JP2022545572A - ロドプシン転写体に特異的なトランススプライシングリボザイム及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ロドプシン転写体を標的にするトランススプライシングリボザイム及びその網膜色素変性症治療及び／又は予防の用途に関する。

Description

本発明は、ロドプシン転写体に特異的なトランススプライシングリボザイム及びその用途に関する。

網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ、ＲＰ）は、網膜に分布する光受容体（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）の機能異常により発生し、目に入ってきた光を電気信号に変える役割を果たす網膜の機能が消失する遺伝性及び進行性疾患であって、漸進的な網膜変性が特徴である。病気の初期に杆体光受容体（ｒｏｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）細胞の機能的な異常を暗示する夜盲症を始め、視覚細胞が損傷して末梢視力の喪失をはじめとして次第に視野が狭くなり、窮極的に失明を招く。現在の網膜色素変性症に対する治療法は、視力損失を遅らせるなどの一部の選択肢があるだけで、根本的な治療剤は皆無である。

網膜色素変性症は、様々な網膜視細胞などの遺伝子の突然変異によって発生するが、遺伝の態様は多様であり、常染色体の劣性／優性、Ｘ－関連ＲＰなど、単一遺伝子の異常で観察される全ての遺伝態様に発生し得る。様々な遺伝的な原因のうち、１５～２５％が常染色体の優性ＲＰ（ＡＤＲＰ、Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）である。数多くの遺伝子の突然変異がＡＤＲＰに関わることが知られており、その中でも、ロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ、ＲＨＯ）遺伝子の突然変異は、約３０％に達する高い比率を占めている。

ロドプシンは、網膜の桿状細胞（ｒｏｄ ｃｅｌｌ）に存在するＧＰＣＲ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の１つとして目を通して入ってくる光を電気信号に伝達し、暗いところでさらに多く必要とする。ＲＨＯ遺伝子の突然変異は、桿状細胞の機能障害及び死滅を誘発し、杆体錐体（ｒｏｄ－ｃｏｎｅ）の形態学的異常に続いて円錐細胞（ｃｏｎｅ ｃｅｌｌ）の機能障害及び死滅が続く。ＲＨＯ遺伝子の突然変異は、常染色体の優性ＲＰ（ＡＤＲＰ）を誘発し、視力喪失を招く杆体光受容体（ｒｏｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）の変性を誘導、網膜色素変性症を誘発する。この病気に関するＲＨＯ遺伝子の突然変異は、１５０個以上の互いに異なるミスセンス／ナンセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ／ｎｏｎｓｅｎｓｅ）、挿入／結実（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及びスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）の突然変異が知られており、現在も突然変異は持続的に発見されている（非特許文献１）。

様々なＲＨＯ遺伝子の突然変異のうちＰ２３Ｈ突然変異は、ＡＤＲＰ患者で最も多く発見される突然変異である。この突然変異は、ＲＨＯタンパク質のフォールディングに問題が生じて細胞膜へ輸送されず、視覚回路及び光エネルギー伝達に問題が発生する。ＡＤＲＰの場合、突然変異遺伝子の除去及び対立遺伝子である正常（ＷＴ）遺伝子の発現が伴わなければならないため、ＲＨＯ遺伝子の突然変異の除去及び機能的な対立遺伝子ＷＴ ＲＨＯ遺伝子の保全はこの疾患に対して重要な治療法である。

ＬＣＡ（Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ）及び常染色体劣性（ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）ＲＰ（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）治療のために、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（商標名）を用いている。これは眼球の光受容体を保持する機能を担当しているＲＰＥ６５遺伝子の突然変異に対する治療剤である。この製品は、ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異患者にのみ限定して使用されるという問題がある。したがって、異なるＲＰ要因であるＲＨＯ遺伝子の突然変異による網膜色素変性症の治療剤が別途必要とされる。

ＡＤＲＰ治療剤として、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを用いた遺伝子矯正技術の適用が可能であるが、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用する場合、１つの遺伝子の突然変異についてのみ矯正可能である。あるいは二重伝達システム（ｄｕａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて正常ＲＨＯ遺伝子を伝達しなければならない。また、様々な突然変異を矯正するためには、各突然変異を標的にすることができる個別のｓｇＲＮＡが必要である。即ち、各個別的な突然変異を矯正することのできる別個のシステムが必要である。また、免疫原性の誘発可能性があるｃａｓ９のような外部タンパク質を共に導入又は発現させなければならない短所を有する。

また、ｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを用いた遺伝子沈黙（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）技術を考えてみることができる。しかし、ｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムと同様に、１つの遺伝子の突然変異についてのみ沈黙するだけでなく、正常（ＷＴ）に取り戻すことができない。正常及び全ての突然変異を標的とするｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを考慮することができるが、このような製剤と共にＷＴ ＲＨＯ遺伝子を別途導入しなければならない。

上記で説明したように、現在進行中のＲＨＯ－ＡＤＲＰに対して開発中である治療剤の現況は、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）及びｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを用いたＲＮＡターゲット治療剤、遺伝子矯正技術を用いた治療剤が全てである。結論として、これらの従来技術の問題を解決してＡＤＲＰを治療するためには、ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡ発現を誘導できる遺伝子導入が別途必要である。

ここで、本発明者は、トランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を用いて様々な種類のＲＨＯ転写体を除去することができ、同時に、野生型（ＷＴ）ＲＨＯ遺伝子を発現させるための研究を続けることで本発明に至った。

Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１８ Ｊａｎｕａｒｙ；６２：１－２３．

本発明の目的は、ロドプシン転写体を標的として、同時に野生型（ＷＴ）ロドプシン転写体の発現を誘導することができるトランススプライシングリボザイムを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子伝達体を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記遺伝子コンストラクトが含まれた組換え発現ベクターを提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記遺伝子コンストラクトが含まれた組換えウイルスを提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記リボザイム、前記遺伝子コンストラクト、前記組換え発現ベクター、又は前記組換えウイルスを有効成分として含む網膜色素変性症の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記組成物を個体に投与することを含む網膜色素変性症の予防又は治療方法を提供することにある。

このような発明が解決しようとする技術的な課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載によって、この技術分野の当業者が明確に理解できるものである。

前記課題を解決するために、本発明は、ロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムを提供する。具体的に、ロドプシン転写体を標的として、同時に野生型（ＷＴ）ＲＨＯ転写体の発現を誘導できる、トランススプライシングリボザイムを提供する。

本発明の一実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造を有してもよい。

本発明の他の実現例として、トランススプライシングリボザイムは、前記リボザイム^＊次の３’方向にエクソン（ｅｘｏｎ）領域をさらに含んでもよい。即ち、前記トランススプライシングリボザイム、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造にエクソン（ｅｘｏｎ）が連結され、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’の構造を有するが、エクソンの部分には正常ロドプシン遺伝子が連結されてもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＩＧＳ領域は、ロドプシン転写体（ＲＮＡ）に特異的に結合してＧ／Ｕゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成できる５～１０ｎｔの長さの塩基配列からなるものであってもよい。

具体的に、前記ＩＧＳ領域は、ロドプシン転写体の＋３０、＋３５、＋４２、＋４３、＋５２、＋５４、＋５５、＋５９、＋７５、＋９７、＋１１６、＋１２２、＋１２３、＋１２７、＋１３２、＋１４０、＋１５４、＋１６５、＋１７１、＋１８７、＋１９１、＋２０７、＋２１５、＋２２２、＋２３０、＋２３２、＋２４４、＋２５６、＋２６２、＋２７３、＋２９８、＋３０８、＋３８１、＋４０３、＋６６１又は＋６８８部位、好ましくは、＋５９部位の塩基を含む領域と相補的に結合し、Ｇ／Ｕゆらぎ塩基対を形成できる５－１０ｎｔの長さの塩基配列からなるものであってもよい。

本発明の更なる実現例として、ロドプシン転写体は、ロドプシン突然変異を含んでもよい。

前記ロドプシン突然変異は、配列番号１に表示される野生型ロドプシン転写体の１番～１１４２番の間の塩基のうち少なくとも１つの塩基に発生した突然変異であってもよい。具体的に、前記ロドプシン突然変異転写体は、下記からなる突然変異群より選択される少なくとも１つを含んでもよいが、必ずしもこれらに制限されず、既に知られている、あるいは新たに発見されるロドプシン突然変異転写体を全て含むことができる。

Ｌ３２８Ｐ、Ｔ３４２Ｍ、Ｑ３４４Ｒ／Ｐ／ｔｅｒ、Ｖ３４５Ｌ／Ｍ、Ａ３４６Ｐ、Ｐ３４７Ａ／Ｒ／Ｑ／Ｌ／Ｓ／Ｔ、ｔｅｒ３４９／Ｑ／Ｅ、Ｎ１５Ｓ、Ｔ１７Ｍ、Ｖ２０Ｇ、Ｐ２３Ａ／Ｈ／Ｌ、Ｑ２８Ｈ、Ｇ５１Ｒ／Ｖ、Ｐ５３Ｒ、Ｔ５８Ｒ／Ｍ、Ｖ８７Ｄ／Ｌ、Ｇ８９Ｄ、Ｇ１０６Ｒ／Ｗ、Ｃ１１０Ｆ／Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｅ１１３Ｋ、Ｌ１２５Ｒ、Ｗ１６１Ｒ、Ａ１６４Ｅ／Ｖ、Ｃ１６７Ｒ／Ｗ、Ｐ１７１Ｑ／Ｌ／Ｓ、Ｙ１７８Ｎ／Ｄ／Ｃ、Ｅ１８１Ｋ、Ｇ１８２Ｓ／Ｖ、Ｃ１８５Ｒ、Ｃ１８７Ｇ／Ｙ、Ｇ１８８Ｒ／Ｅ、Ｄ１９０Ｎ／Ｇ／Ｙ、Ｈ２１１Ｒ／Ｐ、Ｃ２２２Ｒ、Ｐ２６７Ｒ／Ｌ、Ｓ２７０Ｒ、Ｋ２９６Ｎ／Ｅ／Ｍ、Ｒ１３５Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｗ、Ｔ４Ｋ†、Ｔ１７Ｍ†、Ｍ３９Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｇ９０Ｖ、Ｍ４４Ｔ、Ｖ１３７Ｍ、Ｇ９０Ｄ、Ｔ９４Ｉ、Ａ２９２Ｅ、Ａ２９５Ｖ、Ｆ４５Ｌ、Ｖ２０９Ｍ、Ｆ２２０Ｃ、Ｐ１２Ｒ、Ｒ２１Ｃ、Ｑ２８Ｈ、Ｌ４０Ｒ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｒ、Ｆ５２Ｙ、Ｆ５６Ｙ、Ｌ５７Ｒ、Ｙ６０ｔｅｒ、Ｑ６４ｔｅｒ、Ｒ６９Ｈ、Ｎ７８Ｉ、Ｌ７９Ｐ、Ｌ８８Ｐ、Ｔ９２Ｉ、Ｔ９７Ｉ、Ｖ１０４Ｆ、Ｇ１０９Ｒ、Ｇ１１４Ｄ／Ｖ、Ｅ１２２Ｇ、Ｗ１２６Ｌ／ｔｅｒ、Ｓ１２７Ｆ、Ｌ１３１Ｐ、Ｙ１３６ｔｅｒ、Ｃ１４０Ｓ、Ｔ１６０Ｔ、Ｍ１６３Ｔ、Ａ１６９Ｐ、Ｐ１７０Ｈ／Ｒ、Ｓ１７６Ｆ、Ｐ１８０Ａ／Ｓ、Ｑ１８４Ｐ、Ｓ１８６Ｐ／Ｗ、Ｙ１９１Ｃ、Ｔ１９３Ｍ、Ｍ２０７Ｒ／Ｋ、Ｖ２１０Ｆ、Ｉ２１４Ｎ、Ｐ２１５Ｌ／Ｔ、Ｍ２１６Ｒ／Ｌ／Ｋ、Ｒ２５２Ｐ、Ｔ２８９Ｐ、Ｓ２９７Ｒ、Ａ２９８Ｄ、Ｋ３１１Ｅ、Ｎ３１５ｔｅｒ、Ｅ３４１Ｋ、Ｓ３４３Ｃ及びＱ３１２ｔｅｒ。

より具体的に、前記リボザイムは、ロドプシンＰ２３Ｈ突然変異転写体を標的とすることができるが、必ずしもこれに制限されることはない。前記ロドプシンＰ２３Ｈ突然変異は、正常ロドプシンの２３番目の部位でプロリンがヒスチジンで突然変異が生じたものである。

前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号２～配列番号４のいずれか１つに表示される塩基配列を含むか、これからなるものであってもよい。

また、本発明のトランススプライシングリボザイムは、前記配列番号２～配列番号４のいずれか１つに表示される塩基配列と配列の相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上である配列は全て含む。

本発明の一実施形態として、前記リボザイムの５’－末端方向にアンチセンス（ＡＳ）をコーディングするヌクレオチドが連結されてもよい。

前記アンチセンスは、標的ロドプシン転写体に相補的な配列であってもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＡＳ領域の長さは１０ｎｔ～２１０ｎｔ、好ましくは、５０ｎｔ～１５０ｎｔであってもよい。

本発明の更なる実現例として、前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号６からなるＩＧＳ領域を含み、配列番号１０の１５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含んでもよい。

本発明が異なる実現例に係る前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造、又は、５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム^＊－３’構造、又は、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’、又は、５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’構造を含んでもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＩＧＳ領域とＡＳ領域との間には５～２０個のランダムなヌクレオチドが含まれ、前記ランダムなヌクレオチドの配列は制限酵素の配列であってもよく、前記ランダムなヌクレオチドの配列は、好ましくは、８ｎｔの長さであってもよく、図４に図式化されたＰ１（配列番号７）及びＰ１０配列（配列番号８及び配列番号９）を含んでもよい。

本発明の更なる実現例として、前記リボザイム^＊領域は、配列番号５に表示される塩基配列を含むか、これからなるものであってもよい。

また、前記上記リボザイム^＊領域は、前記配列番号５に表示される塩基配列と配列の相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上の配列は全て含む。

本発明の更なる実現例として、前記エクソン領域は、正常ロドプシン遺伝子配列を全て又は一部又は最適化されたＲＨＯ遺伝子配列を全て又は一部を含んでもよい。

本発明において、「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」とは、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質で構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な３次構造を有するＲＮＡ分子で化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的な特性を有し、いくつかのリボザイムは、自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害することが明らかになり、他のリボザイムは、リボソームのアミノ伝達酵素（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を触媒することが確認された。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム、及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれてもよい。

本発明において、具体的にトランススプライシング機能を有するリボザイム、より具体的に、ロドプシン転写体に関する特定遺伝子を標的にするトランススプライシングリボザイムを含むことができる。

本発明において、「トランススプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）リボザイム」は、別途存在する標的ＲＮＡとリボザイムのＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との塩基結合によって標的ＲＮＡを認知して切断した後、切断された標的ＲＮＡの標的塩基のすぐ後にリボザイムの３’エクソンを連結させる反応である、トランススプライシング機能を有するリボザイムを意味する。

本発明において、リボザイムの配列は、ＤＮＡ及びこれに対応するＲＮＡ配列で表示されてもよく、ＤＮＡ配列で表示される場合、これに対応するＲＮＡ配列も本発明の範囲に含まれることはこの技術分野において極めて自明であると言える。

本発明において、「ロドプシン転写体、又はＲＨＯ転写体又はＲＨＯ ＲＮＡ」とは、正常ロドプシン又はロドプシン突然変異遺伝子の転写によって作られた物質（例えば、ＲＮＡ）を指す。本発明では、正常ロドプシン転写体と突然変異ロドプシン転写体とを区分するために、「ロドプシン突然変異転写体」は「ＲＨＯ突然変異転写体」又は「ＲＨＯ突然変異ＲＮＡ」又は突然変異の部位により「Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ」などと表示し、「正常ロドプシン転写体」は、「ＷＴ ＲＨＯ転写体」又はＷＴ ＲＨＯ又は「ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡ」と表示する。

また、「ロドプシン突然変異転写体部位のうち少なくとも１つを標的とするトランススプライシングリボザイム」とは、細胞内に注入されたときに網膜色素変性症に関与するロドプシンＲＮＡを認識し、選択的なトランススプライシング反応を起こすように遺伝的に操作された形態のリボザイムを意味し、この技術分野において幅広く知られている方法によって制作することができる。例えば、リボザイムの５’末端に標的ＲＮＡの保全的部位に特異的な相補性配列を連結させることで、特定のＲＮＡを標的とする基質特異性を有することができる。

