CN116334006A - 一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。本发明的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.23875的杂交瘤细胞株分泌得到。该杂交瘤细胞株具有稳定的分泌IgG1抗体能力，所产生的单克隆抗体效价高且亚类单一，能特异性识别ADV VP2蛋白492FPHEV496的抗原表位，该抗原表位与国内外已发表的24株ADV同源性达到100％。能与ADV毒株或蛋白发生特异性反应，可用作水貂阿留申病的诊断试剂，具有实际应用价值，为水貂阿留申病的临床鉴别诊断和实验室研究提供了物质基础及技术支撑。

Description

一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞 株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
水貂阿留申病(Aleutian mink disease，AD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutianmink disease virus，ADV)引起的慢性消耗性传染病，又被称为浆细胞增多症，主要侵害水貂免疫细胞，以浆细胞弥漫性增多、繁殖能力下降、持续性病毒感染和免疫系统紊乱为特征，主要导致感染水貂生殖能力、免疫水平、毛皮发育等严重下降，是危害水貂养殖业的三大病毒病之一。
ADV属于细小病毒科、阿留申细小病毒属，是能自我复制的单股线性负链DNA病毒，病毒粒子无囊膜，无糖类，无脂质，直径为22～25nm，呈二十面体对称，每个病毒粒子包含60个衣壳粒，每个衣壳外径为128A。
结构蛋白VP2是ADV的主要免疫原性抗原蛋白，能体外中和病毒，是抗原决定簇的载体，与病毒的致病性和宿主选择等密切相关，VP2基因是研究ADV病毒粒子蛋白的结构功能、ADV复杂的致病机理和建立ADV检测技术的首选基因。VP2蛋白是检测ADV特异性抗体的理想靶标抗原。
水貂阿留申病潜伏期长，公貂的发病率高于母貂，成年貂的感染率高于仔貂，秋冬两季的发病率与病死率高于春夏两季。主要传染源是病貂和潜伏期的带毒貂，病毒在貂群中的主要传播途径是水平传播和垂直传播。水平传播主要是带毒水貂的尿液、排泄物和唾液污染貂场环境，健康水貂对其接触而感染，垂直传播主要是带毒母貂胎盘垂直感染及产后哺乳使仔貂感染病毒，病毒能够在母貂胎盘中复制，母貂体内的抗体无法阻断垂直传播途径。
水貂阿留申病作为典型的免疫复合物疾病，主要侵蚀网状内皮系统，引发机体体液免疫，使浆细胞呈弥漫性增生，出现高γ球蛋白血症，但产生的抗体非但不能中和病毒，反而会和病毒结合形成免疫复合物，帮助病毒侵入细胞，引发Fc受体介导的抗体依赖性增强作用，这是水貂阿留申病病毒感染水貂的免疫系统功能的紊乱以及其接种疫苗治疗会失败的原因之一。
由于水貂阿留申病对仔貂和成年貂的感染方式的不同，因此显现出不同的临床症状。仔貂感染水貂阿留申病后，病情发展迅速，表现为现呼吸窘迫、咳嗽、发热等急性间质性肺炎的症状，病死率高。成年水貂感染水貂阿留申病后，主要表现为为缓慢发展的进行性疾病症状，具体表现为嗜睡，食欲不振，进行性身体消瘦，饮欲明显增强，冬季更为明显出现啃冰块的表现，被毛蓬乱，无光泽，严重贫血，排黑色煤焦油样的稀便，口腔溃疡、舌根出血，易怒，发病后期出现明显的神经症状，共济失调、后肢麻痹，多以其他疾病继发感染和尿毒症死亡为主。母貂流产或产木乃伊胎，公貂睾丸发育不良，生殖能力的损伤等症状。
由于水貂阿留申病病毒特殊的致病机理，截止目前，该病尚无有效的疫苗和特效治疗方法，世界各地水貂养殖地区均采用种源净化、阳性淘汰的方法控制该病。我国各省份ADV流行毒株的同源性存在一定差异，目前缺乏针对不同ADV流行毒株的通用检测技术。
单克隆抗体的制备为水貂阿留申病免疫学诊断奠定了基础，使ELISA、胶体金试纸条等以单抗为基础的检测方法进一步发展丰富。利用单克隆抗体，ADV检测技术将向更加快速、简便、灵敏、特异性、高通量和自动化方向发展。
