CN102286534A

CN102286534A - 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用

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Publication number: CN102286534A
Application number: CN 201110142492
Authority: CN
Inventors: 张志芳; 李轶女; 易咏竹; 韦永龙; 刘兴健; 沈桂芳; 舒惠国
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102286534B

Abstract

本发明公开了表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用。其构建方法包括：（1）、将多拷贝高效细菌DNA复制起始子导入到杆状病毒基因组的几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶两个基因中，得到杆状病毒穿梭质粒；（2）、用抗生素基因替换杆状病毒穿梭质粒的多角体基因下游的病毒复制的必须基因，获得杆状病毒质粒DNA；（3）、用反向选择标志基因替换杆状病毒穿梭质粒中的其它病毒复制和感染的非必须基因，即得。将外源目的基因替换所构建的昆虫生物反应器中的抗生素基因或反向选择标志基因，可在宿主昆虫或昆虫细胞中表达多种外源基因。本发明昆虫生物反应器可以在昆虫体内同时高效表达一个或多个外源基因，可大量、廉价生产重组蛋白。

Description

表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表达外源目的基因的生物反应器的构建方法，尤其涉及能在昆虫体内进行高效表达多种外源目的基因的昆虫杆状病毒生物反应器的构建方法以及由该方法构建得到的产品，属于表达外源基因的生物反应器的构建领域。

背景技术

杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统，是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。已经成为当今基因工程常用的四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅中国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。昆虫杆状病毒表达载体系统是当今基因工程四大表达系统之一，相对于原核表达系统而言，杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，具有真核蛋白翻译后加工、修饰和转运体系，表达产物在生物活性、抗原性和免疫原性方面接近天然产物。美国食品和药品管理局对杆状病毒表达系统的评价为“FDA认可杆状病毒表达系统生产的产品，它提供了新兴生物制药业的前景，尤其对于人类疾病治疗和疫苗的开发，改善人类的健康和提高数百万人的生活质量更是如此(Patterson R M，Environ.Health Perspect，1995，103：756～759)。

杆状病毒表达系统和其他的表达系统相比，具有以下几个优点：(1)真核表达环境，昆虫细胞能够够为外源表达产物提供糖基化，磷酸化，信号肽切除等翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的重组蛋白具有正常的生物学活性提供了保证； (2)杆状病毒基因组较大，可以插入大片段或同时表达多个外源基因，最大时甚至能插入约40kb的外源片段(Cheshenko et al.2001)；(3)安全性高，重组杆状病毒由于其多角体蛋白基因受到破坏，在自然环境中不能感染昆虫，另外，杆状病毒在人体细胞中不能复制。(4)这一表达系统的表达效率极高，产量可达毫克级/虫的水平，可大大降低生产成本并使许多贵重的重组蛋白的大规模生产成为可能。杆状病毒具有多角体启动子及P10等晚期强启动子，外源蛋白表达量很高，另外，晚期启动子能够用来表达一些对细胞有毒害作用的蛋白(Hu 2005)。

杆状病毒基因组较大，所以只能通过同源重组的办法，先将外源基因连接到转移载体上，再将转移载体与病毒共转染细胞或者体外酶促重组，从而构建杆状病毒表达载体。一般的转移载体均含有病毒的两个同源臂，一个或多个杆状病毒启动子(多数取多角体启动子)，将外源目的基因插入到启动子下游之后，与杆状病毒重组，得到重组病毒，再将重组病毒纯化，感染昆虫细胞或虫体，外源基因随着病毒的复制而获得表达。

重组病毒最早构建时构建使用的是环状的野生病毒，当病毒与转移载体发生重组之后，病毒的多角体蛋白基因受到破坏，不能形成多角体，感染这种重组毒株的细胞在显微镜下形成空斑，通过多次重复筛选，可以对重组病毒进行纯化，此筛选过程耗费很大人力物力，效率很低，在很大程度上限制了杆状病毒的应用。近年来，围绕着解决筛选重组杆状病毒的难题，开创了多种技术，简化了杆状病毒的构建和筛选过程。1990年，Kitts等(Biotechoniques，14：810-7，1993)在AcNPV的多角体蛋白基因所在位置(polyhedrin)引入一个唯一的限制性酶切位点(Bsu36I)。重组前先用Bsu36I消化，使亲本病毒线性化，线性化的病毒不能顺利复制，因此降低了野生型病毒背景，使筛选的效率有了很大的提高，但实际上，线性化的病毒在昆虫细胞内仍然能够自我发生环化，重组病毒的比率仅占25％左右(Kitts et al.1990)，随后，Kitts等将另一个Bsu36I引入了杆状病毒基因组中的必需基因ORF1629内，Bsu36I消化后，ORF1629缺失一个片段而失活，必需与携带外源基因的转移载体重组，将ORF1629补齐后方可复制，这一改进，杆状病毒的重组率提高到了90％(Kitts et al.1993)。1998年，吴祥甫也在BmNPV中引入了Bsu36I，构建了BmNPV的线性化重组系统(Wu et al.1998)。理论上，ORF1629缺陷的线性化病毒的重组率能达到100％，但实际操作中，仍然存在很大比率的假阳性，这可能与病毒能够通过一定途径自我修复相关。上述重组杆状病毒构建方法需要先在杆状病毒基因组中引入唯一的限制性酶切位点，如Bsu36I等，并且需要先在体外酶切病毒DNA，破坏必须基因ORF1629，而后在体外重组、补全ORF1629的过程中同时发生重组，由于杆状病毒基因组非常大，昆虫细胞中能提取的病毒DNA含量较少，质量不好，酶切反应很难完全，导致存在重组率低，假阳性率高等缺点。

1993年，Luckow等根据F因子载体的原理，在AcNPV杆状病毒基因组中引入了一个细菌复制子，构建了一种新型杆状病毒穿梭载体，取baculovirus和plasmid的字头字尾命名为bacmid，此质粒既能在大肠杆菌中复制，也能感染昆虫细胞。Bacmid中，多角体蛋白基因所在位置加上了attTn7位点，卡那霉素抗性基因以及作为筛选标记的LacZ基因，在大肠杆菌中，利用辅助质粒携带的Tn7转座酶，bacmid就能够与携带外源基因的转移载体发生特异位点重组，通过转移载体携带的抗性基因，加上病毒发生重组后破坏了LacZ基因而使其所在的细菌宿主不能形成蓝斑，能够高效筛选出含有重组病毒细菌单克隆。此法与传统方法相比，操作简单，耗时短，整个重组病毒筛选过程都能够在细菌中完成，所以周期可以缩短至7～10d，而且不易出现假阳性，因此是一个非常便捷的系统(Luckow et al.1993)。但该方法在AcNPV基因组中引入的是单拷贝DNA复制起始点，一个大肠杆菌细胞中只能复制一个AcNPV基因组拷贝，导致杆状病毒基因组DNA产量少、质量差，后续的昆虫细胞转染效率低。同时它是利用转座原理将外源基因连带抗性筛选标记转到LacZ基因中，而以不能形成蓝斑进行筛选的过程繁琐、复杂、表达效率低。

此外，在杆状病毒基因组中，存在着许多对外源基因表达不利的病毒基因，如半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin，cat)和几丁质酶(Chifinase，chi)；影响外源基因表达效率的病毒基因，譬如P10、P74、P26等(Hitchman et al.，Cell Biol Toxicol，26：57-68，2010)；影响宿主昆虫或昆虫细胞生理状态的病毒基因，如egt等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的表达外源目的基因的昆虫杆状病毒生物反应器所存在的不足，提供一种在昆虫体内同时高效表达一个或多个外源基因，同时生产出一个或多个重组蛋白的新型高效昆虫杆状病毒生物反应器，通过这种生物反应器可以大量、廉价地生产重组蛋白，以用于医药、食品、饲料、酶制剂等工农业生产中，尤其是需要多个重组蛋白同时在昆虫或昆虫细胞内表达并需要组装才有最佳生物活性的蛋白，如抗体蛋白的重链和轻链蛋白、病毒空衣壳组装所需的多个衣壳蛋白等。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。

一种能够高效表达多种外源目的基因的昆虫杆状病毒生物反应器，其构建方法包括以下步骤：

1、将多拷贝高效细菌DNA复制起始子导入到杆状病毒基因组的几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶两个基因中，破坏病毒几丁质酶和组织蛋白酶基因，构建得到既可感染宿主昆虫或昆虫细胞又能在大肠杆菌中复制的杆状病毒穿梭质粒；

