CN105238760A - 抗蓝舌病病毒15型vp2蛋白的单克隆抗体btv15-vp2-2d6及其识别的b细胞表位和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗蓝舌病病毒(Bluetongue？virus,BTV)15型VP2蛋白的单克隆抗体BTV15-VP2-2D6及其识别的B细胞表位和应用。本发明还公开了一株经筛选得到的能够稳定分泌抗BTV-15？VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV15-VP2-2D6，微生物保藏号是：CGMCC？NO.10206，研究表明该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能够与BTV-15？VP2蛋白发生特异性反应。此外，本发明还公开了该单克隆抗体所识别的BTV-15？VP2蛋白特异性B细胞表位。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV-15？VP2蛋白特异性B细胞表位可用于制备鉴别、诊断、预防或治疗特异性血清型BTV-15感染的试剂或药物，并为建立BTV-15型特异性病毒与环状病毒属其他病毒的鉴别诊断方法以及进一步研究预防与治疗措施奠定了基础。

Description

抗蓝舌病病毒15型VP2蛋白的单克隆抗体BTV15-VP2-2D6及其识别的B细胞表位和应用

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗蓝舌病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的蓝舌病病毒15型VP2蛋白B细胞表位；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位在制备鉴别诊断不同血清型蓝舌病病毒以及预防和治疗蓝舌病相关试剂和药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防治领域。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的成员蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的，经由其传播媒介库蠓通过吸血途径在反刍动物之间进行广泛传播的虫媒性急性、烈性动物传染病。其易感动物主要有绵羊、山羊、水牛、黄牛、鹿、骆驼等反刍动物，其中绵羊、山羊最易感。通常只有绵羊被感染后才表现出明显典型的发病症状，其主要表现为：体温升高至40.5-41.4摄氏度；口腔黏膜发绀充血；嘴唇、眼睑、面部水肿；大量流涎、呕吐、下痢。蓝舌病发病急，传染性较强，造成反刍动物的高死亡率，对大动物养殖业以及动物经济市场造成了严重的损失。所以我国将蓝舌病划规为一类疫病，世界动物卫生组织将其列为须通报动物疫病。由于传播媒介库蠓生活的季节性和地域性，所以蓝舌病主要分布于非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个热带、亚热带和温带地区国家。蓝舌病最早于18世纪被发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热后出现口腔黏膜损失以及舌头发蓝，蓝舌病因此而得名。1940年前本病还仅发现于撒哈拉以南的非洲大陆，比如埃及(1907年)、肯尼亚(1909年)、西非(1927年)、塞浦路斯、巴勒斯坦、土耳其、叙利亚(1943-1949年)。

而后，欧洲、美洲及亚洲都相继报道该病的爆发。而我国是在1979年在云南省师宗县首次分离出蓝舌病病毒，而报道蓝舌病在中国的爆发，之后在湖北省(1983年)、安徽省(1985年)、四川省(1989年)、山西省(1991年)相继爆发此病。有关学者通过对我国多个省区蓝舌病血清型进行分析调查，结果鉴定出BTV-1、2、3、4、12、15以及16血清型。我国流行的蓝舌病血清型即为1、2、3、4、12、15以及16型。进入21世纪以来，在全球温室效应的催化作用下，蓝舌病传播媒介库蠓也广泛地活跃于相关地区，蓝舌病也以流行范围更广、发生频率越大、并且毒力更强的趋势爆发于世界各地。但是由于蓝舌病病毒血清型众多，且基因容易发生飘移等特征，使得目前并没有统一有效确实的治疗措施来预防或是治疗蓝舌病，所以制备出针对某一特定血清型的蓝舌病病毒相关试剂刻不容缓，我们应当未雨绸缪通过储备好相关试剂，以更快、更有效地方式抵御蓝舌病的侵害，最大化地减少畜牧业的经济损失以及保卫公共卫生安全。

蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员，是呼肠孤病毒科中最大的一类病毒。其病毒粒子呈20面体对称，病毒粒子直径为70-80nm，无囊膜，基因组为10个分节段大小不等的双股RNA，分别编码7个结构蛋白VP1～VP7和四种非结构蛋白NS1、NS2、NS3/NS3a以及NS4。病毒粒子外层衣壳由VP2和VP5构成，大约占病毒总蛋白的40％；核衣壳由VP3和VP7以及三种次要结构蛋白VP1、VP4以及VP6共同构成。病毒基因组包含在病毒双层衣壳中。其中，60个口袋状结构的VP2蛋白聚体位于病毒粒子的最外层。VP2由L2基因编码，不同血清型L2长度和保守性差异是最大的。VP2是血清型特异性抗原，主要作用是刺激中和抗体产生，也是病毒血凝素抗原。所以，VP2是BTV血清型的主要决定因素。目前，已经确定BTV有26个血清型。不同血清型之间交叉保护效力较差。而我国流行的主要血清型是1、2、3、4、12、15以及16型，目前还未有针对BTV15的单克隆抗体。所以，本发明针对BTV15-VP2制备的杂交瘤细胞以及相应的单克隆抗体及其B细胞抗原表位对于建立BTV15型的快速鉴别诊断以及预防和治疗15型蓝舌病提供了一定的技术储备。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV15VP2蛋白发生特异性反应；

本发明目的之三是提供一种BTV15VP2蛋白的特异性B细胞表位。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用pMAL-C4X原核表达系统表达纯化的重组的BTV15VP2蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV15VP2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，最终获得一株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为：BTV15-VP2-2D6，分类命名为：分泌抗BTV15-VP2-2D6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号为：CGMCCNo.10206，保藏时间为：2014年12月23日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

此外，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，命名为BTV15-VP2-2D6，IFA检测结果表明该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与BTV15感染BHK细胞产生的VP2蛋白发生特异性反应，而与相应阴性对照不发生反应。

进一步的，本发明利用肽扫描技术对BTV15-VP2-2D6所识别的BTV15VP2蛋白的B细胞表位进行了鉴定，结果表明：BTV15-VP2-2D6所识别的BTV15VP2蛋白的线性B细胞表位的氨基酸序列为⁹IERNSTIAPAIIKRYP²⁴(SEQIDNO.1所示)。同时，序列比对特异性鉴定结果显示⁹IERNSTIAPAIIKRYP²⁴为BTV15型特异性表位，即BTV15血清型特异性抗原表位。

综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV15VP2蛋白的单克隆抗体、该抗体所识别的BTV15VP2蛋白的B细胞表位以及稳定分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株，研究证明本发明的单克隆抗体以及单克隆抗体所识别的针对BTV15特异性的B细胞表位可用于制备特异性血清型BTV15型的鉴别诊断试剂以及预防或治疗BTV15型感染的药物。

附图说明

图1为原核表达及纯化的重组BTV15VP2蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；

M：标准蛋白Marker1：空载体pMAL-C4X表达蛋白；2：BTV15VP2蛋白诱导前；3：BTV15VP2蛋白诱导超声后上清；4：BTV15VP2蛋白诱导超声后沉淀；5：纯化后的BTV15VP2蛋白；6：纯化的BTV15VP2蛋白(WB)；7：未纯化的BTV15VP2蛋白(WB)；M：标准蛋白Marker。

图2为真核表达及纯化的重组BTV15VP2蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；

M：标准蛋白Marker1：Sf9细胞；2：野生型杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞；3：重组杆状病毒感染的Sf9细胞；4：纯化的真核表达的BTV15VP2蛋白；5：纯化的真核表达的BTV15VP2蛋白(WB)；6：重组杆状病毒感染的Sf9细胞(WB)；7：Sf9细胞；M：标准蛋白Marker。

图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV15-VP2-2D6与BTV15感染的BHK细胞以及与未感染BTV15的BHK细胞的反应结果；

1.BTV15-VP2-2D6与BTV15感染的BHK细胞之间的反应；2.小鼠阳性血清与BTV15感染的BHK细胞之间的反应；3.BTV15-VP2-2D6与未感染BTV15的BHK细胞之间的反应。

图4为原核表达的10条截短蛋白的SDS-PAGE分析；

M：标准蛋白Marker；V：空载体pMAL^TM-c4X表达的蛋白；1-10：表达的10条VP2截短蛋白B15-VP2-1～B15-VP2-10。

图5为原核表达的14条16氨基酸短肽的SDS-PAGE分析；

M：标准蛋白Marker；V：空载体pMAL^TM-c4X表达的蛋白；1-14：表达的14条VP2短肽B15-VP2-1-j-1～B15-VP2-1-j-14。

图6为原核表达的16肽与BTV15-VP2-2D6反应性的Westernblot鉴定；

M：标准蛋白Marker；1：BTV15-VP2-2D6与B15-pC4X-VP2-1-j-2的反应；2：BTV15-VP2-2D6与真核表达的重组VP2蛋白的反应。

