였다.

이는 종래의 방법으로 생산한 10배 이상의 혈구 응집능을 갖는 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 토끼 출혈병 변이주 바이러스의 유전자재조합 단백질 항원의 혈구 응집능과 종래의 토끼 간 유제액 항원의 혈구 응집능을 비교한 사진이다.

도 2의 A는 종래의 토끼 간유제액 항원의 혈구 응집능이 16,384배임을 나타내고 있고, B는 본 발명에 따른 토끼 출혈병 유전자재조합 항원으로 세포 및 상층액을 얼리고 녹여 생산한 항원의 혈구응집능이 16,384배임을 확인할 수 있다.

또한, 토끼 출혈병변이주 바이러스의 VP60 유전자 재조합 단백질을 곤충세포로부터 수확한 항원을 50 ㎕당 10,000배 이상의 혈구응집능이 되도록 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)로 희석하고 난 후 포르말린 0.2%를 첨가하여 37 ℃에서 24시간동안 불활화 하였다.

불활화 한 것을 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)로 투석한 후 곤충세포에 VP60reBac 베큘로바이러스의 불활화를 확인한 후 에쥬번트(Rehydragel)를 20%가 함유되도록 첨가하고 150 rpm에서 30분간 교반한 후 유전자재조합 불활화백신을 제조하였다.

도 3은 유전자 재조합불활화백신의 0.5두분을 토끼 출혈병 항체음성인 300g의 기니픽에 2회 접종 후 2주에 채혈하여 혈구응집억제가를 측정한 것이다.

도 3에서 나타난 바와 같이 1차접종후에는 40배 이상의 혈구응집억제가를, 2차 접종 2주후에는 기하평균 1,000배 이상의 혈구응집억제가를 나타내었다.

도 4는 유전자 재조합불활화백신의 효능을 확인하기위하여 7주령 토끼에 백신 1두분을 접종하고, 3주후에 1,000 MLD50(16 HA titer) 이상의 야외 토끼 출혈병변이주바이러스(KV0801 strain)로 공격 접종하였을 때 백신 접종군은 모두 생존한 반면 대조군은 7일 이내에 모두 폐사하였다.

이 토끼의 혈액을 이용하여 혈구응집억제능을 확인하였던 바 유전자재조합불활화백신을 접종 후 3주에 기하평균 40배 이상의 혈구응집억제가를 나타내었고, 공격접종 후 7일에는 640배 이상의 혈구응집억제가를 나타내어 유전자 재조합불활화백신의 효능을 확인하였다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 토끼 출혈병변이주바이러스의 항체를 측정하기위하여 살아있는 토끼를 이용하여 혈구응집용 항원을 생산할 때 발생하는 생물학적위험을 줄일 수 있는 효과를 갖는 방법임을 알 수 있다.

또한, 간 조직을 이용하여 불활화 백신을 제조할 때 많은 수의 토끼가 희생되어야 하는 동물복지적인 문제를 초래할 수 있으나, 본 발명에 따른 토끼 출혈병변이주 유전자 재조합 불활화백신은 곤충세포를 이용하여 백신의 항원을 생산하기 때문에 항원함량이 높고 기존의 생산방법을 개량할 뿐만 아니라 생물학적 위험을 줄일수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시 예들은 예시의 목적을 위해 개시된 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나니 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이나, 이러한 치환, 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11756BP

