KR20220042340A

KR20220042340A - 로돕신 전사체에 특이적인 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220042340A
Application number: KR1020220037572A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 김지현; 한승렬
Original assignee: 알지노믹스 주식회사
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-04-05
Also published as: WO2022019706A1; KR102522273B1; US20220117996A1; JP7334346B2; JP2022545572A; US11504388B2

Abstract

본 발명은 로돕신 전사체를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 망막색소변성증 치료 및/또는 예방 용도에 대한 것이다.

Description

로돕신 전사체에 특이적인 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도{A trans-splicing ribozyme specific for rhodopsin transcript and uses thereof}

본 발명은 로돕신 전사체에 특이적인 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도에 관한 것이다.

망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP)은 망막에 분포하는 광수용체(photoreceptor)의 기능 이상으로 발생하며 눈에 들어온 빛을 전기 신호로 바꾸는 역할을 하는 망막의 기능이 소실되는 유전성 및 진행성 질환으로 점진적인 망막 변성이 특징이다. 질병 초기 막대 광수용체(rod photoreceptor) 세포의 기능적 이상을 암시하는 야맹증을 시작으로 시각세포가 손상되면서 말초 시력 상실을 비롯해 점차 시야가 좁아지며, 궁극적으로 실명을 초래한다. 현재 망막색소변성증에 대한 치료법은 시력 손실을 늦추는 등의 일부 옵션만이 존재할 뿐 근본적인 치료제는 전무하다.

망막색소변성증은 매우 다양한 망막 시세포 등의 유전자 돌연변이에 의해 발생하게 되는데, 유전양상은 다양하여 상염색체 열성/우성, X-연관 RP 등 단일 유전자 이상에서 관찰되는 모든 유전양상으로 발생할 수 있다. 여러가지가 유전적 원인 중 15~25%가 상염색체 우성 RP(ADRP, Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa)이다. 수많은 유전자의 돌연변이가 ADRP와 관련이 있다고 알려져 있으며, 그 중에서도 로돕신(rhodopsin, RHO) 유전자의 돌연변이는 약 30%에 달하는 높은 비율을 차지한다.

로돕신은 망막의 간상세포 (rod cell)에 존재하는 GPCR(G-protein coupled receptor)의 하나로 눈을 통해 들어오는 빛을 전기 신호로 전달하며, 어두운 곳에서 더 많이 필요로 한다. RHO 유전자의 돌연변이는 간상세포의 기능 장애와 사멸을 유발하며, 막대-콘(rod-cone)의 형태학적 이상에 이어서 원추세포(cone cell)의 기능 장애와 사멸이 뒤따른다. RHO 유전자의 돌연변이는 상염색체 우성 RP(ADRP)를 유발하며, 시력 상실을 초래하는 막대광수용체(rod photoreceptor)의 변성을 유도, 망막색소변성증을 유발한다. 이 질병과 관련된 RHO 유전자의 돌연변이는 150개 이상의 서로 다른 미스센스/넌센스(missense/nonsense), 삽입/결실(insertion/deletion) 및 스플라이스 부위(splice site) 돌연변이가 알려져 있으며 현재에도 돌연변이는 지속적으로 발견되고 있다(비특허문헌 1).

다양한 RHO 유전자 돌연변이 중 P23H 돌연변이는 ADRP 환자에서 가장 많이 발견되는 돌연변이이다. 이 돌연변이는 RHO 단백질의 폴딩에 문제가 생겨 세포막으로 수송되지 않아 시각회로 및 빛에너지 전달에 문제가 발생한다. ADRP의 경우 돌연변이 유전자의 제거 및 대립유전자인 정상(WT) 유전자의 발현이 동반되어야 하기 때문에 RHO 유전자 돌연변이의 제거와 기능적 대립유전자 WT RHO 유전자의 보전은 이 질환에 대한 중요한 치료법이다.

LCA(Leber congenital amaurosis) 및 상염색체 열성(autosomal recessive) RP(retinitis pigmentosa) 치료를 위해 Luxturna(상표명)를 사용하고 있다. 이는 안구의 광 수용체 유지 기능을 담당하는 RPE65 유전자 돌연변이에 대한 치료제이다. 이 제품은 RPE65 유전자 돌연변이 환자에게만 한정적으로 사용되는 문제가 있다. 따라서 다른 RP 요인인 RHO 유전자 돌연변이에 의한 망막색소변성증 치료제가 별도로 필요하다.

ADRP 치료제로, CRISPR/cas9 시스템을 이용한 유전자 교정 기술의 적용이 가능하나 CRISPR/cas9 시스템을 이용할 경우 하나의 유전자 돌연변이에 대해서만 교정만 가능하다. 혹은 이중전달시스템(dual delivery system)을 이용하여 정상 RHO 유전자를 전달해 줘야 한다. 또한, 다양한 돌연변이를 교정하기 위해선 각 돌연변이를 표적 할 수 있는 개별의 sgRNA가 필요하다. 즉 각 개별적인 돌연변이를 교정할 수 있는 각각의 별개의 시스템이 필요하다. 또한, 면역원성 유발 가능성이 있는 cas9과 같은 외부 단백질을 함께 도입 또는 발현시켜야 하는 단점이 있다.

또한 siRNA/안티센스 RNA를 이용한 유전자 침묵(gene silencing) 기술을 생각해 볼 수 있다. 그러나 siRNA/안티센스 RNA를 이용할 경우 CRISPR/cas9 시스템과 마찬가지로 하나의 유전자 돌연변이에 대해서만 침묵할 뿐만 아니라 정상(WT)으로 되돌릴 수 없다. 정상 및 모든 돌연변이를 표적으로 하는 siRNA/안티센스 RNA를 고려할 수 있으나, 이러한 제제와 함께 WT RHO 유전자를 별도로 도입시켜줘야만 한다.

위에서 설명한 바와 같이, 현재 진행되고 있는 RHO-ADRP에 대해 개발 중인 치료제 현황은 안티센스(antisense) 및 siRNA/shRNA를 이용한 RNA 타겟 치료제, 유전자 교정 기술을 이용한 치료제가 전부이다. 결론적으로 이러한 종래기술의 문제점을 해결하고 ADRP를 치료하기 위해선 WT RHO RNA 발현을 유도할 수 있는 유전자 도입이 별개로 필요하다.

이에 본 발명자들은 트랜스-스플라이싱 라이보자임(trans-splicing ribozyme)을 이용하여 여러 종류의 RHO 전사체를 제거할 수 있고, 동시에 야생형(WT) RHO 유전자를 발현시키기 위한 연구를 계속하여 본 발명에 도달하였다.

Prog Retin Eye Res. 2018 January ; 62: 1-23.　

본 발명의 목적은 로돕신 전사체를 표적으로 하고 동시에 야생형 (WT) 로돕신 전사체 발현을 유도할 수 있는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 유전자 전달체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 재조합 발현벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 재조합 바이러스를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 라이보자임, 상기 유전자 컨스트럭트, 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료방법을 제공하기 위한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 이 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 로돕신 전사체를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 제공한다. 구체적으로, 로돕신 전사체를 표적으로 하고 동시에 야생형(WT) RHO 전사체 발현을 유도할 수 있는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은, 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme* -3'의 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은, 상기 Ribozyme* 다음의 3' 방향으로 엑손(exon) 영역을 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임, 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme* -3'의 구조에 엑손(exon)이 연결되어, 5'-IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3'의 구조를 가질 수 있는데, 엑손 부분에는 정상 로돕신 유전자가 연결될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역은 로돕신 전사체(RNA)에 특이적으로 결합하고 G/U 와블 염기쌍(wobble base pair)을 형성할 수 있는 5 ~ 10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

구체적으로 상기 IGS 영역은 로돕신 전사체의 +30, +35, +42, +43, +52, +54, +55, +59, +75, +97, +116, +122, +123, +127, +132, +140, +154, +165, +171, +187, +191, +207, +215, +222, +230, +232, +244, +256, +262, +273, +298, +308, +381, +403, +661 또는 +688 부위, 바람직하게는 +59 부위 염기를 포함하는 영역과 상보적으로 결합하고 G/U 와블 염기쌍을 형성할 할 수 있는 5-10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 로돕신 전사체는 로돕신 돌연변이를 포함할 수 있다.

상기 로돕신 돌연변이는 서열번호 1로 표시되는 야생형 로돕신 전사체의 1 번 내지 1142번 사이의 염기 중 적어도 하나의 염기에 발생한 돌연변이일 수 있다. 구체적으로, 상기 로돕신 돌연변이 전사체는 하기로 이루어진 돌연변이 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이미 알려진 혹은 새로 발견될 로돕신 돌연변이 전사체는 모두 포함할 수 있다:

L328P, T342M, Q344R/P/ter, V345L/M, A346P, P347A/R/Q/L/S/T, ter349/Q/E, N15S, T17M, V20G, P23A/H/L, Q28H, G51R/V, P53R, T58R/M, V87D/L, G89D, G106R/W, C110F/R/S/Y, E113K, L125R, W161R, A164E/V, C167R/W, P171Q/L/S, Y178N/D/C, E181K, G182S/V, C185R, C187G/Y, G188R/E, D190N/G/Y, H211R/P, C222R, P267R/L, S270R, K296N/E/M, R135G/L/P/W, T4K, T17M, M39R, N55K, G90V, M44T, V137M, G90D, T94I, A292E, A295V, F45L, V209M, F220C, P12R, R21C, Q28H, L40R, L46R, L47R, F52Y, F56Y, L57R, Y60ter, Q64ter, R69H, N78I, L79P, L88P, T92I, T97I, V104F, G109R, G114D/V, E122G, W126L/ter, S127F, L131P, Y136ter, C140S, T160T, M163T, A169P, P170H/R, S176F, P180A/S, Q184P, S186P/W, Y191C, T193M, M207R/K, V210F, I214N, P215L/T, M216R/L/K, R252P, T289P, S297R, A298D, K311E, N315ter, E341K, S343C 및 Q312ter.

