CN108715856A - 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的马尔堡病毒病疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种编码马尔堡病毒包膜糖蛋白的核苷酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明还公开了能够表达该核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒及其制备方法以及在制备预防马尔堡病毒病疫苗中的应用。所述疫苗以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因是密码子优化后的马尔堡病毒Angola株包膜糖蛋白基因。包膜糖蛋白基因经密码子优化后，在转染细胞中可检测到包膜糖蛋白的显著表达。该重组疫苗免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，具有良好的免疫保护效果。该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于应对突发马尔堡病毒疫情和生物恐怖袭击。

Description

一种以人复制缺陷腺病毒为载体的马尔堡病毒病疫苗
技术领域
本发明涉及一种核苷酸序列，更具体地，涉及一种病毒包膜糖蛋白的核苷酸编码序列，属于突变或遗传工程技术领域。
背景技术
马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)属于丝状病毒科，是一种出血热病毒。马尔堡病毒可导致人类和非人灵长类动物产生病毒性出血热——马尔堡病毒病，病死率可高达90％。马尔堡病毒是一种极度危险的病毒，WHO将其列为危险等级第4类病原体(需要生物安全等级4级实验室进行相关操作)。美国NIH和国家过敏和传染病研究所将其列为A类病原体，美国CDC将其列为A类生物恐怖战剂。
马尔堡病毒首次发现于1967年，当时在德国的马尔堡、法兰克福和南斯拉夫首都贝尔格莱德暴发小规模流行，共导致31人感染，其中7人死亡。起因是从乌干达进口的非洲绿猴携带了马尔堡病毒，工作人员接触了被马尔堡病毒感染的猴组织而被感染。马尔堡病毒因德国马尔堡而得名。
马尔堡病毒主要流行于撒哈拉以南的非洲地区，其宿主可能是果蝠。在人群中主要是经体液通过性交、破损皮肤接触等方式传播，非洲地区的葬礼仪式是病毒传播的一大风险。马尔堡病毒最大的两次暴发分别为：1998年至2000年在刚果，共154人感染，128人死亡，病死率为83％；以及2004年至2005年在安哥拉，共252人感染，227人死亡，病死率为90％。
马尔堡病毒株可分为Ravn病毒和马尔堡病毒两个分支。其中后者又可分为A毒株和B毒株两种，A毒株分离自乌干达(1967年5株)、肯尼亚(1980)和安哥拉(2004-2005年)；B毒株分离自刚果共和国(1999-2000年)和乌干达(2007-2009年)。两个分支毒株的基因同源性约为80％，而A、B两毒株的基因同源性大于90％。
马尔堡病毒包膜糖蛋白(Marburg virus glycoprotein,MARV-GP)是马尔堡病毒包膜唯一的表面蛋白。MARV-GP在马尔堡病毒的致病过程中起重要作用，同时，它也是诱导机体产生保护性免疫反应的主要靶蛋白。目前正在研制的马尔堡病毒疫苗基本上都是以MARV-GP作为目标抗原，这些疫苗包括DNA疫苗、亚单位疫苗、非复制型和可复制型的病毒载体疫苗。有多种疫苗在动物模型上获得良好的免疫保护效果，一些疫苗已经进入到了临床试验阶段，包括DNA疫苗，改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus Ankara,MVA)载体埃博拉-马尔堡联合疫苗和黑猩猩3型腺病毒(cAd3)载体马尔堡疫苗。然而，截止到2018年4月，目前世界上还没有批准的马尔堡病毒疫苗。
AdMax系统由含有LoxP位点的穿梭质粒、骨架质粒和HEK293细胞株组成，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在HEK293细胞中进行基因重组产生重组腺病毒。经AdMax系统包装所获得的重组腺病毒是E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒，以此作为疫苗，具有安全性高的优点。此外，AdMax系统还具有包装高效稳定、方便快捷，出毒快、产率高等优点。此前本申请发明人使用AdMax系统成功制备了以Zaire型埃博拉病毒Makona株包膜糖蛋白为目标抗原的重组埃博拉病毒病疫苗，实现了5个月内完成从基因合成到疫苗进入临床研究的快速研制实例，突显了该疫苗包装系统的优势。
目标蛋白的表达水平是活病毒载体疫苗产生免疫效应的重要因素。高水平表达目标蛋白，可以在降低免疫剂量的情况下获得良好的免疫效果，降低活病毒载体对接种者的不良反应。因此，通过对MARV-GP的基因进行密码子优化，更改信号肽，使其能够更高效的表达并且分泌到细胞外，从而增强了疫苗的免疫效果。
2014年西非暴发了有史以来最大规模的埃博拉疫情，造成28000多人感染，11000多人死亡。马尔堡病毒与埃博拉病毒同为丝状病毒科，都是危险系数最高的病毒，同样有可能暴发大规模流行，也可能被作为生物武器用于生物战或生物恐怖。因此，研发一种安全有效的马尔堡病毒疫苗至关重要。基于马尔堡病毒的现实威胁，以及AdMax系统在重组埃博拉病毒病疫苗制备上的成功经验，本申请人欲通过对MARV-GP进行密码子优化，使其在真核细胞中实现高水平表达，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平体液和细胞免疫反应的重组腺病毒载体马尔堡病毒病疫苗。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种用于马尔堡病毒病疫苗的MARV-GP基因密码子优化的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述核苷酸序列以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体马尔堡病毒病疫苗。
本发明还提供了含有上述核苷酸序列的载体。
在一个优选的实施方案中，所述载体为pDC316。
本发明还提供了一种能够表达上述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。
在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒载体来源于AdMax腺病毒系统。
本发明还提供了上述重组腺病毒载体在制备预防马尔堡病毒病疫苗中的应用。
在一个优选的实施方案中，上述应用中，所述重组腺病毒被制备为注射剂。