参考として、この技術分野でロドプシン突然変異遺伝子に関する情報はすでに多く知られている（非特許文献１、及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｔｉｎａ－ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｓｃｉ－ｎｅｗｓ／ｒｈｏｍｕｔ．ｈｔｍなどを参考）。

本発明は、予め知られたロドプシン突然変異遺伝子情報に基づいて、「ロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイム」を制作し、突然変異ロドプシンを正常（野生型、ＷＴ）ロドプシンに変える技術である（図１）。

機能的異常を誘発するＲＨＯ突然変異は、５’－ＵＴＲ部位のダウンストリームで主に発生する。本発明のトランススプライシングリボザイムは、５’－ＵＴＲ部位を標的としてトランススプライシングによって、突然変異を含むＲＨＯ転写体を切り出すと共に、ＷＴ ＲＨＯ転写体の発現を誘導することができる。即ち、本発明のトランススプライシングリボザイムは、突然変異の種類に関係なく、疾患の治療及び／又は予防の用途に利用することができる。

また、本発明のトランススプライシングリボザイムが正常ロドプシン転写体を標的とすることもできるが、この場合、再び正常ロドプシンに変形するため、本発明のトランススプライシングリボザイムは正常ロドプシンに影響を与えない。

他の態様において、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムを含む非ウイルス性遺伝子伝達体を提供する。具体的に、前記トランススプライシングリボザイムをＲＮＡ形態に非ウイルス性遺伝子伝達体に担持して生体内に直接伝達することができる。

前記非ウイルス性遺伝子伝達体は、リポソーム、脂質ナノ粒子であってもよいが、必ずしもこれらに制限されることなく、この技術分野で知られている非ウイルス性遺伝子の伝達方法であればいずれのものも利用可能である。

前記リポソームは、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、リポフェクタスなどを使用してもよく、セルフェクチン、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、リポフェクチン、ポフェクタミンＬＴＸ、ＲＮＡｉＭＡＸ、ポフェクタミン２０００、ポフェクタミン３０００、ＤＯＴＡＰ、ＳＡＩＮＴ－ＲＥＤ、Ａｖａｌａｎｃｈｅ－Ｏｍｎｉ、ＥＸ ｐｌｅｘ、ｐｏｌｙｆｅｃｔ、ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ、ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔなど、市販のリポソームを制限されることなく使用できる。

脂質ナノ粒子構成要素のうちリン脂質は、脂質ナノ粒子内でイオン化可能な脂質及び薬物が相互作用して形成されたコアを囲んで保護する役割を果たし、ターゲット細胞のリン脂質二重層と結合して、薬物の細胞内に伝達時に細胞膜の通過及びエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を容易にする。

前記リン脂質は、脂質ナノ粒子の融合を促進できるリン脂質が制限されることなく使用でき、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、ＰＯホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］（ＤＯＰＳ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

陽イオン性脂質伝達体は、主に陽イオン性脂質からなるナノメートルのサイズのリポソームや脂質素材ナノ粒子の陽電荷を用いて陰電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用により細胞内に伝達する方法である。細胞内に伝達された複合体は、エンドソームからリソソームに１次伝達された後、細胞質に抜け出て発現する。陽イオン性高分子伝達体は、脂質の代わりに高分子を使用することを除外すれば、陽イオン性脂質伝達体に類似の方式で遺伝子を伝達し、代表的な陽イオン性高分子として、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムに正常ロドプシン遺伝子のような目的遺伝子を連結した後、これを非ウイルス性遺伝子伝達体に担持することができる。前記非ウイルス性遺伝子伝達体を用いてＲＨＯ転写体を標的にし、正常ロドプシン遺伝子を伝達することができる。

他の態様において、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供する。

前記コンストラクトは、前記リボザイムの３’－末端方向に目的遺伝子が追加的に連結されてもよい。これは、前記言及したエクソン（ｅｘｏｎ）領域に目的遺伝子が追加的に連結されることを意味する。

前記目的遺伝子は、正常ロドプシン遺伝子及び／又はリポーター遺伝子であってもよい。

前記リポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び増強された藍色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）からなる群より選択される１種以上であってもよいが、必ずしもこれらに制限されず、この技術分野で知られたリポーター遺伝子は全て利用することができる。

目的遺伝子として、リポーター遺伝子を挿入させることでロドプシン転写体特異的なリボザイムの発現程度を観察することができる。

前記遺伝子コンストラクトは、前記遺伝子コンストラクトに作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでもよい。

前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＣＡＧ（ＣＭＶ ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ ＋ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳＤ＋ｒａｂｂｉｔ ｂｅｔａ－Ｇｌｏｂｉｎ ＳＡ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、呼吸器細胞融合ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）プロモーター、ＬＴＲプロモーターなどの原核細胞又は哺乳類ウイルスのプロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ベータアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ１－アルファ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）プロモーター、ＩＬ－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）遺伝子プロモーター、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーター、ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターなどの動物細胞プロモーター、ＲＨＯ（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）遺伝子プロモーター、ＲＫ（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、ＲｅｄＯ（ｒｅｄ ｏｐｓｉｎ）遺伝子プロモーターなどのような網膜組織特異プロモーターなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これらに制限されることはない。

本発明において、「遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、標的ロドプシン転写体部位に対する特異性を高めるためのエレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む構造体を意味する。具体的に、前記トランススプライシングリボザイムを含む構造体であってもよい。

前記コンストラクトのトランススプライシングリボザイムに追加的に連結されるアンチセンス配列は、標的ロドプシン転写体に対する特異性を増加させて治療効果を高めるためのもので、このような目的を達成するための配列であれば、制限されることなく含まれてもよい。

また、本発明に係るコンストラクトは、リボザイムがロドプシン転写体部位を標的にし、標的ロドプシン転写体特異的なアンチセンス配列を含んでおり、ロドプシン転写体が発現する細胞にのみ特異的に発現してもよい。

図２は、本発明の一実施形態により製造した、プロモーター、トランススプライシングリボザイム領域、正常ロドプシン遺伝子領域を含む遺伝子コンストラクト基本構成を示す模式図である。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトが含まれた組換え発現ベクターを提供する。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトが含まれた組換えウイルスを提供する。

前記ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスからなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、必ずしもこれらに制限されず、この技術分野で使用できるウイルスであれば、いずれのものも使用できる。

本発明で用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子の作製物をいう。本発明で用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節の配列及び目的とするタンパク質をコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、リボザイム暗号化配列は、プロモーターに作動可能に連結させることによって、リボザイム暗号化配列の発現は、このプロモーターの影響又は調節下にある。２つの核酸配列（リボザイム暗号化配列とこの配列の５’末端のプロモーター部位配列）は、プロモーター作用が誘導されることによってリボザイム暗号化配列が転写される場合に作動可能に連結されたものであり、前記２つの配列間の連結特性がフレーム変更突然変異（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導せず、発現の調節配列がリボザイムの発現を支配する能力を阻害しない場合、作動可能に連結されたという。組換えベクターとの作動可能な連結は、当技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位－特異的ＤＮＡの切断及び連結は、この技術分野で一般に知られた酵素などを用いてもよい。

本発明のベクターは、プロモーター、オペレーター、コザックコドン、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素の他にも、標的化又は分泌のための信号配列又はリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。ベクターのプロモーターは構成的又は誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製の起源を含み得る。ベクターは、自己複製するか、又は宿主ＤＮＡに統合されてもよい。前記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、又はウイルスベクターなどを含んでもよく、具体的に、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスなどに由来するベクターを含むが、これらに制限されることはない。

本発明の更なる一実施形態は、前記組換えベクターが導入された形質転換細胞を提供する。

本発明において、用語「導入」は、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって外来の遺伝子を細胞に流入させることを意味する。形質感染は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介形質感染法、ポリブレン媒介形質感染法、エレクトロポレーション法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法など、この技術分野で公知の様々な方法によって実行されてもよい。また、形質導入は、感染を手段として、ウイルス又はウイルスベクター粒子を用いて細胞内に遺伝子を伝達することができる。

本発明において、用語「形質転換細胞」は、宿主細胞に目的とするポリヌクレオチドを導入した細胞を意味する。

形質転換は、前記「導入」方法によって行われてもよく、この技術分野で公知のように宿主細胞により適切な標準技術を選択して行うことができる。

具体的に、本発明の形質転換細胞は、ロドプシン転写体を標的にするリボザイムをコーディングするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを導入させて製造したものであってもよい。

本発明の一具体例として、前記組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）であってもよい。具体的に、本発明に係るトランススプライシングリボザイムをコーディングするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されたものである、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）であってもよい。

前記組換えＡＡＶは、ＡＡＶの天然又は人工由来の血清型又は単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）又は系統群（ｃｌａｄｅ）であってもよい。

前記トランススプライシングリボザイムをコーディングするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～５のいずれか１つと、７０％以上、８０％以上、又は、９０％以上の配列の相同性を有するものであってもよい。

前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はＲＨＯプロモーターであってもよい。

前記組換えＡＡＶは、追加的な調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含んでもよい。

前記調節配列は、スプライシング供与／スプライシング配列（ＳＤＳＡ）及び／又はＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｐｏｓｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）配列であってもよい。

本発明に係るＳＤ／ＳＡは、転写開始（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）とＲＮＡ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＩＩのプロセッシング及びｍＲＮＡの核で細胞質への移動（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｏｒｔ）を増加させる。

本発明に係るＷＰＲＥは、ｍＲＮＡのプロセッシングと核から細胞質への移動を増加させ、それぞれｐｒｅ－ｍＲＮＡのレベルを増加させることができる。上記のような構成によって、細胞内でリボザイムのＲＮＡレベルを著しく増加させて生体内において機能を向上することができる。

本発明に係るＳＤ／ＳＡ配列は、ＲＮＡ転写体のイントロンを除去するスプライシング反応において、切り取られるイントロンの開始部分と終了部分に該当する配列であって、一般に、ＳＤ配列は、イントロン５’末端のＧＵ配列であってもよく、ＳＡ配列は、イントロンの３’末端のＡＧ配列であってもよい。

本発明に係るＷＰＲＥは、ＤＮＡに転写を促進する３次構造を誘導し、遺伝子の発現を増加させる配列を意味する。

本発明において、前記ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１３の配列を含んでもよいが、目的遺伝子の発現カセット内に存在しながら目的遺伝子の発現を促進させ得る限り、これらに制限されることはない。

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの天然又は人工由来血の清型又は単離体又は系統群に由来し得る。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然ＡＡＶウイルスゲノムであるか、又は人工的に作られたＡＡＶウイルスゲノムであり得る。当業者に知られているように、ＡＡＶウイルスは、様々な生物学的なシステムにより分類されてもよい。

一般に、ＡＡＶウイルスは、それらの血清型に応じて称される。血清型は、自身のカプシド表面の抗原の発現プロファイルのために、他の変異体の変種と区別するのに使用され得る独特の反応性を有するＡＡＶの変異体の変種（ｖａｒｉａｎｔ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）に該当する。一般に、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と交差反応が効率的に発生しない。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１を含み、また、最近霊長類の脳で確認されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３のような組換え血清型も含む。

本発明に使用するために特に関心のある血清型は、網膜色素上皮のような眼球内の組織に効率よく形質導入されるＡＡＶ２、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８を含む。ＡＡＶ血清型のレビューは、Ｃｈｏｉら（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）及びＷｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；１４（３）、３１６－３２７）に見られる。

ＡＡＶウイルスはまた、系統群又はクローンの観点で称される。これは天然又は人工由来のＡＡＶウイルスの系統発生学的な関係、及び一般に共通先祖に遡ることができるＡＡＶウイルスの系統発生学的な群を示し、その全ての子孫を含む。また、ＡＡＶウイルスは自然で探すことができるか、又は人工的に操作された、特定のＡＡＶウイルスの遺伝的な単離体のような特定の単離体に応じて称されてもよい。用語の遺伝的な単離体（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｅ）は、他の天然ＡＡＶウイルスと制限的な遺伝子の混合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｉｘｉｎｇ）が発生し、それによって遺伝子レベルで認識可能に区別される別個の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を定義する、ＡＡＶウイルス集団を記述する。

一般に、ＡＡＶの天然又は人工由来の血清型又は単離体又は系統群のＡＡＶゲノムは、１つ以上の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、ｃｉｓ位置で機能的な複製基点を提供する役割を果たし、細胞のゲノムからベクターの融合及びそれからの切断を可能にする。好ましい具体例として、１つ以上のＩＴＲ配列は、Ｒｅｐ－１又はその変異体をコーディングするポリヌクレオチド配列をフランク（ｆｌａｎｋ）する。

ＡＡＶゲノムはまた、一般にＡＡＶウイルス粒子のためのパッケージング機能をコーディングするｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子のようなパッケージング遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０又はその変異体タンパク質の１つ以上をコーディングする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３又はその変異体のような１つ以上のカプシドタンパク質をコーディングする。このようなタンパク質がＡＡＶウイルス粒子のカプシドを構成している。プロモーターは、各パッケージング遺伝子に作動可能に連結されている。

本発明のベクターに使用されるＡＡＶゲノムは、天然又は人工ＡＡＶウイルスの全体ゲノムであってもよい。例えば、全体ＡＡＶゲノムを含むベクターがインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＡＡＶウイルスを製造するために使用されてもよい。しかし、このようなベクターは、原則として患者に投与され得る。好ましくは、ＡＡＶゲノムは、患者に投与するための目的として誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅ）される。このような誘導体化は、この技術分野の標準であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの周知の誘導体及びこの技術分野に知られた方式を適用して生成され得る誘導体の利用を含む。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトを含む非ウイルス性遺伝子伝達体を提供する。

前記非ウイルス性遺伝子伝達体はリポソーム、脂質ナノ粒子であってもよいが、必ずしもこれらに制限されることなく、この技術分野で周知の非ウイルス性遺伝子伝達方法であれば、いずれも利用可能である。これに対する具体的な説明は前述したため省略する。

更なる態様において、本発明は、前記リボザイム、前記非ウイルス性遺伝子伝達体、前記遺伝子コンストラクト、前記組換え発現ベクター、又は前記組換えウイルスを有効成分として含む網膜色素変性症の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

更なる態様において、本発明は、前記薬学組成物を個体に投与することを含む網膜色素変性症の予防又は治療方法を提供する。

本発明において使用された「予防」という用語は、本発明に係る薬学組成物の投与で網膜色素変性症の発症を遅延させる全ての行為を意味する。

本発明において使用された「治療」という用語は、本発明に薬学組成物の投与で網膜色素変性症が好転したり、有利に変更したりする全ての行為を意味する。

本発明に係る医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、目的とする方法により経口投与するか、又は非経口投与することができるが、非経口で投与することが好ましい。非経口の投与として眼球内に物質を投与できる経路は３つあり、硝子体内注射法（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上内注射法（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注射法（ｓｕｎｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）がある。

本発明の一実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、標的とする細胞が光受容体細胞として最も効率的であり、直接的に伝達できる投与経路として網膜下注射方法により投与することができる。本発明に係る注射剤は患者に投与するとき、そのまま利用できるように滅菌媒質に分散した形態であってもよく、投与時に注射用蒸留水を加えて適切な濃度で分散させてから投与する形態であってもよい。また、注射剤で製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などと混合されてもよく、単位投薬アンプル又は多重投薬の形態に製造されてもよい。

具体的に、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を活用して、ヒトの誘電体に直接挿入する方法ではなく、エピソーマル状態で本発明に係るトランススプライシングリボザイムの発現を誘導し、標的ＲＨＯ転写体の除去及びＷＴ ＲＨＯタンパク質の発現を誘導してもよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態、及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路、及び時間により異なるが、当業者によって適切に選択され得る。一方、本発明に係る医薬組成物は単独に使用されるか、又は他の治療剤と並行して使用されるか、又は外科的な手術療法などの補助治療方法と並行して使用されてもよい。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、標的ロドプシン転写体を除去すると共に、正常（野生型）ロドプシン遺伝子（ＲＮＡ）に置換して正常ロドプシン遺伝子を発現させる効果を提供する。したがって、本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、網膜色素変性症を根本的に治療する効果を提供する。特に、標的転写体部位は、全ての種類のロドプシン突然変異を含むロドプシン転写体を標的とすることができる部位を選択することで、１つの治療剤が様々なロドプシン突然変異患者に全て適用され得るという長所がある。また、患者細胞内で発現する標的ロドプシン転写体の発現量に応じて正常ロドプシンタンパク質を発現させることができるため、過剰な正常ロドプシンタンパク質の発現による副作用及び毒性誘導も最小化することができる。また、トランススプライシングリボザイムによるＲＮＡ置換機能は、内生細胞機作（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を利用することなく、細胞内における機能のために外部のタンパク質導入が必要でないトランススプライシングリボザイムのＲＮＡ自体の機作で作動することから、より安全な治療剤になり得る。