图7为单克隆抗体BTV15-VP2-2D6对应B细胞表位的特异性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施实例来进一步阐述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述的展开而更加清晰。但这些实施实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

主要实验材料和来源

1.蛋白、细胞、毒株

真核重组BTV15-VP2蛋白、原核重组BTV15-VP2蛋白由本实验室制备并纯化；BHK细胞、Sf9细胞、SP2/0细胞、BTV1～24型毒；携带BTV15-VP2基因的重组杆状病毒B15-BACV-VP2以及B15-pC4X-VP2蛋白截短表达的10段蛋白以及进一步截短表达的14条VP2蛋白均由本实验室制备并保存。

2.主要试剂和药品

PrimerStarDNA聚合酶、premixr-TaqDNA聚合酶、限制性内切酶BamHI、PstI、DNAMarker购自大连宝生物有限公司；T4DNAquickligase购自NEB公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自金桥生物技术有限公司；E.coliRosseta(DE3)感受态细胞由哈尔滨兽医研究所人畜共患病自然疫源性传染病团队馈赠；E.coliDH5α、E.coliBL21感受态细胞购自天根生化科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基购自GIBCOL公司；弗氏佐剂、50％PEG、50×HAT、和和异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠IgG均购自Sigma公司；SBAClonotyping^TMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于SouthernBiotechnology公司；抗6×His标签的单克隆抗体购自Roche公司。

3.实验动物

6～8周龄BALB/c雌鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

实施例1BTV15VP2蛋白的原核和真核表达及纯化

1.引物设计

根据已知的BTV15型L2基因序列(GenBank登录号：CAE51102.1)设计PCR扩增引物，并在上、下游引物的5＇端各自引入酶切位点BamHI和PstI，原核表达载体为pMAL-C4X：

B15-pC4X-VP2-F:5＇-GCggatccATGGAGGATTTCCCTGTGA-3＇(BamHI)；

B15-pC4X-VP2-R:5＇-CGctgcagTCATATATTTGTAAGCTTGG-3＇(PstI)

真核表达载体为pFAST-HAT:

B15-pFAST-VP2-F:5＇-GCggatccGATGGAGGATTTCCCTGTGA-3＇(BamHI)；

B15-pFAST-VP2-R:5＇-CGctgcagTCATATATTTGTAAGCTTGG-3＇(PstI)

2.BTV15VP2蛋白原核表达载体的构建及VP2蛋白的原核表达及纯化

将实验室已有质粒pZERO-VP2进行PCR扩增获得L2基因并进行胶回收，并将胶回收获得的L2基因以及原核表达载体pMAL-C4X分别进行双酶切。酶切后的L2基因和原核表达载体pMAL-C4X进行连接。将混合物置于DNA连接仪中25℃作用10min。继而将连接产物转化至E.coliDH5α，冰浴30min后于水浴锅42℃热激90s，之后将产物冰浴3min后再加入500μL无抗性的LB培养基，于37℃摇床中摇菌1h，将菌液涂于Amp⁺抗性的平皿中，37℃恒温倒置过夜培养。随机挑取单个菌落，分别接种到5mLLB液体培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃摇菌8～12h。提取重组质粒并进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将疑似阳性质粒送测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为B15-pC4X-VP2，-20℃保存备用。

将B15-pC4X-VP2转化E.coliRosseta(DE3)感受态细胞，37℃过夜培养后，随机挑取单个菌落，分别接种于5mLLB液体培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃摇菌8～12h。将菌液以1:100的接种量进行重组VP2蛋白的诱导表达。将菌液置于37℃摇床培养，大约3h后测其OD_600nm约为0.5后，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导6h。12000g离心5min收集菌体，并超声裂解菌体，分别收集裂解离心后的上清及沉淀，之后进行SDS-PAGE电泳鉴定。其结果显示原核表达的VP2蛋白主要以包涵体的形式存在于超声裂解离心后的沉淀中。以直链淀粉树脂进行亲和层析纯化，纯化效果较差。所以我们使用切胶纯化的方式对原核重组VP2蛋白进行纯化，并使用电洗脱仪将切下的胶条进行洗脱回收。最后得到一条大约150Kd的条带，与目的蛋白大小相符合。利用HRP标记的抗MBP标签单克隆抗体进行Westernblot鉴定，表明重组VP2蛋白表达纯化成功(图1)。