最后，本发明提供了一种制备上述的可表达MARV-GP的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有MARV-GP核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)从步骤(3)所述宿主细胞中提取可表达MARV-GP的人复制缺陷重组腺病毒。
优选的，步骤(1)所述载体为pDC316。
优选的，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGloxΔE1,3Cre，两种质粒均属于AdMax腺病毒系统，共同用于在宿主细胞中进行含有编码MARV-GP的核苷酸序列的重组腺病毒包装。
优选的，步骤(3)所述细胞为HEK293细胞。
优选的，在步骤(4)中采用Source 30Q和Sepharose 4FF两步法柱层析对马尔堡病毒病疫苗进行纯化。
本发明提供的可表达MARV-GP的重组腺病毒作为马尔堡病毒病疫苗免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。小鼠免疫该疫苗4周后以马尔堡病毒鼠适应株攻毒，所有疫苗免疫的小鼠均成活，所有对照小鼠均在攻毒后6至8天内死亡，说明本疫苗对马尔堡病毒具有良好的免疫保护效果。该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于应对突发马尔堡疫情和生物恐怖袭击。而且疫苗目标蛋白的基因经密码子优化后才能在转染的细胞中检测到MARV-GP的表达，以其为基础而包装的重组腺病毒载体马尔堡病毒病疫苗所诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应均有显著水平的提高。免疫水平的提高对预防马尔堡病毒的感染具有重要的意义。
附图说明
图1穿梭质粒图谱；
图2MARV-GP体外表达鉴定；
图3第一代毒种PCR鉴定；
图4马尔堡病毒病疫苗一代毒种MARV-GP表达鉴定；
图5Source 30Q层析过程；
图6马尔堡病毒病疫苗纯化样本PCR鉴定；
图7马尔堡病毒病疫苗候选株纯化样品MARV-GP表达鉴定；
图8血清抗体IgG水平随时间变化情况；
图9血清抗体IgG水平维持情况；
图10细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果统计分析图；
图11Ad5-MAGPopt不同免疫剂量诱导产生的CD4+T细胞免疫反应；
图12Ad5-MAGPopt不同免疫剂量诱导产生的CD8+T细胞免疫反应；
图13Ad5-MAGPopt不同免疫剂量诱导产生的CD154+CD4+T细胞反应；
图14ELISPOT检测IFNγ分泌水平统计分析结果和代表性结果；
图15Ad5-MAGPopt不同免疫剂量诱导产生的IFNγ分泌情况；
图16马尔堡病毒病疫苗在小鼠模型上的保护效果；
图17小鼠攻毒后的体重变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1以人复制缺陷腺病毒为载体的马尔堡病毒病疫苗的制备
1.MARV-GP基因密码子优化及合成
对2004年至2005年非洲安哥拉暴发流行的马尔堡病毒株ang0998(Genebank编号：DQ447660.1)包膜糖蛋白的基因使用Upgene软件(Gao,W.Rzewski,A.Sun,H.Robbins,P.D.&Gambotto,A.UpGene:Application of a web-based DNA codon optimizationalgorithm.Biotechnol Prog,2004.20(2):p.443-8.)进行密码子优化，将核苷酸序列中稀有密码子更改为最佳密码子，同时增强转录后mRNA的稳定性，使其更适合在真核细胞中表达。密码子优化后，MARV-GP核苷酸整体变化26.1％。同时，将MARV-GP原始信号肽(1aa-18aa)改为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA，并在翻译起始密码子前面加入Kozak序列，上下游分别使用HindIII和SalI两个酶切位点。将密码子优化后并更改了信号肽的MARV-GP基因序列进行基因合成。与此同时，作为对照，将包膜糖蛋白基因的原始序列进行合成。MARV-GP密码子优化基因序列(酶切位点为HindIII和SalI)见SEQ ID NO:1，MARV-GP原始基因序列(酶切位点为HindIII和SalI)见SEQ ID NO:2。
2.载体构建和MARV-GP的体外表达鉴定
2.1载体构建
以上合成的基因序列，分别用HindIII和SalI进行双酶切，回收目的基因片断，将其连接至AdMax腺病毒系统(加拿大Microbix Biosystems Inc.)的穿梭质粒pDC316上，转化DH5-α感受态，涂布Ampr LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。MARV-GP基因序列未进行密码子优化的质粒记为pDC316-MAGP，MARV-GP基因密码子优化后的质粒记为pDC316-MAGPopt，质粒图谱如图1所示，其中A为pDC316-MAGPopt质粒图谱，B为pDC316-MAGP质粒图谱。
2.2MARV-GP的体外表达鉴定
将以上构建的2个穿梭质粒和pDC316载体，使用转染试剂TurboFectTransfection Reagent(Thermo Scientific,#R0531)转染至HEK293细胞，48小时后收细胞进行Western blot检测。实验方法如下：
转染：实验前一天，HEK293细胞以8×105细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。转染前1小时，将培养基换成新鲜的含2％FBS的MEM培养基，每孔2mL。转染时，每个转染孔取对应质粒2μg，加入到200μL无FBS的MEM培养基中，混匀，加入转染试剂3μL，轻轻混匀，室温放置15min。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，5小时后将培养基换成新鲜的含10％FBS的MEM培养基，48小时后收集细胞，制备样品，进行Western blot检测。
样品制备：转染48小时后，小心地吸弃培养基，用PBS洗涤细胞一次。将6孔板置于冰上，每孔各加入120μL细胞裂解液(含50mmol/L DTT、1×蛋白酶抑制剂和250U/mL核酸酶的1×SDS-PAGE buffer)。用细胞刮刀将裂解的细胞收集起来，转移至1.5mL EP管中，冰浴15min，95℃加热5min，冰浴冷却，4℃12000rpm离心5min，取上清分装，冻存，用于Westernblot检测。