더욱 구체적으로, 상기 라이보자임은 로돕신 P23H 돌연변이 전사체를 표적으로 할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 로돕신 P23H 돌연변이는 정상 로돕신의 23 번째 부위에서 프롤린이 히스티딘으로 돌연변이가 일어난 것이다.

상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

또한 본 발명의 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 상기 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상인 서열은 모두 포함한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 라이보자임의 5'-말단 방향에 안티센스(AS)를 코딩하는 뉴클레오타이드가 연결될 수 있다.

상기 안티센스는 표적 로돕신 전사체에 상보적 서열일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 AS 영역의 길이는 10 nt 내지 210 nt, 바람직하게는 50 nt 내지 150 nt 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 서열번호 6으로 이루어진 IGS 영역을 포함하고, 서열번호 10의 150nt 길이의 AS 영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명이 다른 구현예에 따른, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-3'의 구조; 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme* - 3' 구조; 또는 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-엑손(exon)-3'; 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme* - 엑손(exon)-3' 구조를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역과 AS 영역 사이에는 5~20개의 무작위 뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 제한효소 서열일 수 있고, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 바람직하게 8nt 길이일 수 있으며, 도 4에 도식화된 P1(서열번호 7) 및 P10 서열(서열번호 8 및 서열번호 9)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Ribozyme* 영역은 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

또한 상기 Ribozyme* 영역은 상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상인 서열은 모두 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 엑손 영역은 정상 로돕신 유전자 서열을 전부 또는 일부 또는 최적화된 RHO 유전자 서열을 전부 또는 일부 포함할 수 있다.

본 발명에서, "라이보자임(ribozyme)"이란, 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가지며, 몇몇 라이보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하는 것으로 밝혀졌으며, 다른 라이보자임은 라이보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것이 확인되었다. 이러한 라이보자임에는 망치머리(hammerhead) 라이보자임, VS 라이보자임 및 헤어핀(hairpin) 라이보자임 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서는, 구체적으로 트랜스-스플라이싱 기능을 갖는 라이보자임, 더욱 구체적으로는 로돕신 전사체와 관련된 특정 유전자를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 라이보자임"이란, 별도로 존재하는 표적 RNA와 라이보자임의 IGS(internal guide sequence)와의 염기 결합을 통해 표적 RNA를 인지하여 절단한 후에 절단된 표적 RNA의 표적 염기 바로 뒤에 라이보자임의 3' 엑손을 연결시키는 반응인, 트랜스-스플라이싱 기능을 갖는 라이보자임을 의미한다.

본 발명에서 라이보자임 서열은 DNA 및 이에 대응하는 RNA 서열로 표시될 수 있고, DNA 서열로 표시되는 경우 이에 대응하는 RNA 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 이 기술분야에서 너무나 자명하다 할 것이다.

본 발명에서 "로돕신 전사체, 또는 RHO 전사체 또는 RHO RNA "란 정상 로돕신 또는 로돕신 돌연변이 유전자의 전사로 인해 만들어진 물질(예: RNA)을 말한다. 본 발명에서는 정상 로돕신 전사체와 돌연변이 로돕신 전사체를 구분하기 위해, "로돕신 돌연변이 전사체"는 "RHO 돌연변이 전사체" 또는 "RHO 돌연변이 RNA" 또는 돌연변이 부위에 따라 "P23H RHO" 등으로 표시하고, "정상 로돕신 전사체"는 "WT RHO 전사체" 또는 WT RHO 또는 "WT RHO RNA"로 표시한다.

또한, "로돕신 돌연변이 전사체 부위 중 적어도 하나를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임"이란, 세포 내에 주입되었을 때 망막색소변성증에 관여하는 로돕신 RNA를 인식하여 선택적인 트랜스-스플라이싱 반응을 일으키도록 유전적으로 조작된 형태의 라이보자임을 의미하며, 이 기술분야에 널리 알려져 있는 방법을 통해 제작할 수 있다. 예컨대 라이보자임의 5' 말단에 표적 RNA의 보전적 부위에 특이적인 상보성 서열을 연결시킴으로써, 특정 RNA를 표적으로 하는 기질 특이성을 갖도록 할 수 있다.

참고로, 이 기술분야에서 로돕신 돌연변이 유전자에 관한 정보는 이미 많이 알려져 있다(비특허문헌 1 및 https://www.retina-international.org/files/sci-news/rhomut.htm 등 참고).

본 발명은 이미 알려진 로돕신 돌연변이 유전자 정보를 기초로, "로돕신 전사체를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임"을 제작하여 돌연변이 로돕신을 정상(야생형, WT) 로돕신으로 바꿔주는 기술이다(도 1).

기능적 이상을 유발하는 RHO 돌연변이는 5'-UTR 부위의 다운스트림에서 주로 발생한다. 본 발명의 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 5'-UTR 부위를 표적으로 하여 트랜스-스플라이싱을 통해, 돌연변이가 포함된 RHO 전사체를 잘라내고 동시에 WT RHO 전사체 발현을 유도할 수 있다. 즉, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 라이보자임은, 돌연변이 종류에 상관없이 질환의 치료 및/또는 예방 용도로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 정상 로돕신 전사체를 표적 할 수도있으나 이 경우, 다시 정상 로돕신으로 변형하므로, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 정상 로돕신에는 영향을 주지 않는다.

다른 측면에서 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달체를 제공한다. 구체적으로, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 RNA 형태로 비바이러스성 유전자 전달체에 담지하여 생체 내로 직접 전달할 수 있다.

상기 비바이러스성 유전자 전달체는 리포좀, 지질 나노입자일 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에 알려진 비바이러스성 유전자 전달 방법이라면 어느 것이나 이용 가능하다.

상기 리포좀은 리포펙타민, 리포펙틴, 셀펙틴, 리포펙테스 등을 사용할 수 있으며, Cellfectin, DMRIE-C, lipofectin, lipofectamine LTX, RNAiMAX, Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000, DOTAP, SAINT-RED, Avalanche-Omni, EX plex, polyfect, superfect, effectene, attractene, HiPerFect 등 시판되는 리포좀을 제한없이 사용할 수 있다.

지질 나노입자 구성요소 중 인지질은 지질 나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물이 상호 작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 인지질 이중층과 결합하여 약물의 세포내 전달 시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 용이하게 한다.

상기 인지질은, 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol,DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(POPE), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine](DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

양이온성 지질 전달체는 주로 양이온성 지질로 이루어진 나노미터 크기의 리포좀이나 지질 소재 나노입자의 양전하를 이용하여 음전하인 유전자, 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산과 복합체를 형성시킨 후 이 복합체를 탐식 작용으로 세포 내로 전달하는 방법이다. 세포 내로 전달된 복합체는 엔도솜에서 라이소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져나와 발현된다. 양이온성 고분자 전달체는 지질 대신 고분자를 사용하는 것을 제외하면 양이온성 지질 전달체와 유사한 방식으로 유전자를 전달하며, 대표적인 양이온성 고분자로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리라이신(poly-L-lysine), 키토산(chitosan) 등이 있다.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 정상 로롭신 유전자와 같은 목적유전자를 연결한 다음 이를 비바이러스성 유전자 전달체에 담지 할 수 있다. 상기 비바이러스성 유전자 전달체를 이용하여 RHO 전사체를 표적으로 하여 정상 로돕신 유전자를 전달할 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공한다.

상기 컨스트럭트는 상기 라이보자임의 3'-말단 방향에 목적유전자가 추가로 연결될 수 있다. 이는 상기 언급한 엑손(exon) 영역에 목적유전자가 추가로 연결되는 것을 의미한다.

상기 목적유전자는 정상 로돕신 유전자 및/또는 리포터 유전자일 수 있다.

상기 리포터 유전자는　루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent　protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질　(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며 이 기술분야에 알려진 리포터 유전자는 모두 사용할 수 있다.

목적 유전자로서 리포터 유전자를 삽입시킴으로써 로돕신 전사체 특이적인 라이보자임의 발현 정도를 관찰할 수 있다.

상기 유전자 컨스트럭트는 상기 유전자 컨스트럭트에　작동 가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter), CAG (CMV early enhancer element +chicken beta-Actin promoter/SD + rabbit beta-Globin SA) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, LTR 프로모터 등의 원핵세포 또는 포유류 바이러스의 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, EF1-알파 (elongation factor 1-alpha) 프로모터, IL-2 (interleukin-2) 유전자 프로모터, 림포톡신(lymphotoxin) 유전자 프로모터, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터 등의 동물 세포 프로모터, RHO(rhodopsin) 유전자 프로모터, RK(rhodopsin kinase) 유전자 프로모터, RedO(red opsin) 유전자 프로모터 등과 같은 망막 조직 특이 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "유전자 컨스트럭트(construct)"란, 표적 로돕신 전사체 부위에 대한 특이성을 높이기 위한 엘리먼트(element)를 포함하는 구조체를 의미한다. 구체적으로는, 상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 구조체일 수 있다.