抗原表位是免疫反应的物质基础，决定了单克隆抗体的特异性和检测方法的适用范围。但目前对ADV单克隆抗体抗原表位的研究较少，2016年，Yi等制备了抗ADV VP2蛋白291～502肽段的特异性单克隆抗体1M13，通过对一系列部分重叠的合成肽进行ELISA分析，确定了386HLQQNFSTRYIYD398是单抗1M13能识别的最小线性B细胞表位(Yi et al.，2016)；2018年，Lu等制备了抗ADV VP2蛋白200～588肽段的特异性单克隆抗体1G5并证实其识别的最小线性B细胞表位位于459EEEGWPAASGTHFED473氨基酸残基上(Lu et al.，2018)。但这两种抗原表位在ADV国内外的大多数毒株中并不保守，在近年来我国所分离的ADV毒株中同源性无法达到100％，仍无法较好的解决我国ADV的检测问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种稳定分泌抗水貂阿留申病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体所识别的抗原表位具有高度保守性，与国内外具有代表性的ADV毒株同源性达到100％，氨基酸序列在病毒流行的过程中并未发生基因变异，能更多的识别国内外ADV毒株，在开发新的ADV诊断工具方面具有潜在的应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.23875。
本发明的杂交瘤细胞株能够稳定的分泌针对ADV VP2蛋白的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7，其胞核染色体数为102。该杂交瘤细胞株已于2021年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名为抗ADV单克隆细胞株，保藏编号为CGMCC No.23875，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述杂交瘤细胞株在制备识别水貂阿留申病病毒VP2蛋白的单克隆抗体中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供一种单克隆抗体，由上述保藏编号为CGMCC No.23875的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的保藏编号为CGMCC No.23875的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体具有如下特点：
(1)所述单克隆抗体的抗体亚类为IgG1。
(2)所述单克隆抗体能特异的识别水貂阿留申病病毒，不识别水貂肠炎细小病毒与水貂犬瘟热病毒，具有良好的特异性及反应活性。
(3)所述单克隆抗体可与ADVVP2原核表达蛋白及天然病毒蛋白发生特异性反应。
(4)所述单克隆抗体的腹水抗体效价达到1:1.6×106，效价高。
(5)所述单克隆抗体特异性识别的最短线性表位为ADV VP2蛋白的492FPHEV496；该抗原表位的位置限定是基于水貂阿留申病病毒标准毒株(ADV-G)VP2基因位置，Genbank：M20036。该抗原表位分布于蛋白的表面，利于与抗体直接接触，从而更容易让机体产生免疫应答反应；而且，该抗原表位在ADV毒株中具有高度保守性，与国内外报道的24株代表性的ADV毒株同源性达到100％，是检测ADV毒株传播的良好靶标，有助于提高ADV检测技术的特异性与普遍性，加快ADV的净化。
本发明的第三方面，提供上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备检测水貂阿留申病病毒的产品中的应用。
上述应用中，作为优选，所述产品可以为ELISA试剂盒、胶体金试纸条、间接免疫荧光分析(IFA)试剂盒或其它免疫发热发光检测试剂盒。
本发明的第四方面，提供上述单克隆抗体在制备预防或治疗水貂阿留申病的药物中的应用。
本发明的第五方面，提供一种检测水貂阿留申病病毒的试剂盒，其含有有效量的上述单克隆抗体。
本发明的有益效果：
(1)本发明根据NCBI中已发表的ADV-G毒株基因序列(GenBank：M20036)，截取VP2基因中具有更广泛代表性(同源性较高)、抗原指数较高、表达184个氨基酸的区域作为免疫原，经细胞融合、多次筛选和克隆得到一株杂交瘤细胞。本发明的杂交瘤细胞株的染色体数目为102，符合杂交瘤细胞染色体数目；本发明的杂交瘤细胞株在相同条件下连续传代10代，能够稳定分泌抗体；经冻存与复苏后，抗体分泌能力在至少12个月内无任何下降，具有良好的稳定性。
(2)本发明的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，能特异的识别水貂阿留申病病毒，具有良好的特异性及反应活性；腹水抗体效价高；所能识别的最短线性表位为ADV VP2蛋白的492FPHEV496，该抗原表位与国内外已发表的24株ADV毒株同源性达100％，是检测ADV毒株传播的良好靶标，有助于提高ADV检测技术的特异性与普遍性，加快ADV的净化。
附图说明
图1：重组表达质粒图谱；其中，A图为重组质粒pET-32a-ADV图谱，B图为重组质粒pGEX-6P-1-ADV图谱。