20100826

<110> National Veterinary Research and Quarantine Services <120> antigen for hemagglutination of rabbit hamorrhagic disease variant virus using recombinant vp60 baculovirus and method of recombinant inactivated vaccine <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3385 <212> DNA <213> Rabbit hemorrhagic disease virus <400> 1 atggacaaac tcagaatggt gctacatgaa aactctggat ctgcagactt tagaagatgt 60 tctgcccatt taagttcctt cacttttgct gtagtcgctg ttctcagtgc ctgcttggtc 120 actagttctc ttggaggaaa agacaaggag ctgaggctaa cgggtggtga aaacaagtgc 180 tctggaagag tggaggtgaa agtgcaggag gagtggggaa ctgtgtgtaa taatggctgg 240 gacatggatg tggtctctgt tgtttgtagg cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc 300 actggatggg ctaattttag tgcaggttct ggacgcattt ggatggatca tgtttcttgt 360 cgagggaatg agtcagctct ctgggactgc aaacatgatg gatggggaaa gcataactgt 420 actcaccaac aggatgctgg agtaacctgc tcagatggat ctgatttaga gatggggctg 480 gtgaatggag gaaaccggtg cttaggaaga atagaagtca aatttcaagg acggtgggga 540 acagtgtgtg atgataactt caacataaat catgcttctg tggtttgtaa acaacttgaa 600 tgtggaagtg ctgtcagttt ctctggttca gctaattttg gagaaggttc tggaccaatc 660 tggtttgatg atcttgtatg caatggaaat gagtcagctc tctggaactg caaacatgaa 720 ggatggggaa agcacaattg cgatcatgct gaggatgctg gagtgatttg cttaaatgga 780 gcagacctga aactgagagt ggtagatgga gtcactgaat gttcaggaag attggaagtg 840 aaattccaag gagaatgggg aacaatctgt gatgatggct gggatagtga tgatgccgct 900 gtggcatgta agcaactggg atgtccaact gctgtcactg ccattggtcg agttaacgcc 960 agtgagggaa ctggacacat ttggcttgac agtgtttctt gccatggaca cgagtctgct 1020 ctctggcagt gtagacacca tgaatgggga aagcattatt gcaatcatga tgaagatgct 1080 ggtgtgacat gttctgatgg atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac 1140 tgtgctggga cagtggaggt ggaaattcag aaactggtag gaaaagtgtg tgatagaagc 1200 tggggactga aagaagctga tgtggtttgc aggcagctgg gatgtggatc tgcactcaaa 1260 acatcatatc aagtttattc caaaaccaag gcaacaaaca catggctgtt tgtaagcagc 1320 tgtaatggaa atgaaacttc tctttgggac tgcaagaatt ggcagtgggg tggacttagt 1380 tgtgatcact atgacgaagc caaaattacc tgctcagccc acaggaaacc caggctggtt 1440 ggaggggaca ttccctgctc tggtcgtgtt gaagtacaac atggagacac gtggggcacc 1500 gtctgtgatt ctgacttctc tctggaggcg gccagcgtgc tgtgcaggga actacagtgc 1560 ggcactgtgg tttccctcct ggggggagct cactttggag aaggaagtgg acagatctgg 1620 gctgaagaat tccagtgtga ggggcacgag tcccaccttt cactctgccc agtagcaccc 1680 cgccctgacg ggacatgtag ccacagcagg gacgtcggcg tagtctgctc aagatacaca 1740 caaatccgct tggtgaatgg caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt 1800 gggtcctggg ggtccctctg caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc 1860 cagcagctta aatgtggagt tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga 1920 agtgagcagg tctggaggca catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat 1980 tgttccgtca ctgctctggg cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc 2040 tgctcaggga accagagtca gacactatct ccgtgcaatt catcatcctc ggacccatca 2100 agctctatta tttcagaaga aaatggtgtt gcctgcatag ggagtggtca acttcgcctg 2160 gtcgatggag gtggtcgttg tgctgggaga gtagaggtct atcatgaggg ctcctggggc 2220 accatctgtg atgacagctg ggacctgaat gatgcccatg tggtgtgcaa acagctgagc 2280 tgtggatggg ccattaatgc cactggttct gctcattttg gggaaggaac agggcccatt 2340 tggctggatg agataaactg taatggaaaa gaatctcata tttggcaatg ccactcacat 2400 ggttgggggc ggcacaattg caggcataag gaggatgcag gagtcatctg ctcagagttc 2460 atgtctctga gactgatcag tgaaaacagc agagagacct gtgcagggcg cctggaagtt 2520 ttttacaacg gagcttgggg cagcgttggc aggaatagca tgtctccagc cacagtgggg 2580 gtggtatgca ggcagctggg ctgtgcagac agaggggaca tcagccctgc atcttcagac 2640 aagacagtgt ccaggcacat gtgggtggac aatgttcagt gtcctaaagg acctgacaca 2700 ctatggcagt gcccatcatc tccatggaag aagagactgg ccagcccctc agaggagaca 2760 tggatcacat gtgccaacaa aataagactt caagaaggaa acactaattg ttctggacgt 2820 gtggagatct ggtacggagg ttcctggggc actgtgtgtg acgactcctg ggaccttgaa 2880 gatgctcagg tggtgtgccg acagctgggc tgtggctcag ctttggaggc aggaaaagag 2940 gccgcatttg gccaggggac tgggcccata tggctcaatg aagtgaagtg caaggggaat 3000 gaaacctcct tgtgggattg tcctgccaga tcctggggcc acagtgactg tggacacaag 3060 gaggatgctg ctgtgacgtg ctcagaaatt gcaaagagcc gagaatccct acatgccaca 3120 ggtcgctcat cttttgttgc acttgcaatc tttggggtca ttctgttggc ctgtctcatc 3180 gcattcctca tttggactca gaagcgaaga cagaggcagc ggctctcagt tttctcagga 3240 ggagagaatt ctgtccatca aattcaatac cgggagatga attcttgcct gaaagcagat 3300 gaaacggata tgctaaatcc ctcaggagac cactctgaag tacaatgaaa aggaaaatgg 3360 gaattataac ctggtgagtt cagcc 3385