상기 컨스트럭트의 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 추가적으로 연결되는 안티센스 서열은 표적 로돕신 전사체에 대한 특이성을 증가시켜 치료 효과를 높이기 위한 것으로, 이러한 목적을 달성하기 위한 서열이면 제한없이 포함될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 컨스트럭트는 라이보자임이 로돕신 전사체 부위를 표적하고, 표적 로돕신 전사체 특이적인 안티센스 서열을 포함하고 있어, 로돕신 전사체가 발현되는 세포에서만 특이적으로 발현할 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 프로모터, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 영역, 정상 로돕신 유전자 영역을 포함하는 유전자 컨스트럭트 기본 구성을 나타내는 모식도이다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 언급한 유전자 컨스트럭트가 포함된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 언급한 유전자 컨스트럭트가 포함된 재조합 바이러스를 제공한다.

상기 바이러스는　아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며 이 기술분야에서 사용할 수 있는 바이러스라면 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 라이보자임 암호화 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써, 라이보자임 암호화 서열의 발현은 이 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(라이보자임 암호화 서열과 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도됨으로써 라이보자임 암호화 서열이 전사되는 경우 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frame-shift mutation)를 유도하지 않으며, 발현 조절서열이 라이보자임의 발현을 지배하는 능력을 저해하지 않는 경우 작동 가능하게 연결되었다고 한다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 이 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 코작코돈, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며,

구체적으로는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 유전자를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 이 기술분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "형질전환 세포"는 숙주세포에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포를 의미한다.

형질전환은 상기 "도입" 방법에 의해 이루어질 수 있고, 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환 세포는 로돕신 전사체를 표적으로 하는 라이보자임을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 도입시켜 제조한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 재조합 바이러스는 재조합 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV)일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인, 재조합 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV)일 수 있다.

상기 재조합 AAV는 AAV의 천연 또는 인공 유래 혈청형 또는 단리체(isolate)또는 계통군(clade)일 수 있다.

상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나와 70% 이상. 80% 이상, 또는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.

상기 프로모터는 CMV 프로모터 또는 RHO 프로모터일 수 있다.

상기 재조합 AAV는 추가적인 조절 서열(regulatory sequence)를 더 포함할 수 있다.

상기 조절서열은 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(SD/SA) 및/또는 WPRE(woodchuck hepatitis postregulatory element) 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 SD/SA는 전사 시작(transcription initiation)과 RNA 중합효소(polymerase)Ⅱ의 프로세싱(processing) 및 mRNA의 핵에서 세포질로의 이동(nucleocytoplasmic export)을 증가시킨다.

본 발명에 따른 WPRE는 mRNA의 프로세싱과 핵에서 세포질로의 이동을 증가시켜 각각 pre-mRNA의 수준을 증가시킬 수 있다. 상기와 같은 구성을 통하여 세포 내에서 라이보자임의 RNA 수준을 현저히 증가시켜 생체 내에서 기능을 향상할 수 있다.

본 발명에 따른 SD/SA 서열은 RNA 전사체의 인트론을 제거하는 스플라이싱 반응에 있어서 잘려 나가는 인트론의 시작 부분과 끝나는 부분에 해당하는 서열로서, 일반적으로 SD 서열은 인트론 5' 말단의 GU 서열일 수 있으며, SA 서열은 인트론의 3' 말단의 AG 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 WPRE는 DNA에 전사를 촉진하는 3차 구조를 유도하여, 유전자의 발현을 증가시키는 서열을 의미한다.

본 발명에서 상기 SD/SA 서열 및 WPRE 서열은 각각 서열번호 11 및 서열번호 13의 서열을 포함할 수 있으나, 목적 유전자 발현 카세트 내에 존재하면서 목적 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.

AAV 게놈은 AAV의 천연 또는 인공 유래 혈청형 또는 단리체(isolate) 또는 계통군(clade)으로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 천연 AAV 바이러스 게놈이거나 인공적으로 만들어진 AAV 바이러스 게놈일 수 있다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, AAV 바이러스는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.

일반적으로, AAV 바이러스는 그들의 혈청형에 따라 지칭된다. 혈청형은 자신의 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일 때문에 다른 변이체 아종과 구별하는 데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 갖는 AAV의 변이체 아종(variant subspecies)에 해당한다. 일반적으로, 특정 AAV 혈청형을 가지는 바이러스는 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 교차-반응이 효율적으로 일어나지 않는다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11을 포함하고, 또한 최근 영장류의 뇌에서 확인된 Rec2 및 Rec3과 같은 재조합 혈청형도 포함한다.

본 발명에 사용하기 위해 특히 관심 있는 혈청형은 망막색소상피와 같은 안구 내 조직에 효율적으로 형질도입되는 AAV2, AAV5 및 AAV8을 포함한다. AAV 혈청형의 리뷰는 Choi 등(Curr Gene Ther. 2005;5(3);299-310) 및 Wu 등(Molecular Therapy;14(3),316-327)에서 찾을 수 있다.

AAV 바이러스는 또한 계통군 또는 클론의 측면에서 지칭된다. 이는 천연 또는 인공 유래 AAV 바이러스의 계통발생학적 관계, 및 일반적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV 바이러스의 계통발생학적 군을 나타내며, 그의 모든 자손을 포함한다. 또한, AAV 바이러스는, 자연에서 찾을 수 있거나 인공적으로 조작된, 특정한 AAV 바이러스의 유전적 단리체(isolate) 같은 특정한 단리체에 따라 지칭될 수도 있다. 용어 유전적 단리체(genetic isolate)는 다른 천연 AAV 바이러스와 제한적인 유전자 혼합(genetic mixing)이 일어나서, 그에 의해 유전자 수준에서 인식 가능하게 구별되는 별개의 집단(population)을 정의하는, AAV 바이러스 집단을 기술한다.

일반적으로, AAV의 천연 또는 인공 유래 혈청형 또는 단리체 또는 계통군의 AAV 게놈은 하나 이상의 역위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 시스(cis) 위치에서 기능적 복제 기점을 제공하는 역할을 하고, 세포의 게놈으로부터 벡터의 융합 및 그로부터의 절단을 가능하게 한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 ITR 서열은 Rep-1또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹(flank) 한다.

AAV 게놈은 또한 일반적으로 AAV 바이러스 입자를 위한 패키징 기능을 코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자와 같은 패키징 유전자를 포함한다. rep 유전자는 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 그의 변이체 단백질 중 하나 이상을 코딩한다. cap 유전자는 VP1, VP2 및 VP3 또는 그의 변이체와 같은 하나 이상의 캡시드 단백질을 코딩한다. 이러한 단백질이 AAV 바이러스 입자의 캡시드를 구성한다. 프로모터는 각 패키징 유전자에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명의 벡터에 사용되는 AAV 게놈은 따라서 천연 또는 인공 AAV 바이러스의 전체 게놈일 수 있다. 예를 들면, 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터가 인 비트로(in vitro)에서 AAV 바이러스를 제조하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수는 있다. 바람직하게는, AAV 게놈은 환자에게 투여하기 위한 목적으로 유도체화(derivatise)된다. 이러한 유도체화(derivatisation)는 이 기술분야의 표준이며 본 발명은 AAV 게놈의 공지된 유도체, 및 이 기술분야에 알려진 기법을 적용하여 생성될 수 있는 유도체의 이용을 포함한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 상기 언급한 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비바이러스성 유전자 전달체를 제공한다.

상기 비바이러스성 유전자 전달체는 리포좀, 지질 나노입자일 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에 알려진 비바이러스성 유전자 전달 방법이라면 어느 것이나 이용 가능하다. 이에 대한 구체적인 설명은 앞서 언급하였으므로 생략한다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 라이보자임, 상기 비바이러스성 유전자 전달체, 상기 유전자 컨스트럭트, 상기 재조합 발현 벡터 또는 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 "예방"이라는 용어는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여로 망막색소변성증의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 "치료"라는 용어는 본 발명에 약학 조성물의 투여로 망막색소변성증이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으나, 비경구로 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여로 안구내 물질을 투여할 수 있는 경로는 세 가지로, 유리체강내주사법(intravitreal injection), 맥락막상내주사법 (suprachoroidal injection), 망막하주사법(sunretinal injection)이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 표적하는 세포가 광수용체 세포로써 가장 효율적이며 직접적으로 전달할 수 있는 투여 경로로는 망막하 주사 방법을 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 또한, 주사제로 제조될 때 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.