本発明に係るＲＨＯ転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムの機作を示した模式図である。 本発明の一実施形態により製造した、プロモーター、トランススプライシングリボザイム領域、正常ロドプシン遺伝子領域を含む遺伝子コンストラクトの基本構成を示す模式図である。 インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるＲＨＯ ＲＮＡの標的部位の選定過程及びその結果を示した模式図である。 インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるＲＨＯ ＲＮＡの標的部位の選定過程及びその結果を示した模式図である。 本発明の一実施形態に係るロドプシンＲＮＡ＋５９番目の塩基部位を標的とするトランススプライシングリボザイム（以下、「ＲＨＯ標的リボザイム」という）を含むコンストラクトの最適化過程を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むベクター模式図である。 ＲＨＯ標的リボザイムを最適化するために２９３Ａ細胞でコンストラクトの活性を比較する結果を示したものである。 ＲＨＯ標的リボザイムのインビトロ効能をｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを用いて確認した結果である。 ＲＨＯ標的リボザイムの様々な突然変異に対するインビトロ効能を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムをアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）ベクターで発現させるための組換えＡＡＶ発現ベクターの模式図である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患動物モデルでリボザイムの効能を確認した結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患動物モデルでリボザイムの効能を確認した結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の血清内免疫及び炎症反応結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係る動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の網膜（Ｒｅｔｉｎａ）と網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）組織でリボザイムの効能を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の生体内リボザイムの分布を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る正常マウスにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の毒性を分析した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の網膜電位図検査を行った結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の血清（Ａ）、及びリボザイムの活性を分析した結果である（Ｂ）。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含む様々な組換えＡＡＶベクターの制作模式図である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後３週目のリボザイム分布及びトランススプライシング活性を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜電位図を検査した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜電位図を検査した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜のリボザイム分布及びリボザイムＲＮＡ発現を確認した結果である。

ロドプシンＲＮＡ１μｇとランダムライブラリーリボザイム１μｇを１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを入れて混合した。リポフェクタミン２０００の２μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを、他の本発明は、多様な変換を加えることができ、様々な実施例を有することができるが、以下に特定の実施例を図面に例示して、詳細な説明で詳しく説明することにする。しかし、これは、本発明を特定の実施例について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものとして理解しなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を曖昧にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。

実施例１：ロドプシン（ＲＨＯ）ＲＮＡ標的トランススプライシングリボザイムの設計
ターゲットＲＮＡ部位を選定するために、ＲＨＯ ＲＮＡ変異体の配列を比較し、ＲＨＯ ＲＮＡ標的トランススプライシングリボザイムを設計した（図２）。

実施例２：インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるロドプシン（ＲＨＯ）ＲＮＡの標的部位選定
ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡあるいはＰ２３Ｈ ＲＨＯ ＲＮＡとリボザイムＲＮＡライブラリーを用いてインビトロマッピング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｐｐｉｎｇ）及び細胞内マッピングを行った。インビトロマッピングのために、テストチューブでロドプシンＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムとを混合して反応させてからＲＴ－ＰＣＲを行った後、トランススプライシング産物として予想されるＰＣＲ ＤＮＡバンドの配列分析によってトランススプライシングが発生したロドプシンＲＮＡ部位を確認した。

より具体的に、ロドプシンＲＮＡをインビトロ転写過程により合成し、５’末端にランダムな配列（ＧＮＮＮＮＮ）を有するトランススプライシングＲＮＡライブラリーをインビトロ転写過程により合成した。ロドプシンＲＮＡ０．１ｐｍｏｌｅを１Ｘインビトロトランススプライシング反応バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）と混合して合計１０ｕＬに作り、リボザイムライブラリーＲＮＡ１ｐｍｏｌｅを１Ｘインビトロトランススプライシング反応バッファと混合して合計９ｕＬに作った後、１ｍＭ ＧＴＰ１ｕＬを入れて最終０．１ｍＭ ＧＴＰに濃度を合わせた。これをそれぞれ９５℃で１分、３７℃で３分反応させ、２つを混合した後、３７℃で３時間反応させた。反応液をフェノール抽出／ＥｔＯＨ沈殿過程を経てＲＮＡを回収した後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、リボザイム特異ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）を入れた後、２０ｕＬ体積条件で逆転写によりｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ ２ｕＬを用いてロドプシンＲＮＡ、特に、５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、リボザイム特に３’プライマー（ＲＹ－ＴＳ）（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）をそれぞれ１０ｐｍｏｌｅずつ用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で３５サイクルのＰＣＲを実行し、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認した。確認された全てのＰＣＲ産物をフェノール及び沈殿過程を経てバッファチェンジした後、ロドプシンＲＮＡのいずれかの部位でトランススプライシング反応が生じたかを塩基配列分析によって確認した。トランススプライシングのシークエンシングによって分析した結果、ＲＨＯ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ部分である５９番目のサイトを最もよくターゲッティングすることが確認された（図３Ａ及び図３Ｂ）。

細胞内マッピングのために、テストチューブにロドプシンＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムとを混合して細胞内の共同形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。具体的に、２９３Ａ細胞を３５ｍｍ培養皿に１×１０^５個に分注した後、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーターに培養した。１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温でそれぞれ放置した。その後、前記２つのチューブの内容物を混合し、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後にチューブを１０秒間遠心分離した後、それぞれの細胞上に撒いて共同形質注入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しいバッジに取り替えた。３７℃で５％、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）５００ｕｌ処理してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ５μｇをＤＮａｓｅ Ｉ１μｌを処理してｇＤＮＡを除去し、そのうち、１μｇをリボザイム特異ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）を入れた後、２０ｕＬ体積条件で逆転写によってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ２ｕＬを用いてロドプシンＲＮＡ、特に５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、リボザイム、特に、３’プライマー（ＲＹ－ＴＳ）（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）をそれぞれ１０ｐｍｏｌｅずつ用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で３５サイクルのＰＣＲを実行し、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認した。確認された全てのＰＣＲ産物をフェノール及び沈殿過程を経てバッファチェンジした後、ロドプシンＲＮＡのいずれかの部位でトランススプライシング反応が生じたかを塩基配列分析によって確認した。

実施例３：トランススプライシングリボザイムの製造
配列番号１に表示されるＷＴ ＲＨＯ、そして、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ配列のうち＋５９番目の塩基部位をターゲットにするトランススプライシングリボザイムを含むコンストラクトを最適化した（図４）。前記ターゲット部位は、ＲＨＯ ＲＮＡの＋５９位置の塩基を含み、５’末端に前記ターゲット部位を標的とし得るＩＧＳ（５’－ＧＣＣＣＡＡ－３’：配列番号６）を導入した。細胞内におけるＲＨＯ ＲＮＡ ＋５９塩基を標的とするリボザイム（以下、「ＲＨＯ標的リボザイム」という）のトランススプライシング活性を分析するために、改善されたＲＨＯ標的リボザイムコンストラクトを製造した。６－ｎｔの長さのＩＧＳだけを有するグループＩイントロンは、哺乳類の細胞内で発現したときに不活性化するか、又は非特異的な活性を示すと知られているためである。改善されたＲＨＯ標的リボザイムコンストラクトを製造するために、リボザイムのＩＧＳアップストリームに延長されたＰ１（配列番号７）及び７－ｎｔの長さのＰ１０螺旋（配列番号８及び配列番号９）を含む相補的なオリゴヌクレオチドを挿入することでリボザイムを変形した。

実施例４：トランススプライシングリボザイムの最適化
実施例３で製造した第１、第２、及び第３デザインのＲＨＯ標的リボザイムのうち、トランススプライシングに最適化されたＲＨＯ標的リボザイムを確認するためにＲＨＯ標的リボザイムを含むベクターを制作した（図５）。

図５において、ＡＳ１５０は配列番号１０に、ＳＤ／ＳＡは配列番号１１に、５’ＵＴＲ一部の配列は配列番号１２に表示される。Ｔ２Ａはリンカー配列であり、ＹＦＰは蛍光蛋白質配列であって、この技術分野で幅広く知られているため具体的な配列表示は省略する。ｐｏｌｙＡ配列についてもこの技術分野において幅広く知られている。

ＲＨＯ標的リボザイムの３つのデザイン間のリボザイム効果をインビトロ（哺乳動物細胞）で比較検証した。その結果を図６に示した。第１デザインと第２デザインを比較したとき、第２デザインのトランススプライシング作用がより優れていることが確認された（図６Ａ）。第２デザインと第３デザインを比較したとき、第２デザインによるトランススプライシング効率がより優れていることが確認された（図６Ｂ）。第２デザインを選択してリボザイムの特異性及び効率性を最適化するためにアンチセンスの長さを調節して比較し、アンチセンス１５０個の長さ（配列番号１０）が最も効果が優れていることが確認された（図６Ｃ）。トランススプライシング産物が正確にトランススプライシングされたかを確認するためにシークエンシングを行い、標的部位でトランススプライシングが発生したことが確認された（図６Ｄ）。

実施例５：インビトロでトランススプライシングの活性分析
ＲＨＯ標的リボザイムのインビトロ効能をｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを用いて確認した。陽性対照群としてＹＦＰがタグされた野生型ＲＨＯ（ｗｉｌｄ Ｒｈｏ－ＹＦＰ）を用いた。ロドプシンｍＲＮＡが安定的に発現する２９３Ａ ＷＴ ＲＨＯ、２９３Ａ Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞株を制作し、この細胞株を介して機能分析を行った。正常ロドプシンタンパク質は、細胞膜に移動して偏在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するが、Ｐ２３Ｈロドプシン突然変異の場合、タンパク質のフォールディングに問題が生じて、細胞膜に移動せずに細胞質の小胞体にとどまることになる。したがって、タンパク質の位置を確認することでロドプシンタンパク質の機能的な変化を確認することができる。

ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクターをｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌにトランスフェクションし、トランススプライシング効果を確認するためにＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲを行った。

具体的に、ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを３５ｍｍ培養皿に１×１０^５個に分注した後、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーターに培養した。ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクター２μｇとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、リポフェクタミン２０００を２μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合してから５分間常温で放置した。その後、前記２つのチューブの内容物を混合して、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後にチューブを１０秒間遠心分離してからそれぞれの細胞上に撒いて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しいバッジに取り替えた。３７℃で５％のＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリゾール５００ｕｌ処理してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ５μｇをＤＮａｓｅ Ｉ１μｌを処理してｇＤＮＡを除去し、そのうち１μｇを逆転写してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを用いてＰＣＲによりトランススプライシング産物を確認し、トランススプライシング作用が正確に発生したことを塩基配列分析から確認した（図７Ａ）。

また、上記のような方法でＲＨＯ標的リボザイム発現ベクターを形質注入した後、ＲＨＯ抗体を用いてＲＨＯタンパク質を染色した。２次抗体を、蛍光抗体を用いて蛍光学顕微鏡を用いてＲＨＯタンパク質の細胞内分布を確認した。Ｐ２３Ｈ突然変異によって細胞内にとどまっていたロドプシンタンパク質がリボザイムによって細胞膜として分布していることが確認された（図７Ｂ）。

また、ＲＨＯ標的リボザイムの様々な突然変異に対するインビトロ効能を２９３Ａ細胞に共同形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して確認した（図８）。具体的に、ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクター０．５μｇと様々な突然変異発現ベクター２μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、リポフェクタミン２０００の２．５μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合してから５分間常温で放置した。その後、上記のような方法により形質注入した後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。その結果、標的な部位に正確にトランススプライシングが発生したことを確認することで、様々な突然変異の部位に対して正常ＲＨＯ ＲＮＡに交替されることが確認された。したがって、本発明に係るロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムは、特定の突然変異遺伝子のみを矯正できるものではなく、突然変異の種類に関わらず突然変異の部位を交替できることが分かる。

実施例６．組換えウイルス制作及び動物モデルでトランススプライシング効能確認
６－１：組換えウイルスの制作
実施例４の第２デザインのＲＨＯ標的リボザイムをアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）ベクターで発現させるために、組換えＡＡＶ発現ベクターを制作した。プロモーターは、ＣＭＶプロモーターを使用した（図９）。ｐＡＡＶバックボーンプラスミド２０μｇをＥ．ｃｏＲＩで反応させた後、アガロースゲルを溶出した。合成したリボザイム＋ＲＨＯ ＤＮＡをインフュージョン（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いて反応させてから形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）してコロニーを取得した。それぞれのコロニーを培養してプラスミドを取得し、シークエンシングによって配列が正常にクローニングされたクローンを選別した。このように作られたプラスミドをＥｃｏＲＶとＸｂａＩで反応させた後、アガロースゲル溶出した。合成したＹＦＰ ＤＮＡを、インフュージョン酵素を用いて反応させてから形質転換してコロニーを取得した。コロニーを培養してプラスミドを取得し、シークエンシングによって配列が正常にクローニングされたコロニーを選別した。アンチセンス配列を追加するために、Ｅ．ｃｏＲＩで反応させた後、アガロースゲルを溶出した。ＰＣＲによって取得したＡＳ１５０配列を、インフュージョン酵素を用いて反応させてから形質転換してコロニーを取得した。同じ方法により、配列分析した後、最終のＡＡＶ－ｃＲｉｂ－ＹＦＰプラスミドを取得した。

ＡＡＶウイルスベクターを制作するために、２９３Ｔ細胞にＨｅｌｐｅｒベクター、ＲＨＯリボザイム発現ベクター、Ｒｅｐ２Ｃａｐ５ベクターを三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、７２時間後に細胞はライシス（ｌｙｓｉｓ）、上層液はＰＥＧダウン（ｄｏｗｎ）した。これをイオジキサノール勾配超遠心分離（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）方法でＡＡＶ発現ベクターを取得した。

６－２：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの効能確認
実施例６－１のＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでリボザイムの効能を確認した。ｈＰ２３Ｈマウス－ＲＦＰモデルは、人体Ｐ２３Ｈ遺伝子とＲＦＰ蛍光タンパク質が融合した形態でノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）されたＲＰマウスモデルとして、ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ研究に幅広く用いられているモデルである。ＡＡＶ発現ベクター１μｌ網膜下注射（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法によりマウスの眼球に注入した。ＩＯキットに連結されている３４Ｇニードルを強膜穿刺（ｓｃｌｅｒａｌ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により刺入させた後、１μｌ／ｅｙｅの体積で両眼に網膜下注射で投与した。投与が完了すると、マウスの眼球に抗生剤点眼液を一滴点眼して感染を防いだ後、ＦＰ／ＯＣＴ撮影によって網膜のブレブ（ｂｌｅｂ）形成を確認する方法で投与の成功可否を判定した。

投与した後、２週あるいは５週目に眼球を摘出してスライドを制作した。ＡＡＶ発現ベクターにはＹＦＰ蛍光物質が結合されているため、ＲＨＯタンパク質に対する追加染色は進まないものの、ＤＡＰＩ染色によって細胞内の核染色を行った。図１０は、投与後２週（図１０Ａ）、投与後５週（図１０Ｂ）の結果を示したものである。

ＡＡＶ５－ＹＦＰ（蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰ（ｇｅｎｅ、蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅ）をＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰに対する対照群として活用した。ＡＡＶ５－ＹＦＰとＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰの物質が網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）にも蛍光が発現することから、光受容体特異的に導入されないことを確認することができ、一方、ＲＨＯ標的リボザイムが付着されたＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰの場合、ＲＰＥで発現せず光受容体にのみ特異的に発現したことが確認された。

実施例７：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの投与後に免疫及び炎症反応確認
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでトランススプライシングリボザイムの投与後に血清内免疫及び炎症反応を確認した結果を図１１に示した（Ａ：投与後２週、Ｂ：投与後５週）。

