KR100977306B1

KR100977306B1 - 닭 전염성 ｆ낭병 바이러스의 유전자 재조합 ｖｐ２단백질및 이를 포함하는 닭 전염성 ｆ낭병 진단시약

Info

Publication number: KR100977306B1
Application number: KR1020080009261A
Authority: KR
Inventors: 최강석; 전우진; 이은경; 윤은임; 권준헌; 주후돈; 장병식; 양미영
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원); 주식회사 제노바이오텍
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2010-08-23
Also published as: KR20090083236A

Abstract

본 발명은 닭전염성F낭병(IBD) 진단에 관한 것으로, 본 발명은 베큘로바이러스를 이용한 유전자재조합 기법으로 인공발현한 단백질 항원인 닭전염성F낭병의 진단 항원 및 이를 포함하는 진단시약에 관한 것이다.

좀 더 상세하게는, 닭에서 분리된 강독형 국내분리 닭전염성F낭병바이러스로부터 추출한 VP2 단백질 유전자를 포함하는 유전자재조합 발현벡터와 이를 이용하여 제조한 VP2 단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스, 및 상기 베큘로 바이러스 발현벡터를 이용하여 작성한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현된 재조합 VP2단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 VP2 단백질을 IBD의 진단에 적용하는 IBD 진단용 항원 및 IBD 진단시약에 관한 것이다.

따라서 본 발명에 의하여 종래에 닭을 감염시켜 생산하여 진단하던 것을 대체하여 실험실 배양법으로 인공발현 단백질 형태로 생산함으로써 감염성 병원체 취급에 따른 질병 전파 위험성 없이 진단액을 안전하고 신속하게 대량으로 생산이 가능하며, 종래의 바이러스항원보다 오히려 더 민감하게 특이항체를 검출할 수 있다.

닭전염성F낭병, 닭전염성F낭병 바이러스, 유전자재조합 VP2단백질, 한천겔침강반응법(AGID)

Description

닭 전염성 Ｆ낭병 바이러스의 유전자 재조합 ＶＰ２단백질 및 이를 포함하는 닭 전염성 Ｆ낭병 진단시약{IBDV recombinant VP2 protein and diagnostic reagent for IBD containing there}

본 발명은 닭 전염성 F낭병(IBD) 진단에 관한 것으로, 본 발명은 베큘로바이러스를 이용한 유전자재조합 기법으로 제조한 인공발현 단백질인 닭전염성F낭병 진단 항원 및 이를 포함하는 진단시약에 관한 것이다.

닭전염성F낭병 (Infectious Bursal Disease)은 일명 감보로병(Gumboro disease)이라 불리는 질병으로, 3주령 이전의 병아리에 감염되어 준임상형으로 질병이 발생될 경우는 폐사는 거의 없지만 심한 면역능력의 저하가 나타나게 되고, 3-8주령의 육성계에 감염되는 임상형의 경우는 병의 경과가 매우 빠르며 20% 전후의 폐사가 나타나는 급성 바이러스성 질병이다. 따라서 3주령 내지 6주령의 닭에 감염시 높은 폐사율을 보이며, 3주령이내의 어린 닭에서는 면역기관인 F낭의 면역세포를 파괴시켜 면역억제를 유발하여 타른 질병에 대한 피해를 증가시키거나, 다른 예방백신의 백신효과를 감소시킴으로서 경제적 피해를 입힐 수 있다.

닭전염성F낭병의 병원체인 전염성F낭병바이러스(Infectious Bursal Disease Virus, 이하 'IBDV'라 한다.)는 현재까지 두 가지의 혈청형이 존재하고 있다. 그 중 혈청형 1형만이 닭에서 병증을 유발하여 피해를 입히는 것으로, 이 바이러스는 외부환경에 대한 저항성이 매우 높아 오염된 계사 내에서 수년간 생존할 수 있다. 또한 혈청형 1형의 경우 병원성의 형태에 따라서 표준형, 강독형, 항원변이형, 약독형(백신바이러스포함) 등으로 분류하고 있다. 특히, 강병원형 바이러스는 1986년 유럽에서 분리된 이후 다수의 유럽 및 아시아 등에서 닭에 큰 피해를 입히고 있는 실정이다.

국내에서는 1980년에 IBDV(표준형)가 처음으로 닭에서 분리되었고, 1992년 강병원형 IBDV가 닭에서 분리된 바 있다. 현재 국내 야외 양계농가에 강독형 IBDV에 의한 경제적 피해가 여전히 문제시되고 있다. 닭전염성F낭병은 감염계의 분변으로 배설된 바이러스가 오염된 사료나 물등을 섭취함으로 감염이 나타나고, 이 질병의 원인체인 IBDV는 일반소독제나 외부환경에서의 생존력이 매우 높기 때문에 한번 오염된 계사에서는 수년간 생존하게 되므로 오염된 계사 내에 건강계가 입식하여 사육되면 대부분의 경우 질병 감염이 나타나게 된다. 이러한 특성 때문에 일단 농장에서 닭전염성F낭병이 발병하면 감염된 닭을 제거한 후 철저하게 소독 조치를 취하지 않으면 이 질병이 쉽게 근절되지 않고 재발할 위험성을 가지고 있다.

