CN115308411A - 肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，所述的通透性指标谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)，主要来自于发生铁死亡的肠上皮细胞所释放的；所述诊断试剂通过检测被试者的肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4，并与健康对照组的平均水平相比较，来判断被试者发生重症急性胰腺炎的风险。本发明还公开了用于诊断重症急性胰腺炎的试剂盒，预测SAP发病病程中具有良好的灵敏度，以及在诊断SAP和评价治疗情况有较好的表现。

Description

肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肠损伤的通透性指标在制备 重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用。

背景技术

急性胰腺炎(AP)是胰腺的炎性疾病。严重程度分为轻度(MAP)， 中度严重(MSAP)和严重(SAP)。在SAP患者中，器官功能障碍可发 生在疾病过程的早期阶段，伴有继发感染，死亡率为36％-50％。在重症急 性胰腺炎发展的晚期，由胰腺坏死组织和胰周积液引起的感染相关并发 症，若不及时诊治，死亡率很高。许多研究表明在急性胰腺炎发病过程中 常常伴随肠道菌群失调与代谢紊乱进而导致肠粘膜屏障功能障碍和肠源 性细菌移位，而肠道菌群移位被认为是胰腺坏死组织感染和胰周积液的主 要原因。肠道菌群在人体代谢活动中起着重要作用，近年来，SAP中肠道 菌群的代谢活动受到越来越多的关注。作为人体新发现的“器官”，肠道 菌群与人体健康的关系愈发受到重视。随着研究的深入，人们对肠道菌群 在SAP发生发展中的作用有了更清晰的认识。

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的治疗已从传统手术 治疗转变为以非手术为主的策略，此重大转变使其30％的病死率显著下降 到5％-10％。SAP最致命的特点：由腺泡细胞坏死释放出来的酶及酶原 是炎性细胞的超级激活物，会级联式激活炎症/免疫系统，当大量释放炎症 介质可发生全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)。而SIRS极易引发远处器官损伤，导致多脏器功能障 碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，强烈的SIRS反 应释放大量的促炎介质，使肺、肾、心血管、肝脏等器官发生功能障碍， 更进一步发展成多器官功能衰竭，构成SAP的第一个死亡高峰。持续的 SIRS合并胰腺坏死感染及肠道细菌移位是SAP后期的主要矛盾，形成 SAP的第二个死亡高峰。在SAP中，肠道作为一个应激的靶器官在疾病早期就己经被损伤，临床可表现为肠道动力障碍、肠管损伤和肠粘膜屏障 损伤，形成肠道屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance, IBFD)。而由此导致的肠屏障功能障碍(IBFD)是重症急性胰腺炎患者发生 细菌移位、内毒素血症和多器官功能障碍综合征(MODS)的始动因素,使 得肠道成为了其他受累器官“二次打击”的源头。据报道，肠道屏障损伤是 由早期局部和全身炎症反应引起的肠缺血引起的，它增加了肠道的通透性。肠粘膜屏障通透性增加导致肠道内的微生物和毒素通过受损的黏膜屏 障进入血液循环，胰腺组织坏死感染细菌75％来自肠道菌群，如大肠杆菌、 肠球菌等。肠道通透性增加和肠腔内细菌移位在MODS的发病机制中发 挥重要作用，同时也是SAP引起死亡的主要原因。因此寻求有效的治疗 措施,早期检测并保护肠屏障功能及抑制肠道菌群移位对SAP的防治和 治疗具有重要作用。研究发现SAP发生时，肠上皮细胞发生了铁死亡， 出现铁死亡的细胞释放大量炎症相关的损伤相关分子从而触发固有免疫 系统，免疫细胞通过识别不同模式细胞死亡的机制进一步激发炎症反应。 在细胞内，胱氨酸被谷胱甘肽(GSH)或硫氧还蛋白还原酶1还原为半胱 氨酸，在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的作用下进一步合 成GSH。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的主要底物。我们初步 实验也证实重症急性胰腺炎时，肠道上皮细胞发生了典型铁死亡，GPX4 表达显著增加。

传统的诊断方法主要是体格检查，血清脂肪酶，以及依靠影像学的特 征表现。但常常重症急性胰腺炎的发作是局部发展累及全身器官及系统， 以上的方式，不能准确的实时检测病情的发展情况，对重症急性胰腺炎的 特异性不高。根据SAP的发病特点，以及病程中病人肠道屏障的破坏， 我们采用一种全新的检测针对性的肠道通透性的指标，从而实现更准确的 的诊断以及预测SAP的发病情况，或者是作为辅助检查进一步提高SAP 诊断的诊断效率。