関連サイトカインのうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－１０がＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰに対して２週目に増加する様相を示し、ＩＬ－４及びＩＬ－２に対しては変化の様相を示さなかった。このような変化は、対照群であるＡＡＶ５－ＹＦＰとＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰ物質処理によっては反応を示していないため、ウイルスベクター自体の効果ではないものと考えられる。２週目に増加パターンを見せたサイトカインは、５週目に減少して対照群に類似の量に減少するという結果から、トランススプライシングリボザイムを発現するベクターの網膜下注射（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって増加した炎症及び免疫反応が物質投与の初期には増加し、５週目には本来のレベルに復帰することを意味する。

実施例８：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの投与後の網膜と網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）組織でリボザイムの効能確認
疾患モデルに有効物質を投与した後、ＲＨＯ ＲＮＡをターゲットにしてトランススプライシングが生体内の光受容体で発生したか否かを確認した。そのために、マウスの眼球を摘出して網膜と網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ）を分離し、各部位でＲＮＡを抽出した後にＲＴ－ＰＣＲを行って、トランススプライシング産物生成の有無を観察した。その結果を図１２に示した。

ＲＰＥでは、増幅したトランススプライシング産物ＰＣＲバンドを確認することができないが、網膜特異的にトランススプライシング産物が確認された（図１２Ａ）。増幅したトランススプライシング産物に対してシークエンシングを行って突然変異ＲＨＯ ＲＮＡをターゲッティングして正常ＲＨＯ ＲＮＡに置換されたことが確認された（図１２Ｂ）。

また、網膜及び網膜色素上皮細胞のｇＤＮＡを抽出してＡＡＶ ＩＴＲ部位をｑＰＣＲしたとき、網膜よりも網膜色素上皮細胞でさらに多く検出されたが（図１２Ｃ）、これはＡＡＶベクターがＲＰＥに円満に伝達されるものの、リボザイムによって調節されるトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の発現は、光受容体特異的に示されることが確認された。

実施例９：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後に生体内リボザイムの分布確認
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでリボザイムの投与後２週目に全臓器でリボザイム分布を確認した（図１３）。投与後２週目にマウス犠牲後に全臓器を得て、ｇＤＮＡ錠剤を介してｇＤＮＡを取得した。それぞれの臓器の１μｇ ｇＤＮＡを用いてトランススプライシングリボザイム特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。全臓器のうち肝臓組織でトランススプライシングリボザイムを発現するベクターを投与し、全ての個体から検出範囲内でリボザイムが検出された。その他、一部の個体から、肺、小腸、前立腺組織で投与したベクターが検出範囲内でリボザイムが検出され、他の組織では検出されなかった。

実施例１０：正常マウスにトランススプライシングリボザイム投与後の毒性分析
正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で濃度別のトランススプライシングリボザイムの投与後、眼球変化を観察して毒性を確認するために、トランススプライシングリボザイムの投与後の週目ごとのＦｕｎｄｕｓ及びＯＣＴイメージ、Ｈ＆Ｅ染色結果を確認した（図１４）。試験群で網膜下投与によるブレブが形成されることを確認して投与が正常になされたことが確認された（赤い色点線）。一部の個体で角膜の炎症及び硝子体の出血が発生した（白い点線）。Ｈ＆Ｅ染色で確認したとき、３×１０^９ＧＣ／ｅｙｅ以上の濃度を処理した群で水晶体の変性、網膜の変性、及び外側網膜の萎縮、脈絡膜の組織構成炎症の発生を確認した。したがって、１×１０^９ＧＣ／ｅｙｅ以下の濃度では毒性がないことが確認された。

実施例１１：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の網膜電位図検査
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢のマウス）においてトランススプライシングリボザイムの投与後の時間経過による網膜電位図検査の結果である（図１５及び表１）。網膜電位図検査のために桿体系（ｓｃｏｔｏｐｉｃ）ＥＲＧ測定を実施し、Ｂウェーブの振幅を比較した。網膜電位図を評価するために、マウスをケタミンで全身麻酔した後、麻酔点眼剤を眼球に点眼して追加局所麻酔した後、散瞳剤を点眼して散瞳誘導した。マウスを載置台上に乗せてからプローブをそれぞれ尾の尾根部、眉間、角膜に設置した状態でｍｏｎｏ－ｆｌａｓｈ刺激（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ２（１０ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））に対するＥＲＧを測定した。測定が完了すると、マウスの眼球に抗生剤の点眼液を一滴点眼した。分析は、「ＬａｂＳｃｒｉｂｅＥＲＧ（ｉＷｏｒｘ ＤａｔａＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）」のプログラムを用いて実施した。

ロドプシン遺伝子のＰ２３Ｈ突然変異は、細胞内で正常な機能を果たすことができず、桿状細胞（ｒｏｄ ｃｅｌｌ）、円錐細胞（ｃｏｎｅ ｃｅｌｌ）の死滅を誘導して視覚的な機能が退行する。光受容体細胞（ｒｏｄ、ｃｏｎｅ）は、光エネルギーを電気信号に変える役割を果たすが、光受容体細胞の数及び機能が低下すれば、電気信号が減少することになる。このような電気信号に対する評価を網膜電位図の検査（ＥＲＧ）によって確認することで、視覚的な機能差を確認しようと試みた。網膜電位図検査でＢウェーブは、実際の電気信号が伝達されたかを判断する指標であり、ＲＨＯ標的リボザイム（ＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰ）投与によって５週目でＢウェーブが有意に増加したことを確認し、この効果は、８週目まで継続している。したがって、ＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰによって疾患モデルで視覚的機能を保持改善するものと見られる。

実施例１２：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の血清及びリボザイム活性分析
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）でトランススプライシングリボザイムの投与後８週目で血清分析及びリボザイム活性を確認した（図１６）。投与後８週目でもＰＢＳを投与した正常動物（Ｇ１）と、ＰＢＳのみを投与したＧ２群を比較したとき、有効物質によるサイトカインの変化はなかった（図１６Ａ）。実施例７において、２週目でサイトカインの変化を示したのが５週目では正常動物と比較したときに差がなかったことを確認したが、この結果と比較して判断すると、８週目までもサイトカインの変化には影響を与えないことを意味する。

物質の投与後にＲＨＯ ＲＮＡを標的にしてトランススプライシングが８週目にも持続的であるか否かを確認するために、マウスの眼球を摘出して網膜からＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲによってトランススプライシング産物が生成されることを確認した（図１６Ｂ）。これは、組換えＡＡＶベクターが網膜に伝達されてＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰの発現及び作用が８週目まで持続的に引き続いていることを意味する。

実施例１３：組換えウイルスベクターの最適化
網膜への感染能及び発現能を確認するために、様々な組換えＡＡＶベクターを製造した（図１７）。図１７に示したように、５’末端にスプライシング供与／スプライシング受容配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３’末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結された。ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥの配列は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１３に表示されている。最適な物質を選別するために、以前の実施例で使用したＡＡＶベクターとは異なり、様々な組換えＡＡＶ血清（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）及びプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有する物質を生産して利用した。これに対して、ＣＭＶプロモーターとＲＨＯプロモーターを利用し、最終物質に対する効能を確認するためにＹＦＰ蛍光物質は除去し、発現を増加させるためにＷＰＲＥを挿入した。

１３－１：リボザイムの分布及びトランス－スプライシンの効率確認
製造した組換えＡＡＶベクターを疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）に投与した後、３週目でリボザイムの分布及びトランススプライシングを確認した（図１８）。

図１８に表示されたＧ１～Ｇ７の構成は下記の表２の通りである。

血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に対する感染率を確認するために、注入後３週目に眼球を摘出し、網膜とＲＰＥ／ｃｈｏｌｏｉｄを分離してそれぞれＲＮＡ及びｇＤＮＡを抽出してｇＤＮＡを比較したとき、ＡＡＶ血清型５が血清型２あるいは８よりも、網膜及びＲＰＥの両方によく感染した。ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡ分析を同一に進行確認し、ＣＭＶプロモーターによって調節される場合、ＲＰＥにおいてもリボザイムの発現が高く示される一方、網膜ではＣＭＶプロモーターによって調節されることで、ＲＨＯプロモーターによって調節されるリボザイムの発現がさらに高く示されることが確認された（図１８Ａ及び１８Ｂ）。

実際の網膜にトランススプライシングリボザイムが作用してトランススプライシング産物が生成されたかを確認し、ＡＡＶ血清型５にＲＨＯプロモーターから調節される物質のトランススプライシング産物ＰＣＲバンドが濃く示されることが確認された（図１８Ｃ）。

これによって、ＡＡＶ血清型５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥが網膜への伝達及び発現に優れ、トランススプライシングの効率も優れていることが確認された。

１３－２：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の網膜電位図検査
網膜への感染能疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）でトランススプライシングリボザイムの投与後６週目で網膜電位図検査を行った。その結果を図１９及び表３に示した。

正常マウス（Ｇ０）対比Ｐ２３Ｈ－ＲＦＰ疾患マウス（Ｇ１）において光に対するＢウェーブ反応が有意的に低く示されることを確認したが、これは、Ｐ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでＲＨＯ突然変異によって光受容体細胞が損傷することにより電気信号伝達への問題が生じたことを意味する。

疾患モデルにそれぞれのＡＡＶを投与後の網膜電位図を測定したとき、全ての試験群で平均の桿体系Ｂ波振幅（ｓｃｏｔｏｐｉｃ Ｂ－ｗａｖｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）がＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比増加することが確認された。特に、プロモーター間の比較では、ＣＭＶプロモーターよりもＲＨＯプロモーターから調節される場合、ＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比Ｂウェーブが極めて増加し（Ｇ３＜Ｇ４、Ｇ５＜Ｇ６）、血清型間の比較では、ＡＡＶ２／５投与群（Ｇ５、Ｇ６）とＡＡＶ２／８投与群（Ｇ７）でＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比Ｂウェーブが増加した。そのうち、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの投与群が有意的に最も増加したことを確認し、前記試験群では、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの網膜下投与時に疾患モデルの視覚機能の改善効果が最も大きいと判断される。

一方、図１７に示す組換えＡＡＶベクターのうち、ＡＡＶ血清型５あるいは８とＲＨＯプロモーターを含むＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ、ＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの組換えＡＡＶベクターを疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）に投与した後４週目で網膜電位図検査を比較実行し、図２０及び表４に示した。

表４及び図２０に示されたように、投与後４週目でのＢウェーブは、ＰＢＳ投与群（Ｈ２）対比ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）及びＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）において全て有意に増加した。ＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）がＰＢＳ投与群（Ｈ２）とＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）よりも投与前（０ｗｅｅｋ）Ｂウェーブが高かったことを勘案すれば、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）及びＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）のＢウェーブ増加能が類似すると考えられる。したがって、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ又はＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥを網膜下投与時に疾患モデルの視覚機能の改善効果がＰＢＳ投与群（Ｈ２）に比べて非常に優れていると判断される。

１３－３：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後網膜のリボザイム分布及びトランススプライシング確認
以下の表５に示すように、疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）にトランススプライシングリボザイムの投与後６週目に網膜におけるリボザイム分布とトランススプライシングを確認して図２１に示した。

疾患モデルで機能的な効能を確認した後、眼球組織を摘出して網膜ｇＤＮＡとＲＮＡを分離分析し、実施例１３－１の３週目の結果と同様に、ＡＡＶ血清型５が網膜への伝達が円満に行われることが確認された。ＲＮＡを分析したときも、ＡＡＶ血清型５による発現がより優れて示されるだけでなく、ＲＨＯプロモーターによって調節されるリボザイムの発現が高く示されることが確認された。これにより、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの網膜への伝達及び発現が３週目と同様に６週目においても優れていることを示す。

前記結果をまとめると、ｈＲＨＯ－Ｐ２３Ｈ疾患モデルにおいて、ＡＡＶ血清型５及び８による網膜及びＲＰＥへの伝達が効果的であり、ＲＨＯプロモーターによって調節されるトランススプライシングリボザイムが網膜特異的に発現することが確認された。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、投与初期である３週目から６週目に至るまで発現が持続的に行われ、４週目及び６週目に網膜電位図検査による視覚機能を確認したとき、視覚改善に効果を与えることが確認された。

以上で本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、この技術分野にける通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことを明らかにする。したがって本発明の実質的な範囲は添付された請求項とこれらの等価物によって定義されるものと言える。

本発明は、ロドプシン転写体に特異的なトランススプライシングリボザイム及びその用途に関する。

網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ、ＲＰ）は、網膜に分布する光受容体（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）の機能異常により発生し、目に入ってきた光を電気信号に変える役割を果たす網膜の機能が消失する遺伝性及び進行性疾患であって、漸進的な網膜変性が特徴である。病気の初期に杆体光受容体（ｒｏｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）細胞の機能的な異常を暗示する夜盲症を始め、視覚細胞が損傷して末梢視力の喪失をはじめとして次第に視野が狭くなり、窮極的に失明を招く。現在の網膜色素変性症に対する治療法は、視力損失を遅らせるなどの一部の選択肢があるだけで、根本的な治療剤は皆無である。

網膜色素変性症は、様々な網膜視細胞などの遺伝子の突然変異によって発生するが、遺伝の態様は多様であり、常染色体の劣性／優性、Ｘ－関連ＲＰなど、単一遺伝子の異常で観察される全ての遺伝態様に発生し得る。様々な遺伝的な原因のうち、１５～２５％が常染色体の優性ＲＰ（ＡＤＲＰ、Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）である。数多くの遺伝子の突然変異がＡＤＲＰに関わることが知られており、その中でも、ロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ、ＲＨＯ）遺伝子の突然変異は、約３０％に達する高い比率を占めている。

ロドプシンは、網膜の桿状細胞（ｒｏｄ ｃｅｌｌ）に存在するＧＰＣＲ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の１つとして目を通して入ってくる光を電気信号に伝達し、暗いところでさらに多く必要とする。ＲＨＯ遺伝子の突然変異は、桿状細胞の機能障害及び死滅を誘発し、杆体錐体（ｒｏｄ－ｃｏｎｅ）の形態学的異常に続いて円錐細胞（ｃｏｎｅ ｃｅｌｌ）の機能障害及び死滅が続く。ＲＨＯ遺伝子の突然変異は、常染色体の優性ＲＰ（ＡＤＲＰ）を誘発し、視力喪失を招く杆体光受容体（ｒｏｄ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）の変性を誘導、網膜色素変性症を誘発する。この病気に関するＲＨＯ遺伝子の突然変異は、１５０個以上の互いに異なるミスセンス／ナンセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ／ｎｏｎｓｅｎｓｅ）、挿入／結実（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及びスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）の突然変異が知られており、現在も突然変異は持続的に発見されている（非特許文献１）。

様々なＲＨＯ遺伝子の突然変異のうちＰ２３Ｈ突然変異は、ＡＤＲＰ患者で最も多く発見される突然変異である。この突然変異は、ＲＨＯタンパク質のフォールディングに問題が生じて細胞膜へ輸送されず、視覚回路及び光エネルギー伝達に問題が発生する。ＡＤＲＰの場合、突然変異遺伝子の除去及び対立遺伝子である正常（ＷＴ）遺伝子の発現が伴わなければならないため、ＲＨＯ遺伝子の突然変異の除去及び機能的な対立遺伝子ＷＴ ＲＨＯ遺伝子の保全はこの疾患に対して重要な治療法である。

ＬＣＡ（Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ）及び常染色体劣性（ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）ＲＰ（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）治療のために、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（商標名）を用いている。これは眼球の光受容体を保持する機能を担当しているＲＰＥ６５遺伝子の突然変異に対する治療剤である。この製品は、ＲＰＥ６５遺伝子の突然変異患者にのみ限定して使用されるという問題がある。したがって、異なるＲＰ要因であるＲＨＯ遺伝子の突然変異による網膜色素変性症の治療剤が別途必要とされる。

ＡＤＲＰ治療剤として、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを用いた遺伝子矯正技術の適用が可能であるが、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用する場合、１つの遺伝子の突然変異についてのみ矯正可能である。あるいは二重伝達システム（ｄｕａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて正常ＲＨＯ遺伝子を伝達しなければならない。また、様々な突然変異を矯正するためには、各突然変異を標的にすることができる個別のｓｇＲＮＡが必要である。即ち、各個別的な突然変異を矯正することのできる別個のシステムが必要である。また、免疫原性の誘発可能性があるｃａｓ９のような外部タンパク質を共に導入又は発現させなければならない短所を有する。