IBDV의 공격목표는 훼브리셔스낭 (F낭)이며, 이 F낭은 닭의 항문 바로 윗 쪽에 위치하고 있는 공모양의 주머니이다. 물론 갓 부화된 병아리에서는 그 크기가 쌀알정도에 불과하지만 부화 후 2 ~ 3주에 급격히 커지며 품종간의 차이는 있지만 산란계에서는 4 ~ 5주에, 육계에서는 9 ~ 10주에 최고의 크기에 달하며 그 후 퇴화된다. 약 5주령 닭에서의 정상 F 낭은 직경이 약 2 cm에 달하고 중량도 2 ~ 3 g정도 된다. 이러한 F낭은 항체를 생산하는 세포를 가공하는 기관으로 여기서 생산된 세포들은 혈관을 따라 전신에 퍼져 닭의 면역에 도움을 주고 있다. 이렇게 중요한 기관이 어린 일령에서 IBD 바이러스의 공격을 받아 손상을 입게 되면 항체를 만드는 세포를 충분히 생산할 수 없기 때문에 저항력이 약해지게 되고, 이런 이유로 IBD에 걸린 닭은 많은 병에 쉽게 걸려 손실을 입을 뿐만 아니라 뉴캣슬병이나 마렉병과 같은 백신을 사용할 지라도 면역이 잘 형성되지 않는다.

IBDV는 이중나선 RNA(double stranded RNA)로 구성된 두 개의 절편 (A와 B)으로 구성되어 버나비리데 (Birnaviridae)의 아비버나바이러스 (Avibirnavirus)에 속한다 (Murphy et al.;Virus taxonomy, Springer, pp240-244, 1995). 절편 A (약 3.3 kbp)는 두 개의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 가지고 있고, 그 중 큰 ORF는 크기가 약 3kb정도로 VP2, VP3, 그리고 VP4로 되는 109-Kda의 전구체 폴리단백질 (precursor polyprotein)을 암호화하는 유전자를 가지고 있으며. 그 중에서 VP2 (약 494 아미노산)는 구조 의존형으로 중화항체와 혈청형의 특이성과 관계 있는 항원 부위(antigenic region)를 포함하고 있다. 작은 ORF는 크기가 약 400bp이며 VP5 단백질을 암호화하는 유전자를 가지고 있다. 절편 B (약 2.9 kbp)는 이중나선 RNA 중합효소(dsRNA polymerase)인 VP1 단백질을 암호화하는 유전자를 가 지고 있다.

특히, 닭전염성F낭병 바이러스 입자를 구성하고 있는 단백질 중 VP2단백질은 바이러스 입자 표면 외피를 구성하는 단백질로 바이러스 닭 전염성 F낭병의 감염을 방어할 수 있는 중화항체를 유도하는 항원결정기가 다수 존재하여 우수한 면역원성을 가지는 것으로 알려져 있다 (H. Muller et al., Review Research on infectious disease the past, the present and the future. 2003. 97, 153-165).

닭 전염성 F낭병을 일으키는 바이러스는 외부환경에서의 생존력이 강하여 연중 발생할 수 있으며 1992년 이후에는 높은 폐사율을 동반하는 강독성 전염성 F낭병이 국내에서도 발생하기 때문에 본병에 대해 높은 경각심을 가져야 할 실정이다. 특히 전염성 F낭병은 산란계에서 높은 폐사율과 설사증을 나타내기 때문에 쉽게 진단할 수 있지만 육계에서는 직접적인 폐사보다 증체량 저하, 2차 세균 감염 등으로 인하여 진단하기가 쉽지 않다. 이와 같이 감염 일령에 따라 임상증상이 다양하여 잘못하면 다른 질병으로 오진할 수 있으므로 전염성F낭병의 정확한 진단은 이 질병의 예방 및 대책 마련을 위해 매우 중요하다.

닭 전염성 F낭병의 진단은 크게 항원검사법과 항체검출법에 의해 이루어진다.

항체검사법으로는 한천겔침강법(AGID), 바이러스 중화시험 (VN) 및 효소결합면역반응측정법 (ELISA) 등이 사용되고 있다. 이 중 바이러스 중화시험 (VN)은 한 천겔침강법에 비해 항체 검출율에서 민감도가 우수한 것으로 알려져 있으나 바이러스가 세포에서 성장할 수 있도록 적응과정을 거쳐야 하며, 세포배양 등을 위한 특수실험실과 전염성 병원체를 취급하여야 하는 단점이 있다. 또한 효소결합면역반응 측정법은 대량의 시료를 신속하게 검사할 수 있고, 전염성병원체를 실험과정에서 취급하지 않기 때문에 이 방법 또한 전염성F낭병의 검사에 폭넓게 사용되고 있다.

