CN112661817A - 非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法、表位鉴定及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株针对ASFV p54蛋白单克隆抗体的制备方法、表位鉴定以及应用。通过将分析p54蛋白的优势抗原表位，选取合适的区域克隆到pET‑30a载体中，构建出原核表达载体pET‑30a‑p54‑JD,将表达的p54蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠，经过四次免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞，然后利用间接ELISA方法进行亚克隆获得抗p54蛋白的单克隆抗体，并鉴定了该抗体所对应的p54蛋白抗原表位。

Description

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法、表位鉴定及 应用

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种猪ASFV p54蛋白单克隆抗体MAb的制备方法、表位鉴定及应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus，ASFV）引起的，一种猪的急性、热性、高度接触传染性疾病，可以跨境传播。该病自1921 年首次报道后，主要流行于撒哈拉以南非洲地区。2007年格鲁吉亚暴发ASF，随后疫情迅速蔓延至整个高加索和俄罗斯。2014年ASF传入东欧大部分国家，并初步呈现出扩大流行趋势。世界动物卫生组织 (World Organization for Animal Health, OIE) 将 ASF列为必须通报动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物传染病。目前无商业化疫苗可用于防控ASF。自2018年8月3日中国首例ASF在沈阳被确诊以来, 给中国的养猪业造成了巨大的损失。

ASFV是一种核质双链DNA大病毒，呈二十面体结构，外有囊膜包被，不同毒株基因组大小存在些许差异，长度介于170-190Kb之间，包含１个中间保守区和２个分布在两端的可变区，有150多个主要开放阅读框，编码约200种蛋白质，其中存在许多与病毒复制、免疫逃逸、病毒传播等相关的蛋白。包括 p54、p72、p30 等。 p54蛋白由E183L编码，大小约为30Ku,主要集中在感染细胞的衍生内质网膜处。p54蛋白作为非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白,是血清抗体的主要结合位点,有着良好的免疫原性,可作为非洲猪瘟病毒早期检测的标志物。

前期研究 p54 蛋白大部分集中在蛋白结构分析、生理调控、对病毒复制的影响等方面， 抗原表位相关研究鲜有报道。本发明利用细胞融合以及亚克隆筛选，成功获得了一株针对 p54 蛋白的单克隆抗体，并对其抗原表位进行了鉴定，发现其能够识别猪ASFVp54蛋白175-184肽段（¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴），利用软件分析发现该肽段在p54蛋白中很保守，不仅为疫苗设计提供了宝贵的见识。并具有确定表位的诊断潜力，而且还揭示了针对选择性表位变异的保护机制。并且通过实验表明，该单克隆抗体具有很强的特异性。为 ASF 疫苗的研制以及高灵敏度检测方法的建立奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种非洲猪瘟p54蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用。本法的技术方案是：通过将ASFV E183L截短基因克隆到pET-30a载体中构建出了原核表达载体，利用不同浓度咪唑洗脱的方式纯化蛋白，将纯化后的p54 蛋白作为抗原免疫Bal/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，用纯化的p54 蛋白包被板子，通过间接ELISA筛选能够特异性识 p54 蛋白的阳性杂交瘤细胞。

具体发明有：获得了1株可特异性识别ASFV p54蛋白的单克隆抗体。可用于IFA、Western blotting检测，能够很好地识别ASFV p54 蛋白,亚型鉴定表明该单抗重链为IgG2a，轻链为Kappa链。通过构建截短表达的 p54 蛋白表达质粒以及合成一系列 p54 小肽，最终确定了该p54蛋白单抗能特异性识别 p54 蛋白175-184肽段，其氨基酸序列为5’-¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴-3’，如SEQ ID NO.1所示。

附图说明

图1中A图为本发明实施例1中 p54 蛋白全长跨膜区预测，全长蛋白的 30 位至52 位氨基酸为一段跨膜区。由于带跨膜区的蛋白在大肠杆菌中很难表达，因此对 p54 蛋白进行截短，去掉蛋白的跨膜序列（图 1B），仅表达 p54 蛋白的 163~555bp基因序列。

图2是本发明实施例1中 p54 蛋白163-555片段的PCR扩增电泳图。其中，第1泳道为DNA标准DL2000，第2泳道为阴性对照，第3泳道为p54 蛋白163-555bp片段。表明成功获得了大小正确的片段。