また、ｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを用いた遺伝子沈黙（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）技術を考えてみることができる。しかし、ｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムと同様に、１つの遺伝子の突然変異についてのみ沈黙するだけでなく、正常（ＷＴ）に取り戻すことができない。正常及び全ての突然変異を標的とするｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡを考慮することができるが、このような製剤と共にＷＴ ＲＨＯ遺伝子を別途導入しなければならない。

上記で説明したように、現在進行中のＲＨＯ－ＡＤＲＰに対して開発中である治療剤の現況は、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）及びｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを用いたＲＮＡターゲット治療剤、遺伝子矯正技術を用いた治療剤が全てである。結論として、これらの従来技術の問題を解決してＡＤＲＰを治療するためには、ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡ発現を誘導できる遺伝子導入が別途必要である。

ここで、本発明者は、トランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を用いて様々な種類のＲＨＯ転写体を除去することができ、同時に、野生型（ＷＴ）ＲＨＯ遺伝子を発現させるための研究を続けることで本発明に至った。

Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１８ Ｊａｎｕａｒｙ；６２：１－２３．

本発明の目的は、ロドプシン転写体を標的として、同時に野生型（ＷＴ）ロドプシン転写体の発現を誘導することができるトランススプライシングリボザイムを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子伝達体を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記遺伝子コンストラクトが含まれた組換え発現ベクターを提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記遺伝子コンストラクトが含まれた組換えウイルスを提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記リボザイム、前記遺伝子コンストラクト、前記組換え発現ベクター、又は前記組換えウイルスを有効成分として含む網膜色素変性症の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記組成物を個体に投与することを含む網膜色素変性症の予防又は治療方法を提供することにある。

このような発明が解決しようとする技術的な課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載によって、この技術分野の当業者が明確に理解できるものである。

前記課題を解決するために、本発明は、ロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムを提供する。具体的に、ロドプシン転写体を標的として、同時に野生型（ＷＴ）ＲＨＯ転写体の発現を誘導できる、トランススプライシングリボザイムを提供する。

本発明の一実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造を有してもよい。

本発明の他の実現例として、トランススプライシングリボザイムは、前記リボザイム^＊次の３’方向にエクソン（ｅｘｏｎ）領域をさらに含んでもよい。即ち、前記トランススプライシングリボザイム、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造にエクソン（ｅｘｏｎ）が連結され、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’の構造を有するが、エクソンの部分には正常ロドプシン遺伝子が連結されてもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＩＧＳ領域は、ロドプシン転写体（ＲＮＡ）に特異的に結合してＧ／Ｕゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成できる５～１０ｎｔの長さの塩基配列からなるものであってもよい。

具体的に、前記ＩＧＳ領域は、ロドプシン転写体の＋３０、＋３５、＋４２、＋４３、＋５２、＋５４、＋５５、＋５９、＋７５、＋９７、＋１１６、＋１２２、＋１２３、＋１２７、＋１３２、＋１４０、＋１５４、＋１６５、＋１７１、＋１８７、＋１９１、＋２０７、＋２１５、＋２２２、＋２３０、＋２３２、＋２４４、＋２５６、＋２６２、＋２７３、＋２９８、＋３０８、＋３８１、＋４０３、＋６６１又は＋６８８部位、好ましくは、＋５９部位の塩基を含む領域と相補的に結合し、Ｇ／Ｕゆらぎ塩基対を形成できる５－１０ｎｔの長さの塩基配列からなるものであってもよい。前記部位は、配列番号１に表示される部位で確認される。

本発明の更なる実現例として、ロドプシン転写体は、ロドプシン突然変異を含んでもよい。

前記ロドプシン突然変異は、配列番号１に表示される野生型ロドプシン転写体の１番～１１４２番の間の塩基のうち少なくとも１つの塩基に発生した突然変異であってもよい。具体的に、前記ロドプシン突然変異転写体は、下記からなる突然変異群より選択される少なくとも１つを含んでもよいが、必ずしもこれらに制限されず、既に知られている、あるいは新たに発見されるロドプシン突然変異転写体を全て含むことができる。

Ｌ３２８Ｐ、Ｔ３４２Ｍ、Ｑ３４４Ｒ／Ｐ／ｔｅｒ、Ｖ３４５Ｌ／Ｍ、Ａ３４６Ｐ、Ｐ３４７Ａ／Ｒ／Ｑ／Ｌ／Ｓ／Ｔ、ｔｅｒ３４９／Ｑ／Ｅ、Ｎ１５Ｓ、Ｔ１７Ｍ、Ｖ２０Ｇ、Ｐ２３Ａ／Ｈ／Ｌ、Ｑ２８Ｈ、Ｇ５１Ｒ／Ｖ、Ｐ５３Ｒ、Ｔ５８Ｒ／Ｍ、Ｖ８７Ｄ／Ｌ、Ｇ８９Ｄ、Ｇ１０６Ｒ／Ｗ、Ｃ１１０Ｆ／Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｅ１１３Ｋ、Ｌ１２５Ｒ、Ｗ１６１Ｒ、Ａ１６４Ｅ／Ｖ、Ｃ１６７Ｒ／Ｗ、Ｐ１７１Ｑ／Ｌ／Ｓ、Ｙ１７８Ｎ／Ｄ／Ｃ、Ｅ１８１Ｋ、Ｇ１８２Ｓ／Ｖ、Ｃ１８５Ｒ、Ｃ１８７Ｇ／Ｙ、Ｇ１８８Ｒ／Ｅ、Ｄ１９０Ｎ／Ｇ／Ｙ、Ｈ２１１Ｒ／Ｐ、Ｃ２２２Ｒ、Ｐ２６７Ｒ／Ｌ、Ｓ２７０Ｒ、Ｋ２９６Ｎ／Ｅ／Ｍ、Ｒ１３５Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｗ、Ｔ４Ｋ†、Ｔ１７Ｍ†、Ｍ３９Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｇ９０Ｖ、Ｍ４４Ｔ、Ｖ１３７Ｍ、Ｇ９０Ｄ、Ｔ９４Ｉ、Ａ２９２Ｅ、Ａ２９５Ｖ、Ｆ４５Ｌ、Ｖ２０９Ｍ、Ｆ２２０Ｃ、Ｐ１２Ｒ、Ｒ２１Ｃ、Ｑ２８Ｈ、Ｌ４０Ｒ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｒ、Ｆ５２Ｙ、Ｆ５６Ｙ、Ｌ５７Ｒ、Ｙ６０ｔｅｒ、Ｑ６４ｔｅｒ、Ｒ６９Ｈ、Ｎ７８Ｉ、Ｌ７９Ｐ、Ｌ８８Ｐ、Ｔ９２Ｉ、Ｔ９７Ｉ、Ｖ１０４Ｆ、Ｇ１０９Ｒ、Ｇ１１４Ｄ／Ｖ、Ｅ１２２Ｇ、Ｗ１２６Ｌ／ｔｅｒ、Ｓ１２７Ｆ、Ｌ１３１Ｐ、Ｙ１３６ｔｅｒ、Ｃ１４０Ｓ、Ｔ１６０Ｔ、Ｍ１６３Ｔ、Ａ１６９Ｐ、Ｐ１７０Ｈ／Ｒ、Ｓ１７６Ｆ、Ｐ１８０Ａ／Ｓ、Ｑ１８４Ｐ、Ｓ１８６Ｐ／Ｗ、Ｙ１９１Ｃ、Ｔ１９３Ｍ、Ｍ２０７Ｒ／Ｋ、Ｖ２１０Ｆ、Ｉ２１４Ｎ、Ｐ２１５Ｌ／Ｔ、Ｍ２１６Ｒ／Ｌ／Ｋ、Ｒ２５２Ｐ、Ｔ２８９Ｐ、Ｓ２９７Ｒ、Ａ２９８Ｄ、Ｋ３１１Ｅ、Ｎ３１５ｔｅｒ、Ｅ３４１Ｋ、Ｓ３４３Ｃ及びＱ３１２ｔｅｒ。

より具体的に、前記リボザイムは、ロドプシンＰ２３Ｈ突然変異転写体を標的とすることができるが、必ずしもこれに制限されることはない。前記ロドプシンＰ２３Ｈ突然変異は、正常ロドプシンの２３番目の部位でプロリンがヒスチジンで突然変異が生じたものである。

前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号２～配列番号４のいずれか１つに表示される塩基配列を含むか、これからなるものであってもよい。

また、本発明のトランススプライシングリボザイムは、前記配列番号２～配列番号４のいずれか１つに表示される塩基配列と配列の相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上である配列は全て含む。

本発明の一実施形態として、前記リボザイムの５’－末端方向にアンチセンス（ＡＳ）をコーディングするヌクレオチドが連結されてもよい。

前記アンチセンスは、標的ロドプシン転写体に相補的な配列であってもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＡＳ領域の長さは１０ｎｔ～２１０ｎｔ、好ましくは、５０ｎｔ～１５０ｎｔであってもよい。

本発明の更なる実現例として、前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号６からなるＩＧＳ領域を含み、配列番号１０の１５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含んでもよい。

本発明が異なる実現例に係る前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造、又は、５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム^＊－３’構造、又は、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’、又は、５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム^＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’構造の構造体を含んでもよい。

本発明の更なる実現例として、前記ＩＧＳ領域とＡＳ領域との間には５～２０個のランダムなヌクレオチドが含まれ、前記ランダムなヌクレオチドの配列は制限酵素の配列であってもよく、前記ランダムなヌクレオチドの配列は、好ましくは、８ｎｔの長さであってもよく、図４に図式化されたＰ１（配列番号７）及びＰ１０配列（配列番号８及び配列番号９）を含んでもよい。

本発明の更なる実現例として、前記リボザイム^＊領域は、配列番号５に表示される塩基配列を含むか、これからなるものであってもよい。

また、前記上記リボザイム^＊領域は、前記配列番号５に表示される塩基配列と配列の相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上の配列は全て含む。

本発明の更なる実現例として、前記エクソン領域は、正常ロドプシン遺伝子配列を全て又は一部又は最適化されたＲＨＯ遺伝子配列を全て又は一部を含んでもよい。

本発明において、「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」とは、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質で構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な３次構造を有するＲＮＡ分子で化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的な特性を有し、いくつかのリボザイムは、自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害することが明らかになり、他のリボザイムは、リボソームのアミノ伝達酵素（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を触媒することが確認された。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム、及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれてもよい。

本発明において、具体的にトランススプライシング機能を有するリボザイム、より具体的に、ロドプシン転写体に関する特定遺伝子を標的にするトランススプライシングリボザイムを含むことができる。

本発明において、「トランススプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）リボザイム」は、別途存在する標的ＲＮＡとリボザイムのＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との塩基結合によって標的ＲＮＡを認知して切断した後、切断された標的ＲＮＡの標的塩基のすぐ後にリボザイムの３’エクソンを連結させる反応である、トランススプライシング機能を有するリボザイムを意味する。

本発明において、リボザイムの配列は、ＤＮＡ及びこれに対応するＲＮＡ配列で表示されてもよく、ＤＮＡ配列で表示される場合、これに対応するＲＮＡ配列も本発明の範囲に含まれることはこの技術分野において極めて自明であると言える。

本発明において、「ロドプシン転写体、又はＲＨＯ転写体又はＲＨＯ ＲＮＡ」とは、正常ロドプシン又はロドプシン突然変異遺伝子又はこれらの組み合わせの転写によって作られた物質（例えば、ＲＮＡ）を指す。本発明では、正常ロドプシン転写体と突然変異ロドプシン転写体とを区分するために、「ロドプシン突然変異転写体」は「ＲＨＯ突然変異転写体」又は「ＲＨＯ突然変異ＲＮＡ」又は突然変異の部位により「Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ」などと表示し、「正常ロドプシン転写体」は、「ＷＴ ＲＨＯ転写体」又はＷＴ ＲＨＯ又は「ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡ」と表示する。

また、「ロドプシン突然変異転写体部位のうち少なくとも１つを標的とするトランススプライシングリボザイム」とは、細胞内に注入されたときに網膜色素変性症に関与するロドプシンＲＮＡを認識し、選択的なトランススプライシング反応を起こすように遺伝的に操作された形態のリボザイムを意味し、この技術分野において幅広く知られている方法によって制作することができる。例えば、リボザイムの５’末端に標的ＲＮＡの保全的部位に特異的な相補性配列を連結させることで、特定のＲＮＡを標的とする基質特異性を有することができる。

参考として、この技術分野でロドプシン突然変異遺伝子に関する情報はすでに多く知られている（非特許文献１、及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｔｉｎａ－ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｓｃｉ－ｎｅｗｓ／ｒｈｏｍｕｔ．ｈｔｍなどを参考）。

本発明は、予め知られたロドプシン突然変異遺伝子情報に基づいて、「ロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイム」を制作し、突然変異ロドプシンを正常（野生型、ＷＴ）ロドプシンに変える技術である（図１）。

機能的異常を誘発するＲＨＯ突然変異は、５’－ＵＴＲ部位のダウンストリームで主に発生する。本発明のトランススプライシングリボザイムは、５’－ＵＴＲ部位を標的としてトランススプライシングによって、突然変異を含むＲＨＯ転写体を切り出すと共に、ＷＴ ＲＨＯ転写体の発現を誘導することができる。即ち、本発明のトランススプライシングリボザイムは、突然変異の種類に関係なく、疾患の治療及び／又は予防の用途に利用することができる。

また、本発明のトランススプライシングリボザイムが正常ロドプシン転写体を標的とすることもできるが、この場合、再び正常ロドプシンに変形するため、本発明のトランススプライシングリボザイムは正常ロドプシンに影響を与えない。

他の態様において、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムを含む非ウイルス性遺伝子伝達体を提供する。具体的に、前記トランススプライシングリボザイムをＲＮＡ形態に非ウイルス性遺伝子伝達体に担持して生体内に直接伝達することができる。

前記非ウイルス性遺伝子伝達体は、リポソーム、脂質ナノ粒子であってもよいが、必ずしもこれらに制限されることなく、この技術分野で知られている非ウイルス性遺伝子の伝達方法であればいずれのものも利用可能である。

前記リポソームは、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、リポフェクタスなどを使用してもよく、セルフェクチン、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、リポフェクチン、ポフェクタミンＬＴＸ、ＲＮＡｉＭＡＸ、ポフェクタミン２０００、ポフェクタミン３０００、ＤＯＴＡＰ、ＳＡＩＮＴ－ＲＥＤ、Ａｖａｌａｎｃｈｅ－Ｏｍｎｉ、ＥＸ ｐｌｅｘ、ｐｏｌｙｆｅｃｔ、ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ、ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔなど、市販のリポソームを制限されることなく使用できる。

脂質ナノ粒子構成要素のうちリン脂質は、脂質ナノ粒子内でイオン化可能な脂質及び薬物が相互作用して形成されたコアを囲んで保護する役割を果たし、ターゲット細胞のリン脂質二重層と結合して、薬物の細胞内に伝達時に細胞膜の通過及びエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を容易にする。

前記リン脂質は、脂質ナノ粒子の融合を促進できるリン脂質が制限されることなく使用でき、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、ＰＯホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］（ＤＯＰＳ）、１、２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

陽イオン性脂質伝達体は、主に陽イオン性脂質からなるナノメートルのサイズのリポソームや脂質素材ナノ粒子の陽電荷を用いて陰電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用により細胞内に伝達する方法である。細胞内に伝達された複合体は、エンドソームからリソソームに１次伝達された後、細胞質に抜け出て発現する。陽イオン性高分子伝達体は、脂質の代わりに高分子を使用することを除外すれば、陽イオン性脂質伝達体に類似の方式で遺伝子を伝達し、代表的な陽イオン性高分子として、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムに正常ロドプシン遺伝子のような目的遺伝子を連結した後、これを非ウイルス性遺伝子伝達体に担持することができる。前記非ウイルス性遺伝子伝達体を用いてＲＨＯ転写体を標的にし、正常ロドプシン遺伝子を伝達することができる。

他の態様において、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムを含む遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供する。

前記コンストラクトは、前記リボザイムの３’－末端方向に目的遺伝子が追加的に連結されてもよい。これは、前記言及したエクソン（ｅｘｏｎ）領域に目的遺伝子が追加的に連結されることを意味する。

前記目的遺伝子は、正常ロドプシン遺伝子及び／又はリポーター遺伝子であってもよい。

前記リポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び増強された藍色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）からなる群より選択される１種以上であってもよいが、必ずしもこれらに制限されず、この技術分野で知られたリポーター遺伝子は全て利用することができる。