항원검사법으로 계태아를 이용한 바이러스의 분리, 감염된 F낭 조직유제액을 항원으로 사용하는 한천겔침강법 (AGID), 역전사중합효소연쇄반응법 (RT-PCR), 형광항체법 등이 사용되고 있다.

특히, 한천겔침강법은 한천겔 상의 검사 웰 (well) 각각에 항원시료와 항체시료를 첨가하여 반응시키면, 항원과 항체가 한천겔상에 확산 (diffusion)에 의해 한천겔의 중간지점에서 항원-항체반응이 일어나서 흰 침강대 (precipitation band)를 형성하는 원리를 이용한 검사방법으로, 고가의 실험장비나 고난도의 실험 기술 없이도 질병의 진단을 용이하게 할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 한천겔침강법에 있어서, 진단용 항원제조는 4내지 5주령 특정병원체 부재 감수성 닭 (Specific pathogen free Chicken)에 전염성이 있는 IBDV를 접종하여 감염시킨 다음 3일 후에 닭을 안락사시켜 닭의 F낭 조직을 적출한 다음, 동량의 증류수와 동량의 메틸렌 클로라이드 (metylene chloride)를 첨가하여 유제하여 원심분리한 다음 그 상층액만을 취하여 제조한다 (국제수역사무국 진단매뉴얼, 2003).

그러나 종래의 한천겔침강반응법용 항원생산은 특정병원체 부재 닭을 사용하 여 생산하므로 엄격한 동물실험 위생관리가 요구되고, 고가의 특수닭을 사용하므로 항원제조 생산단가가 높으며, 닭을 안락사 시켜 F낭 조직을 채취하여 생물학적 안전캐비넷 (class II safety cabinet)에서 항원을 제조하기 때문에 제조공정이 까다롭다. 또한, 병원체가 환경저항성이 매우 강해 동물사육시설의 오염가능성이 상시 존재하기 때문에 닭 전염성 F낭병 항원제조 용도이외의 다른 실험 용도로 동물사육시설을 사용할 수 없다는 문제점이 있어 왔다. 동물보호법이 전면개정(2007.1.26)됨에 따라 동물사용을 줄이거나 대체가능한 In vitro 진단제제 개발이 시급히 필요한 실정이다.

이에 따라 최근 질병예방용 인공합성 단백질 백신 개발이나 효소결합면역반응측정법(ELISA) 진단액으로 종래의 바이러스입자 항원 대신에 VP2, 세그멘트 A 폴리프로테인 등 바이러스 단백질의 일부를 다양한 유전자재조합기법들을 이용하여 인공합성하는 방법들이 개발되고 있으나, 진단에 자주 사용되는 한천겔침강반응법의 경우 바이러스 입자 대신 인공합성 단백질을 진단항원으로 적용하여 개발된 사례는 없는 실정이다.

이에 본 발명자는 감염된 실험 닭을 이용해서 닭 전염성 F낭병 항원을 제조하는 종래의 방법을 개선하고, 유전자 재조합기법을 이용하여 닭 전염성 F낭병바이러스 VP2 단백질만을 실험실 배양방법으로 인공합성하여 생산하는 데 성공하였으며, 본 발명의 인공합성 VP2단백질 항원을 닭 전염성 F낭병 진단액으로서 적용한 결과 본 발명의 단백질 항원이 닭 전염성 F낭병 항체를 검출하는 데 우 수한 민감성 및 특이성을 가짐을 처음으로 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 닭전염성 F낭병 바이러스의 전체 유전자 중에서 VP2 구조단백질 유전자를 삽입하여 제조한 베큘로 바이러스 발현벡터 및 재조합 베큘로 바이러스를 제공하고, 상기 베큘로 바이러스 발현벡터를 이용하여 작성한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현된 재조합 VP2단백질을 제공함을 목적으로 한다.

또한, 닭전염성F낭병 바이러스 구조단백질 VP2 유전자가 발현된 펩타이드 및 재조합 펩타이드 또는 이의 일부 펩타이드를 IBD 진단용 항원으로 제공함을 목적으로 할 뿐만 아니라, 상기 IBD 진단용 항원을 포함하는 IBD 진단시약을 제공함을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 닭전염성F낭병바이러스의 전체 유전자 중에서 VP2 구조단백질 유전자를 삽입하여 제조한 베큘로 바이러스 발현벡터 및 재조합 베큘로 바이러스를 제공한다.

본 발명은 상기 베큘로 바이러스 발현벡터를 이용하여 작성한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현된 재조합 VP2단백질을 제공한다.