图3是实施例2中 p54 蛋白诱导表达鉴定的考马斯亮蓝染色图。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准,泳道1为pET-30a 空载体诱导对照,泳道2为pET-30a-p54-JD诱导后全菌,泳道3为pET-30a-p54-JD诱导前全菌，泳道4为pET-30a-p54-JD诱导后上清，泳道5为pET-30a-p54-JD 诱导后沉淀。说明上清中pET-30a-p54-JD蛋白的表达量较高，可用于纯化抗原进行免疫。

图4是实施例2中不同梯度咪唑洗脱后，pET-30a-p54-JD蛋白的考马斯亮蓝染色情况。说明该抗原纯化效果较好，可用于后期免疫。

图5是实施例2中不同梯度咪唑洗脱后，浓缩pET-30a-p54-JD蛋白后的考马斯亮兰染色图以及用His标签抗体检测pET-30a-p54-JD蛋白蛋白表达的Western blotting图。说明该抗原为大小正确的p54蛋白。

图6是实施例5中用1H9单克隆抗体检测经293T细胞内源性表达的p54蛋白的Western blotting图，说明该抗体可以特异性识别ASFV p54蛋白。

图7是实施例5中用1H9单克隆抗体检测经293T细胞内源性表达的p54蛋白的IFA图，说明该抗体可以特异性识别ASFV p54蛋白。

图8是实施例5中用1H9单克隆抗体亚型检测情况，说明该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链。

图9是实施例6中初步分段筛选1H9单克隆抗体表位的Western blotting图，说明该抗体识别的p54蛋白表位都包含 ¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴序列。

图10是实施例6中最小抗原表位的ELISA鉴定图，说明该1H9单克隆抗体识别的最小表位肽段为 ¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1 重组原核表达载体PET-30a-P54-JD的构建

发明人想要获得p54蛋白单克隆抗体，首先合成了含有p54蛋白全长基因的质粒以及构建了pET-30a-p54-JD原核表达质粒与pCAGGS-p54真核表达质粒，通过软件对 P54 蛋白的全长进行跨膜区预测，全长蛋白的 30 位至 52 位氨基酸之间为一段跨膜区。由于带跨膜区的蛋白在大肠杆菌中很难表达，因此本研究对 p54 蛋白进行截短，去掉蛋白的跨膜序列，仅表达 p54 基因的 163~555位的基因序列。发明人针对p54 163-555bp设计了引物，发明人设计的引物如下：

p54 163-555bp-F：5’－gtggtggtggtggtgctcgagAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTG－3’（SEQ ID NO.2）

p54 163-555bp-R：5’－gctgatatcggatccgaattcTTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGC－3’（SEQ ID NO.3）

上述引物经BLAST分析均为ASFV p54特异性序列，引物由桑尼生物上海公司合成。模板为参考NCBI中ASFV的ASFV-SY18（GenBank：MH713612.1）毒株的 p54 基因序列，并连入pUC57-simple载体中，由上海派森诺生物科技股份有限公司合成，两端带有 EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位点，经测序比对与ASFV E183L基因序列完全一致，命名为pUC57-ASFV-p54。然后以此模板进行PCR扩增，获得p54蛋白163-555bp基因片段，之后将其克隆到原核表达载体pET-30a载体中。如图1所示，获得了大小正确的截断片段的p54 163-555bp以及pET-30a-p54-JD质粒。具体过程如下：

PCR反应条件为：预变性95℃，30 s；变性 95℃，10 s；退火 65℃，30 s；延伸 72℃，1 min，变性至延伸过程设置 35 个循环数；终延伸，72℃，10 min。电泳后紫外下观察并拍照。用设计好的引物对合成的质粒进行PCR鉴定，电泳后在紫外下观察，分别扩增出大小约393bp的特异性条带（图2），结果与预期一致。