目的遺伝子として、リポーター遺伝子を挿入させることでロドプシン転写体特異的なリボザイムの発現程度を観察することができる。

前記遺伝子コンストラクトは、前記遺伝子コンストラクトに作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでもよい。

前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＣＡＧ（ＣＭＶ ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ ＋ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＳＤ＋ｒａｂｂｉｔ ｂｅｔａ－Ｇｌｏｂｉｎ ＳＡ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、呼吸器細胞融合ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）プロモーター、ＬＴＲプロモーターなどの原核細胞又は哺乳類ウイルスのプロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ベータアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ１－アルファ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）プロモーター、ＩＬ－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）遺伝子プロモーター、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーター、ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターなどの動物細胞プロモーター、ＲＨＯ（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）遺伝子プロモーター、ＲＫ（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、ＲｅｄＯ（ｒｅｄ ｏｐｓｉｎ）遺伝子プロモーターなどのような網膜組織特異プロモーターなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これらに制限されることはない。

本発明において、「遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、標的ロドプシン転写体部位に対する特異性を高めるためのエレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む構造体を意味する。具体的に、前記トランススプライシングリボザイムを含む構造体であってもよい。

前記コンストラクトのトランススプライシングリボザイムに追加的に連結されるアンチセンス配列は、標的ロドプシン転写体に対する特異性を増加させて治療効果を高めるためのもので、このような目的を達成するための配列であれば、制限されることなく含まれてもよい。

また、本発明に係るコンストラクトは、リボザイムがロドプシン転写体部位を標的にし、標的ロドプシン転写体特異的なアンチセンス配列を含んでおり、ロドプシン転写体が発現する細胞にのみ特異的に発現してもよい。

図２は、本発明の一実施形態により製造した、プロモーター、トランススプライシングリボザイム領域、正常ロドプシン遺伝子領域を含む遺伝子コンストラクト基本構成を示す模式図である。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトが含まれた組換え発現ベクターを提供する。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトが含まれた組換えウイルスを提供する。

前記ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスからなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、必ずしもこれらに制限されず、この技術分野で使用できるウイルスであれば、いずれのものも使用できる。

本発明で用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子の作製物をいう。本発明で用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節の配列及び目的とするタンパク質をコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、リボザイム暗号化配列は、プロモーターに作動可能に連結させることによって、リボザイム暗号化配列の発現は、このプロモーターの影響又は調節下にある。２つの核酸配列（リボザイム暗号化配列とこの配列の５’末端のプロモーター部位配列）は、プロモーター作用が誘導されることによってリボザイム暗号化配列が転写される場合に作動可能に連結されたものであり、前記２つの配列間の連結特性がフレーム変更突然変異（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導せず、発現の調節配列がリボザイムの発現を支配する能力を阻害しない場合、作動可能に連結されたという。組換えベクターとの作動可能な連結は、当技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位－特異的ＤＮＡの切断及び連結は、この技術分野で一般に知られた酵素などを用いてもよい。

本発明のベクターは、プロモーター、オペレーター、コザックコドン、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素の他にも、標的化又は分泌のための信号配列又はリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。ベクターのプロモーターは構成的又は誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製の起源を含み得る。ベクターは、自己複製するか、又は宿主ＤＮＡに統合されてもよい。前記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、又はウイルスベクターなどを含んでもよく、具体的に、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスなどに由来するベクターを含むが、これらに制限されることはない。

本発明の更なる一実施形態は、前記組換えベクターが導入された形質転換細胞を提供する。

本発明において、用語「導入」は、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって外来の遺伝子を細胞に流入させることを意味する。形質感染は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介形質感染法、ポリブレン媒介形質感染法、エレクトロポレーション法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法など、この技術分野で公知の様々な方法によって実行されてもよい。また、形質導入は、感染を手段として、ウイルス又はウイルスベクター粒子を用いて細胞内に遺伝子を伝達することができる。

本発明において、用語「形質転換細胞」は、宿主細胞に目的とするポリヌクレオチドを導入した細胞を意味する。

形質転換は、前記「導入」方法によって行われてもよく、この技術分野で公知のように宿主細胞により適切な標準技術を選択して行うことができる。

具体的に、本発明の形質転換細胞は、ロドプシン転写体を標的にするリボザイムをコーディングするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを導入させて製造したものであってもよい。

本発明の一具体例として、前記組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）であってもよい。具体的に、本発明に係るトランススプライシングリボザイムをコーディングするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されたものである、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）であってもよい。

前記組換えＡＡＶは、ＡＡＶの天然又は人工由来の血清型又は単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）又は系統群（ｃｌａｄｅ）であってもよい。

前記トランススプライシングリボザイムをコーディングするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～５のいずれか１つと、７０％以上、８０％以上、又は、９０％以上の配列の相同性を有するものであってもよい。

前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はＲＨＯプロモーターであってもよい。

前記組換えＡＡＶは、追加的な調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含んでもよい。

前記調節配列は、スプライシング供与／スプライシング配列（ＳＤＳＡ）及び／又はＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｐｏｓｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）配列であってもよい。

本発明に係るＳＤ／ＳＡは、転写開始（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）とＲＮＡ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＩＩのプロセッシング及びｍＲＮＡの核で細胞質への移動（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｏｒｔ）を増加させる。

本発明に係るＷＰＲＥは、ｍＲＮＡのプロセッシングと核から細胞質への移動を増加させ、それぞれｐｒｅ－ｍＲＮＡのレベルを増加させることができる。上記のような構成によって、細胞内でリボザイムのＲＮＡレベルを著しく増加させて生体内において機能を向上することができる。

本発明に係るＳＤ／ＳＡ配列は、ＲＮＡ転写体のイントロンを除去するスプライシング反応において、切り取られるイントロンの開始部分と終了部分に該当する配列であって、一般に、ＳＤ配列は、イントロン５’末端のＧＵ配列であってもよく、ＳＡ配列は、イントロンの３’末端のＡＧ配列であってもよい。

本発明に係るＷＰＲＥは、ＤＮＡに転写を促進する３次構造を誘導し、遺伝子の発現を増加させる配列を意味する。

本発明において、前記ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１３の配列を含んでもよいが、目的遺伝子の発現カセット内に存在しながら目的遺伝子の発現を促進させ得る限り、これらに制限されることはない。

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの天然又は人工由来血の清型又は単離体又は系統群に由来し得る。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然ＡＡＶウイルスゲノムであるか、又は人工的に作られたＡＡＶウイルスゲノムであり得る。当業者に知られているように、ＡＡＶウイルスは、様々な生物学的なシステムにより分類されてもよい。

一般に、ＡＡＶウイルスは、それらの血清型に応じて称される。血清型は、自身のカプシド表面の抗原の発現プロファイルのために、他の変異体の変種と区別するのに使用され得る独特の反応性を有するＡＡＶの変異体の変種（ｖａｒｉａｎｔ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）に該当する。一般に、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と交差反応が効率的に発生しない。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１を含み、また、最近霊長類の脳で確認されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３のような組換え血清型も含む。

本発明に使用するために特に関心のある血清型は、網膜色素上皮のような眼球内の組織に効率よく形質導入されるＡＡＶ２、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８を含む。ＡＡＶ血清型のレビューは、Ｃｈｏｉら（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）及びＷｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；１４（３）、３１６－３２７）に見られる。

ＡＡＶウイルスはまた、系統群又はクローンの観点で称される。これは天然又は人工由来のＡＡＶウイルスの系統発生学的な関係、及び一般に共通先祖に遡ることができるＡＡＶウイルスの系統発生学的な群を示し、その全ての子孫を含む。また、ＡＡＶウイルスは自然で探すことができるか、又は人工的に操作された、特定のＡＡＶウイルスの遺伝的な単離体のような特定の単離体に応じて称されてもよい。用語の遺伝的な単離体（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｅ）は、他の天然ＡＡＶウイルスと制限的な遺伝子の混合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｉｘｉｎｇ）が発生し、それによって遺伝子レベルで認識可能に区別される別個の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を定義する、ＡＡＶウイルス集団を記述する。

一般に、ＡＡＶの天然又は人工由来の血清型又は単離体又は系統群のＡＡＶゲノムは、１つ以上の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、ｃｉｓ位置で機能的な複製基点を提供する役割を果たし、細胞のゲノムからベクターの融合及びそれからの切断を可能にする。好ましい具体例として、１つ以上のＩＴＲ配列は、Ｒｅｐ－１又はその変異体をコーディングするポリヌクレオチド配列をフランク（ｆｌａｎｋ）する。

ＡＡＶゲノムはまた、一般にＡＡＶウイルス粒子のためのパッケージング機能をコーディングするｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子のようなパッケージング遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０又はその変異体タンパク質の１つ以上をコーディングする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３又はその変異体のような１つ以上のカプシドタンパク質をコーディングする。このようなタンパク質がＡＡＶウイルス粒子のカプシドを構成している。プロモーターは、各パッケージング遺伝子に作動可能に連結されている。

本発明のベクターに使用されるＡＡＶゲノムは、天然又は人工ＡＡＶウイルスの全体ゲノムであってもよい。例えば、全体ＡＡＶゲノムを含むベクターがインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＡＡＶウイルスを製造するために使用されてもよい。しかし、このようなベクターは、原則として患者に投与され得る。好ましくは、ＡＡＶゲノムは、患者に投与するための目的として誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅ）される。このような誘導体化は、この技術分野の標準であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの周知の誘導体及びこの技術分野に知られた方式を適用して生成され得る誘導体の利用を含む。

更なる態様において、本発明は、前記言及した遺伝子コンストラクトを含む非ウイルス性遺伝子伝達体を提供する。

前記非ウイルス性遺伝子伝達体はリポソーム、脂質ナノ粒子であってもよいが、必ずしもこれらに制限されることなく、この技術分野で周知の非ウイルス性遺伝子伝達方法であれば、いずれも利用可能である。これに対する具体的な説明は前述したため省略する。

更なる態様において、本発明は、前記リボザイム、前記非ウイルス性遺伝子伝達体、前記遺伝子コンストラクト、前記組換え発現ベクター、又は前記組換えウイルスを有効成分として含む網膜色素変性症の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

更なる態様において、本発明は、前記薬学組成物を個体に投与することを含む網膜色素変性症の予防又は治療方法を提供する。

本発明において使用された「予防」という用語は、本発明に係る薬学組成物の投与で網膜色素変性症の発症を遅延させる全ての行為を意味する。

本発明において使用された「治療」という用語は、本発明に薬学組成物の投与で網膜色素変性症が好転したり、有利に変更したりする全ての行為を意味する。

本発明に係る医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、目的とする方法により経口投与するか、又は非経口投与することができるが、非経口で投与することが好ましい。非経口の投与として眼球内に物質を投与できる経路は３つあり、硝子体内注射法（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上内注射法（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注射法（ｓｕｎｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）がある。

本発明の一実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、標的とする細胞が光受容体細胞として最も効率的であり、直接的に伝達できる投与経路として網膜下注射方法により投与することができる。本発明に係る注射剤は患者に投与するとき、そのまま利用できるように滅菌媒質に分散した形態であってもよく、投与時に注射用蒸留水を加えて適切な濃度で分散させてから投与する形態であってもよい。また、注射剤で製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などと混合されてもよく、単位投薬アンプル又は多重投薬の形態に製造されてもよい。

具体的に、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を活用して、ヒトの誘電体に直接挿入する方法ではなく、エピソーマル状態で本発明に係るトランススプライシングリボザイムの発現を誘導し、標的ＲＨＯ転写体の除去及びＷＴ ＲＨＯタンパク質の発現を誘導してもよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態、及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路、及び時間により異なるが、当業者によって適切に選択され得る。一方、本発明に係る医薬組成物は単独に使用されるか、又は他の治療剤と並行して使用されるか、又は外科的な手術療法などの補助治療方法と並行して使用されてもよい。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、標的ロドプシン転写体を除去すると共に、正常（野生型）ロドプシン遺伝子（ＲＮＡ）に置換して正常ロドプシン遺伝子を発現させる効果を提供する。したがって、本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、網膜色素変性症を根本的に治療する効果を提供する。特に、標的転写体部位は、全ての種類のロドプシン突然変異を含むロドプシン転写体を標的とすることができる部位を選択することで、１つの治療剤が様々なロドプシン突然変異患者に全て適用され得るという長所がある。また、患者細胞内で発現する標的ロドプシン転写体の発現量に応じて正常ロドプシンタンパク質を発現させることができるため、過剰な正常ロドプシンタンパク質の発現による副作用及び毒性誘導も最小化することができる。また、トランススプライシングリボザイムによるＲＮＡ置換機能は、内生細胞機作（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を利用することなく、細胞内における機能のために外部のタンパク質導入が必要でないトランススプライシングリボザイムのＲＮＡ自体の機作で作動することから、より安全な治療剤になり得る。

本発明に係るＲＨＯ転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムの機作を示した模式図である。 本発明の一実施形態により製造した、プロモーター、トランススプライシングリボザイム領域、正常ロドプシン遺伝子領域を含む遺伝子コンストラクトの基本構成を示す模式図である。 インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるＲＨＯ ＲＮＡの標的部位の選定過程及びその結果を示した模式図である。 インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるＲＨＯ ＲＮＡの標的部位の選定過程及びその結果を示した模式図である。 本発明の一実施形態に係るロドプシンＲＮＡ＋５９番目の塩基部位を標的とするトランススプライシングリボザイム（以下、「ＲＨＯ標的リボザイム」という）を含むコンストラクトの最適化過程を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むベクター模式図である。 ＲＨＯ標的リボザイムを最適化するために２９３Ａ細胞でコンストラクトの活性を比較する結果を示したものである。 ＲＨＯ標的リボザイムのインビトロ効能をｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを用いて確認した結果である。 ＲＨＯ標的リボザイムの様々な突然変異に対するインビトロ効能を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムをアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）ベクターで発現させるための組換えＡＡＶ発現ベクターの模式図である。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患動物モデルでリボザイムの効能を確認した結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患動物モデルでリボザイムの効能を確認した結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の血清内免疫及び炎症反応結果を示したものである（Ａは投与後２週、Ｂは投与後５週の結果である）。 本発明の一実施形態に係る動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の網膜（Ｒｅｔｉｎａ）と網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）組織でリボザイムの効能を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルでＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の生体内リボザイムの分布を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る正常マウスにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の毒性を分析した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の網膜電位図検査を行った結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含むＡＡＶベクター投与後の血清（Ａ）、及びリボザイムの活性を分析した結果である（Ｂ）。 本発明の一実施形態に係るＲＨＯ標的リボザイムを含む様々な組換えＡＡＶベクターの制作模式図である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後３週目のリボザイム分布及びトランススプライシング活性を確認した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜電位図を検査した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜電位図を検査した結果である。 本発明の一実施形態に係る疾患動物モデルにＲＨＯ標的リボザイムを含む組換えＡＡＶベクター投与後の網膜のリボザイム分布及びリボザイムＲＮＡ発現を確認した結果である。

本発明は、多様な変換を加えることができ、様々な実施例を有することができるが、以下に特定の実施例を図面に例示して、詳細な説明で詳しく説明することにする。しかし、これは、本発明を特定の実施例について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものとして理解しなければならない。本発明の説明において、関連する公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を曖昧にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。

実施例１：ロドプシン（ＲＨＯ）ＲＮＡ標的トランススプライシングリボザイムの設計
ターゲットＲＮＡ部位を選定するために、ＲＨＯ ＲＮＡ変異体の配列を比較し、ＲＨＯ ＲＮＡ標的トランススプライシングリボザイムを設計した（図２）。

実施例２：インビトロマッピング及び細胞内マッピングによるロドプシン（ＲＨＯ）ＲＮＡの標的部位選定
ＷＴ ＲＨＯ ＲＮＡあるいはＰ２３Ｈ ＲＨＯ ＲＮＡとリボザイムＲＮＡライブラリーを用いてインビトロマッピング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｐｐｉｎｇ）及び細胞内マッピングを行った。インビトロマッピングのために、テストチューブでロドプシンＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムとを混合して反応させてからＲＴ－ＰＣＲを行った後、トランススプライシング産物として予想されるＰＣＲ ＤＮＡバンドの配列分析によってトランススプライシングが発生したロドプシンＲＮＡ部位を確認した。