发明内容

针对现有技术对于SAP诊断的不足以及实际的需求，本发明提供了 一种肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，通过 检测该通透性的指标，在预测SAP发病病程中具有良好的灵敏度，以及 在诊断SAP和评价治疗情况有较好的表现。

为达以上发明的目的具体技术方案如下：

一种肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用， 所述的通透性指标谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)，主要来自于发生铁死 亡的肠上皮细胞所释放的；

所述诊断试剂通过检测被试者的肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧 化物酶4，并与健康对照组的平均水平相比较，来判断被试者发生重症急 性胰腺炎的风险。

本发明中，检测被试者的肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4 的方法为Western blot法。

本发明中，所述Western blot法所用到的一抗为重组Anti-GlutathionePeroxidase 4抗体[EPNCIR144](ab125066)。

本发明中，所述的诊断试剂包括：用于重症急性胰腺炎高危人群的筛 查的试剂、用于重症急性胰腺炎早期诊断的试剂或者用于重症急性胰腺炎 患者的预后评估的试剂。

本发明的另一个目的在于提供一种用于重症急性胰腺炎诊断的试剂 盒，包括：用于重症急性胰腺炎高危人群的筛查的试剂盒、用于重症急性 胰腺炎早期诊断的试剂盒或者用于重症急性胰腺炎患者的预后评估的试 剂盒，包含：检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂。

本发明中，检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂包 括：重组Anti-Glutathione Peroxidase 4抗体。

本发明中，检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂还 包括：Western blot法的常规试剂。

同现有技术相比，本发明的优点和有益效果：

本发明利用了GPX4作为肠损伤标志物实现其在诊断重症急性胰腺炎 的作用。可以有效的预测重症急性胰腺炎的发展，具有较好的临床应用前 景。合理有效的应用本发明，能提高重症急性胰腺炎患者早期治疗水平。

附图说明

图1为实施例1中Ctrl及SAP小鼠的粪便行16S rRNA扩增子测序结果； 图中，(A)alpha多样性比较；(B)PCA分析；(C)进化分支LEfSe图；(D)物种丰度柱状图。图中横轴为样本或组名称，纵轴代表每个物种的 丰度在样本所有物种丰度中所占的比例(即相对丰度)；不同颜色的柱子 对应不同的物种，柱子的长短代表该物种所占比例的大小。结果显示，SAP时肠道菌群结构简单，乳杆菌(lactobacillales)丰度明显下调，肠杆菌(enterobacteriales)增加，利于入血致病。

图2为实施例2中无肠道菌群造模实验结果，图中，(A)野生型C57BL/6N 小黑鼠，结果显示SAP组GPX4明显下调。(B)应用抗霉素Vancomycin (100毫克/千克)、硫酸新霉素neomycin sulfate(200毫克/千克)、甲硝唑 metronidazole(200毫克/千克)和氨苄青霉素ampicillin(200毫克/千克)建立 的伪无菌小鼠。

图3为实施例3中肠道菌群通过铁死亡导致肠道通透性变化结果；

图4为实施例4中NRF2敲除鼠验证SAP时铁死亡加重结果；

图5为实施例5中体外实验测序证实肠道上皮细胞炎症情况下铁死亡激活 结果。

图6为实施例1小鼠造模后胰腺及小肠HE染色结果，炎症相关的指标 MPO、ICAM以及实施例3小鼠肠道通透性指标ZO-1的变化免疫组化结 果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方 法。

下列实施例中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售 产品，可通过商业途径获得。

实施例1

SAP时肠道菌群变化及其与铁死亡的关系。

1、实验材料与分组

1.1实验动物

C57BL/6N小黑鼠20只

1.2实验分组：

一共20只C57BL/6N小黑鼠，按照随机数字表的方法分ctrl组、SAP 组和治疗组

1.3样本收集

收集10例ctrl组，8例SAP组小鼠新鲜粪便 2、实验方法

2.1动物模型构建及药物处理

28日龄断奶SPF C57BL/6N小黑鼠20只，小黑鼠饲养在无菌隔离包 内，自由采食无菌的标准颗粒鼠粮并24h自由(蒸馏水)。室内温度保持 恒温23摄氏度，相对湿度为63％，昼夜12h循环灯光。在此环境下适应 培养7天。