图2：重组表达质粒单、双酶切鉴定结果；图A中，泳道1为用BamHI和NotI对pET-32a-ADV重组质粒进行双酶切鉴定结果；泳道2为pET-32a-ADV重组质粒的BamHI单酶切鉴定结果；图B中，泳道1为用BamHI和NotI对pGEX-6P-1-ADV重组质粒进行双酶切鉴定结果；2，pGEX-6P-1-ADV重组质粒的BamHI单酶切鉴定结果。
图3：His-ADV VP2重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定；图A：1，空载体在大肠杆菌中表达的蛋白；2，未经IPTG诱导的重组质粒在大肠杆菌中的表达产物；3，经IPTG诱导的重组质粒在大肠杆菌中的表达产物；4，经纯化的His-ADV VP2重组蛋白；图B：1，一抗为抗His标签单抗的Western blot鉴定结果。
图4：GST-ADV VP2重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定；图A：1，空载体在大肠杆菌中表达的蛋白；2，未经IPTG诱导的重组质粒在大肠杆菌中的表达产物；3，经IPTG诱导的重组质粒在大肠杆菌中的表达产物；4，经纯化的GST-ADV VP2重组蛋白；图B：1，一抗为抗GST标签单抗的Western blot鉴定结果。
图5：杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7染色体数目。
图6：腹水抗体的制备。
图7：单克隆抗体ADV-GZ2104-H7的亚类鉴定结果。
图8：IFA鉴定单克隆抗体特异性；其中，A图为ADV-SD毒株，B图为ADV-SD1908毒株，C图为分离自山东诸城某水貂养殖场的ADV毒株，D图为分离自山东海阳某水貂养殖场的ADV毒株，E图为分离自山东日照某水貂养殖场的ADV毒株，F图为阳性对照(His-ADV VP2重组蛋白免疫的BALB/c小鼠阳性血清作为一抗识别ADV-SD毒株感染的CRFK细胞)，G图为MEV毒株，H图为CDV毒株，I图为阴性对照。
图9：Western blot鉴定单克隆抗体，其中，A图为单抗与原核表达蛋白His-ADVVP2抗原反应性鉴定(泳道1为His-ADV VP2重组蛋白，泳道2为His标签蛋白)；B图为单抗与原核表达蛋白GST-ADV VP2抗原反应性鉴定(泳道1为GST-ADV VP2重组蛋白，泳道2为GST标签蛋白)；C图为单抗与CRFK细胞内全病毒蛋白抗原反应性鉴定(泳道1为接毒细胞全蛋白，泳道2为未接毒细胞全蛋白)；D图为单抗与水貂病料全病毒蛋白抗原反应性鉴定(泳道1为山东日照阳性水貂病料，泳道2为山东文登阳性水貂病料，泳道3为山东诸城阳性水貂病料，泳道4为山东海阳阳性水貂病料，泳道5为阴性水貂病料)。
图10：腹水抗体的效价鉴定。
图11：抗体分泌稳定性的鉴定；其中，A图为连续传10代的杂交瘤细胞抗体分泌稳定性；B图为定期复苏的杂交瘤细胞抗体分泌稳定性。
图12：单抗识别抗原表位的鉴定；其中A图为ADV VP2蛋白分段表达设计；B图为表达抗原与单抗的免疫印记分析结果。
图13：ELISA精确鉴定抗原表位。
图14：抗原表位二级结构的预测；图A为DNAstar软件分析二级结构；图B为SOPMA软件分析二级结构。
图15：抗原表位的三维空间构象分析；图A为抗原表位的棒状三维空间结构；图B为抗原表位的球状三维空间结构。
图16：抗原表位保守性分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，水貂阿留申病作为典型的免疫复合物疾病，病毒侵染宿主后持续性感染，缓慢复制，能够引起显著的抗体依赖性增强作用，导致难以研制特效疫苗与药物，只能通过检疫淘汰策略防控该病。由于我国各省份ADV流行毒株的同源性存在一定差异，目前缺乏针对不同ADV流行毒株的通用检测技术。
单克隆抗体的制备为水貂阿留申病免疫学诊断奠定了基础，抗原表位是免疫反应的物质基础，决定了单克隆抗体的特异性和检测方法的适用范围。但目前对ADV单克隆抗体抗原表位的研究较少，且现有报道的ADV单克隆抗体所识别的抗原表位在ADV国内外的大多数毒株中并不保守，在近年来我国所分离的ADV毒株中同源性无法达到100％，仍无法较好的解决我国ADV的检测问题。