より具体的に、ロドプシンＲＮＡをインビトロ転写過程により合成し、５’末端にランダムな配列（ＧＮＮＮＮＮ）を有するトランススプライシングＲＮＡライブラリーをインビトロ転写過程により合成した。ロドプシンＲＮＡ０．１ｐｍｏｌｅを１Ｘインビトロトランススプライシング反応バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）と混合して合計１０ｕＬに作り、リボザイムライブラリーＲＮＡ１ｐｍｏｌｅを１Ｘインビトロトランススプライシング反応バッファと混合して合計９ｕＬに作った後、１ｍＭ ＧＴＰ１ｕＬを入れて最終０．１ｍＭ ＧＴＰに濃度を合わせた。これをそれぞれ９５℃で１分、３７℃で３分反応させ、２つを混合した後、３７℃で３時間反応させた。反応液をフェノール抽出／ＥｔＯＨ沈殿過程を経てＲＮＡを回収した後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、リボザイム特異ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）を入れた後、２０ｕＬ体積条件で逆転写によりｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ ２ｕＬを用いてロドプシンＲＮＡ、特に、５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、リボザイム特に３’プライマー（ＲＹ－ＴＳ）（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）をそれぞれ１０ｐｍｏｌｅずつ用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で３５サイクルのＰＣＲを実行し、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認した。確認された全てのＰＣＲ産物をフェノール及び沈殿過程を経てバッファチェンジした後、ロドプシンＲＮＡのいずれかの部位でトランススプライシング反応が生じたかを塩基配列分析によって確認した。トランススプライシングのシークエンシングによって分析した結果、ＲＨＯ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ部分である５９番目のサイトを最もよくターゲッティングすることが確認された（図３Ａ及び図３Ｂ）。

細胞内マッピングのために、テストチューブにロドプシンＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムとを混合して細胞内の共同形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。具体的に、２９３Ａ細胞を３５ｍｍ培養皿に１×１０^５個に分注した後、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーターに培養した。１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温でそれぞれ放置した。その後、前記２つのチューブの内容物を混合し、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後にチューブを１０秒間遠心分離した後、それぞれの細胞上に撒いて共同形質注入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しいバッジに取り替えた。３７℃で５％、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）５００ｕｌ処理してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ５μｇをＤＮａｓｅ Ｉ１μｌを処理してｇＤＮＡを除去し、そのうち、１μｇをリボザイム特異ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）を入れた後、２０ｕＬ体積条件で逆転写によってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ２ｕＬを用いてロドプシンＲＮＡ、特に５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、リボザイム、特に、３’プライマー（ＲＹ－ＴＳ）（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）をそれぞれ１０ｐｍｏｌｅずつ用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で３５サイクルのＰＣＲを実行し、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認した。確認された全てのＰＣＲ産物をフェノール及び沈殿過程を経てバッファチェンジした後、ロドプシンＲＮＡのいずれかの部位でトランススプライシング反応が生じたかを塩基配列分析によって確認した。

実施例３：トランススプライシングリボザイムの製造
配列番号１に表示されるＷＴ ＲＨＯ、そして、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ配列のうち＋５９番目の塩基部位をターゲットにするトランススプライシングリボザイムを含むコンストラクトを最適化した（図４）。前記ターゲット部位は、ＲＨＯ ＲＮＡの＋５９位置の塩基を含み、５’末端に前記ターゲット部位を標的とし得るＩＧＳ（５’－ＧＣＣＣＡＡ－３’：配列番号６）を導入した。細胞内におけるＲＨＯ ＲＮＡ ＋５９塩基を標的とするリボザイム（以下、「ＲＨＯ標的リボザイム」という）のトランススプライシング活性を分析するために、改善されたＲＨＯ標的リボザイムコンストラクトを製造した。６－ｎｔの長さのＩＧＳだけを有するグループＩイントロンは、哺乳類の細胞内で発現したときに不活性化するか、又は非特異的な活性を示すと知られているためである。改善されたＲＨＯ標的リボザイムコンストラクトを製造するために、リボザイムのＩＧＳアップストリームに延長されたＰ１（配列番号７）及び７－ｎｔの長さのＰ１０螺旋（配列番号８及び配列番号９）を含む相補的なオリゴヌクレオチドを挿入することでリボザイムを変形した。

実施例４：トランススプライシングリボザイムの最適化
実施例３で製造した第１、第２、及び第３デザインのＲＨＯ標的リボザイムのうち、トランススプライシングに最適化されたＲＨＯ標的リボザイムを確認するためにＲＨＯ標的リボザイムを含むベクターを制作した（図５）。

図５において、ＡＳ１５０は配列番号１０に、ＳＤ／ＳＡは配列番号１１に、５’ＵＴＲ一部の配列は配列番号１２に表示される。Ｔ２Ａはリンカー配列であり、ＹＦＰは蛍光蛋白質配列であって、この技術分野で幅広く知られているため具体的な配列表示は省略する。ｐｏｌｙＡ配列についてもこの技術分野において幅広く知られている。

ＲＨＯ標的リボザイムの３つのデザイン間のリボザイム効果をインビトロ（哺乳動物細胞）で比較検証した。その結果を図６に示した。第１デザインと第２デザインを比較したとき、第２デザインのトランススプライシング作用がより優れていることが確認された（図６Ａ）。第２デザインと第３デザインを比較したとき、第２デザインによるトランススプライシング効率がより優れていることが確認された（図６Ｂ）。第２デザインを選択してリボザイムの特異性及び効率性を最適化するためにアンチセンスの長さを調節して比較し、アンチセンス１５０個の長さ（配列番号１０）が最も効果が優れていることが確認された（図６Ｃ）。トランススプライシング産物が正確にトランススプライシングされたかを確認するためにシークエンシングを行い、標的部位でトランススプライシングが発生したことが確認された（図６Ｄ）。

実施例５：インビトロでトランススプライシングの活性分析
ＲＨＯ標的リボザイムのインビトロ効能をｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを用いて確認した。陽性対照群としてＹＦＰがタグされた野生型ＲＨＯ（ｗｉｌｄ Ｒｈｏ－ＹＦＰ）を用いた。ロドプシンｍＲＮＡが安定的に発現する２９３Ａ ＷＴ ＲＨＯ、２９３Ａ Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞株を制作し、この細胞株を介して機能分析を行った。正常ロドプシンタンパク質は、細胞膜に移動して偏在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するが、Ｐ２３Ｈロドプシン突然変異の場合、タンパク質のフォールディングに問題が生じて、細胞膜に移動せずに細胞質の小胞体にとどまることになる。したがって、タンパク質の位置を確認することでロドプシンタンパク質の機能的な変化を確認することができる。

ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクターをｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌにトランスフェクションし、トランススプライシング効果を確認するためにＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲを行った。

具体的に、ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌを３５ｍｍ培養皿に１×１０^５個に分注した後、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーターに培養した。ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクター２μｇとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、リポフェクタミン２０００を２μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合してから５分間常温で放置した。その後、前記２つのチューブの内容物を混合して、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後にチューブを１０秒間遠心分離してからそれぞれの細胞上に撒いて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しいバッジに取り替えた。３７℃で５％のＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリゾール５００ｕｌ処理してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ５μｇをＤＮａｓｅ Ｉ１μｌを処理してｇＤＮＡを除去し、そのうち１μｇを逆転写してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを用いてＰＣＲによりトランススプライシング産物を確認し、トランススプライシング作用が正確に発生したことを塩基配列分析から確認した（図７Ａ）。

また、上記のような方法でＲＨＯ標的リボザイム発現ベクターを形質注入した後、ＲＨＯ抗体を用いてＲＨＯタンパク質を染色した。２次抗体を、蛍光抗体を用いて蛍光学顕微鏡を用いてＲＨＯタンパク質の細胞内分布を確認した。Ｐ２３Ｈ突然変異によって細胞内にとどまっていたロドプシンタンパク質がリボザイムによって細胞膜として分布していることが確認された（図７Ｂ）。

また、ＲＨＯ標的リボザイムの様々な突然変異に対するインビトロ効能を２９３Ａ細胞に共同形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して確認した（図８）。具体的に、ＲＨＯ標的リボザイム発現ベクター０．５μｇと様々な突然変異発現ベクター２μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、リポフェクタミン２０００の２．５μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合してから５分間常温で放置した。その後、上記のような方法により形質注入した後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。その結果、標的な部位に正確にトランススプライシングが発生したことを確認することで、様々な突然変異の部位に対して正常ＲＨＯ ＲＮＡに交替されることが確認された。したがって、本発明に係るロドプシン転写体を標的とするトランススプライシングリボザイムは、特定の突然変異遺伝子のみを矯正できるものではなく、突然変異の種類に関わらず突然変異の部位を交替できることが分かる。

実施例６．組換えウイルス制作及び動物モデルでトランススプライシング効能確認
６－１：組換えウイルスの制作
実施例４の第２デザインのＲＨＯ標的リボザイムをアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）ベクターで発現させるために、組換えＡＡＶ発現ベクターを制作した。プロモーターは、ＣＭＶプロモーターを使用した（図９）。ｐＡＡＶバックボーンプラスミド２０μｇをＥ．ｃｏＲＩで反応させた後、アガロースゲルを溶出した。合成したリボザイム＋ＲＨＯ ＤＮＡをインフュージョン（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いて反応させてから形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）してコロニーを取得した。それぞれのコロニーを培養してプラスミドを取得し、シークエンシングによって配列が正常にクローニングされたクローンを選別した。このように作られたプラスミドをＥｃｏＲＶとＸｂａＩで反応させた後、アガロースゲル溶出した。合成したＹＦＰ ＤＮＡを、インフュージョン酵素を用いて反応させてから形質転換してコロニーを取得した。コロニーを培養してプラスミドを取得し、シークエンシングによって配列が正常にクローニングされたコロニーを選別した。アンチセンス配列を追加するために、Ｅ．ｃｏＲＩで反応させた後、アガロースゲルを溶出した。ＰＣＲによって取得したＡＳ１５０配列を、インフュージョン酵素を用いて反応させてから形質転換してコロニーを取得した。同じ方法により、配列分析した後、最終のＡＡＶ－ｃＲｉｂ－ＹＦＰプラスミドを取得した。

ＡＡＶウイルスベクターを制作するために、２９３Ｔ細胞にＨｅｌｐｅｒベクター、ＲＨＯリボザイム発現ベクター、Ｒｅｐ２Ｃａｐ５ベクターを三重形質感染（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、７２時間後に細胞はライシス（ｌｙｓｉｓ）、上層液はＰＥＧダウン（ｄｏｗｎ）した。これをイオジキサノール勾配超遠心分離（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）方法でＡＡＶ発現ベクターを取得した。

６－２：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの効能確認
実施例６－１のＡＡＶ発現ベクターを用いて疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでリボザイムの効能を確認した。ｈＰ２３Ｈマウス－ＲＦＰモデルは、人体Ｐ２３Ｈ遺伝子とＲＦＰ蛍光タンパク質が融合した形態でノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）されたＲＰマウスモデルとして、ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ研究に幅広く用いられているモデルである。ＡＡＶ発現ベクター１μｌ網膜下注射（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法によりマウスの眼球に注入した。ＩＯキットに連結されている３４Ｇニードルを強膜穿刺（ｓｃｌｅｒａｌ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により刺入させた後、１μｌ／ｅｙｅの体積で両眼に網膜下注射で投与した。投与が完了すると、マウスの眼球に抗生剤点眼液を一滴点眼して感染を防いだ後、ＦＰ／ＯＣＴ撮影によって網膜のブレブ（ｂｌｅｂ）形成を確認する方法で投与の成功可否を判定した。

投与した後、２週あるいは５週目に眼球を摘出してスライドを制作した。ＡＡＶ発現ベクターにはＹＦＰ蛍光物質が結合されているため、ＲＨＯタンパク質に対する追加染色は進まないものの、ＤＡＰＩ染色によって細胞内の核染色を行った。図１０は、投与後２週（図１０Ａ）、投与後５週（図１０Ｂ）の結果を示したものである。

ＡＡＶ５－ＹＦＰ（蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰ（ｇｅｎｅ、蛍光ｐｏｓｉｔｉｖｅ）をＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰに対する対照群として活用した。ＡＡＶ５－ＹＦＰとＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰの物質が網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）にも蛍光が発現することから、光受容体特異的に導入されないことを確認することができ、一方、ＲＨＯ標的リボザイムが付着されたＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰの場合、ＲＰＥで発現せず光受容体にのみ特異的に発現したことが確認された。

実施例７：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの投与後に免疫及び炎症反応確認
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでトランススプライシングリボザイムの投与後に血清内免疫及び炎症反応を確認した結果を図１１に示した（Ａ：投与後２週、Ｂ：投与後５週）。

関連サイトカインのうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－１０がＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰに対して２週目に増加する様相を示し、ＩＬ－４及びＩＬ－２に対しては変化の様相を示さなかった。このような変化は、対照群であるＡＡＶ５－ＹＦＰとＡＡＶ－ＷＴ ｈＲｈｏ－ＹＦＰ物質処理によっては反応を示していないため、ウイルスベクター自体の効果ではないものと考えられる。２週目に増加パターンを見せたサイトカインは、５週目に減少して対照群に類似の量に減少するという結果から、トランススプライシングリボザイムを発現するベクターの網膜下注射（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって増加した炎症及び免疫反応が物質投与の初期には増加し、５週目には本来のレベルに復帰することを意味する。

実施例８：動物モデルでトランススプライシングリボザイムの投与後の網膜と網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）組織でリボザイムの効能確認
疾患モデルに有効物質を投与した後、ＲＨＯ ＲＮＡをターゲットにしてトランススプライシングが生体内の光受容体で発生したか否かを確認した。そのために、マウスの眼球を摘出して網膜と網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ）を分離し、各部位でＲＮＡを抽出した後にＲＴ－ＰＣＲを行って、トランススプライシング産物生成の有無を観察した。その結果を図１２に示した。

ＲＰＥでは、増幅したトランススプライシング産物ＰＣＲバンドを確認することができないが、網膜特異的にトランススプライシング産物が確認された（図１２Ａ）。増幅したトランススプライシング産物に対してシークエンシングを行って突然変異ＲＨＯ ＲＮＡをターゲッティングして正常ＲＨＯ ＲＮＡに置換されたことが確認された（図１２Ｂ）。

また、網膜及び網膜色素上皮細胞のｇＤＮＡを抽出してＡＡＶ ＩＴＲ部位をｑＰＣＲしたとき、網膜よりも網膜色素上皮細胞でさらに多く検出されたが（図１２Ｃ）、これはＡＡＶベクターがＲＰＥに円満に伝達されるものの、リボザイムによって調節されるトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の発現は、光受容体特異的に示されることが確認された。

実施例９：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後に生体内リボザイムの分布確認
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでリボザイムの投与後２週目に全臓器でリボザイム分布を確認した（図１３）。投与後２週目にマウス犠牲後に全臓器を得て、ｇＤＮＡ錠剤を介してｇＤＮＡを取得した。それぞれの臓器の１μｇ ｇＤＮＡを用いてトランススプライシングリボザイム特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。全臓器のうち肝臓組織でトランススプライシングリボザイムを発現するベクターを投与し、全ての個体から検出範囲内でリボザイムが検出された。その他、一部の個体から、肺、小腸、前立腺組織で投与したベクターが検出範囲内でリボザイムが検出され、他の組織では検出されなかった。

実施例１０：正常マウスにトランススプライシングリボザイム投与後の毒性分析
正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で濃度別のトランススプライシングリボザイムの投与後、眼球変化を観察して毒性を確認するために、トランススプライシングリボザイムの投与後の週目ごとのＦｕｎｄｕｓ及びＯＣＴイメージ、Ｈ＆Ｅ染色結果を確認した（図１４）。試験群で網膜下投与によるブレブが形成されることを確認して投与が正常になされたことが確認された（実線）。一部の個体で角膜の炎症及び硝子体の出血が発生した（点線）。Ｈ＆Ｅ染色で確認したとき、３×１０^９ＧＣ／ｅｙｅ以上の濃度を処理した群で水晶体の変性、網膜の変性、及び外側網膜の萎縮、脈絡膜の組織構成炎症の発生を確認した。したがって、１×１０^９ＧＣ／ｅｙｅ以下の濃度では毒性がないことが確認された。