본 발명은 닭전염성F낭병의 진단에 있어서, 닭전염성F낭병 바이러스 구조단백질 VP2 유전자가 발현된 펩타이드 및 재조합 펩타이드 또는 이의 일부 펩타이드인 것을 특징으로 하는, IBD 진단용 항원을 제공할 뿐만 아니라, 상기 IBD 진단용 항원을 포함하는 IBD 진단시약을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 제1견지에 의하면,

본 발명은 게놈 내 닭전염성F낭병 바이러스의 구조단백질 VP2 유전자 (서열번호1)를 포함함을 특징으로 하는, 도1의 개열지도를 갖는 발현벡터에 관한 것으로, 바람직하게는 상기 발현벡터는 6개의 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터(이하 pAcHLT/IBDVP2 라고 한다)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 바이러스가 닭전염성F낭병 바이러스 분리주 (IBDV kr/D62/06) 유전자인 것을 특징으로 하는 것을 더 포함한다.

본 발명에서 사용한 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 구조단백질 유전자는 2006년 닭전염성F낭병 발생으로 심한 경제적 손실을 입었던 국내 닭 사육농장에서 분리된 바이러스 Kr/D62/06에서 유래한 것으로, VP2 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같이 1,359 bp이며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질(서열번호 2)은 452개의 아미노산으로 구성되어 있다.

본 발명의 제2견지에 의하면,

본 발명은 상기 본 발명의 제1견지에 의한 발현벡터가 도입된 재조합 베큘로 바이러스에 관한 것이다. 따라서 본 발명에 의하여 닭전염성F낭병 바이러스의 구 조단백질 VP2 유전자와 6개의 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 베큘로 바이러스 Bac/IBDVP2를 제공할 수 있으며, 상기 바이러스가 닭전염성F낭병 바이러스 분리주 (IBDV kr/D62/06)인 것을 특징으로 하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 재조합 베큘로 바이러스 Bac/IBDVP2는 본 발명의 진단방법에 사용되는 재조합 VP2단백질 진단항원을 생산함을 특징으로 한다.

본 발명의 제3견지에 의하면,

상기 본 발명의 제2견지에 의한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 제조한 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 재조합 단백질 rIBDVP2 (recombinant Infectious Bursal Disease VP2)을 제공한다.

본 발명에 따른 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 재조합 단백질 (이하 rIBDVP2라 한다.)은 유전자재조합기법을 이용하여,

닭전염성F낭병 바이러스의 구조단백질 VP2 유전자를 역전사 중합연쇄반응 (RT-PCR)으로 증폭하고, 베큘로바이러스 발현벡터에 삽입하여 재조합 베큘로바이러스발현벡터를 제조하는 제1단계; 제1단계에서 제조된 발현벡터와 베큘로바이러스 선형 DNA를 곤충세포에서 공동형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 제2단계; 곤충세포에 상기 제2단계에서 제조된 재조합 베큘로바이러스를 감염시켜 6개의 히스티딘이 융합된 형태의 재조합 VP2 단백질 rIBDVP2의 생산 및 정제하는 제3단계;를 포함한 유전자 재조합 방법에 의하여 제조할 수 있다.

상기 바이러스는 닭전염성F낭병 바이러스 분리주 (IBDV kr/D62/06)인 것을 특징으로 하는 것을 더 포함한다.

또한 곤충세포에 형질도입(transfection)의 방법에 의해 수행되는 상기 제2단계에 있어서, 본 발명에서 사용되는 곤충세포는 그의 종류에 특별히 제한되지 않고, 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발된 것 또는 시판된 것, 예를 들면 스포도프테라 프루지페르다 곤충세포 (Spodoptera frugiperda ) Sf21 또는 Sf9 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 재조합 VP2 단백질의 아미노말단부위 앞에 6개의 Histidine이 융합되어 있어 생산단계에서 항히스티딘 항체를 이용하여 VP2 단백질의 발현을 손쉽게 확인할 수 있을 뿐 아니라 생산한 VP2 재조합 융합단백질은 Ni-NTA 아가로스 비드를 이용하여 그 정제가 용이할 수 있다. 따라서 단백질 생산 및 정제가 매우 경제적이다.

이러한 재조합 베큘로 바이러스 제조방법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당 업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다. 상기한 발현벡터 이외에 6개의 히스티딘 유전자가 포함된 다른 종류의 베큘로 바이러스 발현벡터를 사용하여도 무방하기 때문에 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

상기한 방법에 의하여 생산된 재조합 단백질 rIBDVP2은 종래의 재조합 VP2단백질과 달리, 단백질 발현확인 및 정제가 용이하도록 아미노말단부위 앞에 6개의 Histidine이 융합시킨 형태의 닭전염성F낭병바이러스 VP2 단백질임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 재조합단백질은 그 제조 과정에서 불활성화 바이러스 항원을 제조하기 위하여 생바이러스를 조작해야 하는 위험성을 배제하였다는 장점이 있으며, 항원성이 본래의 바이러스 항원과 매우 흡사하여 예방백신용 항원으로도 적용이 가능하다.