有鉴于此，本发明对能够普遍识别不同ADV毒株的单克隆抗体进行了深入研究，单克隆抗体所识别的抗原表位首先是由制备杂交瘤时所使用的免疫原氨基酸序列决定，但并非所有氨基酸均可形成抗原表位，只有那些被抗原递呈细胞识别抗原指数较高和组织相容性抗原复合物MHC1差异较大的结构区可能成为抗原表位，在所使用的免疫原中符合这些特性的结构片段都有一定百分率成为抗原表位，由于融合、筛选时的随机性无法确切说先前决定的还是随机的。在实际研究中，需要把所要筛选的抗原表位优化缩短作为免疫原，减少后续随机性发生是制备特定识别抗原表位单克隆细胞的一种科学化策略。本研究是根据NCBI中已发表的ADV-G毒株基因序列(GenBank：M20036)，截取VP2基因的具有更广泛代表性(同源性较高)、抗原指数较高区域，表达184个氨基酸作为免疫原，免疫原与弗氏佐剂联合接种BALB/c小鼠，间隔15天，共免疫4次，取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)融合，使用HAT/HT培养基筛选杂交瘤细胞，结合ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选分泌识别ADV抗体的杂交瘤细胞。利用有限稀释法对杂交瘤细胞进行多次克隆、纯化筛选，最终获得一株稳定分泌针对ADV VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其识别的抗原表位在国内外分离发表的ADV毒株中高度保守，与选取的代表性24株ADV毒株同源性达到100％，说明本发明的单克隆抗体对这些毒株均具有识别结合能力，用此抗体建立的检测方法所检测ADV毒株范围可能包含目前所知所有毒株，其应用价值优势明显。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：杂交瘤细胞株的制备
1、免疫用蛋白的制备：
根据NCBI中已发表的ADV-G毒株基因序列(GenBank：M20036)，截取VP2基因的高免疫活性区域376～559aa作为免疫原，设计引物进行PCR扩增，得到扩增产物。
将扩增产物、pET-32a空载体质粒、pGEX-6P-1空载体质粒分别用BamHI和NotI进行双酶切，并对酶切产物进行胶回收，连接转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃恒温培养8～10h。随机挑取单个菌落，振荡培养并提取质粒，将双酶切鉴定为阳性的质粒送交北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定，结果如图1、2所示，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pET-32a-ADV与pGEX-6P-1-ADV。
将含有pET-32a-ADV重组质粒的菌液震荡培养至OD600约为0.6～0.8，使大肠杆菌处于对数生长期，加IPTG至终浓度为1mM，震荡培养4h，收集菌液沉淀并用PBS重悬，超声破碎至重悬菌液透亮而不粘稠，弃去上清，收集包涵体蛋白。经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳，结果如图3的A所示。为鉴定制备出的His-ADV VP2蛋白，用抗His标签蛋白的抗体介导的Western blot对其进行了鉴定分析，结果如图3的B所示，在50kDa的位置上存在着一条清晰的免疫反应带，说明成功制备出用于免疫小鼠的His-ADV VP2蛋白。
将含有pGEX-6P-1-ADV重组质粒的菌液扩大培养并在16℃条件下低温诱导16h，离心并收集菌液沉淀，GST标签能够使目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，并且容易保持目的蛋白完整活性，因此弃去沉淀，超声后离心取上清，经GST-tag Purification Resin亲和层析介质纯化后进行SDS-PAGE电泳，结果如图4的A所示，为鉴定制备出的GST-ADV VP2蛋白，用抗GST标签蛋白的抗体介导的Western blot对其进行了鉴定分析，结果如图4的B所示，在48kDa的位置上存在着一条清晰的免疫反应带，说明成功制备出用于筛选阳性杂交瘤细胞株的GST-ADV VP2蛋白。
2、动物免疫：
将纯化的His-ADV VP2重组蛋白颈背部皮下多点注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，免疫四次，每次间隔两周，首次免疫将重组蛋白与完全弗氏佐剂等体积混合乳化，二免和三免以等体积的不完全弗氏佐剂乳化。三免7d后对小鼠颌下静脉采血，分离血清，利用GST-ADV VP2重组蛋白包被的ELISA板检测小鼠血清抗体效价。对抗体效价达到1:105的小鼠，用ADV VP2蛋白(不加佐剂)(100μg/只)进行四免加强免疫，3d后取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0(骨髓瘤细胞)进行细胞融合。
3、饲养层细胞的制备：