3.BTV15VP2蛋白真核表达载体的构建及VP2蛋白真核表达与纯化

将PCR扩增并胶回收的L2基因片段及杆状病毒穿梭载体pFastBac^TMHTA分别进行双酶切。酶切后的L2基因和杆状病毒穿梭载体pFastBac^TMHTA进行连接。将混合物置于DNA连接仪中25℃作用10min。继而将连接产物转化至E.coliDH5α，冰浴～min后进行热激，于水浴锅中42℃静置90s，之后将产物冰浴3min后于37℃摇床中摇菌1h，将菌液涂于Amp⁺抗性的平皿中，37℃恒温倒置过夜培养。提取重组质粒分别进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将疑似阳性的重组质粒pFast-VP2转化E.coliDH10Bac^TM感受态细胞。首先将DH10Bac^TM(100μL)感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰中融化；取将重组质粒pFast-VP20.5μL加入DH10Bac^TM中搅拌混匀，冰浴30min后于水浴锅42℃热激90s，之后将产物冰浴3min后再加入500μL无抗性的LB培养基，于37℃摇床中摇菌4h。分别取该菌液以原倍、10倍以、100倍稀释的每一个稀释度的菌液150μL涂于LA-Bac平皿中(Kan⁺50μg/mL、Gen7μg/mL、Tet10μg/mL、X-gal100μg/mL和IPTG40μg/mL)，37℃温箱中倒置培养48h后进行蓝白斑筛选。随机选取单个白色菌落划线接种到新的LA-Bac平皿中，37℃温箱中倒置培养48h后进行蓝白斑筛选，以此步骤重复操作两次对菌落进行纯化。最后，随机选取白色菌落分别接种到5mL的三抗LB液体培养基中(50μg/mLKan⁺、7μg/mLGen、10μg/mLTet)。于37℃摇床中摇菌12～16h后提取重组杆粒，将其命名为B15-BAC-VP2。

使用转染试剂CellfectinReagent，按照说明书操作将重组杆粒B15-BAC-VP2转染Sf9细胞，最后收获重组杆状病毒，命名为B15-BACV-VP2，将未进行转染的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：

(1)将生长状态良好的Sf9细胞铺于六孔细胞板，每孔细胞数目大约910⁵个，置于27℃恒温培养箱培养，直到每孔中的细胞占单层面积的80％～90％。

(2)取1μg纯化的重组杆粒B15-BAC-VP2稀释到100μl的Grace基础培养基中；取6μl混匀后的CellfectinReagent稀释到100μl的Grace基础培养基中；将二者加到一起混匀后，于室温静置孵育30min。

(3)在转染前，弃掉六孔细胞板中原有的培养液，用Grace基础培养基清洗细胞两次，2mL/次；

(4)将800μLGrace基础培养基加入到上述混合物中混匀后，将这约1mL脂质体-DNA复合物加入到Sf9细胞培养板中，于27℃恒温孵育5h。

(5)弃掉转染混合液，于每孔中加入3.0mLGrace完全培养基，置于27℃恒温孵育，经过72h后直到能观察出细胞发生明显病变。

(6)收集病变后的细胞及上清，离心后收获的上清即是第一代重组杆状病毒，命名为B15-BACV-VP2-P1。

之后，取适量B15-BACV-VP2-P1感染Sf9细胞，依次产生不同代次重组杆状病毒B15-BACV-VP2-P2、BACV-VP2-P3，收集上述病毒上清，于4℃避光保存备用。在此过程中，对每一不同代次重组杆状病毒感染的Sf9细胞产生的BTV15-VP2蛋白通过SDS-PAGE分析确定重组杆状病毒B15-BACV-VP2滴度最高及重组VP2蛋白表达量最大时的病毒代次。其中，野生型杆状病毒BACV-W同样感染Sf9细胞作为对照。分析结果确定，蛋白表达量最大的重组杆状病毒的感染代次为B15-BACV-VP2-P2，因此我们大量接种蛋白表达量最大的重组杆状病毒的感染代次为BACV-E2/P3于Sf9细胞以获得足够的真核重组BTV15-VP2蛋白。之后，我们使用NP4/0裂解法对收集的蛋白进行超声纯化，经过SDS-PAGE及Westernblot鉴定，表明BTV15-VP2蛋白表达纯化成功(图2)。