특히, 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용하는 본 발명에 의한 재조합 VP2 융합단백질은 닭전염성F낭병 진단방법중 하나인 한천겔침강법에 최초로 도입된 인공합성 단백질 항원으로 제공될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 재조합 단백질 rIBDVP2를 항원으로 포함하는 닭전염성F낭병 예방용 서브유닛 백신을 제공될 수 있을 것이다. 즉, 질병예방 측면에서, 본 발명에 의한 VP2 재조합 융합단백질은 종래의 보고에 의하면 닭전염성F낭병바이러스의 방어면역과 관련된 중요한 항원결정기를 가지고 있어서 VP2 단백질을 면역할 경우 강독형 닭전염성 F낭병을 예방할 수 있다고 알려져 있으므로 본 발명의 재조합 rIBDVP2를 항원으로 포함하는 닭전염성 F낭병의 서브유닛 예방백신으로 제공될 수 있다. 특히, 본 발명의 VP2 재조합 융합단백질은 국내유행 강독형 닭전염성F낭병바이러스을 이용하여 제조하였기 때문에, 백신바이러스로 제조하여 만드는 VP2 재조합 융합단백질보다 야외 강독형 바이러스감염을 예방하는 데 보다 더 효과적일 수 있다. 또한 실험실에서 손쉽게 유전자 재조합을 통해서 생산하기 때문에 긴급한 상황에서 예방백신을 신속하고 안전하게 생산할 수 있을 것이다.

본 발명의 제4견지에 의하면,

닭전염성F낭병의 진단에 있어서, 닭전염성F낭병 바이러스 구조단백질 VP2 유전자 (서열번호 1)가 발현된 펩타이드 또는 이의 일부 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 닭전염성F낭병 (Infectious Bursal Disease) 진단용 항원을 제공한다. 바람직하게는 상기 바이러스는 닭전염성F낭병 바이러스 분리주 (IBDV kr/D62/06)인 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 상기 펩타이드는 재조합 단백질 rIBDVP2 또는 이의 일부 펩타이드인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 상기 닭전염성F낭병의 진단은 한천겔 침강반응법에 의한 검사인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 재조합 VP2 융합단백질은 닭전염성F낭병 진단을 위하여 한천겔침강법에 사용되는 진단항원으로서 항원성이 인정되고, 특히 닭전염성F낭병 진단하는 데 필수적인 민감도 측면에서 볼 때 종래의 바이러스항원보다 오히려 더 민감하게 특이항체를 검출함을 확인하였다. 따라서 질병진단 측면에서 보면, 본 발명에 의한 재조합 VP2 융합단백질은 종래의 닭전염성F낭병 진단을 위하여 한천겔침강법에 사용되는 불활성화 바이러스 항원을 대체할 수 있다.

본 발명의 제5견지에 의하면,

본 발명은 상기 닭전염성F낭병 진단용 항원, IBDV 양성 및 음성혈청, 및 AGID 완충액을 포함함을 특징으로 하는 닭전염성F낭병 진단시약을 제공한다. 상기 닭전염성F낭병 진단용 항원이 포함된 진단액 항원에는 착색제가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 한천겔 상의 검사 웰(well)에 항체시료와 항원시료를 첨가하여 한천겔침강반응법에 의한 IBD 진단키트에 있어서, 항원시료가 상기 닭전염성F낭병 진단용 항원인 것을 특징으로 하는 진단키트를 제공할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명은 피 검체로부터 채취한 생물학적 항체시료와 본 발명에 따른 IBD 진단용 항원을 반응시켜 항원-항체 반응을 검출하는 IBD 진단키트를 제공할 수 있다.

닭전염성F낭병 바이러스 VP2 단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용하는 본 발명에 의한 재조합 VP2 융합단백질은 닭전염성F낭병 진단방법중 하나인 한천겔침강법에 최초로 도입된 인공합성 단백질 항원인 것으로, 종래의 바이러스항원보다 오히려 더 민감하게 특이항체를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 닭전염성F낭병 진단을 위하여 한천겔침강법에 사용되는 불활성화 바이러스 항원을 대체할 수 있다.

감염 닭의 F낭 조직을 유제하여 만든 바이러스 항원의 경우 감염성이 있는 생바이러스를 조작해야만 했던 위험성 및 번거로움을 배제하여 일반실험실에서 안전하고 손쉽게 생산할 수 있기 때문에 진단항원으로서의 효용가치가 크고, VP2 재조합 융합단백질의 발현 및 정제가 용이하여 단백질의 생산 및 정제가 경제적이다.

또한 본 발명에 따라 실험실에서 손쉽게 유전자 재조합을 통해서 생산하기 때문에 긴급한 상황에서 예방백신을 신속하고 안전하게 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 과정도 본 발명의 범주에 포함된다.

< 실시예 1>

닭전염성F 낭병 바이러스 RNA 추출

2006년 국내 양계농장에서 분리된 닭전염성F낭병바이러스 Kr/D62/06주를 특정병원체부재 닭 발육란의 융모요막내 접종한 다음 바이러스를 증식시켰다. 발육란에 접종 5일 후에 융모요막을 채취하여 트리졸 용액 (TRIzol reagent, Invitrogen, USA)을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다.