Western blot检测：使用10孔的12％SDS-PAGE胶进行SDS-PAGE，上样量每孔10μL。电泳条件：80V，15min；180V，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为此。将SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为300mA，1小时。电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:2000的稀释度加入抗MARV-GP兔多克隆抗体(Abcam,ab190459)，4℃放置过夜。将膜用Western blot洗涤液洗涤4次，每次于摇床上摇动7min。然后加入以1:5000稀释于5％脱脂奶粉的HRP标记的羊抗兔IgG抗体(CST,7074S)，室温孵育1小时。用Western blot洗涤液将膜洗涤4次，使用ImmobilonTM Western ChemiluminescentHRP Subsrate(MILLIPORE,Cat.No.WBKLS0500)进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。
以GAPDH作为样品检测内参，结果如图2所示，其中1：转染pDC316空载体细胞；2：转染密码子优化穿梭质粒pDC316-MAGPopt细胞；3：转染密码子未优化穿梭质粒pDC316-MAGP细胞。结果显示仅密码子优化后的穿梭质粒pDC316-MAGPopt转染的HEK293细胞可检测到MARV-GP的表达。
3.疫苗的包装、制备和鉴定
3.1疫苗的包装
将以上构建好的载体pDC316-MAGP和pDC316-MAGPopt分别与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：
a)转染前一天，将HEK293细胞接种于六孔板中，每孔5×105个细胞，培养基为MEM+10％FBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
b)转染当天换液，用新鲜的含10％FBS的MEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取骨架质粒(pBHGloxΔE1,3Cre)和穿梭质粒，用LipofectamineTM 2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：
(1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀。
(2)质粒用300μL无血清的MEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(3)取10μL脂质体用300μL无血清MEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(4)将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。
c)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5％FBS的MEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。
d)将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。
所包装的马尔堡重组腺病毒一代毒种，分别记为Ad5-MAGP和Ad5-MAGPopt。
3.2第一代毒种的鉴定
3.2.1PCR扩增MARV-GP全序列及测序鉴定
使用pDC316载体的通用引物，扩增MARV-GP的全序列，引物序列如下：
pDC316-F:ACGTGGGTATAAGAGGCG
pDC316-R:CGATGCTAGACGATCCAG
根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生物，DP315)说明书，提取马尔堡重组腺病毒一代毒种基因组，使用以上引物，进行PCR鉴定。
PCR扩增条件为：
PCR扩增结果如图3所示，其中1：Marker(Takara，DL2000)；2：Ad5-MAGP一代毒种DNA/RNA扩增产物；3：Ad5-MAGPopt一代毒种DNA/RNA扩增产物；4：质粒pDC316-MAGPopt扩增产物(阳性对照)。结果显示扩增条带大小正确。将目标条带2和3进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。
3.2.2马尔堡病毒病疫苗候选株MARV-GP表达鉴定
将马尔堡重组腺病毒一代毒种感染HEK293细胞，48小时后收集细胞进行MARV-GP的Western blot检测，MARV-GP密码子优化的候选疫苗Ad5-MAGPopt感染的细胞MARV-GP目标条带显著，结果如图4所示，其中1：空白细胞；2：Ad5-MAGP感染细胞；3：Ad5-MAGPopt感染细胞。
3.3疫苗的扩大培养和纯化
3.3.1重组腺病毒小规模培养
HEK293细胞在37℃、5％CO2条件下130rpm悬浮培养。毒种接种时，将活度大于95％的细胞稀释至1.0×106cells/mL，终体积为1L。重组腺病毒以MOI 10感染HEK293细胞，37℃，5％CO2，130rpm摇动培养。每隔24小时取样，检测细胞活度和密度。
毒种接种72小时后，当细胞活度下降到40％以下时，每个细胞摇瓶各加入10mLtween-20(终浓度1％)，130rpm，继续摇动1小时。细胞培养液于6000rpm离心30min，取上清，-70℃冻存。沉淀用等体积20mM Tris，250mM NaCl，1mM MgCl2，pH 7.5重悬，加入1％的tween-20，130rpm，37℃摇1小时。悬液于6000rpm离心45min，取上清，于-70℃冻存。
3.3.2重组腺病毒的纯化
以上-70℃冻存的重组腺病毒培养液融化后合并进行纯化。用300kDa膜包超滤浓缩至500mL，加入等体积20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgCl2pH7.5(A液)，超滤换液3次后，浓缩至最小体积(约200mL)，排空膜包及管路后，用少量A液冲洗管路(约150mL)，所得液体合并至超滤浓缩液，混匀。加入Benzonase(30U/mL)，37℃水浴，酶解4h。
采用Source 30Q和Sepharose 4FF两步分离纯化腺病毒颗粒；第一步柱层析主要去除大部分杂蛋白质，收集洗脱峰，而第二步柱层析去除杂DNA分子和部分杂蛋白，收集的是流穿样品。具体过程如下：
Source 30Q层析：层析柱用A液平衡，上样，上样流速为5mL/min；上样结束，用A液平衡至Uv基线，10mL/min,50min,0％B-30％B梯度洗脱，分管收集洗脱峰，最后100％B洗脱，B液为20mM Tris+2M NaCl+2mM MgCl2pH7.5。洗脱峰如图5所示。
Sepharose 4FF层析：上述洗脱峰使用Sepharose 4FF进一步纯化。流动相为A液，流速5mL/min，限压0.3MPa，收集外水体积峰。纯化后的疫苗经鉴定后用0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装保存于-70℃冰箱中。