2、用抗生素基因替换杆状病毒穿梭质粒的多角体基因下游的病毒复制的必须基因，获得杆状病毒质粒DNA；

3、用反向选择标志基因替换步骤(2)的杆状病毒穿梭质粒中的病毒复制和感染的非必须基因，即得。

本发明首先将一个可控的多拷贝高效细菌DNA复制起始子导入到杆状病毒基因组的几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶基因两个基因中，构建了得到了既可感染宿主昆虫或昆虫细胞又能在大肠杆菌中复制的细菌/杆状病毒穿梭质粒，这个穿梭质粒既能稳定存在于细菌中，在需要制备DNA时，又可通过L-阿拉伯糖诱导调控的多拷贝高效DNA复制起始子进行大量扩增，获得大量高质量的病毒基因组DNA进行后续实验。半胱氨酸蛋白酶基因(cathepsin，下面简称cat基因)和几丁质酶基因(chitinase，以下简称chi基因)能够导致外源蛋白的降解，本发明在构建昆虫杆状病毒生物反应器的过程中敲除了这两个基因，能够明显提高外源蛋白的表达量，而且在BmNPV或AcNPV上这两个基因都是相邻，方向相反，ORF之间只有49bp的间隔，所以通过同源重组的方法将高拷贝复制子基因重组到这两个基因的位置既能优化两种穿梭质粒对外源基因的表达又能导入复制控制基因。

所述的多拷贝高效细菌DNA复制起始子优选为由单拷贝的F-因子复制子“ori2”和高拷贝的复制原子“oriV”组成(单拷贝的F-因子复制子“ori2”和高拷贝的复制原子“oriV”的核苷酸序列可参考有关文献，譬如：Wild，j.et al.，Genomic Research，2002)；它们也可以从商业化的载体CopyControl^TM pCC1BAC^TM通过酶切(Sal I)得到。

所述的多拷贝高效细菌DNA复制起始子导入到杆状病毒基因组的几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶两个基因中的方法包括：

(1)、构建含有高拷贝复制子基因并且两端分别有cat基因和chi基因同源臂的打靶载体：

用Sal I酶切CopyControl^TM pCC1BAC^TM载体，回收片段与pUC19-Bm-chi-cat和pUC19-Ac-chi-cat的Sal I酶切产物进行连接，即得打靶载体；

(2)、将所构建的打靶载体与杆状病毒基因组进行同源重组：

将所述打靶载体和杆状病毒DNA导入带有red重组酶的BW25113(ΔaraBAD567)感受态细胞中，chi和cat分别与基因组上对应的同源序列重组，从而将大质粒DNA高拷贝细菌DNA复制子及控制元件pCC载体整合到基因组上，同时敲除chi和cat两个基因，通过插入的氯霉素抗性筛选标记进行筛选得到具有氯霉素抗性的菌株，即得。

所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV；优选为BmNPV或AcMNPV。

本发明同时用抗生素基因破坏杆状病毒穿梭质粒多角体基因下游的病毒复制的必须基因，这样得到的杆状病毒质粒DNA只能在大肠杆菌中可以进行复制，而在昆虫细胞或昆虫体内只能和携带外源目的表达基因并且含有完整的多角体基因下游病毒复制的必须基因的转移载体发生重组后才能进行复制。

其中，所述的抗生素基因优选为四环素抗性基因；所述的杆状病毒多角体基因下游的病毒复制必须基因是ORF1629基因(SEQ ID No.40；Genbank：L33180)。

本发明利用反向选择标志基因(优选为RPSL-NEO基因)替换杆状病毒基因组中的P10、P74、P26、egt等重组病毒复制的非必须蛋白基因；P10、P74、P26、egt等基因是重组病毒复制的非必须的蛋白基因，其中，P10基因亦是一个晚晚期基因，它的表达量仅次于多角体蛋白，它的大量表达影响了BV生成。然而P10是一个强启动子，它能很好的驱动外源基因的表达。本发明所述的反向选择标志基因优选为RPSL-NEO，RPSL-NEO是具有卡那霉素抗性基因和链霉素抗性抑制基因的片段，含有RPSL-NEO片段的重组杆状病毒质粒的细菌，具有卡那霉素抗性，而链霉素抗性丧失；当用P10启动的另一个外源目的基因替代RPSL-NEO后，相应的重组杆状病毒质粒的细菌回复了链霉素抗性，而丧失了卡那霉素抗性，这样能很方便地获得多基因的在同一个杆状病毒中的表达。按同样的方法，只要在不影响杆状病毒BV复制的区段，RPSL-NEO基因可继续在P74、P26、egt等基因处进行替换，再用另外的外源目的基因表达盒替代杆状病毒穿梭质粒中的反向选择标志基因，可实现更多外源目的基因的同时表达。

本发明将其中所构建的一个昆虫生物反应器(杆状病毒穿梭质粒)reBm-dcc-d1629-d10提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.4914；分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；保藏时间是2011年5月26日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所要解决的另一个技术问题是将所构建的昆虫生物反应器应用于表达1个或多个外源目的基因；

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种应用所构建的昆虫生物反应器表达一个或多个外源目的基因的方法，包括：

将需要表达的外源目的表达基因克隆到含有多角体基因下游的病毒复制的必须基因同源臂的转移载体中(例如，可以是pVL1393载体)，该转移载体含有完整的杆状病毒复制的必须基因，得到含有外源目的基因的打靶载体；将所构建的打靶载体与昆虫杆状病毒生物反应器进行同源重组，替换昆虫杆状病毒生物反应器中的抗生素基因，获得在宿主昆虫或昆虫细胞内进行复制和表达的含外源基因的杆状病毒穿梭质粒，将所述杆状病毒穿梭质粒在宿主昆虫或昆虫细胞中表达。

为了实现在一个昆虫生物反应器中表达多个外源目的基因的目的，可以采用以下步骤：

构建有待表达的外源目的基因表达盒，该表达盒含有病毒多角体基因下游的病毒复制的非必须基因同源臂；将有待表达的外源目的基因表达盒替代杆状病毒穿梭质粒中的反向选择标志基因，获得重组病毒，诱导重组病毒在宿主昆虫或昆虫细胞中表达；或者继续用反向选择标志基因(RPSL-NEO基因)替换所构建的含外源目的基因的杆状病毒穿梭质粒的P74、P26、egt等基因，再依次用另一个有待表达的外源目的基因表达盒替代杆状病毒穿梭质粒中的反向选择标志基因，可实现多个外源目的基因在同一昆虫杆状病毒生物反应器中的同时高效表达。

所述宿主昆虫包括昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等。

所述的昆虫细胞包括Sf-9，Sf-21，Hi5，S2，Bm5，BmN或Tn细胞。

本发明的一个最优选的技术方案的概述：

本发明用Sal I酶切CopyControl^TM pCC1BAC^TM载体，回收片段与pUC19-Bm-chi-cat和pUC19-Ac-chi-cat的Sal I酶切产物进行连接，得到打靶载体；

将打靶载体与杆状病毒BmNPV或AcMNPV的基因组进行同源重组，从而将大质粒DNA高拷贝细菌DNA复制子及控制元件pCC载体整合到基因组上，同时敲除chi和cat两个基因，通过插入的氯霉素抗性筛选标记进行筛选得到具有氯霉素抗性的BmBacmid或AcBacmid；用抗生素基因将BmBacmid或AcBacmid中ORF1629基因的缺失；将反向选择标记基因导入到BmBacmid和AcBacmid中的P10基因位点。

本发明将荧光素酶基因克隆到含有多角体基因下游的病毒复制的必须基因ORF1629基因的同源臂的载体上，得到打靶载体；与含有抗生素基因的BmBacmid或AcBacmid进行重组，替换了BmBacmid或AcBacmid中的抗生素基因，得到了BmBacmid-luc或AcBacmid-luc；再将半乳糖苷酶基因替代BmBacmid-luc或AcBacmid-luc中的反向选择标记基因，得到了重组病毒；将该重组病毒在家蚕或Sf细胞中进行表达，表达结果证明，荧光素酶基因和半乳糖苷酶基因都同时在所构建的昆虫杆状病毒生物反应器中实现了高表达，说明本发明所构建的昆虫杆状病毒生物反应器可以高效、同时表达1个或多个外源目的基因。