实施例2单克隆抗体的制备

1.免疫小鼠

以实施例1切胶纯化的原核表达的重组BTV15-VP2蛋白作为免疫原通过腹腔及皮下多点注射免疫6周龄BALB/c雌鼠5只，100μg/只。共免疫两次。初免将弗氏完全佐剂等体积与纯化的原核重组BTV15-VP2蛋白混合并进行乳化；14天后，二免将弗氏不完全佐剂等体积与纯化的原核重组BTV15-VP2蛋白混合并进行乳化。二免一周后断尾采血，利用间接ELISA方法测定小鼠血清抗体效价。融合前三天，选择血清抗体效价较高的小鼠进行加强免疫，即将100μg纯化的原核重组BTV15-VP2蛋白直接注射到小鼠腹腔中。

2.细胞融合

制备饲养层细胞：

(1)首先将8周龄BALB/c雌鼠摘除眼球放血，脱颈致死后置于75％的酒精中浸泡5min；

(2)在超净工作台中，用镊子取出小鼠后尽量沥干其体表的酒精，并使用剪刀钝性分离腹部皮肤，暴露出小鼠腹腔；

(3)用5ml的注射器吸取3ml配制好的2％HAT完全培养基，选取腹腔适当位置进针将其注射入小鼠腹腔中，并用镊子按压小鼠腹腔，再原位吸取出腹腔中的液体，将液体打回平皿中的2％HAT完全培养基；

(4)重复上述操作(3)2～3次；

(5)吹吸混匀平皿中的2％HAT完全培养基，以100μL/孔的量加入到96孔细胞板中，置于37℃恒温培养箱中。

融合细胞：

1.首先，在生物安全柜中准备以下物品：44mlHAT培养基盛于平皿中；50ml双抗DMEM基础培养基盛于50ml离心管中；10ml双抗DMEM基础培养基盛于平皿中；20ml双抗DMEN基础培养基盛于放有200目铜网的平皿中；手术器械(剪刀、镊子等)在酒精灯上灼烧消毒；

2.将免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，脱颈致死后置于75％的酒精中浸泡5min；

3.在超净工作台中，用镊子取出小鼠后尽量沥干其体表的酒精，将其仰面置于平皿中并使用剪刀钝性分离腹部皮肤，暴露出小鼠腹腔，剪开小鼠左侧肌肉，将其脾脏取出；

4.将脾脏置于含有10ml双抗DMEM基础培养基的平皿中，清洗脾脏，分离出结缔组织及脂肪；

5.用镊子将脾脏置于200目铜网上充分研磨；

6.将上述20ml脾细胞悬浮液吸入新的50ml离心管中，再加入SP2/0细胞，SP2/0细胞：脾细胞在1:4～1：10之间。此时离心管中液体量大约为30ml；

7.离心上述细胞悬浮液，1000rpm/min室温离心10min，此步骤重复两次以充分清洗混合细胞；

8.弃去上述离心管中的上清，将离心管在EP管架上来回拖动，直到管中细胞完全散开；

9.细胞融合：

<1>取1ml37℃预热的PEG在1min之内加入上述细胞中，过程中缓慢、轻搅；

<2>将离心管置于37℃水浴90s；

<3>停止反应：第1min之内缓慢加入1ml双抗DMEM基础培养基；第2min之内缓慢加入2ml双抗DMEM基础培养基；第3min之内缓慢加入3ml双抗DMEM基础培养基；

<4>最后加入双抗DMEM基础培养基至20ml，37℃温浴5min。

10.将上述细胞混合液1000rpm/min室温离心10min，以准备好的HAT培养基重悬，于平皿中充分混匀，以100μL的量加入到铺有饲养层细胞的96孔板中。置于37℃恒温培养箱中培养；

11.细胞融合后第7天以含有20％FBS的DMEM对细胞进行完全换液；

12.换液后大约第3天待细胞长满底部面积的约1/3时开始检测杂交瘤上清。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆纯化

利用纯化的真核系统表达的BTV15VP2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法用于筛选阳性杂交瘤细胞株。将阳性杂交瘤细胞转移到12孔细胞板中进行扩大培养，而后使用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行至少3次亚克隆纯化，直到最后一次亚克隆的细胞所检测均为阳性。将最终纯化的阳性杂交瘤细胞扩大培养并及时冻存。并同时扩大培养纯化的阳性杂交瘤细胞，收集细胞分泌的单克隆抗体上清。最终获得一株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV15-VP2-2D6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.10206。并将其分泌的单克隆抗体命名为BTV15-VP2-2D6。