进行细胞融合前1d，取小鼠腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞。取未免疫的BALB/c小鼠，处死后将其浸泡于75％酒精中消毒。将小鼠转移至超净台中，四肢展开后固定，用无菌剪刀和镊子，剪开腹部皮肤，充分暴露腹膜。用无菌注射器向腹腔注入培养基，反复按压其腹部1min，使巨噬细胞充分游离，随后吸出含有腹腔巨噬细胞的培养液；细胞计数后保持细胞浓度在1×105个/mL左右，将上述细胞悬液加到96孔板中，观察是否污染，无污染即可用于融合实验。
4、骨髓瘤细胞的准备：
细胞融合前一周复苏并培养SP2/0细胞，调节其细胞状态，待细胞处于对数生长期，细胞密度较高，细胞圆润、透亮，进行细胞融合。用DMEM基础培养基将SP2/0细胞从瓶壁轻轻吹下，移入无菌离心管内，1,000rpm离心8min，弃上清，用DMEM基础培养基再次洗涤细胞，最后用10mL DMEM基础培养基重悬细胞，用台盼蓝染液对细胞进行计数，待用。
5、脾细胞的制备：
取加强免疫的BALB/c小鼠，眼球摘除放血并分离血清，断颈致死小鼠，75％的酒精中浸泡10min，在超净台中打开小鼠腹腔，无菌状态下摘取小鼠脾脏，除去被膜结缔组织，在70μm细胞过滤网上研磨脾脏，制成单细胞悬液，1,000rpm离心10min，弃上清，用10mL DMEM基础培养基重悬沉淀，混匀，用台盼蓝染液对细胞进行计数，待用。
6、细胞融合：
按照脾细胞：SP2/0细胞＝5:1的比例，取适量的SP2/0细胞与脾细胞充分混匀于灭菌的50mL离心管中，离心，弃上清，轻轻拍打管底使细胞沉淀松散均匀，37℃条件下在1min内匀速缓慢的滴入1mL的50％ PEG并静置1min，然后匀速缓慢加入DMEM基础培养基终止融合，离心弃上清，缓缓加入HAT完全培养基，轻轻吹散沉淀并混匀，将混合细胞悬液滴加入上述制备的铺有饲养层细胞的五块96孔培养板中。37℃,5％ CO2培养箱中培养，观察培养板内细胞的生长状态，保存细胞上清，用于杂交瘤细胞筛选。
7、阳性杂交瘤细胞的筛选、鉴定与克隆化培养：
利用间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，用His-ADV VP2蛋白、GST-ADVVP2蛋白、纯化的pET-32a空载体蛋白(His标签蛋白)三种蛋白包被ELISA板，取细胞上清为一抗，BALB/c鼠阳性血清为阳性对照，SP2/0细胞上清为阴性对照，选择与His-ADV VP2和GST-ADV VP2反应呈阳性而同时与His标签蛋白反应阴性的判定为阳性克隆孔。
对间接ELISA法筛选到的阳性杂交瘤细胞孔通过IFA法再次筛选，保证抗体的特异性。对ELISA、IFA检测呈阳性的杂交瘤细胞，采用有限稀释法进行亚克隆筛选，至少亚克隆3次，具体操作为：对阳性孔的杂交瘤细胞进行细胞计数，用HT培养基稀释细胞并加入铺有饲养层细胞的96孔细胞板内，保证每个孔仅有一个杂交瘤细胞。经多次亚克隆、筛选，最终得到一株能稳定分泌抗ADV单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为ADV-GZ2104-H7。
使用秋水仙素法检测杂交瘤细胞染色体数目，杂交瘤细胞染色体分析是是否获得真正杂交瘤细胞的客观标准之一，每个完整的杂交瘤细胞染色体数目应为小鼠脾细胞与SP2/0细胞的染色体数目之和。秋水仙素可以破坏细胞的纺锤丝，获得中期分裂相细胞，随后用氯化钾溶液(0.075mol/L)低渗处理细胞，使整个细胞体积增大膨胀，细胞内染色体呈松散状态。低渗处理后的细胞经甲醇-冰醋酸溶液固定后，使用10％吉姆萨染液染色，显微镜(1000倍油镜)观察，选择染色体无重叠、分散好、无失散的细胞进行计数。结果如图5所示，杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7染色体数为102。
杂交瘤细胞ADV-GZ2104-H7于2021年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23875，分类命名为抗ADV单克隆细胞株。
实施例2：利用杂交瘤细胞制备腹水抗体
(1)选取状态良好的雌性BALB/c鼠(12周龄)，将实施例1制备的杂交瘤细胞株吹打成单细胞悬液，按1×106个/只剂量腹腔注射杂交瘤细胞悬液，接种细胞10d左右，如图6所示，小鼠腹部明显膨大，缓缓抽取腹水。
(2)离心收集的腹水，4℃，12,000rpm离心10min，除去上层的油脂及底部细胞成分和其他沉淀物，收集上清，用0.45μm的滤器过滤，获纯化的腹水抗体，即为单克隆抗体ADV-GZ2104-H7。
实施例3：单克隆抗体的生物特性鉴定
(1)单克隆抗体的亚类鉴定