구체적으로, AAV(Adeno-associated virus)를 활용하여, 인간 유전체에 직접 삽입하는 방법이 아닌, 에피조말 상태에서 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현을 유도하여 표적 RHO 전사체 제거 및 WT RHO 단백질 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용되거나, 또는 다른 치료제와 병행하여 사용되거나 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 표적 로돕신 전사체를 제거함과 동시에 정상(야생형) 로돕신 유전자(RNA)로 치환시켜 정상 로돕신 유전자를 발현시키는 효과를 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 망막색소변성증을 근본적으로 치료하는 효과를 제공한다. 특히 표적 전사체 부위는 모든 종류의 로돕신 돌연변이를 포함한 로돕신 전사체를 표적할 수 있는 부위를 선택함으로써, 하나의 치료제가 다양한 로돕신 돌연변이 환자들에게 모두 적용될 수 있는 장점이 있다. 또한 환자 세포 내에서 발현되는 표적 로돕신 전사체 발현 양에 따라 정상 로돕신 단백질을 발현시킬 수 있기에, 과도한 정상 로돕신 단백질 발현에 의한 부작용 및 독성 유도도 최소화할 수 있다. 또한 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의한 RNA 치환 기능은 내생 세포 기작(endogenous cell machinery)을 이용하지 않고, 세포 내에서의 기능을 위하여 외부의 단백질 도입이 필요하지 않는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 RNA 자체 기전으로 작동하기에 보다 안전한 치료제가 될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 RHO 전사체를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 기전을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 프로모터, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 영역, 정상 로돕신 유전자 영역을 포함하는 유전자 컨스트럭트 기본 구성을 나타내는 모식도이다.
도 3은 인 비트로 맵핑 및 세포 내 맵핑을 통한 RHO RNA의 표적 부위 선정 과정 및 그 결과를 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 로돕신 RNA +59번째 염기 부위를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임(이하, "RHO 표적 라이보자임"이라 함)을 포함하는 컨스트럭트 최적화 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RHO 표적 라이보자임을 포함한 벡터 모식도이다.
도 6은 RHO 표적 라이보자임 최적화를 위해 293A 세포에서 컨스트럭스의 활성을 비교하는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 RHO 표적 라이보자임의 인비트로 효능을 stable cell을 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 RHO 표적 라이보자임의 다양한 돌연변이에 대한 인비트로 효능을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RHO 표적 라이보자임을 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV) 벡터로 발현시키기 위한 재조합 AAV 발현 벡터 모식도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 발현 벡터를 이용하여 질환 동물 모델에서 라이보자임의 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(a는 투여 후 2주, b는 투여 후 5주의 결과임).
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에서 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 혈청 내 면역 및 염증 반응 결과를 나타낸 것이다(A는 투여 후 2주, B는 투여 후 5주의 결과임).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델에서 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 망막(Retina)과 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium; RPE) 조직에서 라이보자임 효능을 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에서 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 생체 내 라이보자임 분포를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 마우스에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 독성을 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 망막전위도 검사를 수행한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 AAV 벡터 투여 후 혈청(A) 및 라이보자임의 활성을 분석한 결과이다(B).
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 다양한 재조합 AAV 벡터 제작 모식도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 재조합 AAV 벡터 투여 후 3주 차의 라이보자임 분포 및 트랜스-스플라이싱 활성을 확인한 결과이다.
도 19 및 도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 재조합 AAV 벡터 투여 후 망막전위도를 검사한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 질환 동물 모델에 RHO 표적 라이보자임을 포함하는 재조합 AAV 벡터 투여 후 망막의 라이보자임 분포 및 라이보자임 RNA 발현을 확인한 결과이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

실시예 1: 로돕신(RHO) RNA 표적 트랜스-스플라이싱 라이보자임 설계

타겟 RNA 부위를 선정하기 위해 RHO RNA 변이체들의 서열을 비교하고, RHO RNA 표적 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 설계하였다(도 2).

실시예 2: 인 비트로 맵핑 및 세포 내 맵핑을 통한 로돕신(RHO) RNA의 표적 부위 선정

WT RHO RNA 혹은 P23H RHO RNA와 라이보자임 RNA 라이브러리를 이용하여 인 비트로 맵핑(in vitro mapping) 및 세포 내 맵핑을 진행하였다. 인 비트로 맵핑을 위하여 테스트 튜브에서 로돕신 RNA와 랜덤 라이브러리 라이보자임을 혼합하여 반응시킨 뒤 RT-PCR을 수행한 후 트랜스 스플라이싱 산물로 예상되는 PCR DNA 밴드의 서열분석을 통해 트랜스 스플라이싱이 발생한 로돕신 RNA 부위를 확인하였다.

보다 구체적으로, 로돕신 RNA를 인 비트로 전사 과정을 통해 합성하고, 5' 말단에 랜덤한 서열을(GNNNNN) 가지는 트랜스-스플라이싱 RNA 라이브러리를 인 비트로 전사 과정을 통해 합성하였다. 로돕신 RNA 0.1 pmole을 1X 인 비트로 트랜스-스플라이싱 반응 버퍼(50mM Hepes (pH 7.0), 150mM NaCl, 5mM MgCl2)와 섞어 총 10uL로 만들고, 라이보자임 라이브러리 RNA 1 pmole을 1X 인 비트로 트랜스-스플라이싱 반응 버퍼와 섞어 총 9uL로 만든 뒤, 1mM GTP 1uL를 넣어 주어 최종 0.1mM GTP로 농도를 맞추었다. 이를 각각 95℃ 1분, 37℃ 3분에서 반응시키고, 두 개를 섞은 후 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 페놀 추출/EtOH 침전 과정을 거쳐 RNA를 회수한 뒤 RT-PCR을 수행하였다. 이어서, 라이보자임 특이 RT 프라이머(5'- ATGTGCTGCAAGGCGATT-3')을 넣어 준 뒤, 20uL 부피 조건에서 역전사를 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2uL를 사용하여 로돕신 RNA 특히 5' 프라이머(5'- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3'), 라이보자임 특히 3' 프라이머 (RY-TS)(5'- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3')을 각각 10pmole씩 사용하여 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초 조건으로 35 사이클의 PCR을 수행하고, 2% TBE 아가로스 겔에서 PCR 밴드를 확인하였다. 확인된 모든 PCR 산물을 페놀 & 침전 과정을 거쳐 버퍼 체인지 후, 로돕신 RNA의 어느 부위에서 트랜스-스플라이싱 반응이 일어났는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 트랜스-스플라이싱의 시퀀싱을 통해 분석한 결과 RHO mRNA의 5'UTR 부분인 59번째 사이트를 가장 잘 타겟팅하는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).

세포 내 맵핑을 위하여 테스트 튜브에 로돕신 RNA와 랜덤 라이브러리 라이보자임을 혼합하여 세포내 공동 형질감염(co-transfection)하였다. 구체적으로 293A 세포를 35mm 배양 접시에 1x10⁵ 개 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 배양하였다. 로돕신 RNA 1㎍과 랜덤 라이브러리 라이보자임 1㎍을 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 섞은 후 Opti-MEM 100㎕를 넣어 섞었다. 리포펙타민 2000 2㎕와 Opti-MEM 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 각각 방치하였다. 이후 상기 두 튜브의 내용물을 혼합하고, 리포좀(liposome) 형태의 복합체를 이룰 수 있도록 20분 동안 상온에서 보관하였다. 20분 후 튜브를 10초 동안 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 뿌려 공동 형질주입(co-transfection)하고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, trizol 500ul 처리하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 5㎍을 DNase I 1㎕를 처리하여 gDNA를 제거하였고, 이 중 1㎍을 라이보자임 특이 RT 프라이머(5'- ATGTGCTGCAAGGCGATT-3')을 넣어 준 뒤, 20uL 부피 조건에서 역전사를 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2uL를 사용하여 로돕신 RNA 특히 5' 프라이머(5'- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3'), 라이보자임 특히 3' 프라이머 (RY-TS)(5'- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3')을 각각 10pmole씩 사용하여 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초 조건으로 35 사이클의 PCR을 수행하고, 2% TBE 아가로스 겔에서 PCR 밴드를 확인하였다. 확인된 모든 PCR 산물을 페놀 & 침전 과정을 거쳐 버퍼 체인지 후, 로돕신 RNA의 어느 부위에서 트랜스-스플라이싱 반응이 일어났는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

실시예 3: 트랜스-스플라이싱 라이보자임 제조

서열번호 1로 표시되는 WT RHO, 그리고 P23H RHO 서열 중 +59번째 염기 부위를 타겟으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 컨스트럭트를 최적화하였다(도 4). 상기 타겟 부위는 RHO RNA의 +59 위치의 염기를 포함하고, 5' 말단에 상기 타겟 부위를 표적할 수 있는 IGS(5'-GCCCAA-3': 서열번호 6)를 도입하였다. 세포 내에서의 RHO RNA +59 염기를 표적하는 라이보자임(이하, "RHO 표적 라이보자임"이라 함)의 트랜스-스플라이싱 활성을 분석하기 위하여, 개선된 RHO 표적 라이보자임 컨스트럭트를 제조하였다. 6-nt 길이의 IGS만을 가지는 그룹 I 인트론은 포유류 세포 내에서 발현되었을 때 불활성화되거나 비특이적 활성을 나타낸다고 알려져 있기 때문이다. 개선된 RHO 표적 라이보자임 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 라이보자임의 IGS 업스트림에 연장된 P1(서열번호 7) 및 7-nt 길이의 P10 나선(서열번호 8 및 서열번호 9)을 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드를 삽입함으로써 라이보자임을 변형하였다.

실시예 4: 트랜스-스플라이싱 라이보자임 최적화

실시예 3에서 제조한 제1, 제2 및 제3 디자인의 RHO 표적 라이보자임 중 트랜스-스플라이싱에 최적화된 RHO 표적 라이보자임을 확인하기 위해 RHO 표적 라이보자임을 포함한 벡터를 제작하였다(도 5).