将小黑鼠分成3组如下：ctrl组(n＝10)、SAP组(n＝10)

实验小鼠造模建立：SAP组小鼠腹腔每小时注射雨蛙素(50μg/kg)。 雨蛙素(50μg/kg)注射7次后立即腹腔注射LPS(10mg/kg)，建立雨蛙素+ LPS模型。最后一次注射雨蛙素24h后处死小鼠。对照组：小鼠注射等量 生理盐水。

2.2肠道菌群16S rRNA扩增子测序

2.2.1实验流程

(1)DNA提取

使用基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.

DNA Kit)自样本中提 取基因组DNA，按照说明书进行操作。

(2)通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光 度计对DNA进行定量。

(3)PCR扩增

以细菌16s RNA基因的V3～V4可变序列为靶标。引物的具体序列如下：

上游引物：341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')

下游引物：805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')

(4)PCR纯化

PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回 收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒。

(5)荧光定量

纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit 荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2nM以上。

(6)文库构建以及测序

将合格的上机测序文库(Index序列不可重复)梯度稀释后，根据所需 测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序，使用 NovaSeq测序仪进行2×250bp的双端测序。

2.2.2生信分析流程

(1)数据预处理：将测序得到的原始数据进行过滤低质量数据处理， 保证后续信息分析结果的准确性；

使用软件：cutadapt

版本号：cutadapt-1.9

(2)双端拼接，将双端数据合并成一条长的扩增子片段

16S(V3+V4)：

使用软件：FLASH

版本号：FLASH-1.2.8

(3)降噪

使用软件：qiime2 DADA2

版本号：2019.7

(4)序列比对

使用软件：qiime2 feature-classifier

版本号：2019.7

(5)物种注释数据库

SILVA(release 132)

NT-16S(2019.04.05)

2.2.3肠道菌群物种分析

不同于以往的OUT分析，我们采用优选的QIIME 2分析流程，调用 DADA2对数据进行去噪，相当于以100％的相似度聚类，然后去冗余，得 到Feature(特征)，后续分析都是基于Feature数据展开。使用Feature进 行物种鉴定和多样性分析的准确性会显著高于传统的OTU方法。利用使 用Feature数据(其中的代表性序列)，去和16S数据库SILVA(Release132) 和NT-16S进行序列比对，即可对样本中检测到所有的16S序列从分类学 上的界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、 属(Genus)、种(Species)多个层级进行物种鉴定和注释。

Alpha多样性是度量单个样本内有多少种微生物物种(即species richness，丰富度)，以及每个微生物物种所占的比例(即evenness，均匀 度)。当一个样本中所含微生物物种种类越多，则它的丰富度越高，所含 的每种微生物物种的占比越平均，则均匀度越高。本项目我们采用5种常 用指数度量alpha多样性：Observed species和Chao1反映样本中物种丰富 度，而不考虑每个物种的占比情况(均匀度)；Shannon和Simpson反映物 种的丰富度和均匀度；Good’s Coverage反映样本的测序深度。本项目不 同样本(或组)的alpha多样性比较结果见下图1中(A)所示的alpha多 样性比较。Observed species和Chao1"；Shannon和Simpson值越大，丰富 度和均匀度就越高，即多样性越高；Good’s Coverage值越大，测序深度 越充分，最大值为1。

通过利用样本的物种丰度矩阵进行排序分析也称主成分分析(PCA)。 通过PCA可以观察个体或群体间的差异，菌群组成越相似的样本聚得越 近。如图1中(B)所示的PCA分析图，上图中每一个点代表一个样本， 相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差 异越小。PCA后面的百分数表示对应特征向量对数据的解释量，这个值越 大越好。图上的p值来自于ANOSIM的计算。

LEfSe是一种用于发现和解释高维度数据生物标识的分析工具，可以 进行两个或多个分组的比较，寻找生物标志物(Biomarker)。该方法综合 了统计学上的差异分析和该差异物种对分组结果的影响力得分值，同时强 调了统计意义和生物相关性。本项目LEfSe分析的阈值设置为LDA值>3， p<0.05，结果如图1中(C)所示的进化分支LEfSe图。