附图说明

图1 融合PCR反应示意图。

图2 重组Bacmid的PCR检测结果。

图3 chi片段敲除的测序结果。

图4 cat片段敲除的测序结果。

图5 BmBacmid和AcBacmid诱导培养结果。

图6 p P10载体骨架示意图。

图7 含有荧光素酶基因的pGL3-Basic载体图谱。

图8 含有ORF1629同源臂的pVL1393载体示图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1，菌株、病毒株与载体大肠杆菌株：BmNPV，AcNPV，运载载体pVL1393、pBm035，家蚕细胞BmN、Bm-5和Sf-21细胞均购自Invitrogen公司或日本Riken BRC；大肠杆菌(Top10，DH10B等为本实验室保存)，pGL-3载体、荧光素酶试剂盒Luciferase Assay System购自Promega，反向筛选标记RPSL-NEO按GENBANK号：GU084141.1合成；CopyControl^TM pCC1BAC^TM载体购自公司(Madison，USA)；pMD-18T载体和pMD-18T-simple载体(TaKaRa公司)，含重组酶的BW25113/pKD46，DH5alpha/pCP20购自Depart of MCD biology 830KBT，耶鲁大学。

2，酶与试剂：限制性内切酶、连接酶为Promega公司产品。

3，生化试剂：IPTG、X-Gal、SDS为Sigma公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T₄ DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、细胞培养基TC-100、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司。

4，培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；昆虫细胞培养基为TC-100。

5，所用引物：

表1 实验中所用引物

实验例1 含高拷贝复制起始子的杆状病毒质粒构建

1实验方法

构建含有高拷贝复制子基因并且两端分别有cat基因和chi基因同源臂的打靶载体。

1.1.有关溶液和培养基的配置(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯et al.，精编分子生物学指南，1998)

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS(现配现用)。

溶液III：100mL体系，5mol/L醋酸钾80mL，冰乙酸12mL，ddH₂O8mL。TAE(50×)：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，无菌水定容至1000mL。

TER溶液：胰RNAse(RNAse A)溶解于10mM Tris-HCl、15mMNaCl中，配成10mg/mL的储存液-20℃冻存，再用1×TE buf稀释成20μg/mL的工作液，4℃保存。

PPt缓冲液：异丙醇22mL；5mol/mL KAc 1mL；ddw 2mL。

PEG溶液：称取一定质量的NaCl，配成1.6M的盐溶液，加入一定量的PEG，使其终浓度为13％。

6mol/L NaI：将0.75g Na₂SO₃溶于40mL ddH₂O中，加入45gNaI并搅拌至完全溶解，4℃储存。

玻璃奶(Glassmilk)：将10g(100mg/mL，Sigma S-5631)的Silica溶于100mL PBS中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2～3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI中，终浓度为100mg/mL，4℃下避光保存。

New Wash洗液：Tris-HCl(pH 7.4)20mmol/L；EDTA 1mmol/L；NaCl 100mmol/L；与等体积的无水乙醇配制而成。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值到7.0(固体培养基含1.5％琼脂)。

蛋白上样缓冲液(2×)：100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4％SDS、0.2％溴酚蓝、10％甘油。

30％丙烯酰胺溶液29g：丙烯酰胺，1gN，N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL水，过滤。

考马斯亮蓝染液：0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)和10mL冰乙酸中。

脱色液：10％冰乙酸。

1.2病毒DNA的提取(BmNPV或AcNPV)(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002)

(1)收集病虫尸体，充分腐烂之后，加入0.1％SDS，1000rpm，10min，弃上清，加水，重悬，1000rpm，10min，反复离心至沉淀变成粉白，即为多角体。

(2)取火柴头大小的上述沉淀于1.5mlEppendorf管，加入碱性裂解液750μL，冰浴1.5h。

(3)加入35％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkorsel)至终浓度1％，混匀，冰浴10min。

(4)10,000rpm，2min，取上清。

(5)等体积Tris饱和酚抽提一次。

(6)等体积氯仿抽提一次。

(7)加入2倍体积无水乙醇，-20℃，30min。

(8)12,000rpm，5min，弃上清。

(9)800μL 70％乙醇洗涤一次

(10)100μL 0.1×TE溶解沉淀

1.3融合PCR引物的设计与合成

设计合成表1中所列的引物来对chi基因和cat基因进行融合PCR，引物设计如表1中所示。

1.4融合PCR合成含有两基因的同源臂序列

1.4.1融合PCR第一步扩增反应

如图1所示，先用AcNPV-Chi-F和AcNPV-Chi-R；AcNPV-Cat-F和AcNPV-Cat-R；

BmNPV-Chi-F和BmNPV-Chi-R；BmNPV-Cat-F和BmNPV-Cat-R；

共四对引物，分别对BmNPV或AcNPV于50μL体系中进行PCR扩增，反应体系如下。

1.4.2玻璃奶法纯化回收PCR产物(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯et al.，精编分子生物学指南，1998)

(1)PCR产物用普通凝胶进行电泳后，切下所需目的大小的DNA条带，放入Eppendorf管中后称重；

(2)加入3倍体积(v/w)的6mol/LNaI溶液，65℃下使凝胶充分溶解；

(3)再加入10μL玻璃奶吸附DNA，混匀后室温下放置5min；10000rpm稍离心，达到转速即可，去上清；

(4)沉淀用New Wash洗液洗涤三次，10000rpm重复离心，前两次达到转速即可，最后一次离心2min，37℃晾干；

(5)用10μL0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清，将DNA保存于-20℃备用。凝胶电泳检测回收效果。

1.4.3融合PCR第二步扩增反应

分别取5μL的chi，cat的回收产物，混合，加入Taq酶buffer，dNTP，Taq酶，并用ddH₂O补足20μL体积，PCR延伸11个循环(95℃，15s，60℃，20s，72℃，40s)。

1.4.4融合PCR第三步扩增反应

取以上步产物1μL为模板，分别以AcNPV-Chi-F和AcNPV-Cat-R、BmNPV-Chi-F和BmNPV-Cat-R为引物，50μL体系PCR扩增，得到一段同时包含chi及cat的序列，两端随着引物而分别带EcoRI，HindIII两个酶切位点，玻璃奶法回收得到PCR产物。

1.5 PCR产物连接pMD18T(TaKaRa)载体

连接体系：

pMD18T载体 0.5μL

Solution I 3μL

目的DNA 2.5μL

混匀后，16℃连接过夜，连接产物用于转化TOP10感受态。

1.6连接产物的转化

1.6.1感受态的制备(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002)

感受态细胞的小量制备

(1)-80℃冻藏的TOP10甘油菌在LB平板上复苏；

(2)用灭菌牙签挑取单菌落，放入4mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取100μL过夜培养物接种到另一4mL LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5h，使OD值在0.6左右；

(3)5,000g离心4min收集菌体，将菌体重悬于800μL75mmol/L冷CaCl₂中，冰浴30min，；

(4)5,000g离心4min，弃上清，加入200μL75mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放2h后用于转化。

感受态细胞的大量制备

(1)-80℃冻藏的TOP10甘油菌在LB平板上复苏；

(2)挑取单菌落(直径约2～3mm)，放入4mL LB培养基中(不含Amp)，另外挑一个放入加有Amp的LB培养基中，37℃振荡培养8h；在前者生长后者不生张说明没有污染。前者取1mL接种100mL新鲜的LB液体培养基，37℃振荡培养2～3h；

(3)培养物收集在灭菌的离心管中，5,000r/min 4℃离心5min，将菌体重悬于20～30mL75mmol/L的预冷CaCl₂溶液中，冰浴30min；

(4)5,000r/min低温离心5min，弃上清，加入10mL含10％甘油的75mmol/L冷CaCl₂溶液，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放3～4h后分装小管，-80℃冻存。

1.6.2连接产物转化(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯et al.，精编分子生物学指南，1998)

(1)质粒DNA20～100ng或连接混合物3μL加到100μL上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)进行热休克(42℃保温90s)，迅速置冰上1～2min，加入1mL已温育至37℃的LB培养基，37℃振荡培养1h，