実施例１１：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の網膜電位図検査
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢のマウス）においてトランススプライシングリボザイムの投与後の時間経過による網膜電位図検査の結果である（図１５及び表１）。網膜電位図検査のために桿体系（ｓｃｏｔｏｐｉｃ）ＥＲＧ測定を実施し、Ｂウェーブの振幅を比較した。網膜電位図を評価するために、マウスをケタミンで全身麻酔した後、麻酔点眼剤を眼球に点眼して追加局所麻酔した後、散瞳剤を点眼して散瞳誘導した。マウスを載置台上に乗せてからプローブをそれぞれ尾の尾根部、眉間、角膜に設置した状態でｍｏｎｏ－ｆｌａｓｈ刺激（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ２（１０ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））に対するＥＲＧを測定した。測定が完了すると、マウスの眼球に抗生剤の点眼液を一滴点眼した。分析は、「ＬａｂＳｃｒｉｂｅＥＲＧ（ｉＷｏｒｘ ＤａｔａＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）」のプログラムを用いて実施した。

ロドプシン遺伝子のＰ２３Ｈ突然変異は、細胞内で正常な機能を果たすことができず、桿状細胞（ｒｏｄ ｃｅｌｌ）、円錐細胞（ｃｏｎｅ ｃｅｌｌ）の死滅を誘導して視覚的な機能が退行する。光受容体細胞（ｒｏｄ、ｃｏｎｅ）は、光エネルギーを電気信号に変える役割を果たすが、光受容体細胞の数及び機能が低下すれば、電気信号が減少することになる。このような電気信号に対する評価を網膜電位図の検査（ＥＲＧ）によって確認することで、視覚的な機能差を確認しようと試みた。網膜電位図検査でＢウェーブは、実際の電気信号が伝達されたかを判断する指標であり、ＲＨＯ標的リボザイム（ＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰ）投与によって５週目でＢウェーブが有意に増加したことを確認し、この効果は、８週目まで継続している。したがって、ＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰによって疾患モデルで視覚的機能を保持改善するものと見られる。

実施例１２：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の血清及びリボザイム活性分析
疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）でトランススプライシングリボザイムの投与後８週目で血清分析及びリボザイム活性を確認した（図１６）。投与後８週目でもＰＢＳを投与した正常動物（Ｇ１）と、ＰＢＳのみを投与したＧ２群を比較したとき、有効物質によるサイトカインの変化はなかった（図１６Ａ）。実施例７において、２週目でサイトカインの変化を示したのが５週目では正常動物と比較したときに差がなかったことを確認したが、この結果と比較して判断すると、８週目までもサイトカインの変化には影響を与えないことを意味する。

物質の投与後にＲＨＯ ＲＮＡを標的にしてトランススプライシングが８週目にも持続的であるか否かを確認するために、マウスの眼球を摘出して網膜からＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲによってトランススプライシング産物が生成されることを確認した（図１６Ｂ）。これは、組換えＡＡＶベクターが網膜に伝達されてＡＡＶ５－ｃＲｉｂ－ＹＦＰの発現及び作用が８週目まで持続的に引き続いていることを意味する。

実施例１３：組換えウイルスベクターの最適化
網膜への感染能及び発現能を確認するために、様々な組換えＡＡＶベクターを製造した（図１７）。図１７に示したように、５’末端にスプライシング供与／スプライシング受容配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３’末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結された。ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥの配列は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１３に表示されている。最適な物質を選別するために、以前の実施例で使用したＡＡＶベクターとは異なり、様々な組換えＡＡＶ血清（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）及びプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有する物質を生産して利用した。これに対して、ＣＭＶプロモーターとＲＨＯプロモーターを利用し、最終物質に対する効能を確認するためにＹＦＰ蛍光物質は除去し、発現を増加させるためにＷＰＲＥを挿入した。

１３－１：リボザイムの分布及びトランス－スプライシンの効率確認
製造した組換えＡＡＶベクターを疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）に投与した後、３週目でリボザイムの分布及びトランススプライシングを確認した（図１８）。

図１８に表示されたＧ１～Ｇ７の構成は下記の表２の通りである。

血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に対する感染率を確認するために、注入後３週目に眼球を摘出し、網膜とＲＰＥ／ｃｈｏｌｏｉｄを分離してそれぞれＲＮＡ及びｇＤＮＡを抽出してｇＤＮＡを比較したとき、ＡＡＶ血清型５が血清型２あるいは８よりも、網膜及びＲＰＥの両方によく感染した。ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡ分析を同一に進行確認し、ＣＭＶプロモーターによって調節される場合、ＲＰＥにおいてもリボザイムの発現が高く示される一方、網膜ではＣＭＶプロモーターによって調節されることで、ＲＨＯプロモーターによって調節されるリボザイムの発現がさらに高く示されることが確認された（図１８Ａ及び１８Ｂ）。

実際の網膜にトランススプライシングリボザイムが作用してトランススプライシング産物が生成されたかを確認し、ＡＡＶ血清型５にＲＨＯプロモーターから調節される物質のトランススプライシング産物ＰＣＲバンドが濃く示されることが確認された（図１８Ｃ）。

これによって、ＡＡＶ血清型５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥが網膜への伝達及び発現に優れ、トランススプライシングの効率も優れていることが確認された。

１３－２：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後の網膜電位図検査
網膜への感染能疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）でトランススプライシングリボザイムの投与後６週目で網膜電位図検査を行った。その結果を図１９及び表３に示した。

正常マウス（Ｇ０）対比Ｐ２３Ｈ－ＲＦＰ疾患マウス（Ｇ１）において光に対するＢウェーブ反応が有意的に低く示されることを確認したが、これは、Ｐ２３Ｈ－ＲＦＰマウスでＲＨＯ突然変異によって光受容体細胞が損傷することにより電気信号伝達への問題が生じたことを意味する。

疾患モデルにそれぞれのＡＡＶを投与後の網膜電位図を測定したとき、全ての試験群で平均の桿体系Ｂ波振幅（ｓｃｏｔｏｐｉｃ Ｂ－ｗａｖｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）がＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比増加することが確認された。特に、プロモーター間の比較では、ＣＭＶプロモーターよりもＲＨＯプロモーターから調節される場合、ＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比Ｂウェーブが極めて増加し（Ｇ３＜Ｇ４、Ｇ５＜Ｇ６）、血清型間の比較では、ＡＡＶ２／５投与群（Ｇ５、Ｇ６）とＡＡＶ２／８投与群（Ｇ７）でＰＢＳ投与群（Ｇ１）対比Ｂウェーブが増加した。そのうち、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの投与群が有意的に最も増加したことを確認し、前記試験群では、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの網膜下投与時に疾患モデルの視覚機能の改善効果が最も大きいと判断される。

一方、図１７に示す組換えＡＡＶベクターのうち、ＡＡＶ血清型５あるいは８とＲＨＯプロモーターを含むＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ、ＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの組換えＡＡＶベクターを疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）に投与した後４週目で網膜電位図検査を比較実行し、図２０及び表４に示した。

表４及び図２０に示されたように、投与後４週目でのＢウェーブは、ＰＢＳ投与群（Ｈ２）対比ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）及びＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）において全て有意に増加した。ＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）がＰＢＳ投与群（Ｈ２）とＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）よりも投与前（０ｗｅｅｋ）Ｂウェーブが高かったことを勘案すれば、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ３）及びＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ投与群（Ｈ４）のＢウェーブ増加能が類似すると考えられる。したがって、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥ又はＡＡＶ２／８ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥを網膜下投与時に疾患モデルの視覚機能の改善効果がＰＢＳ投与群（Ｈ２）に比べて非常に優れていると判断される。

１３－３：疾患モデルにトランススプライシングリボザイム投与後網膜のリボザイム分布及びトランススプライシング確認
以下の表５に示すように、疾患モデルであるｈＰ２３Ｈ－ＲＦＰマウス（５週齢）にトランススプライシングリボザイムの投与後６週目に網膜におけるリボザイム分布とトランススプライシングを確認して図２１に示した。

疾患モデルで機能的な効能を確認した後、眼球組織を摘出して網膜ｇＤＮＡとＲＮＡを分離分析し、実施例１３－１の３週目の結果と同様に、ＡＡＶ血清型５が網膜への伝達が円満に行われることが確認された。ＲＮＡを分析したときも、ＡＡＶ血清型５による発現がより優れて示されるだけでなく、ＲＨＯプロモーターによって調節されるリボザイムの発現が高く示されることが確認された。これにより、ＡＡＶ２／５ＲＬ－Ｒｉｂ－ＷＰＲＥの網膜への伝達及び発現が３週目と同様に６週目においても優れていることを示す。

前記結果をまとめると、ｈＲＨＯ－Ｐ２３Ｈ疾患モデルにおいて、ＡＡＶ血清型５及び８による網膜及びＲＰＥへの伝達が効果的であり、ＲＨＯプロモーターによって調節されるトランススプライシングリボザイムが網膜特異的に発現することが確認された。

本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、投与初期である３週目から６週目に至るまで発現が持続的に行われ、４週目及び６週目に網膜電位図検査による視覚機能を確認したとき、視覚改善に効果を与えることが確認された。

以上で本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、この技術分野にける通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことを明らかにする。したがって本発明の実質的な範囲は添付された請求項とこれらの等価物によって定義されるものと言える。

Claims (22)

1. ロドプシン転写体を標的にする、トランススプライシングリボザイム。
2. 前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム^＊－３’の構造を有する、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
3. 前記トランススプライシングリボザイムは、前記リボザイム^＊次の３’方向にエクソン（ｅｘｏｎ）領域をさらに含む、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
4. 前記ＩＧＳ領域は、ロドプシン転写体に相補的に結合できる５－１０ｎｔの長さの塩基配列からなる、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
5. 前記ＩＧＳ領域はロドプシン転写体の＋３０、＋３５、＋４２、＋４３、＋５２、＋５４、＋５５、＋５９、＋７５、＋９７、＋１１６、＋１２２、＋１２３、＋１２７、＋１３２、＋１４０、＋１５４、＋１６５、＋１７１、＋１８７、＋１９１、＋２０７、＋２１５、＋２２２、＋２３０、＋２３２、＋２４４、＋２５６、＋２６２、＋２７３、＋２９８、＋３０８、＋３８１、＋４０３、＋６６１又は＋６８８部位の塩基を含む領域と相補的に結合できる５－１０ｎｔの長さの塩基配列からなる、請求項４に記載のトランススプライシングリボザイム。
6. 前記ロドプシン転写体はロドプシン突然変異を含む、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
7. 前記ロドプシン突然変異は、配列番号１に表示されるロドプシン転写体の１番ないし１１４２番の間の塩基のうち少なくとも１つの塩基に発生した突然変異である、請求項６に記載のトランススプライシングリボザイム。
8. 前記ロドプシン突然変異は、下記からなる突然変異群より選択される少なくとも１つを含む、請求項７に記載のトランススプライシングリボザイム。
   Ｌ３２８Ｐ、Ｔ３４２Ｍ、Ｑ３４４Ｒ／Ｐ／ｔｅｒ、Ｖ３４５Ｌ／Ｍ、Ａ３４６Ｐ、Ｐ３４７Ａ／Ｒ／Ｑ／Ｌ／Ｓ／Ｔ、ｔｅｒ３４９／Ｑ／Ｅ、Ｎ１５Ｓ、Ｔ１７Ｍ、Ｖ２０Ｇ、Ｐ２３Ａ／Ｈ／Ｌ、Ｑ２８Ｈ、Ｇ５１Ｒ／Ｖ、Ｐ５３Ｒ、Ｔ５８Ｒ／Ｍ、Ｖ８７Ｄ／Ｌ、Ｇ８９Ｄ、Ｇ１０６Ｒ／Ｗ、Ｃ１１０Ｆ／Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｅ１１３Ｋ、Ｌ１２５Ｒ、Ｗ１６１Ｒ、Ａ１６４Ｅ／Ｖ、Ｃ１６７Ｒ／Ｗ、Ｐ１７１Ｑ／Ｌ／Ｓ、Ｙ１７８Ｎ／Ｄ／Ｃ、Ｅ１８１Ｋ、Ｇ１８２Ｓ／Ｖ、Ｃ１８５Ｒ、Ｃ１８７Ｇ／Ｙ、Ｇ１８８Ｒ／Ｅ、Ｄ１９０Ｎ／Ｇ／Ｙ、Ｈ２１１Ｒ／Ｐ、Ｃ２２２Ｒ、Ｐ２６７Ｒ／Ｌ、Ｓ２７０Ｒ、Ｋ２９６Ｎ／Ｅ／Ｍ、Ｒ１３５Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｗ、Ｔ４Ｋ†、Ｔ１７Ｍ†、Ｍ３９Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｇ９０Ｖ、Ｍ４４Ｔ、Ｖ１３７Ｍ、Ｇ９０Ｄ、Ｔ９４Ｉ、Ａ２９２Ｅ、Ａ２９５Ｖ、Ｆ４５Ｌ、Ｖ２０９Ｍ、Ｆ２２０Ｃ、Ｐ１２Ｒ、Ｒ２１Ｃ、Ｑ２８Ｈ、Ｌ４０Ｒ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｒ、Ｆ５２Ｙ、Ｆ５６Ｙ、Ｌ５７Ｒ、Ｙ６０ｔｅｒ、Ｑ６４ｔｅｒ、Ｒ６９Ｈ、Ｎ７８Ｉ、Ｌ７９Ｐ、Ｌ８８Ｐ、Ｔ９２Ｉ、Ｔ９７Ｉ、Ｖ１０４Ｆ、Ｇ１０９Ｒ、Ｇ１１４Ｄ／Ｖ、Ｅ１２２Ｇ、Ｗ１２６Ｌ／ｔｅｒ、Ｓ１２７Ｆ、Ｌ１３１Ｐ、Ｙ１３６ｔｅｒ、Ｃ１４０Ｓ、Ｔ１６０Ｔ、Ｍ１６３Ｔ、Ａ１６９Ｐ、Ｐ１７０Ｈ／Ｒ、Ｓ１７６Ｆ、Ｐ１８０Ａ／Ｓ、Ｑ１８４Ｐ、Ｓ１８６Ｐ／Ｗ、Ｙ１９１Ｃ、Ｔ１９３Ｍ、Ｍ２０７Ｒ／Ｋ、Ｖ２１０Ｆ、Ｉ２１４Ｎ、Ｐ２１５Ｌ／Ｔ、Ｍ２１６Ｒ／Ｌ／Ｋ、Ｒ２５２Ｐ、Ｔ２８９Ｐ、Ｓ２９７Ｒ、Ａ２９８Ｄ、Ｋ３１１Ｅ、Ｎ３１５ｔｅｒ、Ｅ３４１Ｋ、Ｓ３４３Ｃ及びＱ３１２ｔｅｒ。
9. 前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号２ないし配列番号４のいずれか１つに表示される塩基配列を含む、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
10. 請求項１に記載のトランススプライシングリボザイムを含む非ウイルス性遺伝子伝達体。
11. 請求項１に記載のトランススプライシングリボザイムを含む遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。
12. 前記コンストラクトは、前記リボザイムの３’－末端方向に目的遺伝子が追加に連結される、請求項１１に記載のコンストラクト。
13. 前記目的遺伝子は、正常ロドプシン遺伝子又はリポーター遺伝子である、請求項１２に記載のコンストラクト。
14. 前記コンストラクトは、前記リボザイムの５’－末端方向に、アンチセンスをコーディングするヌクレオチドが連結されたものである遺伝子コンストラクトであって、
    前記アンチセンスは、標的ロドプシン転写体に相補的な配列を有する、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
15. 前記遺伝子コンストラクトに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のコンストラクト。
16. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトが含まれた組換え発現ベクター。
17. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを含む組換えウイルス。
18. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを含む非ウイルス性遺伝子伝達体。
19. 前記ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスからなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１７に記載の組換えウイルス。
20. 前記組換えウイルスは、
    請求項１に記載のトランススプライシングリボザイムをコーディングするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されたものである、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）であって、
    前記組換えＡＡＶは、ＡＡＶの天然由来又は人工血清型又は単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）又は系統群（ｃｌａｄｅ）である、請求項１７に記載の組換えウイルス。
21. 請求項１に記載のリボザイム、請求項１０に記載の非ウイルス性遺伝子伝達体、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト、請求項１６に記載の組換え発現ベクター、請求項１７に記載の組換えウイルス、又は請求項１８に記載の非ウイルス性遺伝子伝達体を有効成分として含む、網膜色素変性症の予防又は治療用薬学組成物。
22. 請求項２１に記載の組成物を個体に投与することを含む、網膜色素変性症の予防又は治療方法。

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