通过计算各个分类层级上每个物种的丰度占全部物种丰度的比值(即 相对丰度)来绘制各个分类层级上不同样本(或组)中的细菌物种分布堆 叠柱状图。如图1中(D)所示的物种丰度柱状图。

3、实验结果

图1为实施例1中Ctrl及SAP小鼠的粪便行16S rRNA扩增子测序结 果；图中，(A)alpha多样性比较；(B)PCA分析；(C)进化分支LEfSe 图；(D)物种丰度柱状图。图中横轴为样本或组名称，纵轴代表每个物种 的丰度在样本所有物种丰度中所占的比例(即相对丰度)；不同颜色的柱 子对应不同的物种，柱子的长短代表该物种所占比例的大小。结果显示，SAP时肠道菌群结构简单，乳杆菌(lactobacillales)丰度明显下调，肠杆 菌(enterobacteriales)增加，利于入血致病。

实施例2

无肠道菌群造模实验证实，SAP时肠道菌群影响了铁死亡，肠道菌群 通过铁死亡导致肠道通透性变化。

1、实验材料与分组

1.1实验动物

C57BL/6N小黑鼠40只

1.2实验分组：

一共40只C57BL/6N小黑鼠，按照随机数字表的方法分为4组

2、实验方法

2.1动物模型构建及药物处理

28日龄断奶SPF C57BL/6N小黑鼠＝40只，小黑鼠饲养在无菌隔离 包内，自由采食无菌的标准颗粒鼠粮并24h自由(蒸馏水)。室内温度保 持恒温23摄氏度，相对湿度为63％，昼夜12h循环灯光。在此环境下适 应培养7天。

将小黑鼠分成两组如下：伪无菌组(n＝20)和对照组(n＝20)。伪无 菌组建模采用口服抗生素治疗方案，利用广谱抗生素处理小黑鼠以构建无 菌小鼠模型。具体方法为：应用采用广谱抗生素(氨苄西林1g/L、硫酸新 霉素1g/L、甲硝唑1g/L、和万古霉素0.5g/L)配制饮用水喂养小鼠持续4 周建立的伪无菌小鼠，对照组喂养灭菌水作为对照。

实验小鼠造模建立：SAP组小鼠腹腔每小时注射雨蛙素(50μg/kg)。 雨蛙素(50μg/kg)注射7次后立即腹腔注射LPS(10mg/kg)，建立雨蛙素+ LPS模型。最后一次注射雨蛙素24h后处死小鼠。对照组小鼠注射生理盐 水。

2.2组织的收集以及切片的制作

(1)取材与固定：采取颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹取胰腺及小肠组 织，投入预先配好的固定液中(10％多聚甲醛)使组织、细胞的蛋白质变性 凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结 构，固定48小时。

(2)脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去 组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲 苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

(3)浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中(提前放入 溶蜡箱保温)。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：倒入已溶化的石蜡， 迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组 织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

(4)切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，切 成4μm厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻 片上，放45℃恒温箱中烘干。

(5)脱蜡：常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异， 利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞 内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin， E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结 构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到 低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。

(6)染色：HE染色过程是：

a.将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。

b.酸水及氨水中分色，各数秒钟。

c.流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。

d.入酒精伊红染色液染色2～3分钟。

(7)脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透 明。

(8)封固：将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固。待树 胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

(9)光学显微镜观察：在光学显微镜下，200倍放大观察胰腺和小肠 的病理改变。随后，按照先前的描述对胰腺病理和小肠损伤进行评分。每 个切片被分成五个相等的部分并计算评分。评分由两名研究人员根据标准 方案独立进行，差异由第三名研究人员仲裁。

2.3 4-HNE免疫组化实验：

(1)脱蜡和水化：将组织切片置于金属染色架上，于60℃烘箱中烘 烤过夜，取出后依次在二甲苯(二甲苯I)、二甲苯(二甲苯II)溶液中 分别放置15min，再在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇溶液中 放置5min。最后置于PBS中洗3次*5min。

(2)抗原修复：配置新鲜的柠檬酸抗原修复液倒入一塑料杠中，置 于高压锅中煮沸。将载有组织切片的金属染色架浸没于修复液中，高火煮 沸10分钟后将塑料缸放在外面通风或置于冰上放凉至室温。

(3)消除内源性过氧化物酶活性：PBS漂洗3次，每次5min，轻轻 甩掉多余液体并用滤纸吸干后迅速在切片组织上滴加0.3％双氧水，切片 置于37℃水浴箱中孵育30min。使用PBS漂洗3次×5min。