(3)稍离心，去部分上清后重悬沉淀，涂布于数个含相应抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

1.7重组质粒的鉴定

细胞破碎法快速鉴定

重组后的质粒与原来的质粒分子量有一定差别时可用此法检出重组子(Beuken，etal.，Biotechniques，72：3827-3836，1998)。

(1)分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取300～500μL菌液于Eppendorf管中，12,000g离心10sec，弃上清，加入30μL缓冲液(6％蔗糖，0.1％溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1∶1)，充分振荡将菌体弹起；

(3)12,000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。

重组质粒的进一步酶切鉴定(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯et al.，精编分子生物学指南，1998)

(1)普通质粒DNA的提取

A.取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000g离心5min收集菌体，弃上清；

B.用150μLSol I悬浮沉淀，冰上放置5min；

C.加300μLSol II和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；

D.加450μLSolIII，剧烈混匀后冰浴5-10min；

E.4℃12,000g离心10min，取上清，加450μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；

F.12,000g离心10min，弃上清，沉淀溶于250μLTER(含20μg/mLRNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μLPPt沉淀Buffer，混匀后置4℃20min；

G.12,000g离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用40μL0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

(2)Bacmid质粒DNA的提取

A.取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000rpm离心5min收集菌体，弃上清；

B.用150μLSol I悬浮沉淀，冰上放置5min；

C.加300μLSol II和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；

D.加450μLSolIII，轻轻混匀后冰浴5-10min；

E.4℃12,000rpm离心10min，取上清，加450μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；

F.12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于250μLTER(含20μg/mLRNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μLPPt沉淀Buffer，混匀后置4℃20min；

G.12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于500μL ddH₂O中，加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀；

H.12,000rpm离心10min，取上层水相于新的Eppendorf管内，再加入等体积的酚氯仿(1∶1体积的酚和氯仿的混合液)，颠倒混匀；

I.12,000rpm离心10min，取上层水相于新的Eppendorf管内，再加入等体积的氯仿，颠倒混匀；

J.12,000rpm离心10min，去上层水相于心的Eppendorf管内，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，冰置10min；

K.12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用100μL0.1×TE(pH8.0)溶解，再加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，冰置10min，离心出沉淀，-20℃保存备用。

(3)重组质粒的酶切鉴定后

本实验选用的是pMD18T克隆载体，选取连接位点两端各一个酶切位点进行双酶切，即可进行鉴定。

鉴定体系如下：

10×Buffer H 1.5μL 重组质粒 2.0μL

酶 0.5μL ddH₂O 11μL

37℃酶切1～2h，加Marker作为参考标准，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

若两种酶的buffer不同则先用单酶切1～2h，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，去掉上清再进行第二个酶切。

1.8融合同源臂片段连接pUC19载体

用前面所设计的引物(AcNPV-Chi-F、AcNPV-Chi-R、AcNPV-Cat-F、AcNPV-Cat-R、BmNPV-Chi-F、BmNPV-Chi-R、BmNPV-Cat-F、BmNPV-Cat-R)上的酶切位点EcoRI和HindIII对上述质粒DNA进行双酶切(方法同上)，回收酶切目的产物，连接到用同样的酶切之后的pUC19载体上，检测得到目的质粒DNApUC19-Bm-chi-cat和pUC19-Ac-chi-cat，在同源臂片段中间有各有一个Sal I酶切位点，用以引入高拷贝复制子基因。

1.9高拷贝复制子位点引入

本发明的高拷贝复制子来自CopyControl^TM pCC1BAC^TM载体，其上含有：

A，两个复制起子：单拷贝的F-因子复制子“ori2”和高拷贝的复制原子“oriV”。其中oriV可以被诱导从而使PCC载体的拷贝数增加到10-20拷贝。

B，氯霉素抗性(Chl R)，lac Z α片段作为筛选标记。

C，多克隆限制酶切位点。

D，噬菌体P1的lox位点，供Cre重组酶识别和切割。Cos噬菌体识别位点，便于噬菌体包装。

E，parA，parB，parC三个维持质粒稳定性的元件。

pCC具有三个Sal I酶切位点，分别位于365，645，7651bp处。因此，Sal I酶切之后，能够得到7.1kb的片段，含有chlR，ori2，oriV，parA，parB，parC等元件，因为不进行噬菌体相关操作，所以Cos，loxP为非必需元件。因此，用Sal I酶切CopyControl^TM pCC1BAC^TM载体，回收7.1kb的片段与pUC19-Bm-chi-cat和pUC19-Ac-chi-cat的Sal I酶切产物利用T₄连接酶进行连接，连接体系如下：

用T₄ DNA连接酶将胶回收的pCC高拷贝复制子基因和pUC19载体酶切产物连接。连接体系如下：

混匀后，16℃连接过夜，连接产物用于转化TOP10感受态。

转化检测正确后得到含有高拷贝复制起始子的打靶载体质粒pCC-Bm-chi-cat和pCC-Ac-chi-cat。

实验例2将高拷贝复制子导入家蚕BmNPV和AcNPV基因组得BmBacmid和AcBacmid

2.1含有red重组酶的大肠杆菌BW25113的电激感受态的制备

red重组酶基因存在于BW25113菌株中的PKD46质粒上，此质粒上有repA101(ts)基因，在37℃条件下培养会丢失质粒，这里含有PKD46质粒的大肠杆菌于30℃条件下培养，并且red重组酶基因是在L-阿拉伯糖诱导下表达，因此，此电激感受态的制备过程如下：

(1)用灭菌牙签挑取单克隆菌落，接种到4ml LB液体培养基中37℃，250rpm，过夜摇动培养。

(2)上述菌液以1∶100接种到400ml LB液体培养基中，37℃，250rpm，摇动培养约1.5-2h至菌液OD600值达到0.3左右，加入L-阿拉伯糖至终浓度为10mM。

(3)37℃，250rpm，诱导培养1h。

(4)将菌液在冰上，预冷5min，后转移到400ml预冷的离心杯中，4℃，7000rpm，1min。

(5)弃上清，离心杯中加入少量ddH₂O，用移液器头吹打，使沉淀悬浮，再将ddH₂O补加至约400ml，4℃，9,000rpm，1min。

(6)弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将ddH₂O补加至约400ml，4℃，10,000rpm，1min。

(7)弃上清，加入少量预冷的10％甘油，重悬菌体，再补加10％甘油至40ml，4℃11,000rpm，1.5min。

(8)弃上清，加入1ml 10％的甘油，悬浮沉淀，80ul/管分装于1.5ml的离心管。

2.2酶切获得线性打靶片段

将打靶载体pCC-Bm-chi-cat和pCC-Ac-chi-cat分别用EcoR I和Hind III双酶切，回收大小为7.9kb，含有大质粒DNA高拷贝复制子及控制元件，AcNPV或BmNPV的chi及cat同源臂的同源片段。

2.3电激转化获得重组Bacmid

将上述片段和家蚕核型多角体病毒DNA导入带有red重组酶的BW25113(ΔaraBAD567)感受态细胞中，chi和cat分别与基因组上对应的同源序列重组，从而将大质粒DNA高拷贝复制子及控制元件pCC载体整合到基因组上，同时敲除chi和cat两个基因，通过插入的氯霉素抗性筛选标记进行筛选得到具有氯霉素抗性的菌株。

电激转化过程如下(Joseph et al.，分子克隆实验指南第三版，2002)：

(1)取1μg打靶载体线性化片段，2μg病毒DNA(AcNPV或BmNPV) 与感受态细胞混匀，转移到0.1CM预冷的电极杯中，冰上2min。

(2)打开电转仪，调节电压为1.3KV，电阻200Ω，电容25μF。

(3)迅速擦净电极杯外壁的水珠，推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，迅速加入1mlLB液体培养基至向电击杯中，用微量移液器重悬细胞后，转移到1.5ml的Eppendorf管中。

(4)30℃，200rpm，复苏2小时。

(5)500rpm，3min，弃部分上清，重悬，涂板(含有对应抗生素)，37℃温箱，倒置过夜培养，次日查看转化结果。

2.4重组Bacmid的检测

2.4.1快速PCR检测

重组后的Bacmid应该含有外源的高拷贝复制子基因，设计引物，上下游引物分别位于一个同源臂的外侧和内侧，外侧引物位于NPV上非重组部分，内侧引物位于外源基因上，如果PCR有产物，则表示重组成功。