按照Sino BiologicalIsotyping Kit for Mouse Monoclonal Antibody抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。结果如图7所示，本发明所制备的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7的抗体亚类为IgG1。
(2)单克隆抗体的识别病毒特性鉴定
采用间接免疫荧光(IFA)检测实施例2制备的腹水抗体的特异性，步骤如下：
将处于对数生长期的CRFK细胞铺入24孔细胞培养板，待细胞长成单层时接种本实验室分离保存的5株ADV毒株与1株水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus，MEV)毒株；将处于对数生长期的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)铺入24孔细胞培养板，待细胞长成单层时接种水貂犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)毒株。同时以未接毒的CRFK细胞作为阴性对照。
待接毒细胞出现细胞病变(CPE)时，弃去细胞培养液；用PBS洗涤3次，每次5min；用4％多聚甲醛4℃固定20min，用PBS洗涤3次，每次5min；加入1:1000倍稀释的腹水抗体，37℃孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；加入1:100倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG荧光二抗，37℃孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；最后在避光环境下，通过倒置荧光显微镜观察细胞膜及细胞质出现绿色荧光者为阳性。
结果如图8所示，实施例2制备的腹水抗体与5株分离的ADV毒株均能发生特异性反应，与阳性对照结果相同，阳性细胞膜及细胞质出现绿色荧光，与MEV感染的CRFK细胞、CDV感染的Vero细胞和未接毒的CRFK细胞反应阴性，无荧光。证明本发明所制备的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7能够特异的识别能特异的识别水貂阿留申病病毒，不识别水貂肠炎细小病毒与水貂犬瘟热病毒，具有良好的特异性及优异的临床适用性。
(3)单克隆抗体的识别病毒蛋白特性鉴定
通过免疫印迹试验(western blot)鉴定单克隆抗体对ADV VP2体外表达蛋白的反应性：
将原核表达的ADV VP2重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印至PVDF膜上；用5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:1000倍稀释的腹水抗体，室温震荡孵育2h，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:8000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，室温震荡孵育1h，用TBST洗涤4次，每次8min，用超敏ECL化学发光试剂盒显色，于蛋白显影仪曝光显示蛋白条带。结果如图9的A所示，本发明所制备的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7能够与原核表达的His-ADV VP2蛋白发生特异性反应，条带与预期结果相符，为50kDa；结果如图9的B所示，单抗ADV-GZ2104-H7能够与原核表达的GST-ADV VP2蛋白发生特异性反应，条带与预期结果相符，为48kDa。
单克隆抗体与CRFK细胞内全病毒VP2蛋白抗原反应western blot鉴定：
将猫肾细胞(CRFK)铺入6孔细胞培养板，待细胞长成单层时接种ADV毒株，同时以未接毒的CRFK细胞作为阴性对照。待接毒细胞出现细胞病变(CPE)时收样，用RIPA裂解液处理接种ADV病毒的CRFK细胞沉淀和未接毒的CRFK细胞沉淀后进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印至PVDF膜上；用5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:1000倍稀释的腹水抗体，室温震荡孵育2h，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:8000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，室温震荡孵育1h，用TBST洗涤4次，每次8min，用超敏ECL化学发光试剂盒显色，于蛋白显影仪曝光显示蛋白条带。结果如图9的C所示，本发明所制备的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7能够与ADV病毒蛋白发生特异性反应，条带大小约为35kDa，而与阴性对照细胞不发生反应。