3.4马尔堡病毒病疫苗纯化样品的鉴定和滴度测定
3.4.1PCR扩增MARV-GP全序列和测序鉴定
实验方法和过程同3.2.1，结果如图6所示，其中1：Marker(Takara，DL2000)；2：Ad5-MAGP纯化样品DNA/RNA扩增产物；3：Ad5-MAGPopt纯化样品DNA/RNA扩增产物；4：阴性对照。结果显示疫苗纯化样品均检测到目标条带。将目标条带胶回收并测序，比对结果表明，疫苗纯品所包含的序列完全正确。
3.4.2Western blot检测。
将马尔堡病毒病疫苗候选株纯化样品以MOI＝10感染HEK293细胞，48小时后收集细胞进行MARV-GP的Western blot检测，结果如图7所示，其中1：Ad5-MAGPopt感染细胞；2：Ad5-MAGP感染细胞。可以看到候选疫苗Ad5-MAGPopt感染的细胞出现了明显的目标条带。
3.4.3滴度测定
使用Clontech Adeno-XTM Rapid Titer Kit进行重组腺病毒滴度的测定。操作按试剂盒所附说明书进行，具体方法如下：
a)将HEK293细胞接种于24孔板。细胞密度为5×105cells/mL，每孔接种0.5mL，培养基为MEM+10％FBS。
b)使用培养基把将要检测的病毒从10-2至10-6进行10倍稀释，制备一系列稀释度的病毒样品，每孔50μL加入到细胞中。
c)细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。
d)吸弃细胞的培养基，让细胞稍微晾干(不要过干)。每孔轻轻加入0.5mL冰甲醇，于-20℃放置10min，对细胞进行固定。
e)吸弃甲醇，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL抗-Hexon抗体稀释液(1:1000稀释)，37℃孵育1小时。
f)吸弃抗-Hexon抗体，用PBS+1％BSA将细胞轻轻洗3次，每孔加入0.25mL HRP标记的Rat anti-mouse antibody(1:500稀释)，37℃孵育1小时。
g)在吸弃0.25mL HRP标记的Rat anti-mouse antibody之前，将10×DAB底物用1×Stable Peroxidase Buffer稀释成1×DAB工作液，让其达到室温。
h)吸弃Rat anti-mouse antibody稀释液，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL DAB工作液，室温放置10min。
i)吸弃DAB工作液，用PBS将细胞轻轻地洗2次。
j)于显微镜下对棕色/黑色的阳性细胞进行计数。每孔至少随机计数3个视野，计算其平均阳性细胞数。
k)计算感染滴度(ifu/mL)。公式如下：
滴度测定结果显示，Sepharose 4FF层析洗脱的峰尖，感染滴度达1.0×1010ifu/mL以上。
实施例2马尔堡病毒病疫苗在小鼠模型上的免疫学评价
1.实验材料
1.1实验动物
SPF级雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠于军事科学院军事医学研究院丰台院动物房饲养。
1.2实验材料
荧光标记抗体FITC anti-mouse CD8a(Clone 5H10-1)，PE anti-mouse IFNγ(Clone XMG1.2)，PerCP/Cy5.5anti-mouse CD3(Clone 17A2)，Alexa700anti-mouseCD4(Clone RM4-5)，APC/Cy7anti-mouse CD14(Clone Sa14-2)，APC/Cy7anti-mouse CD19(Clone6D5)，Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD107a(Clone 1D4B)，BrilliantViolet 510TM anti-mouse CD154(Clone MR1)，Brilliant Violet 605TM anti-mouse IL-2(Clone JES6-5H4)和红细胞裂解液购自Biolegend公司；荧光标记抗体PE/Cy7anti-mouseTNF(Clone MP6-XT22)，Mouse BD Fc BlockTM，BD Perm/WashTM Buffer，BD Cytofix/CytopermTM Fixation and Permeabillization Solution，BD GolgiStopTM，BDGolgiPlugTM，BDTM ELISPOT mouse IFNγ Set，BDTM ELISPOT AEC substrate set和流式管购自BD公司；LIVE/DEADTM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit购自Invitrogen公司，BSA购自Merck公司，HRP标记羊抗小鼠IgG抗体购自Abcam公司，TMB单组分显色液购自Solarbio，24孔板和ELISA板购自Corning公司，马尔堡GP重叠肽库和CTL表位LI-9由上海吉尔生化公司合成，DMSO，PMA和ionomycin购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)，RPMI1640培养基购自Gibco公司，截短型马尔堡病毒GP由本室表达纯化，2N硫酸，70％酒精和PBS自配。
2.小鼠免疫
根据实验设计，将马尔堡候选疫苗和对照疫苗用生理盐水稀释到特定的浓度，使用1mL注射器，经左后腿内侧肌肉注射免疫，每只50μL。每只小鼠的免疫剂量为1×108ifu，1×107ifu，1×106ifu或1×105ifu。小鼠免疫分组情况如表1，表2和表3所示。
表1.疫苗体液免疫反应检测小鼠分组情况
表2.疫苗细胞免疫反应检测小鼠分组情况
表3.疫苗不同免疫剂量细胞免疫反应检测小鼠分组情况
3.疫苗体液免疫反应的检测
3.1采血及血清分离
小鼠免疫后，在特定的时间点上经尾静脉采血。血液于室温静置1小时以上。待血清形成，5000rpm离心10min，将血清转移至新的离心管，-20℃冻存，待用。
3.2血清抗体水平ELISA检测
实验前一天，ELISA板用截短型马尔堡病毒GP蛋白(240aa至526aa，采用E.coli表达制备)以2μg/mL的浓度进行包被，100μL/孔，4℃放置过夜。实验当天，ELISA板于洗板机内用洗液(PBS+0.2％tween-20)清洗3次。每孔加入120μL封闭液(洗液+2％BSA)，于室温封闭1小时。洗板机清洗3次后，每孔加入100μL样品稀释液(洗液+0.2％BSA)。血清样品以特定的初始稀释度进行3倍稀释(初始稀释度通过预实验来确定)，每个样品设8个稀释度。同时每板设定4个不加血清的空白对照孔。血清稀释完成后，于室温孵育1小时。洗板5次后，每孔100μL加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:20000稀释)，室温孵育1小时。洗板5次后进行显色反应。显色过程为每孔加入100μL TMB单组分显色液，显色6min后用2mol/L硫酸终止反应。最后在酶标仪上检测450nm处的吸光值。以空白孔OD450值的2.1倍作为cut-off值，用GraphPad Prism软件计算每个样品的抗体滴度。抗体滴度定义为空白孔OD450值2.1倍对应的样品稀释度的倒数。