도 5에서, AS150은 서열번호 10으로, SD/SA는 서열번호 11로, 5'UTR 일부 서열은 서열번호 12로 표시된다. T2A는 링커 서열이고, YFP는 형광단백질 서열로 이 기술분야에 널리 알려져 있으므로 구체적인 서열 표시는 생략한다. polyA 서열 역시 이 기술분야에 널리 알려져 있다.

RHO 표적 라이보자임 3개 디자인 간의 라이보자임 효과를 인 비트로(포유동물세포)에서 비교 검증하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 제1 디자인과 제2 디자인을 비교해 보았을 때 제2 디자인의 트랜스-스플라이싱 작용이 더 좋음을 확인하였다(도 6A). 제2 디자인과 제3 디자인을 비교했을 때 제2 디자인에 의한 트랜스-스플라이싱 효율이 더 좋음을 확인하였다(도 6B). 제2 디자인을 선택하여 라이보자임의 특이성과 효율성을 최적화하기 위해 안티센스 길이를 조절하여 비교하였고, 안티센스 150개 길이(서열번호 10)가 가장 효과가 좋음을 확인하였다(도 6C). 트랜스-스플라이싱 산물이 정확하게 트랜스-스플라이싱 되었는지 확인하기 위하여 시퀀싱을 진행하였고, 표적 부위에서 트랜스-스플라이싱이 일어났음을 확인하였다(도 6D).

실시예 5: 인 비트로에서 트랜스-스플라이싱 활성 분석

RHO 표적 라이보자임의 인비트로 효능을 stable cell을 이용하여 확인하였다. 양성 대조군으로 YFP가 태그된 야생형 RHO (wild Rho-YFP)를 이용하였다. 로돕신 mRNA가 안정적으로 발현하는 293A WT RHO, 293A P23H RHO 세포주를 제작하였고, 이 세포주를 통하여 기능 분석을 수행하였다. 정상 로돕신 단백질은 세포막으로 이동하여 편재화(localization)하지만 P23H 로돕신 돌연변이의 경우 단백질의 폴딩에 문제가 생겨 세포막으로 이동되지 않고 세포질 소포체에 머물게된다. 따라서 단백질의 위치를 확인함으로써 로돕신 단백질의 기능적 변화를 확인할 수 있다.

RHO 표적 라이보자임 발현 벡터를 stable cell에 트랜스팩션하였고, 트랜스-스플라이싱 효과를 확인하기 위하여 RNA를 추출하여, RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로 stable cell을 35mm 배양 접시에 1x10⁵ 개 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 배양하였다. RHO 표적 라이보자임 발현 벡터 2㎍과 Opti-MEM 100㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞고, 리포펙타민 2000 2㎕와 Opti-MEM 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 방치하였다. 이후 상기 두 튜브의 내용물을 혼합하고, 리포좀(liposome) 형태의 복합체를 이룰 수 있도록 20분 동안 상온에서 보관하였다. 20분 후 튜브를 10초 동안 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 뿌려 형질주입(transfection)하고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, trizol 500ul 처리하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 5㎍을 DNase I 1㎕를 처리하여 gDNA를 제거하였고, 이 중 1㎍을 역전사하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 이용하여 PCR을 통해 트랜스-스플라이싱 산물을 확인하였고, 트랜스-스플라이싱 작용이 정확히 일어났음을 염기서열 분석으로 확인하였다(도 7A).

또한, 위와 같은 방법으로 RHO 표적 라이보자임 발현 벡터를 형질주입 후 RHO 항체를 이용하여 RHO 단백질을 염색하였다. 2차항체를 형광 항체를 이용하여 형광현미경을 이용하여 RHO 단백질의 세포내 분포를 확인하였다. P23H 돌연변이에 의해 세포 내에 머물러 있었던 로돕신 단백질이 라이보자임에 의해 세포막으로 분포함을 확인하였다(도 7B).

또한 RHO 표적 라이보자임의 다양한 돌연변이에 대한 인비트로 효능을 293A 세포에 공동형질감염(co-transfection)하여 확인하였다(도 8). 구체적으로 RHO 표적 라이보자임 발현 벡터 0.5㎍과 다양한 돌연변이 발현 벡터 2㎍을 Opti-MEM 100㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞고, Lipofectamin2000 2.5 ㎕와 Opti-MEM 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 방치하였다. 이 후 위와 같은 방법으로 형질 주입 후 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 표적하는 부위에 정확하게 트랜스-스플라이싱이 일어났음을 확인함으로써 여러 돌연변이 부위에 대해서 정상 RHO RNA로 교체됨을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 로돕신 전사체를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 특정 돌연변이 유전자만 교정할 수 있는 것이 아니고, 돌연변이 종류에 상관없이 돌연변이 부위를 교체할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 재조합 바이러스 제작 및 동물 모델에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임 효능 확인

6-1: 재조합 바이러스 제작

실시예 4의 제2 디자인의 RHO 표적 라이보자임을 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV) 벡터로 발현시키기 위해 재조합 AAV 발현 벡터를 제작하였다. 프로모터는 CMV 프로모터를 사용하였다(도 9). pAAV 백본 플라스미드 20㎍을 E.coRI 으로 반응 시킨 후 아가로스겔 용출하였다. 합성한 라이보자임+RHO DNA를 인퓨젼(infusion) 효소를 이용하여 반응시킨 후 형질전환(transformation)하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 배양하여 플라스미드를 얻어 시퀀싱을 통해 서열이 올바르게 클로닝된 클론을 선별하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 EcoRV와 XbaI으로 반응시킨 후 아가로스겔 용출하였다. 합성한 YFP DNA를 인퓨젼 효소를 이용하여 반응시킨 후 형질전환하여 콜로니를 얻었다. 콜로니를 배양하여 플라스미드를 얻어 시퀀싱을 통해 서열이 올바르게 클로닝된 콜로니를 선별하였다. 안티센스 서열을 추가하기 위해 E.coRI 으로 반응 시킨 후 아가로스 겔 용출하였다. PCR을 통해 얻은 AS150 서열을 인퓨젼 효소를 이용하여 반응시킨 후 형질전환하여 콜로니를 얻었다. 같은 방법으로 서열 분석 후 최종 AAV-cRib-YFP 플라스미드를 얻었다.

AAV 바이러스 벡터를 제작하기 위해 293T 세포에 Helper 벡터, RHO 라이보자임 발현 벡터, Rep2Cap5 벡터를 삼중 형질감염 (triple transfection) 하였고, 72시간 후 세포는 라이시스(lysis), 상층액은 PEG 다운(down)하였다. 이를 이오딕사놀 구배 초원심분리(iodixanol gradient ultracentrifuge) 방법으로 AAV 발현 벡터를 얻었다.

6-2: 동물 모델에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임 효능 확인

실시예 6-1의 AAV 발현 벡터를 이용하여 질환 모델인 hP23H-RFP 마우스에서 라이보자임의 효능을 확인하였다. hP23H 마우스-RFP 모델은 인체 P23H 유전자와 RFP 형광 단백질이 융합된 형태로 넉인(knock-in)된 RP 마우스 모델로서 RHO P23H 연구에 널리 이용되는 모델이다. AAV 발현 벡터 1㎕ 망막하주사(subretinal injection) 방법으로 마우스 안구에 주입하였다. IO 키트에 연결된 34G 니들을 공막 천자(scleral puncture)로 자입시킨 후 1 ㎕/eye의 부피로 양안에 망막 하 주사로 투여하였다. 투여가 완료되면 마우스의 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하여 감염을 막은 후, FP/OCT 촬영을 통하여 망막의 블렙(bleb) 형성을 확인하는 방법으로 투여의 성공 여부를 판정하였다.

투여 후 2주 혹은 5주 차에 안구를 적출하여 슬라이드를 제작하였다. AAV 발현 벡터에는 YFP 형광 물질이 결합되어 있기 때문에 RHO 단백질에 대한 추가 염색은 진행하지 않되 DAPI 염색을 통해 세포 내 핵 염색을 하였다. 도 10은 투여 후 2주(도 10a), 투여 후 5주(도 10b)의 결과를 나타낸 것이다.

AAV5-YFP(형광 positive)와 AAV-WT hRho-YFP(gene, 형광 positive)를 AAV5-cRib-YFP에 대한 대조군으로 활용하였다. AAV5-YFP와 AAV-WT hRho-YFP 물질이 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium; RPE)에도 형광이 발현하는 것으로 보아, 광수용체 특이적으로 도입되지 않는 것을 확인할 수 있었고, 반면, RHO 표적 라이보자임이 부착된 AAV5-cRib-YFP의 경우, RPE에서 발현하지 않고 광수용체에서만 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다.

실시예 7: 동물 모델에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 면역 및 염증반응 확인

질환 모델인 hP23H-RFP 마우스에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 투여 후 혈청 내 면역 및 염증 반응을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다(A: 투여 후 2주, B: 투여 후 5주).