实施例2 重组原核表达载体PET-30a-P54-JD的诱导表达及纯化

将pET-30a-p54-JD和pET-30a空载体转化BL21感受态细胞，均匀地涂布于带卡那抗性的 LB 固体琼脂培养基上，于 37℃恒温培养箱中倒置培养。随机挑取单个菌落，接种于带有卡那抗性的 LB 液体培养基中，37℃恒温摇床内摇菌过夜。次日，分别各取 1 mL 菌液加入到两管新的带有卡那抗性的 LB 液体培养基中，37℃恒温摇床振荡培养。当菌液OD600nm约为 0.6~0.8 时，向其中一管中加入 IPTG 作为诱导组。另一组不做处理，为对照组。对照组除不加诱导剂 IPTG 外，其他条件均与诱导组一致。加入 IPTG 4 h 后收样。将诱导组和对照组各取 1 mL 菌液离心收集并处理菌体。进行 SDS-PAGE 电泳分析，根据结果分析质粒pET-30a-P54-JD的诱导表达情况。表达成功后，将诱导组剩余的菌液高速离心后收集菌体后进行超声。然后进行 SDS-PAGE 电泳分析重组原核质粒pET-30a-P54-JD蛋白是上清表达还是包涵体表达。如图3所示，pET-30a-P54-JD蛋白为上清表达。然后使用QiaGen的Ni-NTA Agarose，利用亲和层析原理对p54蛋白进行纯化。大致过程为：收集大量表达带 His 标签的 p54的菌液，用无菌的PBS 洗涤 2遍，然后利用超声破碎仪进行破碎，高速离心，收集细胞上清。将上清与预先处理好的Ni-NTA Agarose 在 4 ℃结合过夜。然后用含有 10 mM、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、200 mM 和 1M 的咪唑的洗涤液，对Ni-NTA Agarose 进行洗涤，收集洗脱液，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，观察纯化结果。将纯度较高的p54蛋白进行浓缩。纯化蛋白经SDS-PAGE 电泳后，转印到NC膜上进行Westernblotting 实验（图4，图5）。

实施例3 动物免疫

将纯化的pET-30a-P54-JD免疫6 只4周龄雌性BALB/C小鼠。另设一组6只小鼠用作阴性对照。免疫之前，测定纯化蛋白的浓度。取 100 µg 纯化蛋白，与等体积弗氏完全佐剂乳化后，通过腹腔注射的方法对小鼠进行免疫，两周后用弗氏不完全佐剂乳化蛋白后通过同样方式注射入小鼠体内，四周后进行第三次免疫，方法参见第二次免疫。第三次免疫三天后对小鼠断尾取血并用ELISA和Western blotting测定血清抗体效价，两项检测结果均达标后进行加强免疫。

实施例4 ASFV p54蛋白单克隆抗体的制备

（1）SP2/0 细胞的复苏与培养

融合前 15 天左右复苏 SP2/0 细胞并调整细胞密度。具体方法：将SP2/0 冻存细胞从液氮中取出，放进密封的透明袋里，将透明袋迅速放进装有 37℃温水的烧杯中， 静置融解。融解后，室温水平离心，1000 rpm，5 min，在生物安全柜将上清液吸出并丢弃，用1mL培养基将细胞团吹散混匀，平铺到细胞培养皿，加培养基至 10 mL，37℃培养至细胞贴壁后换培养液。

（2）制备饲养层细胞

融合前一天，将对照组的三只小鼠采用眼球采血的方法取血清作为阴性对照。随后将它们脱颈致死，用 75%酒精浸泡 5 min。在生物安全柜内将小鼠腹部朝上固定在灭菌后的泡沫板上，用镊子夹起腹部皮肤后将小鼠腹部下方脂肪层位置的皮肤剪开一个小孔，用镊子和剪刀将皮肤从小孔处撕开，暴露腹腔。向腹腔内注射 5 mL HAT 培养液。用镊子小心弹击腹膜两侧，使小鼠腹腔巨噬细胞悬浮在培养液中，数次弹击后吸出 HAT 培养液。重复该步骤 1 次后将培养液分到 96 孔板内，每孔 100 µL。置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。次日，观察饲养层细胞生长状态，状态良好则可以融合。

（3）脾细胞的制备

选择效价最高的小鼠，摘除其眼球放血处死，将眼球血收集起来，离心取血清用于阳性血清对照。将处死的小鼠放于75%的酒精内浸泡5min，在超净台内将小鼠固定好，用灭菌的剪刀轻轻剪开小鼠的腹部皮肤，无菌状态下摘取免疫小鼠的脾脏，将20 mL DMEM放入培养皿中，用于放置脾脏。将分离干净的完整脾脏用5 mL无菌注射器小心在脾脏一端轻扎几个小孔，在另一端用5 mL无菌注射器吸取基础培养液后小心刺入脾脏冲洗脾脏，多次反复直至脾脏变为灰白色，脾内细胞完全冲出为止。