检测结果如图8和图9所示。马尔堡病毒GP密码子优化可显著提高其疫苗诱导产生的血清抗体水平。马尔堡病毒病疫苗Ad5-MAGPopt免疫BALB/c小鼠2周即可产生高水平的特异性抗体，抗体在小鼠体内的维持时间超过63周。同时，Ad5-MAGPopt在BALB/c小鼠体内的血清IgG抗体水平呈现出一定的剂量依赖关系。
4.细胞免疫水平的检测。
4.1脾淋巴细胞的分离
颈椎脱臼处死小鼠，于70％酒精浸泡约3min。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的200目细胞筛上。加入10mL RPMI1640完全培养基，用注射器活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用10mL RPMI1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至50mL离心管中，500g水平离心5min。弃上清，细胞用3m|1×红细胞裂解液重悬，室温裂解5min，加入27mL RPMI1640完全培养基，500g水平离心5min。弃上清，细胞再用20mL RPMI1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经200目细胞筛过滤至10mL试管中，取50μL稀释20倍后进行计数，待用。
4.2流式细胞术检测特异性细胞表面标示物和细胞内细胞因子
4.2.1小鼠脾细胞的体外刺激
将以上分离的小鼠脾细胞取适量稀释至4×106cells/mL，每孔0.5mL加入到24孔板中。每只小鼠分别设置特异CTL表位刺激孔和无刺激孔。特异CTL表位刺激为MARV-GP重叠肽库和MARV-GP CTL表位LI-9，浓度为每条肽2μg/mL，无刺激加入等量的DMSO。作为阳性对照，加入PMA和ionomycin刺激孔，其中PMA浓度为100ng/mL，ionomycin浓度为1μg/mL。同时每孔加入1μL Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD107a。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养1小时后，每孔各加入适量的GolgiStop和(或)GolgiPlug作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养6小时后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。
4.2.2细胞表面抗原和细胞内细胞因子染色
脾细胞经体外刺激6小时后，转移至流式管中，600g室温离心5min，弃上清。根据表4配制染色液1，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置15min。每管加入3mL PBS+2％FBS，600g室温离心5min，弃上清。根据表4配制染色液2，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置20min。每管加入3mL PBS+2％FBS，600g室温离心5min，弃上清。每管加入200μL Cytofix/CytopermTMFixation and Permeabilizaiton Solution，室温避光放置20min，对细胞进行固定和穿孔。每管加入1mL 1×Perm/WashTM buffer，800g室温离心5min，弃上清。根据表4配制染色液3，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置30min。每管加入2mL1×Perm/WashTM buffer，800g室温离心5min，弃上清。每管加入3mL PBS，800g室温离心5min，弃上清。每管用150μL PBS重悬，4℃避光待测。
表4流式染色液配制表(单位μL)
4.2.3上机检测
使用BD FACS CantoTM进行流式细胞术检测。首先各通道调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后依次上样，收集数据。通过FSC-A和FSC-H圈单细胞，通过FSC和SSC圈淋巴细胞，通过PerCP/Cy5.5通道和APC/Cy7通过圈活的CD3细胞，通过FITC通道和Alexa700通道圈CD8+T细胞和CD4+T细胞，最后通过PE通道、PE/Cy7通道、Brilliant Violet 605通道、Brilliant Violet 421和Brilliant Violet 510通道分别统计CD8+T细胞和CD4+T细胞中IFNγ、TNF、IL-2、CD107a和CD154阳性细胞的百分比。
4.2.4细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果
细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果显示，Ad5-MAGPopt免疫小鼠的脾细胞经MARV-GP重叠肽库和MARV-GP CTL表位LI-9刺激后，CD8+T细胞和CD4+T细胞可大量分泌IFNγ、TNF和IL-2细胞因子，同时细胞毒性标示物CD107a的表达水平显著增高，明显高于MARV-GP未优化疫苗Ad5-MAGP免疫组和对照腺病毒Ad5-Luc组(图10，NS,P>0.05；***,P<0.001)。与此同时，Ad5-MAGPopt免疫小鼠的脾细胞可检测到CD4+T细胞上CD154分子的表达水平显著升高(图13)，说明Ad5-MAGPopt诱导的特异性T细胞可活化B细胞。不同剂量Ad5-MAGPopt免疫小鼠的细胞免疫反应水平检测结果显示，BALB/c小鼠分别免疫Ad5-MAGPopt 1×108ifu、1×107ifu、1×106ifu或1×105ifu，其诱导产生的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应(IFNγ、TNF、IL-2和CD107a)经方差分析显示在不同剂量组间无显著性差异(图11和图12)。
4.3细胞因子的ELISPOT检测