(4)抗原封闭：轻轻甩掉切片上的PBS，用滤纸吸干多余水分，在 组织表面滴加适量用PBS配制的10％山羊血清封闭液，置于37℃孵育箱 中封闭1h。

(5)孵育一抗：按1:200的比例用免疫染色一抗稀释液配制一抗，将 配好的一抗滴加到组织玻片(大约150μL/组织)，阴性对照组滴加封闭液。 小心地将玻片置于湿敷盒中，4℃冰箱中孵育过夜。

(6)孵育二抗：将湿敷盒置于室温复温一小时，取出玻片，使用PBS 摇晃漂洗3次*10min。甩干残留PBS后，用滤纸吸干多余水分，玻片上 滴加带有HRP标记的二抗工作液，室温孵育1h。然后在PBS中摇晃漂洗 3次*5min。

(7)DAB显色(注意必须现配现用)：用滤纸去除玻片表面PBS， 根据说明书配置新鲜的DAB显色液，滴加DAB显色液使组织均匀覆盖染 色液，并于显微镜下实时观察颜色改变。一般染色30s～10min，达到显 色要求后，立即用流水冲洗玻片，并在PBS中漂洗5min，以终止显色。

(8)苏木素复染：组织上滴加适量苏木素，使染色液均匀覆盖切片 组织，显微镜下观察颜色，染色约1～2min，流水冲洗以终止染色。

(9)脱水透明化：将组织切片依次浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％ 乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II溶液中各2min。最后在二甲苯I和二甲苯 II中分别浸泡10min。

(10)树胶封片：将切片放在通风柜中挥发掉残留的二甲苯，滴加少 量中性树脂(覆盖住组织即可)，用盖玻片进行封片处理，避免产生气泡， 置于通风条件下晾干，最后显微镜下观察免疫组化染色结果。

(11)结果判读：请两名病理科高年资医师进行双盲法阅片。每个组 织切片分别在100倍、200倍以及400倍倒置显微镜下观察并拍照记录。 若两名医师意见不一致，则邀请第三位高年资医师再次进行阅片，共同讨 论结果。免疫组化染色结果及评价方法：

(12)染色的面积：小于5％，计0分；5-25％，计1分；25-50％， 计2分；50-75％，计3分；大于75％计4分。染色深度：无染色计0分； 弱染色计1分；中等染色计2分；强染色计3分。染色评分＝染色深度× 染色面积，若小于等于5分判定为低表达，大于等于6分即判定为高表达。

2.4 MDA实验：

MDA的量可反映机体脂质过氧化的程度，间接的反映出细胞损伤的 程度

(1)准备样品：每100万个细胞使用0.1mL细胞裂解液，置于冰上 充分裂解30min后，12000g离心10分钟收集上清用于后续实验。

(2)试剂盒的准备工作：

a.配制TBA储存液：电子天平准确称取适量TBA，用TBA配制液 配制溶解成浓度为0.37％的TBA储存液。通过加热到70℃或置于烘箱内 以促进TBA配制液完全溶解。TBA储存液也需要加热到70℃，并通过剧 烈震荡以促进溶解。配制好的TBA储存液置于室温避光保存，3个月内有 效。

b.配制MDA检测工作液:根据待测定的样品数量(含对照)，参考下 表新鲜配制适量的MDA检测工作液(现配现用)。

注意:MDA检测工作液可以通过70℃加热，并剧烈震荡以促进溶解。 也可以通过超声促溶。配制好的MDA检测工作液必须当天使用。

c.标准品的稀释：用蒸馏水将标准品分别稀释至1、2、5、10、20、 50μM，用于后续制作标准曲线。如果样品中MDA的浓度很高，可以适 当增加标准品浓度。

(3)样品检测:

a.在1.5mL EP管内加入0.1mL细胞裂解液作为空白对照，加入0.1 mL上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1mL样品用于测定； 随后每管中加入0.2mL MDA检测工作液。参考下表依次加入各试剂：

b.震荡混匀后，沸水浴或100℃加热15分钟。加热时管子上方重物 压迫，务必注意防止液体暴沸溅出。我们应用带有热盖的PCR仪。

c.冷却至室温，置于离心机中，设置1000g室温离心10分钟。每管取 200μL上清加入到96孔板中，注意更换枪头，随后用酶标仪在532nm测 定吸光度值。可以设定450nm为参考波长进行双波长测定。

d.MDA含量的计算：对于细胞样品，计算出样品溶液中的MDA含 量后，可以通过单位重量的蛋白含量(BCA试剂盒测定蛋白浓度)等来 表示最初样品中MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织