（4）杂交瘤细胞的融合

将SP2/0骨髓瘤细胞悬液和免疫脾细胞悬液按1:5的比例混合置于50ml离心管内，补加DMEM至30ml，充分混匀后，将细胞1000 rpm离心10 min后，弃上清，轻击管底使细胞沉淀分散呈糊状，将装有脾细胞和SP2/0细胞的离心管放在盛有37℃温水的泡沫盒中，边转动离心管，边缓慢滴入1ml提前在37℃培养箱中预热的PEG2000，在1min内加完后静置2min。再用DMEM基础培养液稀释PEG终止融合。最开始的1min缓慢滴入1ml DMEM，接下来的1min缓慢滴入5ml DMEM，再在随后的3min中之内滴入34ml DMEM。均匀滴完后，1000 rpm离心10 min。用37℃预热的含20 %血清HAT培养液重悬细胞，按100μL/孔的体积加入到铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，放入37℃、5 %CO2培养箱中培养。在最开始的几天，尽量不移动细胞，在融合5天后观察细胞融合情况，用HAT培养液适当补液。在融合10~14d后，用排枪小心吸取50μL细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株分泌的抗体。

（5）阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合细胞长至1/3~1/2面积时，采用间接ELISA检测方法筛选培养上清液，筛选阳性孔。用融合细胞上清液为一抗，SP2/0细胞上清液为阴性对照，融合前小鼠血清为阳性对照，HRP-羊抗鼠IgG为二抗。具体实施方法如下：

用纯化的p54蛋白包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/孔，每孔100μL, 4℃包被过夜。每孔加入200μL 5 %脱脂乳37℃封闭2h，用含有5 ‰ Tween-20的PBST洗涤3次后，取50μL细胞上清液加入到包被蛋白的酶标板中混匀，37℃培养箱作用1h后，用含有5 ‰Tween-20的PBST洗涤3次，每次5 min。再加入100μL用5%脱脂乳按1:10,000倍稀释的HRP羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h后，用含有5 ‰ Tween-20的PBST洗涤3次。每孔加入100μL TMB显色液，避光室温孵育15min。最后每孔加入50μL 2 M H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定OD450值。选取OD值最高的阳性细胞孔扩大培养后，进行3次亚克隆，每次亚克隆均用上述间接ELISA方法进行筛选。选取稳定分泌p54抗体的杂交瘤细胞株1H9进行扩大培养，冻存，用于单抗腹水制备。

（6）腹水的制备

向 BALB/C 6 周龄雌性小鼠腹腔内注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠 0.5 mL。一周后将生长状态良好的杂交瘤细胞吹起，移入 15 mL 离心管中，1000 rpm，5 min。细胞沉淀用PBS 重悬，向小鼠腹腔注射，每只小鼠大约注射 10⁶ 个细胞。一周左右，小鼠腹腔膨胀，用注射器扎进腹腔， 使腹水慢慢流出来。收集腹水，4℃离心，1000 rpm，10 min，吸取中间的腹水层，于-80℃冻存。

实施例5：单克隆抗体的特异性检测

为验证单克隆抗体的特异性，将 pCAGGS 和 pCAGGS-p54质粒分别转染至 Vero细胞，进行免疫荧光检测（immunofluorescence assay，IFA）和 Western blotting 分析。IFA 结果显示，p54 蛋白多克隆抗体可特异性识别 Vero 细胞中表达的 p54 蛋白，而与空白对照没有反应（图 6）。P54 蛋白抗体可识别蛋白分子量约为 30kDa 大小的特异性蛋白条带（图 7）。

进一步根据Proteinech 单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型的鉴定，结果表明该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链（图8）。

实施例6 p54单克隆抗体识别表位的鉴定

首先将 p54（ 163-555aa）分为五大段（P1-1：163-315aa；P1-2：226-375aa；P1-3：286-432aa；P1-4：340-486aa；P1-5：406-555aa），根据引物（SEQ NO：4-13）构建表达质粒。PCR反应条件为：预变性95℃，30 s；变性 95℃，10 s；退火 65℃，30 s；延伸 72℃，1 min，变性至延伸过程设置 35 个循环数；终延伸，72℃，10 min。分别将片段连接到pCold-TF载体上，用BL21(DE)3转化后挑选阳性克隆，选取单菌落进行验证，验证正确后进行诱导表达，在37℃摇床中将细菌培养至OD 0.6~0.8后，加入1mM IPTG进行诱导表达，16°C诱导24 h后，收集菌液进行超声。结果表明单克隆1H9表位位于P1-5区域内（406-555aa）（图9）。