如图2所示，用前述两对引物可以分别扩增出cat基因和chi基因的同源臂部分，初步检测为重组成功。

将上述PCR产物分别进行测序，结果如图3所示。图3中红色方框标注处为Sal I序列，SalI左侧为BmNPV的序列，右侧为pCC载体序列；图3中蓝色框中为引物Bm-chi-F的序列，即打靶载体中chi片段的末端，蓝色框左侧为为BmNPV的序列，蓝色箭头即为打靶载体插入相应的BmNPV和AcNPV病毒基因组的位置。

cat片段敲除的测序结果如图4所示，图4中红色方框标注为Sal I序列，Sal I左侧为pCC载体的序列，右侧BmNPV序列。图4中蓝色框中为引物Bm-cat-R的序列，即打靶载体中cat片段的末端，蓝色框右侧为BmNPV的序列，蓝色箭头即为打靶载体插入基因组的位置。

2.4.2诱导培养检测

根据此高拷贝复制子的作用，将PCR验证后正确的菌株进行诱导培养，提取质粒，通过质粒浓度验证高拷贝复制子在诱导中的复制情况，诱导方法为：挑取单菌落在4mL含有氯霉素的液体LB培养基中，37℃250rpm培养过夜，取1mL菌液加入到3mL液体LB培养基中，加入氯霉素，并加入L-阿拉伯糖至浓度为10mM，37℃250rpm诱导培养2h，提取质粒，观测结果。

根据图5所示，1和2为未诱导培养的BmBacmid和AcBacmid，诱1和诱2为L-阿拉伯糖诱导培养的BmBacmid和AcBacmid。经过紫外分光光度计检测，可以看出诱导后的质粒量为诱导前的5-10倍。

实验3 BmBacmid和AcBacmid中ORF1629基因的缺失

3.1 ORF1629打靶载体的构建

通过设计ORF1629和其相邻多角体基因(phd)上的一段序列为重组同源臂，通过融合PCR的方法(见实验例1)扩增并在两同源臂中引入四环素抗性基因(来自pMON7124质粒)作为筛选标记。

如表2中所示，通过两次PCR，扩增一段同时含有phd及ORF1629的片段，同源片段之间人为加上一个Xho I酶切位点，引物序列见表1。

表2 ORF1629打靶载体融合PCR

扩增之后，连接pMD18-T Simple Vector载体，转化测序验证后得到含有同源臂的质粒pMD18-T-Bm-PHD-1629及pMD18-T-Ac-PHD-1629。

3.2抗性筛选基因的导入

选用四环素抗性为筛选抗性基因，此抗性基因从pMON7124上扩增，所用的引物为tetF和tetR(引物详细序列见表1)。扩增的抗生素基因经测序验证，再用Xho I酶切，连接pMD18-T-Ac-PHD-1629及pMD18-T-Bm-PHD-1629得到：pMD18T-Ac-phd-1629-tet和pMD18T-Bm-phd-1629-tet。

3.3电激转化重组ORF1629

将上述载体用Pst I和EcoR I双酶切，分离2.3kb的片段，电激转化(见实验例2)含有red重组酶，reBm-dcc(实验例2中构建好的BmBacmid)或reAc-dcc(实验例2中构建好的AcBacmid)的BW25113菌株，再通过四环素抗性筛选，得到重组体。

3.4检测重组产物

用PCR验证方法验证(见实验例2)正确后得到ORF1629缺失的reBm-dcc-d1629和reAc-dcc-d1629两穿梭质粒。

检测引物如下表3：

表3 ORF1629敲除验证引物

			预期产物(bp)
				AcNPV	re1629-1F	reAc1629-1R	1079
BmNPV	re1629-1F	reBm1629-1R	1074

实验例4 反向选择标记基因导入BmBacmid和AcBacmid中的P10基因位点

P10基因的启动子为高效启动子，适合表达外源蛋白，因此这里通过反向选择的方法构建P10基因缺失并含有反向标记基因的BmBacmid和AcBacmid。

4.1 P10基因敲除载体合成

合成具有P10基因同源臂和中间含有多克隆酶切位点的p P10载体骨架，P10载体骨架由三部分组成(图6所示)；图6中，两侧黑色部分为酶切位点，用于基因在T载体上的切出，上下游分别为EcoRV、BstXI、HindIII和Sal I、Spe I、Cla I酶切位点，白色部分为P10基因同源臂，中间绿色部分为多克隆酶切位点替换了p10编码序列(SEQNo.38)，用于rpsL-neo基因以及外源基因的插入，此p P10载体骨架克隆于pUC57-simple载体。

4.2反向选择标记基因导入敲除载体

本发明用到的反向选择标记基因为rpsL-neo，其具有反向选择标记的原理是这段基因中含有卡那霉素抗性基因和链霉素抗性抑制基因，将此基因导入到Bacmid中并转化在特定的大肠杆菌株系(有链霉素抗性的Top10，DH10B等株系)后，会使得大肠杆菌获得卡那霉素抗性并抑制其本身的链霉素抗性，而用外源基因通过重组的方法把此标记基因替换后，菌株的链霉素抗性恢复并且卡那霉素抗性消失，从而达到在大肠杆菌中重组后的抗性筛选。

用上下游引物rpsL-neo-U和rpsL-neo-L扩增rpsL-neo基因并克隆到pMD-18-T载体上，构建出rpsL-neo-T载体，利用载体上下游的酶切位点Sal I和BamH I将rpsL-neo切下回收1.5kb左右的片段，同时将含有PP10载体的pUC57-simple载体用Xho I和BamH I的酶切分别形成双酶切粘性末端(PP10上的Xho I和BamH I酶切位点唯一并且位于中间多克隆酶切位点部分)，用T₄连接酶将切出的rpsL-neo连接到PP10上，通过卡那霉素抗性基因筛选目的菌株，用引物PP10-50R和PP10-50L进行PCR检测，得到1.5kb左右的产物，验证正确后得到PP10-neo-T敲除载体。

4.3电激转化重组替换P10基因

提取PP10-neo-T质粒，用HindIII和Sal I双酶切回收2.1kb片段，电激转化(见实验二)进含有red重组酶和BmBacmid(reBm-dcc-d1629)或AcBacmid(reAc-dcc-d1629)的BW25113菌株，筛选含有卡那霉素抗性基因的菌株。

4.4检测重组产物

分别对得到的质粒进行进行重组后两个同源臂片段的PCR检测(见实验例2)，引物分别为：

reBm-P10S-L和re-P10S-R；re-P10X-L和reBm-P10X-R；reAc-P10S-L和re-P10S-R；

re-P10X-L和reAc-P10X-R

验证正确后得到含有反向选择标记的BmBacmid(reBm-dcc-d1629-d10)和AcBacmid(reAc-dcc-d1629-d10)。本发明将BmBacmid(reBm-dcc-d1629-d10)提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是其微生物保藏号是：CGMCC No.4914。

实验例5 荧光素酶基因和家蚕β-半乳糖苷酶基因利用BmBacmid(reBm-dcc-d1629-d10)或AcBacmid(reAc-dcc-d1629-d10)在宿主中进行表达

5.1荧光素酶基因在BmBacmid(reBm-dcc-d1629-d10)或AcBacmid(reAc-dcc-d1629-d10)中的表达

在实验例3中，ORF1629被敲除的BmBacmid或AcBacmid不能在家蚕中复制表达成为多角体病毒，只有将ORF1629再次重组到BmBacmid和AcBacmid上面才能正常复制表达，称为失活拯救，这里荧光素酶基因就是要在含有ORF1629同源臂的载体中重组到BmBacmid和AcBacmid上面来表达同时检测验证1629的失活拯救。

5.1.1荧光素酶基因克隆到pVL1393载体上

(1)含有荧光素酶基因的载体pGL3-Basic载体图谱见图7，此载体上的luc+即是荧光素酶基因。

(2)含有ORF1629同源臂的pVL1393载体图谱见图8，其主要元件如下：

上游同源臂为Recombination sequence(ORF603+)：bases 1-3997，多角体上游启动子为Polyhedrin promoter：bases 3998-4092，多角体基因为Polyhedrin gene：bases 4093-4738，多克隆位点为Multiple cloning site：bases 4128-4179，下游同源臂为Recombination sequence(ORF1629+)：bases 4738-7002，大肠杆菌复制起始位点为ColE1 origin：bases 8029-7356，抗性筛选基因为氨苄霉素抗性基因Ampicillin resistance gene：bases 8965-8177。