2.5wb检测两组的NRF2-KEAP1通路以及GPX4的变化

(1)将配制好的凝胶玻璃板正确地安装在电泳槽上，注意确保内槽 不漏缓冲液。

(2)轻轻垂直拔去梳子，往电泳槽内槽加入足量新鲜配制的1×电泳 缓冲液，缓冲液高度要没过薄玻璃板，外槽也加入足量1×电泳缓冲液(外 槽缓冲液最好为新鲜配制，如为旧缓冲液，使用次数不超过3次)。

(3)上样：从-20℃冰箱取出待电泳蛋白样品，于50℃恒温金属浴上 加热5分钟，振荡混匀。在样品孔用枪头缓慢加入20μL蛋白样品，在蛋 白样品两侧分别加入蛋白marker 5μL，并用1×Loading Buffer补齐至20μL (加入下一个样品时，要注意更换枪头，以免交叉污染)，上样完毕后， 盖上电泳槽盖子。

(4)电泳：接通电源，启动仪器，设置电泳条件，开始为80V，30min， 此时蛋白已经电泳到分离胶内，切换为120V，直至蛋白marker电泳至分 离胶底部，关闭电源，停止电泳。

(5)准备PVDF膜：切取大小于为5.5cm×8cm的PVDF膜，预先 使用甲醇浸泡5min。

(6)转膜：从电泳槽中取出玻璃板，用塑料切胶器轻轻撬开玻璃板， 直至厚玻璃板开始松动，分离厚板与胶，使胶留于薄玻璃板上，将浓缩胶 轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破。

(7)在白色转膜用盘中倒入适量配制预冷过的1×转膜缓冲液，将印 迹滤纸放入其中浸透，在转膜夹板(黑板朝下)中依次放入海绵、双层印 迹滤纸、电泳完全的凝胶、PVDF膜、双层印迹滤纸、海绵(注意：膜和 印迹滤纸的大小应与胶的大小相当，尽量一次性将膜放置准确位置，凝胶 与转印膜一旦接触避免移动，并做标记记住膜与胶的接触面，用小试管将 每层之间的气泡轻轻碾出，尤其是PVDF膜与凝胶之间，整个操作过程均 在1×转膜缓冲液中完成，避免PVDF膜和凝胶干燥，安装好的转印夹应 该使胶紧密地与PVDF膜接触而不被挤压破损)，合上转印夹并上锁扣。

(8)将组装好的夹子放入转膜架中，要使夹子的黑面对槽的黑面， 再一同放入电泳槽中，倒入预冷的1×转膜液，并放入一个适当大小的转 膜用冰袋，盖好盖子。将电泳槽置于装满碎冰的大脸盆中(尽量吸收转膜 过程中产生的热量)。接通电源，开启电泳仪，设置电流220mA，时间90 min，按下开始运行按扭开始转膜；

(9)牛奶封闭：转膜结束后，用镊子取出PVDF膜置于塑料盒中， 加入配置好的5％脱脂奶粉溶液于摇床上室温孵育1.5h。

(10)封闭完成后，弃除封闭液，用去离子水清洗PVDF膜3-5次， 以去除多余的封闭液。

(11)孵育一抗：参照蛋白marker分子量，在目的蛋白附近对PVDF 膜进行裁剪，然后将裁剪好的条带置于一抗的抗体孵育盒内，于4℃摇床 上缓慢震荡，孵育过夜。

(12)去除一抗：室温下，在摇床上用1×TBST清洗PVDF膜条带 三次，每次10分钟，以洗去残余的未结合的一抗。

(13)配制二抗：用5％脱脂奶粉配置稀释二抗至所需比例，一般为 1：5000，摇床上混匀。

(14)去除孵育盒中的1×TBST，加入配置好的对应二抗，室温摇床 孵育1h。

(15)去除二抗，在摇床上用1×TBST清洗PVDF膜条带3-4次， 以洗去残余未结合的二抗，每次5min。

(16)曝光：用滤纸轻轻吸净PVDF膜条带上残余的液体，将膜正面 朝上置于透明塑料薄膜上，将配制好的曝光液均匀覆盖到PVDF膜上，避 光，室温下孵育1min，去除曝光液，放置于曝光机中，打开曝光机软件 进行曝光，保存曝光图像。