관련 사이토카인 중 IL-6, IL-17A, TNF-α, INF-γ, IL-10이 AAV5-cRib-YFP에 대해 2주차에 증가하는 양상을 보였으며, IL-4와 IL-2에 대해서는 변화 양상을 보이지 않았다. 이와 같은 변화는 대조군인 AAV5-YFP와 AAV-WT hRho-YFP 물질 처리에 의해서는 반응을 보이지 않는 것으로 보아 바이러스 벡터 자체의 효과는 아닌 것으로 생각된다. 2주차에 증가 패턴을 보였던 사이토카인은 5주차에 감소하여 대조군과 비슷한 양으로 줄어드는 결과를 보아 이는 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 발현하는 벡터의 망막 하 주사(subretinal injection)에 의해 증가했던 염증 및 면역 반응이 물질 투여 초기에는 증가하였다가 5주차 원래 수준으로 되돌아오는 것을 의미한다.

실시예 8: 동물 모델에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 망막과 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium; RPE) 조직에서 라이보자임 효능 확인

질환 모델에 유효물질 투여 후 RHO RNA를 타겟하여 트랜스-스플라이싱이 생체 내 광수용체에서 발생했는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 마우스의 안구를 적출하여 망막과 망막색소상피세포(RPE/choroid)를 분리하였고, 각 부위에서 RNA 추출 후 RT-PCR을 수행하여 트랜스-스플라이싱 산물 생성 여부를 관찰하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

RPE에서는 증폭된 트랜스-스플라이싱 산물 PCR 밴드를 확인할 수 없었으나 망막 특이적으로 트랜스-스플라이싱 산물을 확인하였다(도 12A). 증폭된 트랜스-스플라이싱 산물에 대해 시퀀싱을 진행하여 돌연변이 RHO RNA를 타켓팅하여 정상 RHO RNA로 치환되었음을 확인하였다(도 12B).

또한, 망막과 망막색소상피세포의 gDNA를 추출하여 AAV ITR 부위를 qPCR하였을 때, 망막보다 망막색소상피세포에서 더 많이 검출되었는데(도 12C), 이는 AAV 벡터가 RPE로 전달은 잘 되지만 라이보자임에 의해 조절되는 트랜스진(transgene) 발현은 광수용체 특이적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 질환 모델에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 생체 내 라이보자임 분포 확인

질환 모델인 hP23H-RFP 마우스에서 라이보자임의 투여 후 2주차에 전 장기에서 라이보자임 분포를 확인하였다(도 13). 투여 후 2주차에 마우스 희생 후 전 장기를 얻었고, gDNA 정제를 통해 gDNA를 얻었다. 각각의 장기의 1μg gDNA를 이용하여 트랜스-스플라이싱 라이보자임 특이적 프라이머를 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하였다. 전 장기 중 간조직에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 발현하는 벡터를 투여한 모든 개체에서 감지 범위(detection range) 내에서 라이보자임이 감지되었다. 이 외 일부 개체에서 폐, 소장, 전립선 조직에서 투여한 벡터가 감지 범위 내에서 라이보자임이 감지되었고, 다른 조직에서는 감지되지 않았다.

실시예 10: 정상 마우스에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 독성 분석

정상마우스(C57BL/6J)에서 농도별 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 안구 변화를 관찰하여 독성을 확인하기 위해, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 주차별 Fundus 및 OCT 이미지, H&E 염색 결과를 확인하였다(도 14). 시험군에서 망막하 투여에 따른 블렙이 형성됨을 확인하여 투여가 제대로 되었음을 확인하였다(붉은색 점선). 일부 개체들에서 각막의 염증 및 유리체의 출혈이 발생하였다(하얀 점선). H&E 염색으로 확인하였을 때 3x10⁹GC/eye 이상의 농도를 처리한 그룹들에서 수정체의 변성, 망막의 변성 및 외측 망막 위축, 맥락막의 조직구성 염증의 발생을 확인하였다. 따라서 1x10⁹GC/eye 이하의 농도에서는 독성이 없음을 확인하였다.

실시예 11: 질환 모델에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 망막전위도 검사

질환 모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령 마우스)에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 투여 후 시간 경과에 따른 망막전위도 검사 결과이다(도 15 및 표 1). 망막전위도검사를 위해 scotopic-ERG 측정을 실시하고, B-웨이브의 진폭(amplitude)을 비교하였다. 망막전위도평가를 위하여 마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취를 시킨 후, 산동제를 점안하여 산동 유도하였다. 마우스를 제물대 위에 올려놓고 프로브를 각각 꼬리의 미근부, 미간, 각막에 설치한 상태에서 mono-flash 자극(0.9 log cds/m2 (10 responses/intensity))에 대한 ERG를 측정하였다. 측정이 완료되면 마우스 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하였다. 분석은 'LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)' 프로그램을 이용하여 실시하였다.

로돕신 유전자의 P23H 돌연변이는 세포 내에서 정상적인 기능을 하지 못하고, 간상세포 (rod cell), 원추세포(cone cell)의 사멸을 유도하여 시각적인 기능이 퇴행하게 된다. 광수용체 세포(rod, cone)는 빛에너지를 전기신호로 바꾸어 주는 역할을 하는데, 광수용체 세포의 수와 기능이 저하되면 전기 신호가 감소하게 된다. 이와 같은 전기 신호에 대한 평가를 망막 전위도 검사(ERG)를 통해 확인함으로써 시각적인 기능 차이를 확인하고자 하였다. 망막전위도 검사에서 B-웨이브는 실제 전기신호가 전달되었는지를 판단하는 지표이며, RHO 표적 라이보자임 (AAV5-cRib-YFP) 투여에 의해 5주차에서 B -웨이브가 유의적으로 증가함을 확인하였고, 이 효과는 8주차까지 지속되었다. 따라서 AAV5-cRib-YFP에 의해 질환모델에서 시각적 기능을 유지 개선하는 것으로 보인다.

[표 1]

실시예 12: 질환 모델에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 혈청 및 라이보자임 활성 분석

질환 모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령)에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 투여 후 8주차에서 혈청 분석 및 라이보자임 활성을 확인하였다(도 16). 투여 후 8주차에서도 PBS를 투여한 정상동물(G1)과 PBS만 투여한 G2군을 비교했을 때, 유효물질에 의한 사이토카인의 변화는 없었다(도 16A). 실시예 7에서 2주차에서 사이토카인의 변화를 보였던 것이 5주차에서는 정상동물과 비교하였을 때 차이가 없었던 것을 확인하였는데, 이 결과와 비교하여 판단해보면 8주차까지도 사이토카인의 변화에는 영향을 주지 않는 것을 의미한다.

물질 투여 후 RHO RNA를 표적하여 트랜스-스플라이싱이 8주차에도 지속적으로 이어지고 있는지 여부를 확인하기 위해, 마우스의 안구를 적출하여 망막에서 RNA 추출 후 RT-PCR을 통해 트랜스-스플라이싱 산물이 생성됨을 확인하였다(도 16B). 이는 재조합 AAV 벡터가 망막으로 전달되어 AAV5-cRib-YFP의 발현 및 작용이 8주차까지 지속적으로 이어지고 있음을 의미한다.

실시예 13: 재조합 바이러스벡터 최적화

망막으로의 감염능 및 발현능을 확인하기 위해 다양한 재조합 AAV 벡터를 제조하였다(도 17). 도 17에 나타낸 것과 같이, 5' 말단에 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(splicing donor/splicing acceptor sequence, SD/SA sequence)이 연결되고, 3' 말단에 WPRE(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element)이 연결되었다. SD/SA 및 WPRE 서열은 각각 서열번호 11 및 서열번호 13으로 표시된다. 최적의 물질을 선별하기 위해 이전 실시예에서 사용하였던 AAV 벡터와는 달리 다양한 재조합 AAV 혈청(serotype) 및 프로모터(promoter)를 가지는 물질을 생산하여서 이용하였다. 이에 대해 CMV 프로모터와 RHO 프로모터를 이용하였고, 최종 물질에 대한 효능을 확인하기 위해 YFP 형광 물질은 제거하고, 발현을 증가시키기 위해 WPRE를 삽입하였다.

13-1: 라이보자임 분포 및 트랜스-스프라이싱 효율 확인

제조한 재조합 AAV 벡터를 질환 모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령)에 투여 후 3주차에서 라이보자임 분포 및 트랜스-스플라이싱을 확인하였다(도 18).

도 18에 표시된 G1 내지 G7의 구성은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

혈청형(serotype)에 대한 감염율을 확인하기 위해 주입 후 3주차에 안구를 적출하였고, 망막(retina)과 RPE/choloid를 분리하여 각각 RNA와 gDNA를 추출하여 gDNA를 비교하였을 때 AAV 혈청형 5가 혈청형 2 혹은 8보다 망막과 RPE에 모두 감염이 잘되었다. RT-PCR을 통해 RNA 분석을 동열하게 진행 확인하였고, CMV 프로모터에 의해 조절되는 경우 RPE에서도 라이보자임의 발현이 높게 나타나는 반면, 망막에서는 CMV 프로모터에 의해 조절되는 것보다 RHO 프로모터에 의해 조절되는 라이보자임의 발현이 더 높게 나타남을 확인하였다(도 18A 및 18B).

실제 망막에 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 작용하여 트랜스-스플라이싱 산물이 생성되었는지 확인하였고, AAV 혈청형 5에 RHO 프로모터의 조절을 받는 물질의 트랜스-스플라이싱 산물 PCR 밴드가 진하게 나타남을 확인하였다(도 18C).