单克隆抗体与阳性ADV水貂病料全病毒蛋白抗原反应性鉴定：
取采集并鉴定的来自山东日照、山东文登、山东诸城、山东海阳的四份水貂阿留申病病毒阳性水貂病料及一份水貂阿留申病病毒阴性水貂病料，用RIPA裂解液处理分别五份病料的肝脏，提取水貂病料全蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印至PVDF膜上；用5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:1000倍稀释的腹水抗体，室温震荡孵育2h，用TBST洗涤4次，每次8min；加入1:8000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，室温震荡孵育1h，用TBST洗涤4次，每次8min，用超敏ECL化学发光试剂盒显色，于蛋白显影仪曝光显示蛋白条带。结果如图9的D所示，本发明所制备的单克隆抗体ADV-GZ2104-H7能够与泳道1、2、3、4的ADV阳性水貂肝脏中提取的天然病毒抗原发生特异性结合，条带大小约为35kDa，与阴性水貂病料提取的蛋白不发生反应，证明制备的单克隆抗体活性良好，适合于ADV毒株临床检测上的应用。
(4)单克隆抗体的效价
采用间接ELISA方法检测实施例2制备的腹水抗体的效价，步骤如下：
以纯化的GST-ADV VP2蛋白为抗原包被在96孔酶标板，加入按比例稀释腹水抗体为一抗，SP2/0细胞制备的阴性腹水为对照，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，在完全避光的条件下，加入TMB单组份底物显色液和终止液终止显色后，OD450nm读数，判定腹水抗体效价。结果如图10所示，实施例4制备的腹水抗体效价为1:1638400(约为1:1.6×106)。
(5)抗体分泌稳定性的测定
将实施例1制备的杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7在相同条件下连续传10代，用GST-ADV VP2重组蛋白包被的间接ELISA法检测细胞上清，鉴定抗体分泌稳定性。
结果如图11的A所示，杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7在相同条件下连续传10代，杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体。
将实施例1制备的杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7冻存，并分别在第1、3、6、9、12月将其复苏，复苏后至少传代3次以上，镜下观察细胞生长状态，并用间接ELISA法测定细胞上清的抗体效价。
结果如图11的B所示，杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7经冻存复苏后，抗体分泌能力在至少12个月内无任何下降，具有良好的稳定性。
(6)单抗识别抗原表位鉴定
为了定位单克隆抗体ADV-GZ2104-H7识别的抗原表位，设计一系列重叠的截断片段，共18段(图12A)。通过BamHⅠ和HindⅢ连接到pET-32a表达载体上。进行原核表达蛋白并纯化，采用Westernblot与间接ELISA法进行鉴定，初步确定单克隆抗体识别的抗原表位。
结果如图12B所示，18段截短蛋白均能与His标签抗体的一抗反应，说明18段截短蛋白均正确表达。单抗与第一次分段的ADV 1-1至ADV 1-6这6段蛋白反应，每段之间互相重叠10个氨基酸，结果表明单抗仅与ADV 1-4反应；再进行第二次截短，将ADV 1-4截短为ADV2-1至ADV 2-6这6段蛋白，每段之间互相重叠6个氨基酸，结果表明单抗与ADV 2-5和ADV 2-6同时反应，表明单抗识别的抗原表位位于ADV2-5和ADV2-6蛋白的重叠部分；随即进行第三次小范围截短，将ADV 2-5和ADV 2-6蛋白的重叠部分截短为ADV 3-1至ADV 3-6，结果表明，单抗结合ADV 3-1(492FPHEV496)、ADV 3-3(491EFPHEV496)、ADV 3-4(491EFPHEVL497)、ADV 3-5(490LEFPHEVL497)、ADV 3-6(491EFPHEVLD498)，不结合ADV 3-2(491EFPHE495)，说明位于第496位的缬氨酸V是构成抗原表位的关键氨基酸，若缺失第496位的缬氨酸V，则破坏了抗原表位的结构，蛋白失去抗原性，无法与抗体发生反应；而位于第491位的谷氨酸E的有无，不影响蛋白的抗原性，说明第491位的谷氨酸E不是构成抗原表位的关键氨基酸。因此，通过三次截短，初步确定单克隆抗体ADV-GZ2104-H7识别的线性表位是492FPHEV496。