3、实验结果

3.1HE染色结果

实验结果表明SAP组胰腺及小肠的病理变化明显表达显著增加，且 伪无菌组的表达也增加，但略低于SAP组，肠道菌与胰腺炎炎症变化有 关见图6。

3.2免疫组化实验

4-羟基壬烯醛(4-HNE)是一种内源性脂质过氧化产物，来源于组织 和细胞中ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)的脂质过氧化过程。既往研究提 示4-HNE参与了多种氧化应激相关疾病的发生发展。实验结果表明SAP 组4-HNE表达显著增加，且伪无菌组的表达也增加，但略低于SAP组， 这些结果都指向了SAP小鼠中，肠道菌群影响了氧化应激的发生。

炎症相关的分子髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),是一种血红素 蛋白，富含于中性粒细胞中,由粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存储于 噬天青颗粒内。ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1即细胞间黏 附分子-1)，又叫做CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中 的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。实验结果表明SAP组MPO 及ICAM-1表达显著增加，且伪无菌组的表达也增加，但略低于SAP组，这些结果表明伪无菌组炎症较轻(图6)。

3.3MDA实验：

MDA用于反应组织细胞中ROS含量变化，且呈正相关，实验结果表 明SAP组MDA显著增加，且伪无菌组的MDA增加，但略低于SAP组， 这些结果都指向了SAP小鼠中，肠道菌群影响了铁死亡的发生。

3.4WB实验表明

The Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)-NF-E2-related factor 2(Nrf2)-antioxidant response element(ARE)系统是抗氧化应激损伤的主要反 应机制。我们的结果表明SAP组小鼠通路表达降低，且伪无菌组SAP组 略高于对照组。这些结果都指向了Nrf2通路在炎症时被显著抑制，并且 与肠道菌群的变化相关。另外我们的实验结果显示GPX4(图2)正常小 鼠SAP时，GPX4显著增高(铁死亡增加)；在无肠道菌群小鼠SAP时，GPX4显著下降(抑制了铁死亡的发生)。

实施例3

肠道菌群通过铁死亡导致肠道通透性变化

1、实验材料与分组

1.1实验动物

同实施例2

1.2实验分组：

一共40只C57BL/6N小黑鼠，按照随机数字表的方法分为4组

2、实验方法

2.1动物模型构建及药物处理

同实施例2

2.2组织的收集以及切片的制作

步骤同实施例2收集肠道组织

2.3免疫荧光(需检查步骤)

(1)脱蜡和水化：将组织切片置于金属染色架上，于60℃烘箱中烘 烤过夜，取出后依次在二甲苯(二甲苯I)、二甲苯(二甲苯II)溶液中 分别放置15min，再在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇溶液中 放置5min。最后置于PBS中洗3次*5min。

(2)抗原修复：配置新鲜的柠檬酸抗原修复液倒入一塑料杠中，置 于高压锅中煮沸。将载有组织切片的金属染色架浸没于修复液中，高火煮 沸10分钟后将塑料缸放在外面通风或置于冰上放凉至室温。

(3)消除内源性过氧化物酶活性：PBS漂洗3次，每次5min，轻轻 甩掉多余液体并用滤纸吸干后迅速在切片组织上滴加0.3％双氧水，切片 置于37℃水浴箱中孵育30min。使用PBS漂洗3次×5min。

(5)用PBS配5％山羊血清或5％BSA室温封闭30min。

(6)弃血清，将一抗(1：100)滴载玻片上后，挑出玻片倒扣于载 玻片上。

(7)(预冷)PBS洗5min*3次。

(8)5％山羊血清或1％BSA配置荧光二抗(1：400)，加入二抗，室 温避光1h；(预冷)PBS洗10min*3次。

(9)加DAPI染细胞核，室温孵育5-10min；(预冷)PBS洗5min*3 次。

(10)晾干玻片，加入10μL防猝灭剂，盖玻片封片。

(11)激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2.4免疫组化

步骤同实施例2

3、实验结果

3.1直接免疫荧光结果

将野生型C57BL/6N小黑鼠分为对照组，SAP组。模型建立24h后， 取小肠组织，行免疫荧光染色检测紧密连接蛋白occludin的变化。如图3 (200Х)可见，SAP时，occludin荧光明显减弱，结构不完整。