4.小鼠腹水的制备

在对小鼠注射阳性杂交瘤细胞前一周，将液体石蜡油注射入12周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔中，500μL/只，共3只。一周后，以DMEM基础培养液重悬阳性杂交瘤细胞(细胞密度为1-2×10⁶个/mL)，腹腔注射小鼠，1ml/只。随后几天密切观察小鼠状况，约4天后待小鼠腹部胀大到一定程度即开始收集腹水。收集的腹水离心分装后置于-20℃保存。

实施例3单克隆抗体特性的鉴定

1.单克隆抗体亚类的鉴定

按照SBAClonotyping^TMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

其鉴定结果表明本发明的单克隆抗体BTV15-VP2-2D6为IgG₁型。

2.间接免疫荧光试验(IFA)

(1)将生长状态良好的BHK细胞铺板于96孔细胞板，待细胞生长至板底面积的80-90％时以DMEM基础培养基分别接种BTV1～24型病毒；同时在同等条件下不接种病毒的BHK细胞作为阴性对照。

(2)大约24～36后细胞尚未发生明显病变时，弃掉培养液，以100μL/孔的量加入-20℃预冷的75％的酒精，4℃固定30min。

(3)弃掉酒精，以PBST摇晃清洗3次，3min/次。

(4)将收集的单克隆抗体上清以100μL/孔的量加入上述细胞培养板中。同时以未感染BTV15的BHK细胞作为阴性对照，以500倍稀释的小鼠阳性血清与感染BTV15的BHK细胞反应作为阳性对照。

(5)将细胞板置于37℃恒温培养箱中孵育1h，弃掉上清后用PBST清洗3次，3min/次。

(6)将200×稀释的FITC标记的山羊抗小鼠二抗加入到每孔中，100μL/孔。

(7)操作如(5)，最后使用倒置荧光显微镜观察反应结果并拍照记录。

IFA结果显示该单克隆抗体上清与感染BTV15的BHK细胞呈阳性反应，而与相应阴性对照不发生反应(图3)。

实施例4VP2蛋白B细胞表位的鉴定

1.VP2蛋白10条截短蛋白的表达

(1)引物设计：根据已知的BTV15型L2基因序列(GenBank登录号：CAE51102.1)设计10条PCR扩增引物，并在上、下游引物的5＇端各自引入酶切位点BamHI和PstI，相应每段蛋白氨基酸残基约为120个aa，相邻蛋白氨基酸残基之间残基重叠30个aa。

(2)PCR扩增得到10条DNA片段，使用限制性内切酶BamHI和PstI对扩增后的10条DNA片段以及原核表达载体pMAL-C4X进行双酶切后分别进行PCR纯化和胶回收。

(3)将胶回收后的pMAL-C4X与纯化后的10条DNA片段进行连接，25℃连接10min。

(4)将连接产物转化E.coliDH5α。次日随机挑取单个菌落，摇菌提质粒后进行双酶切及PCR、测序鉴定，将鉴定正确的10个重组质粒命名为B15-pC4X-VP2-1～B15-pC4X-VP2-10。将重组质粒B15-pC4X-VP2-1～B15-pC4X-VP2-10转化E.coliBL21(DE3)，37℃过夜培养后，随机挑取单个菌落，分别接种于5mLLB液体培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃摇菌8～12h。

(5)将菌液以1:100的接种量进行重组蛋白的诱导表达。将菌液置于37℃摇床培养，大约3h后测其OD_600nm约为0.5后，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导6h。12000g离心5min收集菌体，超声裂解菌体并收集上清，之后进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示在约52Kd处出现1条较粗的条带，与融合蛋白分子质量大小相符合(图4)。

2.VP2蛋白B细胞表位的初步鉴定

将上述表达成功的10条蛋白，以大约100ng/孔的量包被ELISA板，以单克隆抗体上清为一抗进行间接ELISA试验，初步筛选次单克隆抗体所识别的抗原表位。

将BTV15感染的BHK细胞、BHK细胞、原核表达重组VP2蛋白、空载体pMAL-C4X表达蛋白及间接ELISA鉴定反应后的蛋白上样，进行SDS-PAGE鉴定，之后转印到NC膜上进行WesternBlot试验，利用单克隆抗体上清作为一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，DAB显色。