进而对P1-5片段进行进一步截短，分为四段（P2-1:406-456aa；P2-2:439-489aa；P2-3:472-522aa；P2-4:505-555aa），根据表1中的引物（SEQ NO：14-21），如上所述进行扩增、诱导表达鉴定。结果表明该单克隆抗体1H9表位位于P2-4（505-555aa）内（图9）。

为了进一步精确鉴定1H9单克隆抗体的表位，通过吉尔多肽生物有限公司合成8条不同截短的多肽（SEQ NO：22-29），分别用此8条多肽包被酶标板进行间接ELISA鉴定(包被200ng/孔)。结果表明该单克隆抗体识别p54蛋白的最小表位为175-184位氨基酸肽段，其序列为¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴（图10）。

实施例7 P54间接 ELISA 方法的建立及条件优化结果

（1）抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

将P54蛋白稀释成不同浓度进行包被，ASFV阳性血清和阴性血清分别从 50 倍到400 倍稀释，方阵滴定结果显示，抗原的最佳包被量为 2 µg/mL（200ng/孔），血清的稀释度为 1:200，此时的阳性血清与阴性血清的 OD450 nm 值相差最大（P/N=7.641）（表1所示）。

表1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

（2）最佳包被液、最佳封闭液及封闭时间的优化结果

用不同包被液以 2 µg/mL(200 ng/孔)包被酶标板，用不同的封闭液对包被的酶标板按不同时间进行封闭，试验结果表明，用 0.05 M 碳酸盐包被液包被抗原，5 %脱脂乳37℃封闭 2 h 时，P/N 值最大（P/N=17.768）。表2显示的为最佳条件。

表2 最佳抗原包被液和封闭条件的确定

（3）包被温度时间和酶标二抗稀释度的优化结果

用 0.05 M 碳酸盐包被液，分别以 37℃ 1 h、37℃ 2 h、37℃ 4 h、4℃过夜的条件包被抗原， 实验结果表明 37℃包被 2 h，P/N 值最大；将酶标二抗分别作5×10³、1×10⁴、2×10⁴、4×10⁴倍稀释后，置 37°C 作用 2h，选择酶标二抗最佳稀释倍数。试验结果表明，2×10⁴ 倍稀释时，P/N 值最高（P/N=12.996），因而确定最佳二抗稀释倍数为 2×10⁴（如表3所示）。

表3 抗原最佳包被方法和二抗稀释度的确定

（4）血清与酶标二抗的最佳作用时间的优化结果

按上述确定条件进行实验，将血清按 20 min、30 min、45 min、60 min 四个时间段作用，洗三次后，将稀释好的酶标二抗按 20 min、30 min、45 min、60 min 四个时间段作用，根据OD450 测定结果，计算P/N 值，确定最佳血清孵育时间为 60min，最佳二抗孵育时间为 60 min（如表4所示）。

表4 血清最佳反应时间和二抗最佳反应时间的确定

（5）显色温度与时间的优化

按上述条件实验，最后显色时，分别用室温和 37℃，显色时间为 5 min，10 min，15 min， 进行 ELISA 测定，分析实验结果表明，37℃显色 15 min，为最佳底物显色温度时间，此时 P/N 值可达14.620（如表5所示）。

表5 最佳底物显色条件的确定

（6）间接 ELISA 临界值的确立

取本实验室保存的已知背景的 24 份ASFV阴性血清样品，以优化的间接 ELISA实验条件检测，对结果进行统计学分析，计算其平均值为 0.120，标准差为0.035。当 OD450≥X＋3SD=0.225 的血清判为阳性；当OD450nm≤X＋2SD=0.19 的血清判为阴性，两者之间为可疑血清。（如表6所示）

表6 24份猪阴性血清的 ELISA 检测结果

综上所述，本发明提供了一株针对ASFV p54 蛋白单克隆抗体的制备方法与应用，通过将p54 163-555bp克隆到pET-30a载体中构建出携带His标签的能够表达ASFV p54蛋白的原核表达载体，并用梯度咪唑洗脱的纯化方式获得ASFV p54蛋白。以纯化的蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合以及亚克隆筛选获得了抗ASFV p54的单克隆抗体。鉴定结果表明该制备的抗体亚型为IgG2a，轻链为Kappa链。IFA和Western blotting分析结果表明所获得的单克隆抗体能够特异性识别ASFV p54蛋白，可用于检测还原条件下的ASFVp54抗原，其识别的表位序列为¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴，进一步证明了该抗体的特异性。