(3)分析酶切位点，用Bgl II和Xba I酶切pGL3-Basic质粒，回收1.7kb大小的片段，得到荧光素酶基因片段，用BamH I和Xba I酶切pVL1393质粒，得到含有与荧光素酶基因片段粘性末端互补的载体，将上述回收片段和载体连接转化到大肠杆菌Top10感受态中，用氨苄霉素抗性筛选阳性克隆。

(4)取上述阳性克隆提取质粒，用Hind III和Xba I酶切鉴定，应该得到1.7kb和9.6kb的片段，验证正确后得到含有荧光素酶基因且上下游为Bacmid的同源重组臂的质粒pVL1393-luc。

5.1.2荧光素酶基因的病毒重组和BmBacmid/AcBacmid共转染家蚕细胞

将pVL1393-luc质粒分别同reBm-dcc-d1629或reAc-dcc-d1629DNA用脂质体包埋共转染家蚕细胞和Sf-29细胞

接种约0.5～1×10⁶Bm-N细胞于15cm²培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入上述reBm-dcc-d1629的DNA1μg，pVL1393-luc质粒DNA 2ug，脂质体5uL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4～6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4～5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组病毒的筛选和表达。

接种约0.5～1×10⁶Sf-29细胞于15cm²培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入上述reAc-dcc-d1629的DNA1μg，pVL1393-luc质粒DNA 2ug，脂质体5uL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4～6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4～5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组病毒的筛选和表达。

5.1.3重组病毒的筛选、纯化和扩增

接种适量Bm或Sf细胞(平皿底部面积的80％)于35mm小dish中，27℃培养16h至细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清液按10^-3～10^-5作适当稀释后，取1mL稀释液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与等体积经40℃预热的2X TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150μg/mL，沿小dish边缘将胶慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养4～7d。显微镜下选取无色重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于400μL TC-100培养基中，4℃放置4h使病毒粒子释放出来，取100μL病毒液感染24孔板中的细胞，27℃培养3d后，取150uL感染细胞上清按碱变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PC R扩增分析。发现24个斑的病毒都为含荧光素酶基因的重组病毒BmBacmid-luc或AcBacmid-luc，将能扩增出目的片段的病毒上清液铺斑进行第一次筛选。最终获得含目的基因的重组病毒。分别取100pL重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮起后，4℃保存，用以注射。

5.1.4重组病毒在家蚕中的表达以及荧光素酶检测

将上述24个重组病毒BmBacmid-luc培养液按10⁵pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光强度以确定重组情况，操作过程为取蚕血裂解液15μL加入到0.5mL离心管中，再加入荧光素酶底物反应液15μL迅速混匀于光量子仪中读数。

24个重组病毒BmBacmid-luc荧光素酶平均结果为8700000单位，说明荧光素酶基因重组成功，并且表达量很高。

将上述其中的12个重组病毒AcBacmid-luc培养液按10⁵pfu感染Sf细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光强度以确定重组情况，操作过程为取细胞裂解液15μL加入到0.5mL离心管中，再加入荧光素酶底物反应液15μL迅速混匀于光量子仪中读数。

12个重组病毒AcBacmid-luc荧光素酶平均结果为65000单位，说明荧光素酶基因重组成功，并且表达量比较高。

5.2 β-半乳糖苷酶在BmBacmid-luc或AcBacmid-luc上P10基因位点的表达。

5.2.1 β-半乳糖苷酶基因BmGal的获得

这里用到的β-半乳糖苷酶基因为家蚕幼虫中扩增到家蚕肌β-半乳糖苷酶基因BmGal(Bombyx mori β-galactosidase)。

5.2.1.1 Trizol法提取RNA

(1)将样品组织放入盛有Trizol(50～100mg组织/1mL)的玻璃匀浆器中匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10％。

(2)将匀浆液在室温下放置5min以使核蛋白质复合体完全裂解。

(3)加入氯仿(0.2mL/1mlLTrizol)，盖紧管盖并漩涡剧烈震荡15sec；室温放置2～15min。

(4)4℃，12000rpm离心15min。随着离心，混合液被分为三相：处于下层的浅红色酚-氯仿有机相、间相和上层无色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白质则存留于间相和有机相中，水相体积约为用于匀浆的Trizol体积的60％。

(5)将水相移入新管，加异丙醇(0.5mL/1mLTrizol)；室温放置5～10min。

(6)4～25℃，12000rpm离心8min。RNA沉淀(离心前通常看不到)在管壁或管底形成胶状的或白色的小球。

(7)弃上清，用1mL75％乙醇清洗RNA沉淀；然后4～25℃，7500rpm离心5min。

(8)弃上清，干燥；沉淀重溶于30μL DEPC处理的双蒸水(ddH₂O)或去离子甲酰胺中。-80℃保存备用。若沉淀难溶，可用吸管吹打数次并55～60℃温育10～15min。

5.2.1.2 cDNA第一链的合成

(1)取2μl RNA(≤1μg)+2μl Oligo d(T)20V(0.5μg)+13.75μl DEPC处理水；70℃，5min，迅速置冰上5min。

(2)加入5μl 5×M-MLV buffer+1.25μl 10mM dNTP+1μl M-MLV-RT(200U)，使终体积为25μl。

(3)混匀后室温放置10min。

(4)42℃反应1h。

(5)70℃ 2min灭活RTase，-20℃保存备用。

5.2.1.3 PCR获得完整的ORF序列

根据电子克隆初步确定的家蚕肌β-半乳糖苷酶基因的的ORF序列设计上游引物P1和下游引物P2，分别包含BamH I酶切位点、起始密码子ATG和Hind III酶切位点、终止密码子TAG

以5.2.1.2中合成的家蚕幼虫期睾丸cDNA第一链为模板，用所设计的引物P1和P2扩增特异性片段。

PCR反应体系为：

PCR的反应程序为：

5.2.1.4 cDNA末端快速扩增3’RACE(SMART-RACE cDNA amplification kit，Clontech)

A.混合3’RACE cDNA反应体系。1μg总RNA和1μl 5’CDS primer。用ddH2O补充至终体积为5μl。

B.将上述体系混合均匀后稍离心，70℃水浴2min。

C.管中加入以下成分：2μl 5×第1链缓冲液，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)和1μl PowerScript Reverse Transcriptase，终体积为10μl。

D.混合均匀后稍离心，42℃反应1.5h。

E.用Tricine-EDTA buffer稀释所得的第一链cDNA。如果使用的Total RNA＜200ng，加20μl；若＞200ng，加100μl；如果用poly A+RNA作为模板，则加250μl。

F.72℃放置7min灭活反转录酶。

G.-20℃长期保存(三个月)。

H.用特异性引物和试剂盒中的公用引物进行嵌套PCR扩增目的基因。

I.扩增所得片段回收后克隆并测序。

以上步骤参照《SMART^TM RACE cDNA Amplification KitUser Manual》进行。

根据拼接到得靠近乳糖酶基因3’的cDNA片段，设计如下两对特异性引物：race-U、race-L(序列见表1)，按照上面的步骤，进行3’RACE扩增，最终得到此基因ORF的PCR产物。

5.2.1.5 BmGal基因的测序检测

将上述扩增得到的基因连接到pMD18T载体上(方法见实验例1)，转化筛选连接成功的质粒转化菌株，测序得到正确的含有目的基因的载体。基因序列见SEQ IDNo.39。

5.2.2含有β-半乳糖苷酶打靶载体的构建

用下列引物Gal-U和Gal-L对5.2.1中构建的的含有BmGal基因的载体进行扩增，得到两端含有BamH I和EcoR I粘性末端的PCR产物，连接到pMD18T载体上，再用上述两种酶对质粒DNA进行双酶切，回收目的条带，连接到用BamH I和EcoR I双酶切的PP10载体上，转化到大肠杆菌中，筛选出连接成功的产物含有β-半乳糖苷酶打靶载体BmGal-PP10。