为了精确定位单克隆抗体识别的最短抗原表位，使用端部增减合成多肽法，从初步定位的氨基酸序列的N端和C端分别逐个减少和逐个增加氨基酸，合成5段多肽，使用间接ELISA法鉴定抗原表位，直至鉴定出最短抗原表位。
结果如图13所示，当第492位的苯丙氨酸F缺失时，表位的抗原性发生明显改变，当第496位的缬氨酸V缺失时，表位的抗原性也会发生明显改变，说明第492位的苯丙氨酸F与第496位的缬氨酸V是构成此线性表位的关键氨基酸；且ELISA结果显示，在492FPHEV496的基础上，多肽N端多添加一个谷氨酸E或者多肽C端多添加一个亮氨酸L，OD450nm的吸光度值并未发生明显改变。这些结果进一步证实：492FPHEV496是单克隆抗体ADV-GZ2104-H7识别的最短线性表位。
(7)单抗识别抗原表位的生物信息性分析
1)抗原表位的二级结构分析
抗原表位的分布与蛋白的二级结构有关，使用DNAstar软件与SOPMA软件共同分析抗原表位的二级结构，提高结果的可靠性。SOPMA、Gamier-Robson法和Chou-Fasman法分别根据氨基酸残基在特定结构的可能性和氨基酸的晶体结构来预测二级结构。
结果如图14所示，抗原表位492FPHEV496的二级结构由α-螺旋和无规则卷曲构成。α-螺旋围绕一个轴呈有规律的螺旋式上升，形态固定，十分稳定；无规则卷曲是凸出结构，多处于蛋白质的表面，结构松散，有利于与抗体嵌合，十分容易形成抗原表位。
2)抗原表位的三维空间构象分析
利用Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org/)在线网站构建抗原表位492FPHEV496的三维模型，利用SPDBV软件对三维模型进行可视化处理，分析其空间结构，结果如图15所示，从棒状模型可以看出，抗原表位492FPHEV496的五个氨基酸组成了一个环形的三维空间构象，球状模型显示表位的五个氨基酸分布于蛋白的表面，利于与抗体直接接触，从而更容易让机体产生免疫应答反应。
3)抗原表位的保守性分析
在GenBank中选取近50年国内外最具有代表性的24株ADV毒株，进行抗原表位的保守性分析，使用DNAstar软件的Megalign分析抗原表位492FPHEV496在ADV毒株中的保守性。
结果如图16所示，该抗原表位与目前国内外已发表的24株ADV同源性达到100％。表明本研究中的抗原表位492FPHEV496是检测ADV毒株传播的良好靶标，有助于提高ADV检测技术的特异性与普遍性，加快ADV的净化，为进一步防控该病奠定基础。
综上所述，本发明所公开的杂交瘤细胞株ADV-GZ2104-H7，其生物学性能十分优良，用其制备的单克隆抗体识别的抗原表位在ADV的VP2蛋白第492～496位氨基酸，其多肽序列为FPHEV，具有特异性强、亲和力高、识别能力强、稳定性好、效价高的特点。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.23875。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备识别水貂阿留申病病毒VP2蛋白的单克隆抗体中的应用。
3.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.23875的杂交瘤细胞株分泌产生。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗体亚类为IgG1。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别ADVVP2蛋白492FPHEV496的抗原表位。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测水貂阿留申病病毒的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为ELISA试剂盒、胶体金试纸条或者间接免疫荧光分析试剂盒。
8.权利要求3所述的单克隆抗体在制备预防或治疗水貂阿留申病的药物中的应用。
9.一种检测水貂阿留申病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有有效量的权利要求3所述的单克隆抗体。
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