使用BDTM ELISPOT mouse IFNγSet进行IFNγ的ELISPOT检测。按试剂盒说明书所述方法进行操作，其方法如下：ELISPOT板用5μg/mL抗小鼠IFNγ抗体包被，4℃放置过夜。实验前用RPMI1640+10％FBS培养基于室温封闭2小时。实验时弃封闭液，根据板布局，每孔预先加入50μL含有MARV-GP重叠肽库和MARV-GP CTL表位LI-9的RPMI1640+10％FBS培养基(肽浓度为每条2μg/mL)或含有相同DMSO的无刺激对照培养基。每孔加入50μL分离的小鼠脾细胞(4×106cells/mL)，每只小鼠肽刺激和无刺激各设2孔。细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养12-24小时。次日，弃板内细胞，每孔200μL用蒸馏水洗两次，然后用洗液(PBS+0.05％tween-20)洗3次，每次静置2-3min。弃板内洗液，每孔100μL加入以1:250稀释于PBS+10％FBS的Biotinylated anti-mouse IFNγ，室温放置2个小时。用洗液洗3次，每次静置2-3min，每孔加入100μL以1:100稀释于PBS+10％FBS的streptavidin-horseradish peroxidase，室温放置1小时。用洗液洗4次，然后用PBS洗3次。使用BDTM ELISPOT AEC substrate set进行生色反应。待孔内斑点长至合适大小时(一般于室温反应15-25min)弃去显色底物，用大量的蒸馏水冲洗以终止反应。将板晾干，使用酶联斑点成像分析系统进行斑点计数。
与细胞内细胞因子检测结果类似，Ad5-MAGPopt免疫小鼠的脾细胞经马尔堡GP重叠肽库和马尔堡GP CTL表位LI-9刺激后可检测到大量的特异性IFNγ斑点，显著高于GP未优化疫苗Ad5-MAGP免疫组和对照腺病毒Ad5-Luc组(图14，NS,P>0.05；**,P<0.01,***,P<0.001)。同时，不同剂量(1×108ifu、1×107ifu、1×106ifu和1×105ifu)Ad5-MAGPopt免疫BALB/c小鼠诱导产生的特异性IFNγ斑点经方差分析无剂量依赖关系(图15)。
5.免疫学评价小结
肌肉注射MARV-GP密码子优化的马尔堡病毒病疫苗Ad5-MAGPopt可诱导其免疫的BALB/c小鼠产生强烈的体液和细胞免疫反应。
实施例3马尔堡病毒病疫苗在小鼠模型上的保护效果评价。
本实验委托加拿大公共卫生署国家微生物学实验室实施，在生物安全4级实验室进行马尔堡病毒鼠适应株(MA-MARV)的实毒攻毒。
1.实验疫苗、实验动物和攻毒毒株
实验疫苗：Ad5-MAGPopt(Ad5-MARV)；
实验动物：SPF级BALB/c小鼠(4-6周龄)；
攻毒毒株：马尔堡病毒鼠适应株。
2.马尔堡病毒病疫苗保护效果评价实验过程
实验分为4组(表5)，分别肌肉注射Ad5-MARV 108ifu、107ifu或106ifu，或肌肉注射等量体积的PBS。免疫后4周将小鼠转移至生物安全4级实验室，进行MA-MARV攻毒，攻毒方式为腹腔注射，攻毒剂量为2000×LD50。攻毒后14天内记录小鼠存活情况和体重变化情况，并额外记录14天的存活情况。
表5.马尔堡疫苗保护效果研究分组情况
3.马尔堡病毒病疫苗保护效果评价实验结果
不同剂量马尔堡病毒病疫苗免疫小鼠或对照小鼠在免疫后28天进行MA-MARV攻毒，所有疫苗免疫的小鼠(108ifu/只、107ifu/只以及106ifu/只)全部存活，PBS对照组10只小鼠均于攻毒后6至8天内死亡(图16)。所有疫苗免疫小鼠在攻毒后14天内未出现体重下降的情况，PBS对照组小鼠于攻毒后第3天体重开始下降，直至死亡(图17)。
4.马尔堡病毒病疫苗保护效果评价实验小结
马尔堡病毒病疫苗分别以108ifu/只、107ifu/只或106ifu/只免疫BALB/c小鼠，28天后进行2000×LD50的MA-MARV攻毒，所有小鼠均成活下来，未出现体重下降的情况。相比之下，PBS对照组10只小鼠均于攻毒后第3天体重开始下降，并于攻毒后6至8天内全部死亡。结果表明，马尔堡病毒病疫苗具有良好的免疫保护效果。
序 列 表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的马尔堡病毒病疫苗
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2088
<212> DNA
<213> Marburg virus
<400> 1
ccaagcttgc cgccaccatg gacgccatga agcggggcct ctgctgtgtt ctgctgctct 60
gcggcgccgt gttcgtgagt aactcgttac ccattctgga gattgccagc aacatccagc 120
cccagaacgt ggattccgtg tgctccggca ccctgcagaa gaccgaagat gtccatctca 180
tgggcttcac cctgtccggg cagaaggtcg ccgactcgcc cctggaggcc agcaagcgct 240
gggccttccg cgcaggcgtc cctcctaaga acgtggaata cacggaggga gaggaggcca 300
agacttgtta caacatctca gtaaccgacc cctccggtaa aagtctcctg ctcgaccctc 360
cgacgaacat ccgcgactac cccaagtgca agacaatcca ccacattcag ggccagaatc 420
cgcacgccca gggtatcgcc ctgcacctgt ggggcgcttt tttcctgtac gaccgaatcg 480
cctccaccac catgtaccgg gggaaggttt ttaccgaggg caatatcgcc gccatgattg 540
tgaataagac cgtccacaag atgatcttct ccaggcaggg gcagggatac cggcacatga 600
acctgacctc cactaacaag tactggacta gttccaacgg tacccagacc aacgacactg 660
gctgctttgg gaccctccag gagtacaact ccaccaaaaa ccagacttgt gccccgtcca 720
aaaagcccct gcccctgcct accgcccacc cggaagtgaa gctgacatct acatcgaccg 780
acgcaacaaa actcaatact accgacccca atagtgacga cgaggacctg accaccagtg 840
gcagcggctc cggcgagcag gagccataca ccacctcgga cgcagcaacc aagcagggcc 900
tgtcgtccac gatgccgcct accccgtcgc cccagccctc gaccccgcag cagggcggca 960
ataataccaa ccattctcag ggggtcgtta ccgagcccgg caagaccaac acgactgctc 1020
agccatccat gccaccccac aacaccacca ctatctcgac caacaacact tcaaagcaca 1080