< 실시예 2>

닭전염성F 낭병 바이러스 VP2 유전자 cDNA 합성, 증폭 및 클로닝

닭전염성F낭병바이러스 VP2 단백질 유전자의 cDNA합성 및 증폭은 일단계 역전사 중합효소연쇄반응키트 (one-step RT-PCR kit, Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다.

즉, 서열3 (5'-GAA TTC ATG ACG AAC CTG CAA GAT-3')의 포워드 프라이머 및 서열4 (5'-AGA TCT CTA CCT TAG GGC CCG GAT TAT-3')의 리버스 프라이머를 일단계 역전사 중합효소연쇄반응키트 (one-step RT-PCR kit, Qiagen, USA)를 위한 유전자증폭용 반응튜브에 첨가한 다음, 50℃에서 30분간 역전사 반응을 실시하였다. 그 후 95℃에서 15분간 열처리한 후 95℃ 20초, 55℃ 1분, 72℃에서 2분을 1사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 30 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA합성을 연장하였다.

상기에서 기술한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 본 발명에 사용한 닭전염성F낭병 바이러스 Kr/D62/06주의 VP2 단백질 유전자 서열을 기준으로 합성하였으며, 증폭될 유전자부위의 크기는 1359bp로서 VP2단백질 유전자 전체부위가 증폭되도록 하였다.

또한 유전자 클로닝의 효율성을 위하여 서열1의 5-말단 시작코돈 (ATG) 상류에 EcoR I 제한효소 반응부위를, 서열2의 5-말단 종료 코돈 상류에 Bgl II 제한효소 반응부위를 각 말단에 추가하였다.

상기의 역전사 중합효소반응법으로 증폭된 cDNA 증폭산물은 아가로스 전기영동 (Agarose electrophoresis)법으로 증폭산물의 크기를 확인하고, VP2단백질유전자 DNA 증폭산물은 겔익스트랙션 키트 (gel extraction kit, Qiagen, USA)를 이용하여 아가로스 겔 (agarose gel)로부터 추출하였다. 이렇게 추출한 VP2 유전자 cDNA를 pGEM-T easy (Promega사, USA) 벡터의 멀티클로닝사이트 (Multicloning site)에 삽입하여 "pGEMT/IBDVP2"을 제작하였고, 자동염기서열분석기 (ABI 377, USA)를 사용하여 삽입된 유전자의 염기서열을 서열번호 1의 염기서열과 비교 분석함으로써 VP2 유전자 cDNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다.

< 실시예 3>

VP2 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 pAcHLT / IBDVP2 작성

상기 실시예 2에서 제조한 pGEMT/IBDVP2 벡터를 EcoR I 및 Bgl II로 처리하여 해당 DNA 단편을 추출하였다. 한편, 베큘로바이러스 발현벡터 pAcHLT A^TM (BD Biosciences, USA) 역시, 동일한 제한효소로 절단한 다음 상기의 VP2 DNA 단편을 폴리헤드린프로모터 (P_PH)가 있는 유전자 부위의 하류에 있는 멀티클로닝사이트 (Multicloning site)내 삽입하였다. 이렇게 하여 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 유전자가 삽입된 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터인 pAcHLT/IBDVP2를 제작하였다. 도 1에서는 본 발명에 의한 상기 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터(pAcHLT/IBDVP2)의 구조를 보여준다.

< 실시예 4>

VP2 재조합단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스 Bac / IBDVP2 작성

재조합 베큘로바이러스 Bac/IBDVP2는 Baculogold^TM 베큘로바이러스발현시스템 (BD Biosciences, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 작성하였다.

실시예 3의 pAcHLT/IBDVP2 벡터와 Baculogold^TM 베큘로 바이러스 선형 DNA (BD Biosciences, USA)를 이용하여 재조합 베큘로 바이러스를 제조하는 과정은 다음과 같다.

직경 60mm 조직배양용 페트리디쉬에 나비목해충 (Spodoptera frugiperda; 이하 Sf9라 한다) 세포를 웰당 2 x10⁶ 개가 되도록 무혈청 그레이스 배양액(Grace medium)으로 희석하여 첨가한 다음 약 15분간 방치하여 웰 바닥에 부착되도록 하였다. 그 후 그레이스 배양액을 제거하고 형질전환용 배양액 버퍼 A (BD Biosciences, USA)를 웰당 1ml 첨가하였다. 그 사이 에펜도르프 튜브에 상기 실시예 3에서 제작한 pAcHLT/IBDVP2 벡터 2㎍와 Baculogold^TM 베큘로 바이러스 선형 DNA (BD Biosciences, USA) 0.5㎍를 혼합하여 첨가한 후 실온에서 5분간 방치시킨 다음 형질전환용 버퍼 B (BD Biosciences, USA)를 웰당 1ml씩 첨가하였다.