应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述， 但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

〈120〉非洲猪瘟病毒 p54蛋白单克隆抗体的制备方法、表位鉴定及应用

〈160〉 29

〈170〉 PatentIn version 3.3

〈210〉 1

〈211〉 10

〈212〉 PRT

〈213〉抗原表位

〈400〉YTHKDLENSL

〈210〉2

〈211〉 46

〈212〉 nt

〈213〉pET-30a-p54-JD-163-555aa-F

〈400〉gctgatatcggatccgaattcAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTG

〈210〉3

〈211〉 49

〈212〉 nt

〈213〉pET-30a-p54-JD-163-555aa-R

〈400〉gtggtggtggtggtgctcgagTTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGC

〈210〉4

〈211〉46

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-163-315aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTG

〈210〉5

〈211〉40

〈212〉nt

〈213〉pCold-TF-163-315aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTCTGCCCGTGACTGGCTTG

〈210〉6

〈211〉 45

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-226-375aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagTCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCC

〈210〉7

〈211〉 43

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-226-375aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTCTGTCCGTAACTGGGTTGTCC

〈210〉8

〈211〉 43

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-286-432aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTC

〈210〉9

〈211〉 39

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-286-432aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcAGCAGGAGCACTCGCGGC

〈210〉10

〈211〉 44

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-340-486aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagAAACAAACCAGTTACGGACAACC

〈210〉11

〈211〉 47

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-340-486aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTGTTTGTGAAGCAGTGTTCTGAGTAG

〈210〉12

〈211〉 39

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-406-555aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagCGCACCTGCGGCCGCGAG

〈210〉13

〈211〉 49

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-406-555aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGC

〈210〉14

〈211〉 39

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-406-456aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagGCACCTGCGGCCGCGAGT

〈210〉15

〈211〉 41

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-406-456aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTGTCGTGTAAGGCTCAGCCG

〈210〉16

〈211〉 43

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-439-489aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagGCTGAGCCTTACACGACAGTCA

〈210〉17

〈211〉 45

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-439-489aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcCATTGTTTGTGAAGCAGTGTTCTG

〈210〉18

〈211〉 43

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-472-522aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagACTGCTTCACAAACAATGTCGG

〈210〉19

〈211〉 46

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-472-522aaa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcGGTGTTTCTTTGTCGTAAATTTTCA

〈210〉20

〈211〉 46

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-505-555aa-aa-F

〈400〉atggagctcggtaccctcgagTTACGACAAAGAAACACCTATACGC

〈210〉21

〈211〉49

〈212〉 nt

〈213〉pCold-TF-505-555aa-aa-R

〈400〉caggtcgacaagcttgaattcTTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGC

〈210〉22

〈211〉 9

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉THKDLENSL

〈210〉23

〈211〉 8

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉HKDLENSL

〈210〉24

〈211〉 6

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉KDLENSL

〈210〉25

〈211〉 5

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉DLENSL

〈210〉26

〈211〉 9

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉YTHKDLENS

〈210〉27

〈211〉 8

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉YTHKDLEN

〈210〉28

〈211〉 7

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉YTHKDLE

〈210〉29

〈211〉6

〈212〉 protein

〈213〉抗原表位

〈400〉YTHKDL

Claims (8)

1.一种猪ASFV p54蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以特异性识别猪源ASFV p54蛋白。

2.如权利要求1所述的一种猪ASFV p54蛋白的抗原表位，所述抗原表位为猪源p54蛋白175-184肽段，其氨基酸序列为（¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴），可用于IFA实验中ASFV p54蛋白和Western blotting实验中还原状态下p54蛋白的检测。

3.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的ASFV p54蛋白的抗原表位的抗体，所述抗体是单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。

4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的诊断或检测ASFV。

5.一种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1或2中所述的抗原表位给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含在所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。

6.一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含ASFV p54蛋白的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种猪ASFVp54蛋白的抗原表位或抗原决定簇。

7.如权利要求6所述的抗原组合物，所述的猪ASFV p54蛋白的抗原表位为猪ASFV p54蛋白175-184肽段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示（¹⁷⁵YTHKDLENSL¹⁸⁴）。

8.权利要求1或2所述的一种猪ASFV p54蛋白的抗原表位、权利要求3或4所述的抗体制剂、权利要求6、7所述的抗原组合物在制备诊断或检测ASFV的ELSIA抗体检测试剂盒中的应用。

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