acctctcgac ccccagtgtc ccaatccaga acgccaccaa ctataacacg cagtccacag 1140
cgcccgagaa cgagcagaca agtgccccct ctaagacgac cctcctcccc accgagaacc 1200
ccacaaccgc caagtccacc aactcaacca agtcccccac gacgaccgtt cccaacacca 1260
ccaacaagta ctcaacctct ccttcgccta ccccaaactc caccgcgcag caccttgtgt 1320
acttccgccg gaagcgaaac atcctgtggc gcgagggaga catgttccct ttcctcgatg 1380
gactgatcaa cgcccccatc gactttgatc cagtccccaa caccaagacg atcttcgatg 1440
aaagtagtag ttcgggggct agtgcagaag aggaccagca tgcgagtcct aacatctccc 1500
tgaccctctc ctacttcccc aaggtgaacg agaataccgc ccactccggc gagaatgaga 1560
acgattgcga tgccgaactg aggatctgga gtgtgcagga ggacgacctg gcggctggcc 1620
tgtcttggat ccccttcttt gggccgggca tcgagggcct gtacaccgcc ggcctgatta 1680
aaaaccagaa caacctggtt tgccgcctga gaagactggc aaaccagact gccaagtccc 1740
tggaactgct cttacgcgtc accaccgagg agcggacctt ttcgctcatc aaccgccacg 1800
ccatcgactt cctgctggcc cggtggggcg gtacgtgcaa agtgctgggc cccgactgct 1860
gcatcggcat cgaggatctc agccgcaaca tctctgagca aatcgatcag atcaagaagg 1920
atgagcagaa ggaaggtacc ggctggggcc tgggggggaa gtggtggacc agtgactggg 1980
gcgtgctgac taacctgggc atcctgctgc tgctatcgat cgccgtgctc atcgccctgt 2040
cttgcatctg ccgtatcttc accaaatata tcggctaagt cgacgtct 2088
<210> 2
<211> 2073
<212> DNA
<213> Marburg virus
<400> 2
ccaagcttgc cgccaccatg aaaaccacat gtctccttat cagtcttatc ttaatccaag 60
gggtaaaaac tctccctatt ttagagatag ccagtaacat tcaaccccaa aatgtggatt 120
cagtatgctc cgggactctc cagaagacag aagacgttca tctgatggga ttcacactga 180
gcgggcaaaa agttgctgat tcccctttag aggcatccaa acgatgggcc ttcagggcag 240
gtgtacctcc caagaatgtt gagtatacag aaggggagga agctaaaaca tgttacaata 300
taagtgtaac ggatccctct ggaaaatcct tgctgttaga tcctcctacc aacatccgtg 360
actatcctaa atgcaaaact atccatcata ttcaaggtca aaaccctcat gcacagggga 420
tcgctctcca tttgtgggga gcatttttct tgtatgatcg catcgcctcc acaacgatgt 480
atcgaggcaa agtcttcact gaagggaaca tagcagctat gattgtcaat aagacagtgc 540
acaaaatgat tttctcgagg caaggacaag ggtaccgtca catgaaccta acttctacta 600
ataaatattg gacaagtagc aacggaacgc aaacgaatga cactggatgc ttcggtactc 660
ttcaagaata taattctaca aagaaccaaa catgtgctcc gtccaaaaaa cctttaccac 720
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gtgcttcagc tgaggaagat cagcatgcct cccctaatat cagtttaact ttatcttact 1500
ttcctaaggt aaatgaaaac actgcccact ctggagaaaa tgaaaatgat tgtgatgcag 1560
agttaagaat ttggagtgtt caggaggacg acctggcagc aggactcagt tggataccgt 1620
tttttggccc tggaatcgaa ggactttata ctgctggttt aattaaaaat caaaataatt 1680
tggtttgcag gttgaggcgt ctagccaatc agactgccaa atccttggaa ctcttattaa 1740
gagtcacaac cgaggaaaga acattttcct taatcaatag acatgccatt gattttttac 1800
tcgcaaggtg gggaggaaca tgcaaagtgc ttggacctga ttgttgcatc ggaatagaag 1860
acttgtccag aaatatttca gaacaaattg atcaaatcaa aaaggacgaa caaaaagagg 1920
ggactggttg gggtctgggt ggtaaatggt ggacatcaga ctggggtgtt cttactaact 1980
tgggcatctt gctactactg tccatagctg tcttaattgc tctgtcctgt atttgtcgta 2040
tttttactaa atatattgga taagtcgacg tct 2073

Claims (12)

1.一种编码马尔堡病毒包膜糖蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种含有权利要求1所述核苷酸序列的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pDC316。