3.2免疫组化结果

ZO-1(zonulaoccludens-1)常被用来作为观察各种组织紧密连接屏障 功能和通透性功能的指标。近年来发现其与维持和调节上皮篱笆和屏障功 能有关,还参与调节细胞物质转运,维持上皮极性细胞增殖分化,肿瘤细胞转 移等重要过程。我们的结果表明SAP组肠道通透性变差，而伪无菌组中 炎症的作用减轻(图6)

实施例4

NRF2敲除鼠验证SAP时铁死亡加重

1、实验材料与分组

1.1实验动物

Nrf2敲除的C57BL/6N小黑鼠与野生型的C57BL/6N小黑鼠

1.2实验分组：

2、实验方法

2.1动物模型构建及药物处理

实验小鼠SAP模型建立：小黑鼠制模前禁食12h，不禁水。采用经腹 腔注射典精氨酸以及雨蛙素联合LPS建立SAP相关肠损伤的动物模型 2.2组织的收集以及切片的制作

步骤同实施例2收集肠组织

2.3 4-HNE免疫组化

步骤同实施例2

2.4 WB检测GPX4和ACSL4

步骤同实施例2

2.5 MDA实验

步骤同实施例2

3、实验结果

3.1 4-HNE免疫组化实验

实验结果表明野生型小鼠炎症组4-HNE表达较对照组明显升高，而 敲除鼠炎症组4-HNE表达最高。

3.2 MDA实验：

MDA用于反应组织细胞中ROS含量变化，且呈正相关，实验结果表 明野生型小鼠炎症组MDA表达较对照组明显升高，而敲除鼠炎症组MDA 表达最高。这些结果表明Nrf通路影响了铁死亡的发生。

3.3 WB实验：

表明炎症时铁死亡相关蛋白表达明显升高，而敲除鼠的炎症组铁死亡 表达较野生型明显升高(图4)，结果表明Nrf通路影响了铁死亡的发生。

实施例5

体外实验测序进一步证实肠道上皮细胞炎症情况下铁死亡激活。结果 显示CACO2细胞分为N及LPS组(补充具体的实验方法)，送RNA-seq 测序后，差异基因行GO-P富集，其中显著的谷胱甘肽代谢及氧化应激过 程均跟铁死亡关系密切。(图5)

1、实验材料与分组

1.1实验材料

CACO2细胞

1.2实验分组：

分为N及LPS组

2、实验方法

CACO2细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素抗生素的 DMEM/F12培养基中于37℃，5％CO₂下生长。培养基每2天更换一次。 在每次实验之前，将细胞在无血清培养基中饥饿24小时。LPS组添加5μg mL^-1进行造模。

3、质谱测序。

Claims (7)

1.一种肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的通透性指标为谷胱甘肽过氧化物酶4；

所述诊断试剂通过检测被试者的肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4，并与健康对照组的平均水平相比较，来判断被试者发生重症急性胰腺炎的风险。

2.根据权利要求1所述的肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，其特征在于，检测被试者的肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的方法为Western blot法。

3.根据权利要求2所述的肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，其特征在于，所述Western blot法所用到的一抗为重组Anti-Glutathione Peroxidase4抗体[EPNCIR144](ab125066)。

4.根据权利要求1所述的肠损伤的通透性指标在制备重症急性胰腺炎诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂包括：用于重症急性胰腺炎高危人群的筛查的试剂、用于重症急性胰腺炎早期诊断的试剂或者用于重症急性胰腺炎患者的预后评估的试剂。

5.一种用于重症急性胰腺炎诊断的试剂盒，包括：用于重症急性胰腺炎高危人群的筛查的试剂盒、用于重症急性胰腺炎早期诊断的试剂盒或者用于重症急性胰腺炎患者的预后评估的试剂盒，其特征在于，包含：检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂。

6.根据权利要求5所述的用于重症急性胰腺炎诊断的试剂盒，其特征在于，检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂包括：重组Anti-Glutathione Peroxidase 4抗体。

7.根据权利要求5所述的用于重症急性胰腺炎诊断的试剂盒，其特征在于，检测肠上皮细胞所释放的谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂还包括：Western blot法的常规试剂。

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