5.2.3 β-半乳糖苷酶基因的重组

将上述打靶载体用相应酶切得到打靶片段，将片段电激转化(见实验例2)到含有red重组酶和BmBacmid-luc或AcBacmid-luc质粒的大肠杆菌DH10B感受态中，由于重组后β-半乳糖苷酶基因会替代具有链霉素抗性抑制基因的rpsL-neo片段，所以转化重组成功后的菌株应该具有链霉素抗性，筛选后同样对产物进行PCR检测(见实验例2)，检测用引物如下：

reBm-P10S-L和re-GalS-R；re-GalX-L和reBm-P10X-R；reAc-P10S-L和re-GalS-R；

re-GalX-L和reAc-P10X-R；

检测正确后得到含有β-半乳糖苷酶基因的BmBacmid-luc-gal和AcBacmid-luc-gal。

5.2.4含β-半乳糖苷酶基因的BmBacmid-luc-gal/AcBacmid-luc-gal感染家蚕细胞或Sf细胞并筛选重组病毒

如5.1.3和5.1.4中所述，用同样的方法将上述含有β-半乳糖苷酶基因的BmBacmid-luc-gal/AcBacmid-luc-gal DNA进行转染家蚕细胞或Sf细胞，筛选得到含有Luc和β-半乳糖苷酶基因的重组病毒颗粒。

5.2.5重组病毒在家蚕中的表达和ONPG法检测β-半乳糖苷酶基因和荧光素的表达酶活

将24个BmBacmid-luc-gal重组病毒培养液按10⁵pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存。

5.2.5.1 ONPG检测酶活所用药品试剂

a.ONPG 4mg/ml

b.1M Na2CO3

c.Buffer Z：16.1g Na2HPO4·7H2O，5.5g NaH2PO4·H2O，0.75g KCl，0.246g MgSO4·7H2O，2.7ml 2-mercaptoethanol pH调至7.0(测不同PH下酶的活性时调PH至相应值)加水至1L

5.2.5.2酶活测定

取适量上述蚕血加入含4mg/mL ONPG的缓冲溶液40μL于稀释后的蚕血裂解溶液中，振荡混匀，再于30℃静置反应20min(出现黄色为止)，加入100μL的1mol/L Na₂CO₃溶液终止反应。记录反应时间，加入酶标板中，分别于420nm、550nm波长下测定吸光度值(以加入系时候的蚕血裂解液的缓冲溶液为参照空白)。

根据下面的公式计算酶活：

U＝1000×(OD₄₂₀-1.75×OD₅₅₀)/(T×V×OD₅₉₅)

式中：U为β-半乳糖苷酶活性；T为加入ONPG后的反应时间(min)；V为体积

最后计算时，再减去阴性对照的值。

24个重组病毒BmBacmid-luc-gal感染家蚕样品的β-半乳糖苷酶活性平均为每毫升血淋巴360IU，同时24个重组病毒BmBacmid-luc-gal感染的家蚕15微升血淋巴裂解液的荧光素酶活性平均结果为8340000荧光单位。

将上述其中的12个重组病毒AcBacmid-luc-gal培养液按10⁵pfu感染Sf细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存，按同样方法检测荧光素酶和半乳糖苷酶的活性。

12个重组病毒AcBacmid-luc-gal平均结果为每瓶细胞的β-半乳糖苷酶活性平均42IU，15微升的细胞裂解液的荧光素酶活性平均结果为56300荧光单位。

上述实验结果说明在本发明所构建的昆虫生物反应器中可以同时高效表达半乳糖苷酶和荧光素酶基因，并且表达量都非常高。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用

<130> dqxl0067

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

cgaattcgct tcgaggtcgt ctagcattg 29

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

gctgtttaca acgccgtaca cgtcgacgtg ttggtcaaag tcgcagac 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

gtctgcgact ttgaccaaca cgtcgacgtg tacggcgttg taaacagc 48

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

caagcttcag cgtcgacaaa atcacaatc 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

cgaattcgaa atagaacggg tccgacag 28

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

aggcgctttc aaaggatcgt cgactcgaat acacatggct ggaa 44

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 7

ttccagccat gtgtattcga gtcgacgatc ctttgaaagc gcct 44

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 8

caagcttgat catttgctgc tccgacag 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 9

ccctgtttat agttaacaat gtc 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 10

gatggcttcc atgtcggcag aatgc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 11

gtcgatcaga ctatcagcgt gagac 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 12

gcagcgtcta tggccatagg aatag 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 13

gtagactgtt gtttggtagc ccaaatc 27

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 14

cgaattccca tatatgtatc tatcgtatag ag 32

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 15

gagcgaaaat ccattagata gctcgaggtg atattagttt gtgcgtctc 49

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 16

gagacgcaca aactaatatc acctcgagct atctaatgga ttttcgctc 49

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 17

cggatccctg cagacgcttt ctaacgtgtt gtctg 35

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 18

cggcctggtg atgatggcgg gatcg 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 19

tcagaagaac tcgtcaagaa gg 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 20

actgtaaatt acattttatt tac 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 21

accggtcaat atggattgaa ttca 24

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 22

cctcgagctc atgtttgaca gcttatc 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 23

cctcgagcat tcacagttct ccgcaag 27

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 24

cgcggatcca tgaaaggaca caacat 26

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 25

cccaagcttc taaggaaact tccacg 26

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 26

cggatccaga tgaaaggaca caaca 25

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 27

cgaattcgta acttgtccgc cgctaag 27

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 28

ctttgccgac tttcgaagag ttg 23

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 29

gatggaaaac cacaaggcgt attgag 26

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 30

ctagtttcgg ttgtgacgac gttc 24

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 31

atgggtttgt ttgcaacaaa cac 23

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 32

ctactagcag gtgacggaac gttc 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 33

gatccgtacg ttcatcgtcc gtcg 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 34

cgatcccgcc atcatcacca ggcc 24

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 35

ctatcgcctt cttgacgagt tcttc 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 36

cacgccaata cactgcaggg accct 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 37