4.一种能够表达权利要求1所述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒载体来源于AdMax腺病毒系统。
6.权利要求4和5所述重组腺病毒载体在制备预防马尔堡病毒病疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备为注射剂。
8.一种制备权利要求5所述的人复制缺陷重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有马尔堡病毒包膜糖蛋白核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)收获从步骤(3)所述细胞中释放的人复制缺陷重组腺病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述载体为pDC316。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGloxΔE1,3Cre。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞为HEK293细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中采用Source 30Q和Sepharose 4FF两步法层析对重组腺病毒进行提取并纯化。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057716A (zh) * 2019-07-27 2020-04-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用
CN111057685A (zh) * 2019-07-27 2020-04-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种复制型4型腺病毒载体重组马尔堡病毒病疫苗
CN112618707A (zh) * 2020-10-15 2021-04-09 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304176A (zh) * 2020-03-07 2020-06-19 北京工业大学 基于q-6xl和4ff的腺病毒载体规模化纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016138312A2 (en) * 2015-02-25 2016-09-01 Vanderbilt University Antibody-mediated neutralization of marburg virus
CN107022007A (zh) * 2017-04-05 2017-08-08 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 基于马尔堡病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105483140B (zh) * 2016-01-31 2019-11-12 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗
CN106868025B (zh) * 2017-03-13 2020-01-21 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016138312A2 (en) * 2015-02-25 2016-09-01 Vanderbilt University Antibody-mediated neutralization of marburg virus
CN107022007A (zh) * 2017-04-05 2017-08-08 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 基于马尔堡病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI,Y.等: "Marburg marbugvirus isolate IRF0169, partial genome", 《DATABASE GENBANK [ONLINE]，登录号：KY425629》 *
MASAHIRO KAJIHARA等: "Novel mutations in Marburg virus glycoprotein associated with viral evasion from antibody mediated immune pressure", 《JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》 *
胡旭乐: "表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白GP重组新城疫病毒的构建及免疫原性分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057716A (zh) * 2019-07-27 2020-04-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用
CN111057685A (zh) * 2019-07-27 2020-04-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种复制型4型腺病毒载体重组马尔堡病毒病疫苗
WO2021017135A1 (zh) * 2019-07-27 2021-02-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种复制型4型腺病毒载体重组马尔堡病毒病疫苗
CN111057685B (zh) * 2019-07-27 2022-03-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种复制型4型腺病毒载体重组马尔堡病毒病疫苗
CN111057716B (zh) * 2019-07-27 2022-04-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用
CN112618707A (zh) * 2020-10-15 2021-04-09 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
CN112618707B (zh) * 2020-10-15 2023-07-04 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法

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