그 후 에펜도르프 튜브로부터 DNA 반응산물 1 ml를 Sf9세포가 부착된 페트리디쉬 웰에 방울 방울 떨어뜨리면서 첨가한 다음 27℃에서 4시간 배양함으로서 형질감염시켰다. 그 다음 반응액을 웰에서 완전히 제거한 후 10% 우태아 혈청(GibcoBRL, USA)가 함유된 그레이스 배양액을 웰당 3ml씩 첨가하여 27℃에서 5일간 배양하면서 세포변성효과 (Cytopathic effect; CPE) 출현여부를 관찰하였다. 그 후 형질감염시킨 세포의 배양 상층액을 수확하고 프라크 시험법 (Plaque Assay)을 실시하여 순수하게 재조합 베큘로 바이러스를 분리하였다. 즉, 3 x 10⁴ 개의 Sf9 세포를 직경 35mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 단층으로 도포한 후, 상기에서 수확한 상층액을 10배 단계로 희석한 희석액을 각각 1ml씩 접종하였으며, 27℃에서 1시간동안 감작한 다음, 상층액을 제거하고 나서 1% 저융점 아가로스가 포함된 그레이스 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포 (overlay)하여 8일간 27℃에서 배양하여 플라크 형성을 확인하였다. 몇 개의 플라크를 채취하여 Sf9 세포를 감염시켜 4일간 배양하여 CPE 출현여부를 관찰하고, 감염 sf9세포를 특이 단클론성 항체 (ATCC R63)과 닭전염성F낭병 고도면역혈청으로 형광염색하여 VP2단백질을 발현하는 유전자재조합 베큘로바이러스 여부를 확인하였다 (도 2 참조). 이렇게 하여 닭전염성F낭병 바이러스 VP2 유전자가 삽입된 재조합 베큘로 바이러스 Bac/IBDVP2를 제작하였다.

< 실시예 5>

재조합 베큘로바이러스를 이용한 6개의 히스티딘이 융합된 VP2 융합단백질 생산

먼저 150 cm² 세포배양용 플라스크에 Sf9 cells을 미리 배양하여 단층을 형성시켰다. 그런 다음, 플라스크내 배양액을 제거하고 세포당 0.4 PFU (plaque forming unit, 플라크형성단위)되게 희석한 재조합 베큘로바이러스액 5ml를 첨가하여 27℃에서 1시간 동안 감작시켰다. 그 후 10% 우태아혈청이 첨가된 그레이스 배 양액 25ml를 첨가하여 27℃에서 4일 정도 배양하면서 세포변성효과가 나타나는 지 관찰하였다. 그 후, 스크래퍼 (scraper)를 이용하여 플라스크내 감염세포를 수확하여 4℃에서 3,000 rpm, 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 세포 펠렛만을 0.1M Phosphate buffered saline에 부유시켰다.

그 후 침전된 세포 펠렛에 대하여 전기영동법(12% SDS-PAGE)후 웨스턴블롯(western blot)법으로 검사하여 VP2 단백질에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 이용하여 약 50kDa의 특이단백질의 생산을 확인하였다(도 2). 그렇게 하여 생산된 재조합 VP2 융합단백질은 사용전까지 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 6>

생산된 재조합 VP2 융합단백질의 정제

실시예 5에서 생산한 재조합 VP2 융합단백질을 함유한 세포 펠렛을 세포배양 플라스크 5개당 10ml 되게 lysis 완충액 (20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 1% NP-40, pH7.4)에 현탁한 후 얼음에서 30분간 반응시키면서 초음파처리(sonication, 10초 처리 10초 휴식 총 10분간)으로 세포를 파쇄하였다. 그런 다음, 파쇄된 세포 현탁액을 4℃에서 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 수확하였다. 그 동안 NTA column (BD sciences, USA)에 5ml NTA-Agarose를 충전하고 0.1M Phosphate buffered saline로 3회 세척하였다. 그 후 1x binding buffer (20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 10mM Imidazole, pH7.4) 50 ml를 column에 로딩 (loading)하여 equilibration하도록 하였다. 그 후 상기에서 준비한 시료 10ml를 column에 분당 2ml씩 loading하였다. 그 후 세척용액 (20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole, pH7.4)으로 3회 column을 세척하였다. 그 후 1x elution buffer (20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 500mM Imidazole, pH7.4)를 column에 loading하여 elution하여 각 fraction을 코니칼튜브에 수확하였다. Fraction중 단백질량 200㎍/ml 이상을 회수하여 전기영동법 (12% SDS-PAGE)로 VP2 단백질을 확인하였다. VP2단백질이 포함된 Fraction 은 모두 합쳐서 0.1M Phosphate buffered saline에서 투석하였다. 그 후 단백질을 정량하여 재조합 VP2 융합단백질의 항원성을 확인하였다.