이를 통해 AAV 혈청형 5 RL-Rib-WPRE이 망막으로의 전달 및 발현이 우수하고 트랜스-스플라이싱 효율 역시 우수함을 확인하였다.

13-2: 질환 모델에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 망막전위도 검사

망막으로의 감염능 질환모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령)에서 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 투여 후 6주차에서 망막전위도 검사를 수행하였다. 그 결과를 도 19 및 표 3에 나타내었다.

[표 3]

정상 마우스(G0) 대비 P23H -RFP 질환 마우스(G1)에서 빛에 대한 B-웨이브 반응이 유의적으로 낮게 나타남을 확인하였는데, 이는 P23H-RFP 마우스에서 RHO 돌연변이에 의해 광수용체 세포가 손상됨으로써 전기신호 전달에 문제가 생겼음을 의미한다.

질환 모델에 각각의 AAV를 투여 후 망막전위도를 측정하였을 때, 모든 시험군에서 평균 스코토픽 B파 진폭(scotopic B-wave amplitude)이 PBS 투여군(G1) 대비 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 프로모터 간 비교에서는 CMV 프로모터보다 RHO 프로모터에 조절을 받는 경우 PBS 투여군(G1) 대비 B-웨이브가 상당히 증가하였고(G3<G4, G5<G6), 혈청형 간 비교에서는 AAV2/5 투여군(G5, G6)과 AAV2/8 투여군(G7)에서 PBS 투여군(G1) 대비 B-웨이브가 증가하였다. 이 중 AAV2/5 RL-Rib-WPRE 투여군이 유의적으로 가장 증가한 것을 확인하여, 상기 시험군에서는 AAV2/5 RL-Rib-WPRE 망막하 투여 시 질환모델의 시각 기능 개선 효과가 가장 큰 것으로 판단된다.

한편, 도 17의 재조합 AAV 벡터 중, AAV 혈청형 5 혹은 8과 RHO 프로모터를 포함하는 AAV2/5 RL-Rib-WPRE, AAV2/8 RL-Rib-WPRE의 재조합 AAV 벡터를 질환 모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령)에 투여 후 4주차에서 망막전위도 검사를 비교 수행하였고, 도 20 및 표 4에 나타내었다.

[표 4]

표 4에 및 도 20에 나타난 것과 같이, 투여 후 4주차에서의 B-웨이브는 PBS 투여군(H2) 대비 AAV2/5 RL-Rib-WPRE 투여군(H3) 및 AAV2/8 RL-Rib-WPRE 투여군 (H4)에서 모두 유의적으로 증가하였다. AAV2/8 RL-Rib-WPRE 투여군 (H4)이 PBS 투여군(H2)과 AAV2/5 RL-Rib-WPRE 투여군(H3) 보다 투여 전(0 week) B-웨이브가 높았던 것을 감안하면, AAV2/5 RL-Rib-WPRE 투여군 (H3) 및 AAV2/8 RL-Rib-WPRE 투여군 (H4)의 B-웨이브 증가능이 유사한 것으로 생각된다. 따라서 AAV2/5 RL-Rib-WPRE 또는 AAV2/8 RL-Rib-WPRE를 망막하 투여 시 질환 모델의 시각 기능 개선 효과가 PBS 투여군(H2) 대비 매우 우수한 것으로 판단된다.

13-3: 질환 모델에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 망막의 라이보자임 분포 및 트랜스-스플라이싱 확인

아래 표 5와 같이, 질환 모델인 hP23H-RFP 마우스(5주령)에 트랜스-스플라이싱 라이보자임 투여 후 6주차에 망막에서의 라이보자임 분포와 트랜스-스플라이싱을 확인하여 도 21에 나타내었다.

[표 5]

질환 모델에서 기능적 효능을 확인한 후 안구 조직을 적출하여 망막 gDNA와 RNA를 분리 분석하였고, 실시예 13-1의 3주차 결과와 동일하게 AAV 혈청형 5가 망막으로의 전달이 잘 됨을 확인하였다. RNA 분석을 하였을 때 역시 AAV 혈청형 5에 의한 발현이 더 좋게 나타났을 뿐만 아니라 RHO 프로모터에 의해 조절되는 라이보자임의 발현이 높게 나타남을 확인하였다. 이를 통해 AAV2/5 RL-Rib-WPRE의 망막에 전달 및 발현이 3주차와 동일하게 6주차에서도 역시 우수함을 보여준다.