间接ELISA及WesternBlot结果显示BTV15-VP2-2D6与B15-pC4X-VP2-1反应，即BTV15-VP2-2D6所识别的抗原表位初步定位于VP2的前120个氨基酸残基中。

3.B细胞表位的精确鉴定

将单克隆抗体BTV15-VP2-2D6所识别的抗原表位所在区域B15-pC4X-VP2-1进一步截短表达，将B15-pC4X-VP2-1所包含的120个aa截短表达为14个短肽，每相邻短肽之间相互重叠8个aa。命名为B15-pC4X-VP2-1-j-1～B15-pC4X-VP2-1-j-14。

表达该14条短肽，以大约100ng/孔的量包被ELISA板，以单克隆抗体上期为一抗进行间接ELISA试验，进一步筛选次单克隆抗体所识别的抗原表位。

将BTV15感染的BHK细胞、BHK细胞、原核表达重组VP2蛋白、空载体pMAL-C4X表达蛋白及间接ELISA鉴定反应后的蛋白上样，进行SDS-PAGE鉴定(图5)，之后转印到NC膜上进行WesternBlot试验，利用单克隆抗体上清作为一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，DAB显色。

间接ELISA及WesternBlot结果显示BTV15-VP2-2D6与B15-pC4X-VP2-1-j-2反应(图6)，即BTV15-VP2-2D6所识别的抗原表位定位于VP2的第9到24位氨基酸残基中。对应的VP2蛋白氨基酸序列为⁹IERNSTIAPAIIKRYP²⁴(SEQIDNO.1所示)。

4.B细胞表位特异性鉴定

查找NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中记录的24个血清型的蓝舌病病毒VP2蛋白序列(BTV1:CAE51077.1；BTV2：:AEO19771.2；BTV3:AGJ83432.1；BTV4:AGJ83442.1；BTV5:CAE51092.1；BTV6:CAE51093.1；BTV7:CAE51094.1；BTV8:AGJ83482.1；BTV9:AGJ83492.1；BTV10:AGJ83502.1；BTV11:AGJ83512.1；BTV12:CAE51099.1；BTV13:AAA42838.1；BTV14:CAE51101.1；BTV15:CAE51102.1；BTV16:CAE51103.1；BTV17:AAB30550.1；BTV18:ADT78574.1；BTV19:CAE51106.1；BTV20:CAE51107.1；BTV21:AEZ52427.1；BTV22:ADT78575.1；BTV23:CAE51110.1；BTV24:ADT78579.1；BTV25:ACJ06702.1；BTV26:AED99447.1；EHDV:AEY69029.1；AHSV:AAC40994.1；BAA93692.1；Chuzan:BAA34933.1，通过生物信息学软件MegAlign对24个血清型的蓝舌病病毒VP2蛋白序列进行序列比对。分析BTV15-VP2-2D6所识别的抗原表位⁹IERNSTIAPAIIKRYP²⁴在24个血清型蓝舌病病毒VP2蛋白的同源性，结果显示24个血清型蓝舌病病毒VP2蛋白的相似度很低，即每个血清型VP2蛋白的保守性都非常低，比较第9位到第24位氨基酸残基，可以看出在每一位氨基酸残基中，BTV15型之外的其余23个血清型以及同种属其他几个病毒都有不同的氨基酸残基进行替代(图7)。这表明在不同血清型蓝舌病病毒的VP2蛋白之中，BTV15-VP2-2D6所识别的抗原表位⁹IERNSTIAPAIIKRYP²⁴只是特异性地针对BTV15，而与其他血清型的蓝舌病病毒VP2蛋白并不能发生反应。

Claims (6)

1.一株分泌抗蓝舌病病毒15型(Bluetonguevirus-15subtype,BTV-15)VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号为：CGMCCNo.10206。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗蓝舌病病毒15型VP2蛋白的单克隆抗体。

3.蓝舌病病毒15型VP2蛋白线性B细胞表位，其特征在于所述表位由权利要求2所述的单克隆抗体识别，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备鉴别、诊断、预防或治疗特异性血清型BTV-15型感染的试剂与药物中的应用。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在在制备鉴别、诊断、预防或治疗特异性血清型BTV-15型感染的试剂与药物中的应用。

6.权利要求3所述的蓝舌病病毒15型VP2蛋白线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗特异性血清型BTV-15型感染的试剂与药物中的应用。