aaccatggag ttcatagaca atcct 25

<210> 38

<211> 472

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 38

gatatcccaa tgcattggaa gctttggagt cttgtgtgct attttacaga gattcagaaa 60

tacgcatcac ttacaacagg ggggactatg aaattatgca tttgaggatg ccgggacctt 120

taattcaacc caacacaata tattacagct aaataagaat tattattaaa ttatttgtat 180

attaattaaa atcttatact gtaaattaca ttttatttac tatcatttca aagcctaacg 240

ttttgacacg aattttggat ccctgcaggc ctcgagttcg aatctagaag atctggtacc 300

gagctcgaat tcccgggcgg ccgcttaatt aattgagacg gtttgcccgc tcaattgact 360

gattttaaca ctaaaatctc agaaattcaa tccatattga ccggtgacac tgctccggac 420

cctccagaat cctagagcct aacctgaaaa gccagtcgac actagtatcg at 472

<210> 39

<211> 1821

<212> DNA

<213>

<400> 39

atgaaaggac acaacataag catcgttgga gacaagttta tgatagacgg gaagcctcta 60

cacatcatat cagggtcatt gcactacttc agggtccctg cagtgtattg gcgtgaccga 120

ctgcataagt tcaaagccgc tggtctcaac acagttgcta cgtacgtaga atggagttac 180

catgagcccg aggagaaaca gtataatttc gaaggagatc gtgacttggt gagatttgtt 240

cagacagcgg ccgaagtagg cttgcacgtt ctactaaggg ttggtcctta catctgtgct 300

gaaagagatt taggaggatt gccgtattgg ctactcggaa agtatccgaa tataaaactt 360

cgtacaaccg acaaagattt catcgcggag agcgacatat ggctgaagaa actattcgaa 420

caagtctcac atttgttatt cggaaatggt ggacctatta tcttagtaca ggtggagaat 480

gaatacggca gttatgatag cgacctggca tacaaggaaa agatgcggga tctgataagc 540

gcccacgttg gggataaggc tttgctatac accacagatg gaccgagcct agtcggcgcc 600

ggcatgatcc caggagtgca cgccaccatc gacttcggcg ttacatcaca accaacggag 660

cagttcgaca gcctgttcca cctgaggccg gctcccgggc cgctcatgaa ctccgaattc 720

tacccgggct ggctgacgca ctggggcgag cgtatggcgc gcgtcggcac caacgacatt 780

gtgctcacat tgcgtaacat gatcgttaat aaaatacacg tcaattttta tgtattcttt 840

ggtggaagta attttgagtt cacatcagga gcgaatttcg atggaacgta ccagcccgac 900

ataacctcgt acgattacga cgctcccctc tccgaagccg gcgacccaac cccaaaatat 960

tacgccatca gagaaacatt gaaacagttg aatttcgtgg atgagaaaat tgagccgcca 1020

cagcccagcc ctaaaggtcg gtatggcgcc gtgcccgtcg cagcgaaact cagtatcatg 1080

tccccgaagg gtcgctgcga cttggggaaa cgatacgagg acgtgtcggg cggaactttg 1140

ccgactttcg aagagttgag gcaacggagc ggcttggttt tatacgagac gacgctcaac 1200

gaaacagagg gagtccttgt cctcaacaag ccgcgcgacc tggtcttcgt ctttgtggat 1260

ggaaaaccac aaggcgtatt gagtcggatg cacaagaaat accatttgcg tataagttcg 1320

acggccggca gtaagctgtc cctcctagtc gagaaccaag gccgtattaa ttacggcacg 1380

ctactacacg accgtaaggg aattttaagt gaagttattt acaacaataa agttattgga 1440

ggcaaatgga gtattactgg atatccgcta gagacggttc agtttaactc ttctgtgagc 1500

gaagttaccc aaggcccaac gttttatgag ggtacatttg tgttaccaga gggtcaaaaa 1560

ccattggata cgtttttgga tactacggga tgggataagg gctacgtttg ggtgaacggt 1620

cacaatctag gacggtactg gcccggagtc ggtccccagg tcactctcta cgtccccgga 1680

gtttggctgc tcgaagcgcc gcaaccgaac gtgctacaaa tacttgaact gaacaaacct 1740

tcggacagct caaccatgga gttcatagac aatcctattc taaaccggac tggaaattta 1800

cacgcgtgga agtttcctta g 1821

<210> 40

<211> 1629

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 40

atgacgaatc gtaaatatga atctgtacaa tcttatttat tcaataatag gaacaataaa 60

attgatgcac atcaattttt tgaacgcgtc gatactgcgg aagcgcaaat tatcaaagac 120

agcatttacg acaacacagt gttgctgaac agagatgttt ttttaaatat tttaaagttt 180

gccaacgacg tttttgacaa caaagcgtac atgtacgtcg acgacagcga agtgtctcgc 240

tactacaatg ctgtggtaaa aatgaaaagg cttgtcatca acgtgcggga tccgagcttg 300

agacaatccc tctacaatac aattgcttac attgagcgat tgttaaatat cggcacggta 360

aacgatagcg aaattacaat gcttatagca gatttttacg atttgtattc caattataat 420

attgaattgc cgccgccacc accccaagcg ctgcctcgaa gcagacgacc ttccgttgtg 480

cagccagcgg cgcctgcgcc ggtgcccaca atcgtgcacg aacaaactaa accagaacaa 540

attataatac cggcggcacc gccaccacct tcttccgtgc ctaacattcc agcgcctcca 600

cctccaccac caccaccgcc atcatcgatg tctgaattgc cgcccgctcc accaatgccg 660

actaaacctc aacccgctgc acctttagac gacagacaac aattgttgga agctattaga 720

aacgaaaaaa atcgcactcg tctcagaccg gtcaaaccaa aaacggcgcc cgaaaccaat 780

acaataattg aggtgccgac gactgtgttg cctaaagagc ccaaaccgcc gtctgcatca 840

ccgccgccac cacctccgcc gccagccccg cctgcgcctc caccaatgat agatttatca 900

tcagctccat tacagccgcc attagtagat ttgccggctg aaatgttacc accgcctgca 960

ccatcgcttt ctaacgtgtt gtctgaatta aaatcgggca cagttagatt gaaacccgca 1020

caaaaacgtc cgcaatcaga aataattccg aaaaactcaa caactaaaaa tttgatcgcg 1080

gacgtgttag tcgacacaat taataggcgt cgtgtggcta tggcaaaatc gtcttcggaa 1140

gcaacttcta acgacgaggg ttgggacgac ggcggcaata atcggcctaa cgcgcccgat 1200

gttaaatatg tccaagcttt atttaacgtg tttacgtcga gtcaattgta caccaacgac 1260

agtgatgaaa aaaatacaaa agcgcataat attttgaacg acgtcgaatc tttattacaa 1320

aacaaaacac aaacgaatat cgacaaagct agattgctgc tacaagattt ggcaagtcgt 1380

gtggtgttga gcgaaaatcc attagatagt ccagccatcg gtttgcaaaa acaacccttg 1440

tttgaaacca atcgaaacct attttacaaa tctattgagg atttaatatt taaattcaga 1500

tacaaagacg ctgaaaatca tttgattttc gctctaacat accaccctaa agattacaaa 1560

tttaatgaat tattaaaata cgtacaacaa ttgtctgtaa atcaacaacg cacagaatct 1620

aacgcttaa 1629

Claims

1.一种能够同时表达多种外源目的基因的昆虫生物反应器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、将多拷贝高效细菌DNA复制起始子导入到杆状病毒基因组的几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶两个基因中，破坏杆状病毒几丁质酶和组织蛋白酶基因，构建得到杆状病毒穿梭质粒；

（2）、用抗生素基因替换杆状病毒穿梭质粒的多角体基因下游的病毒复制和感染的必须基因，获得杆状病毒质粒DNA；

（3）、用反向选择标志基因替换步骤（2）的杆状病毒穿梭质粒中的病毒复制和感染的非必须基因，即得。

2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的多拷贝高效细菌DNA复制起始子由单拷贝的 F-因子复制子 “ori2”和高拷贝的复制原子 “oriV”组成。

3. 按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、 HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV。

4.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的抗生素基因是四环素抗性基因；所述的病毒复制的必须基因是杆状病毒ORF1629基因；所述的反向选择标志基因是RPSL-NEO基因；所述的杆状病毒复制和感染的非必须基因包括P10、P74、P26或egt基因。

5.按照权利要求1-4任何一项所述方法构建得到的昆虫生物反应器。

6.按照权利要求5所述的昆虫生物反应器，其特征在于：其微生物保藏号是CGMCC No.4914。

7.权利要求5或6所述的昆虫生物反应器在表达外源目的基因中的应用。

8. 按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：构建含有需要表达的外源目的基因的打靶载体；将所构建的打靶载体与昆虫杆状病毒生物反应器进行同源重组，替换昆虫杆状病毒生物反应器中的抗生素基因，获得在宿主昆虫或昆虫细胞内进行复制和表达的含外源基因的杆状病毒穿梭质粒，获得重组病毒，将所述重组病毒在宿主昆虫或昆虫细胞中表达。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：构建有待表达的外源目的基因表达盒；将有待表达的外源目的基因表达盒替代在宿主昆虫或昆虫细胞内进行复制和表达的含外源基因的杆状病毒穿梭质粒中的反向选择标志基因，获得重组病毒，诱导重组病毒在宿主昆虫或昆虫细胞中表达；或者继续用反向选择标志基因依次替换昆虫杆状病毒生物反应器中的杆状病毒穿梭质粒的P74、P26或egt基因，再依次用有待表达的外源目的基因表达盒替代杆状病毒穿梭质粒中的反向选择标志基因。

10.按照权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述宿主昆虫包括家蚕（Bombyx mori）、野蚕（Bombyx mandarina）、蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricim）、樟蚕（Dictyoploca japanica）、樗蚕（Philosamia cynthia pryeri）、柞蚕（Antheraea pernyi）、日本柞蚕（Antheraea yamamai）、野天蚕（Antheraea polyphymus）、苜蓿尺蠖（Atographa califorica）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、甘兰夜蛾（Mamestra brassicae）、斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）、秋粘虫（Spodoptera frugiperda）、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、行军虫（Thaumetopoea wilkinsoni）、棉铃虫（Heliothis armigera）、美国棉铃虫（Heliothis zea）、烟青虫（Heliothis assulta）、烟草夜蛾（Heliothis virescens）、东方粘虫（Pseudaletia separata）或舞毒蛾（Lymantria dispar）；所述的昆虫细胞包括Sf-9, Sf-21, Hi5, S2, Bm5, BmN或Tn细胞。