Claims

토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자(RECOMBINANT VP60 BACULOVIRUS; 수탁번호:KCTC 11756BP)로부터 얻어진 유전자재조합 베큘로바이러스를 조직배양세포에 접종하여 생성됨을 특징으로 하는,
혈구 응집억제용 항원.
제1항에 있어서,
상기 토끼 출혈병 변이주바이러스로 KV0801 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는,
혈구 응집억제용 항원.
제1항에 있어서,
상기 유전자재조합 베큘로바이러스는 토끼 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자를 pGEM-T 벡터에 1차 클로닝하고, 다시 pBluBac 4.5His 벡터에 2차 클로닝하여 생성됨을 특징으로 하는,
혈구 응집억제용 항원.
제1항에 있어서,
상기 조직배양세포는 곤충세포 sf-9 cell인 것을 특징으로 하는.
혈구 응집억제용 항원.
토끼 출혈병 변이주의 VP60 유전자(RECOMBINANT VP60 BACULOVIRUS;수탁번호: KCTC 11756BP)를 pGEM-T 벡터에 1차 클로닝하는 단계;
상기 1차 클로닝 후 pBuleBacHis4.5 벡터에 2차 클로닝하여 유전자재조합 베큘로바이러스를 생성하는 단계;
상기 생성된 유전자재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 접종하여 출혈병변이주바이러스의 VP60 유전자 재조합 단백질을 수확하는 단계;
상기 수확한 재조합 단백질에서 혈구응집능을 갖는 항원을 분리해내는 단계;
상기 분리된 항원을 불활화하는 단계;를 포함하여 구성된,
유전자 재조합 불활화백신의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 항원을 불활화하는 단계에서 항원을 인산완충용액(PBS:Phosphate Buffered Saline)로 희석한 후 포르말린을 첨가한 다음 37 ℃에서 24시간동안 불활화하는 것을 특징으로 하는,
유전자 재조합 불활화백신의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 불활화단계 후 에쥬번트를 전체중량을 기준으로 20 중량부를 더 혼합하여 백신을 제조하는 것을 특징으로 하는,
유전자 재조합 불활화백신의 제조방법.
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