상기 결과들을 종합하면, hRHO-P23H 질환 모델에서 AAV 혈청형 5 및 8에 의한 망막 및 RPE로의 전달이 효과적이었으며, RHO 프로모터에 의해 조절되는 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 망막 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 투여 초기인 3주차에서부터 6주차에 이르기까지 발현이 지속적으로 이루어졌고, 4주차 및 6주차에 망막전위도검사를 통한 시각 기능을 확인했을 때 시각 개선에 효과를 주는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Rznomics Inc. <120> A trans-splicing ribozyme specific for rhodopsin transcript and uses thereof <130> APC-2021-0720DIV1 <150> KR 20/092,265 <151> 2020-07-24 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2768 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2768) <223> Homo sapiens rhodopsin (RHO) <400> 1 agagtcatcc agctggagcc ctgagtggct gagctcaggc cttcgcagca ttcttgggtg 60 ggagcagcca cgggtcagcc acaagggcca cagccatgaa tggcacagaa ggccctaact 120 tctacgtgcc cttctccaat gcgacgggtg tggtacgcag ccccttcgag tacccacagt 180 actacctggc tgagccatgg cagttctcca tgctggccgc ctacatgttt ctgctgatcg 240 tgctgggctt ccccatcaac ttcctcacgc tctacgtcac cgtccagcac aagaagctgc 300 gcacgcctct caactacatc ctgctcaacc tagccgtggc tgacctcttc atggtcctag 360 gtggcttcac cagcaccctc tacacctctc tgcatggata cttcgtcttc gggcccacag 420 gatgcaattt ggagggcttc tttgccaccc tgggcggtga aattgccctg tggtccttgg 480 tggtcctggc catcgagcgg tacgtggtgg tgtgtaagcc catgagcaac ttccgcttcg 540 gggagaacca tgccatcatg ggcgttgcct tcacctgggt catggcgctg gcctgcgccg 600 cacccccact cgccggctgg tccaggtaca tccccgaggg cctgcagtgc tcgtgtggaa 660 tcgactacta cacgctcaag ccggaggtca acaacgagtc ttttgtcatc tacatgttcg 720 tggtccactt caccatcccc atgattatca tctttttctg ctatgggcag ctcgtcttca 780 ccgtcaagga ggccgctgcc cagcagcagg agtcagccac cacacagaag gcagagaagg 840 aggtcacccg catggtcatc atcatggtca tcgctttcct gatctgctgg gtgccctacg 900 ccagcgtggc attctacatc ttcacccacc agggctccaa cttcggtccc atcttcatga 960 ccatcccagc gttctttgcc aagagcgccg ccatctacaa ccctgtcatc tatatcatga 1020 tgaacaagca gttccggaac tgcatgctca ccaccatctg ctgcggcaag aacccactgg 1080 gtgacgatga ggcctctgct accgtgtcca agacggagac gagccaggtg gccccggcct 1140 aagacctgcc taggactctg tggccgacta taggcgtctc ccatccccta caccttcccc 1200 cagccacagc catcccacca ggagcagcgc ctgtgcagaa tgaacgaagt cacataggct 1260 ccttaatttt tttttttttt ttaagaaata attaatgagg ctcctcactc acctgggaca 1320 gcctgagaag ggacatccac caagacctac tgatctggag tcccacgttc cccaaggcca 1380 gcgggatgtg tgcccctcct cctcccaact catctttcag gaacacgagg attcttgctt 1440 tctggaaaag tgtcccagct tagggataag tgtctagcac agaatggggc acacagtagg 1500 tgcttaataa atgctggatg gatgcaggaa ggaatggagg aatgaatggg aagggagaac 1560 atatctatcc tctcagaccc tcgcagcagc agcaactcat acttggctaa tgatatggag 1620 cagttgtttt tccctccctg ggcctcactt tcttctccta taaaatggaa atcccagatc 1680 cctggtcctg ccgacacgca gctactgaga agaccaaaag aggtgtgtgt gtgtctatgt 1740 gtgtgtttca gcactttgta aatagcaaga agctgtacag attctagtta atgttgtgaa 1800 taacatcaat taatgtaact agttaattac tatgattatc acctcctgat agtgaacatt 1860 ttgagattgg gcattcagat gatggggttt cacccaacct tggggcaggt ttttaaaaat 1920 tagctaggca tcaaggccag accagggctg ggggttgggc tgtaggcagg gacagtcaca 1980 ggaatgcaga atgcagtcat cagacctgaa aaaacaacac tgggggaggg ggacggtgaa 2040 ggccaagttc ccaatgaggg tgagattggg cctggggtct cacccctagt gtggggcccc 2100 aggtcccgtg cctccccttc ccaatgtggc ctatggagag acaggccttt ctctcagcct 2160 ctggaagcca cctgctcttt tgctctagca cctgggtccc agcatctaga gcatggagcc 2220 tctagaagcc atgctcaccc gcccacattt aattaacagc tgagtccctg atgtcatcct 2280 tatctcgaag agcttagaaa caaagagtgg gaaattccac tgggcctacc ttccttgggg 2340 atgttcatgg gccccagttt ccagtttccc ttgccagaca agcccatctt cagcagttgc 2400 tagtccattc tccattctgg agaatctgct ccaaaaagct ggccacatct ctgaggtgtc 2460 agaattaagc tgcctcagta actgctcccc cttctccata taagcaaagc cagaagctct 2520 agctttaccc agctctgcct ggagactaag gcaaattggg ccattaaaag ctcagctcct 2580 atgttggtat taacggtggt gggttttgtt gctttcacac tctatccaca ggatagattg 2640 aaactgccag cttccacctg atccctgacc ctgggatggc tggattgagc aatgagcaga 2700 gccaagcagc acagagtccc ctggggctag aggtggagga ggcagtcctg ggaatgggaa 2760 aaacccca 2768 <210> 2 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trans-splicing ribozyme <400> 2 gctcccgccc aaaaaagtta tcaggcatgc acctggtagc tagtctttaa accaatagat 60 tgcatcggtt taaaaggcaa gaccgtcaaa ttgcgggaaa ggggtcaaca gccgttcagt 120 accaagtctc aggggaaact ttgagatggc cttgcaaagg gtatggtaat aagctgacgg 180 acatggtcct aaccacgcag ccaagtccta agtcaacaga tcttctgttg atatggatgc 240 agttcacaga ctaaatgtcg gtcggggaag atgtattctt ctcataagat atagtcggac 300 ctctccttaa tgggagctag cggatgaagt gatgcaacac tggagccgct gggaactaat 360 ttgtatgcga aagtatattg attagttttg gagtactcgg ggagc 405 <210> 3 <211> 409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trans-splicing ribozyme <400> 3 cgtactccgc ccaaaaaagt tatcaggcat gcacctggta gctagtcttt aaaccaatag 60 attgcatcgg tttaaaaggc aagaccgtca aattgcggga aaggggtcaa cagccgttca 120 gtaccaagtc tcaggggaaa ctttgagatg gccttgcaaa gggtatggta ataagctgac 180 ggacatggtc ctaaccacgc agccaagtcc taagtcaaca gatcttctgt tgatatggat 240 gcagttcaca gactaaatgt cggtcgggga agatgtattc ttctcataag atatagtcgg 300 acctctcctt aatgggagct agcggatgaa gtgatgcaac actggagccg ctgggaacta 360 atttgtatgc gaaagtatat tgattagttt tggagtactc gcgagtacg 409 <210> 4 <211> 409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trans-splicing ribozyme <400> 4 cgtactccgc ccaaaaaagt tatcaggcat gcacctggta gctagtcttt aaaccaatag 60 attgcatcgg tttaaaaggc aagaccgtca aattgcggga aaggggtcaa cagccgttca 120 gtaccaagtc tcaggggaaa ctttgagatg gccttgcaaa gggtatggta ataagctgac 180 ggacatggtc ctaaccacgc agccaagtcc taagtcaaca gatcttctgt tgatatggat 240 gcagttcaca gactaaatgt cggtcgggga agatgtattc ttctcataag atatagtcgg 300 acctctcctt aatgggagct agcggatgaa gtgatgcaac actggagccg ctgggaacta 360 atttgtatgc gaaagtatat tgattagttt tggagtactc gccagtacg 409 <210> 5 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribozyme* <400> 5 aaaagttatc aggcatgcac ctggtagcta gtctttaaac caatagattg catcggttta 60 aaaggcaaga ccgtcaaatt gcgggaaagg ggtcaacagc cgttcagtac caagtctcag 120 gggaaacttt gagatggcct tgcaaagggt atggtaataa gctgacggac atggtcctaa 180 ccacgcagcc aagtcctaag tcaacagatc ttctgttgat atggatgcag ttcacagact 240 aaatgtcggt cggggaagat gtattcttct cataagatat agtcggacct ctccttaatg 300 ggagctagcg gatgaagtga tgcaacactg gagccgctgg gaactaattt gtatgcgaaa 360 gtatattgat tagttttgga gtactcg 387 <210> 6 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS <400> 6 gcccaa 6 <210> 7 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 7 cccgcccaa 9 <210> 8 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P10 <400> 8 cguacuc 7 <210> 9 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P10 <400> 9 gaguacg 7 <210> 10 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS150 <400> 10 ggcggccagc atggagaact gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg 60 gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc 120 attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 150 <210> 11 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SD/SA <400> 11 aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt tttgtttatc ttatttctaa tactttccct 60 aatctctttc tttcagggca ataatgatac aatgtatcat gcctctttgc accattctaa 120 agaataacag tgataatttc tgggttaagg caatagcaat atttctgcat ataaatattt 180 ctgcatataa attgtaactg atgtaagagg tttcatattg ctaatagcag ctacaatcca 240 gctaccattc tgcttttatt ttatggttgg gataaggctg gattattctg agtccaagct 300 aggccctttt gctaatcatg ttcatacctc ttatcttcct cccacagctc ctgggcaacg 360 tgctggtctg tgtgctggcc catcactttg gcaaagaatt 400 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR <400> 12 gggagcagcc acgggtcagc cacaagggcc acagcc 36 <210> 13 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 13 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

Claims

로돕신 전사체를 표적으로 하는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 있어서,
상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은, 5'-IGS (internal guide sequence)-Ribozyme*-3'의 구조를 가지며,
상기 IGS 영역은 로돕신 전사체의 +30, +35, +42, +43, +52, +54, +55, +75, +97, +116, +122, +123, +127, +132, +140, +154, +165, +171, +187, +191, +207, +215, +222, +230, +232, +244, +256, +262, +273, +298, +308, +381, +403, +661 또는 +688 부위 염기를 포함하는 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 5-10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것인, 트랜스-스플라이싱 라이보자임.
제1항에 있어서,
상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은, 상기 Ribozyme* 다음의 3' 방향으로 엑손(exon) 영역을 더 포함하는 것인, 트랜스-스플라이싱 라이보자임.
제1항에 있어서,
상기 로돕신 전사체는 로돕신 돌연변이를 포함하는 것인, 트랜스-스플라이싱 라이보자임.
제3항에 있어서,
상기 로돕신 돌연변이는 서열번호 1로 표시되는 로돕신 전사체의 1 번 내지 1142번 사이의 염기 중 적어도 하나의 염기에 발생한 돌연변이인, 트랜스-스플라이싱 라이보자임.
제4항에 있어서,
상기 로돕신 돌연변이는 하기로 이루어진 돌연변이 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 트랜스-스플라이싱 라이보자임:
L328P, T342M, Q344R/P/ter, V345L/M, A346P, P347A/R/Q/L/S/T, ter349/Q/E, N15S, T17M, V20G, P23A/H/L, Q28H, G51R/V, P53R, T58R/M, V87D/L, G89D, G106R/W, C110F/R/S/Y, E113K, L125R, W161R, A164E/V, C167R/W, P171Q/L/S, Y178N/D/C, E181K, G182S/V, C185R, C187G/Y, G188R/E, D190N/G/Y, H211R/P, C222R, P267R/L, S270R, K296N/E/M, R135G/L/P/W, T4K, T17M, M39R, N55K, G90V, M44T, V137M, G90D, T94I, A292E, A295V, F45L, V209M, F220C, P12R, R21C, Q28H, L40R, L46R, L47R, F52Y, F56Y, L57R, Y60ter, Q64ter, R69H, N78I, L79P, L88P, T92I, T97I, V104F, G109R, G114D/V, E122G, W126L/ter, S127F, L131P, Y136ter, C140S, T160T, M163T, A169P, P170H/R, S176F, P180A/S, Q184P, S186P/W, Y191C, T193M, M207R/K, V210F, I214N, P215L/T, M216R/L/K, R252P, T289P, S297R, A298D, K311E, N315ter, E341K, S343C 및 Q312ter.
제1항의 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달체.
제1항의　트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 유전자 컨스트럭트(construct).
제7항에 있어서,
상기 컨스트럭트는 상기 라이보자임의 3'-말단 방향에 목적유전자가 추가로 연결되는 것인, 컨스트럭트.
제8항에 있어서,
상기 목적유전자는 정상 로돕신 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 리포터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열인 컨스트럭트.
제7항에 있어서,
상기 컨스트럭트는 상기 라이보자임의 5'-말단 방향에, 안티센스를 코딩하는 뉴클레오타이드가 연결된 것인 유전자 컨스트럭트로,　
상기 안티센스는 표적 로돕신 전사체에 상보적 서열을 갖는 것인 유전자 컨스트럭트.
제7항에 있어서,
상기 유전자 컨스트럭트에　작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는, 컨스트럭트.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트가 포함된 재조합 발현 벡터.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비바이러스성 유전자 전달체.
제13항에 있어서,
상기 바이러스는　아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 바이러스.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스로,
상기 재조합바이러스는,
제1항의 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인, 재조합 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV)로,
상기 재조합 AAV는 AAV의 천연 유래 또는 인공 혈청형 또는 단리체(isolate)또는 계통군(clade)인 재조합 바이러스.
제1항의 라이보자임 또는 제6항의 비바이러스성 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항의 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제13항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제14항의 비바이러스성 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 망막색소변성증 예방 또는 치료용 약학 조성물.