< 실시예 7>

재조합 VP2 단백질의 한천겔침강반응법 ( AGID )에의 적용

상기 실시예 6에서 제조한 닭전염성F낭병 재조합 VP2 융합단백질을 한천겔침강법(AGID)의 항원으로 적용하여 진단항원으로서의 유효성을 평가하였다. 검사자가 항원의 확산을 편리하게 확인하기 위하여 적량의 phenol red(0.001%- 0.01%)를 첨가하였으며, 대조 시험군 감염닭유래 F낭유제액으로 만든 종래의 진단항원을 사용하여 결과를 비교하였다. 또한 유효성 평가를 위하여 과거 닭전염성F낭병 백신접종한 모계유래의 1일령 병아리에서 채취한 혈액 10점, 과거에 닭전염성F낭병 백신접종 받은 종계(breeder)에서 채취한 혈액 9점, 특정병원체 부재닭으로부터 채취한 혈액 7점을 사용하였다.

먼저, 8% NaCl, 2% PEG8000, 1% 노블 아가를 100ml 증류수에 첨가시킨 다음 pH를 7.4로 조정한 후 열탕으로 완전히 용해시킨 다음 직경 35mm 페트리디쉬에 20ml 첨가하여 실온에서 고형화시킨 한천겔 플레이트를 실험에 사용하였다. 한천겔 침강법은 국제수역사무국에서 권장하는 방법에 따라 실시하였다. 검사결과의 판정은 도4와 같이 항원 항체반응에 의하여 웰 사이에 침강대가 형성된 경우 양성으로 판정하였다.

종래의 항원과 본 발명의 항원을 이용한 한천겔침강법 검사결과

혈청그룹	두수	한천겔침강법 검사결과		비고
혈청그룹	두수	종래의 항원	본 발명 항원
1일령 병아리	10	0/10*	10/10	모체이행항체양성 개체
150일령 종계	9	8/9	9/9	백신접종 개체
특정병원체부재 닭	7	0/7	0/7	닭전염성 F낭병 음성 닭

* 양성혈청수/검사혈청수

상기 표1는 본 발명의 재조합 VP2 융합단백질 항원을 사용한 한천겔 검사법과 종래의 바이러스 항원을 사용한 한천겔 검사법의 검사결과를 비교 분석한 결과이다.

본 발명의 재조합 VP2 융합단백질 항원은 1일령 병아리와 150일령 종계의 혈청 모두에서 닭전염성F낭병 항체를 검출하였으나, 종래의 바이러스 항원을 사용한 경우 종계의 혈청 대부분에서 항체가 검출된 것과 달리, 낮은 역가의 모체이행항체를 가진 1일령 병아리의 혈청에서는 항체를 검출하지 못했다. 이러한 결과는 본 발명의 재조합 VP2 융합단백질 항원이 종래의 바이러스 항원보다 항체를 검출할 수 있는 민감도가 우수하다는 것을 보여주는 것이다.

전염성F낭병 항체음성인 특정병원체 부재 닭의 혈청의 경우, 본 발명의 재조합 VP2 융합단백질 항원과 종래의 바이러스 항원 모두 검사결과 음성을 나타내었다. 그러므로 이 결과는 본 발명의 재조합 VP2 융합단백질 항원은 진단항원으로서의 특이성 또한 높다는 것을 보여주는 결과이다.

본 발명은 상기 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

도 1은 닭 전염성 F낭병의 VP2 단백질 유전자 및 히스티딘 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 발현벡터의 모식도이다.

도 2는 형광항체법으로 유전자재조합 베큘로바이러스 감염된 곤충세포에서의 닭전염성F낭병 재조합 VP2 단백질의 발현확인도이다.

도3은 웨스턴블롯법으로 유전자재조합 베큘로바이러스에 의하여 생산된 닭 전염성 F낭병 바이러스의 재조합 VP2단백질의 항원성을 확인한 사진이다.
도4는 한천겔침강법으로 유전자재조합 베큘로바이러스에 의하여 생산된 닭 전염성 F낭병 바이러스의 재조합 VP2단백질의 항원성을 확인한 사진이다.

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<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research--) Jeno Bioteck Co., Ltd. <120> IBDV recombinant VP2 protein and diagnostic reagent for IBD containing there <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1359 <212> DNA <213> Infectious bursal disease virus VP2 <400> 1 atgacgaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggagctac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300 ttagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aatggcacta taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480 ggggaagggg tgaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540 ggtgacccta ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660 caagctggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720 agcatcgggg gagaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780 atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840 gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960 acgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020 aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg 1080 tctgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260 gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ctaaggtct 1359 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Infectious bursal disease virus VP2 protein <400> 2 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Thr Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Leu Arg 450 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gaattcatga cgaacctgca agat 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 agatctctac cttagggccc ggattat 27

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닭전염성 F낭병 바이러스 구조단백질 VP2 유전자(서열번호1)가 발현된 재조합 단백질 rIBDVP2(recombinant Infectious Bursal Disease VP2) 항원, IBDV (Infectious Bursal Disease Virus)양성혈청, IBDV 음성혈청 및 한천겔침강법(AGID) 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 닭전염성F낭병 진단시약.
제9항에 따른 진단시약을 포함하는 닭전염성 F낭병 진단키트.
제10항에 따른 진단키트를 활용하는 것을 특징으로 하는 닭전염성 F낭병 진단방법.