JP2020511150A - 造血移植片の改善方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)造血幹細胞、好ましくは初期原始造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および、
b)細胞表面抗原CD135および/またはCD110の発現に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および、
c)CD135+および/またはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
多能性幹細胞、好ましくは、胚様体(EB)の形成を誘導する人工多能性幹細胞を提供すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地中でEBを培養すること、
EBを液体培養培地で培養し、多能性幹細胞を造血細胞内系統に分化すること、および
EB細胞を解離すること
を含み得、
それによって、ステップa)で提供される細胞の集団を得る。
10〜100ng/mLのSCF、好ましくは10〜50ng/mLのSCF;
10〜100ng/mLのTPO、好ましくは10〜50ng/mLのTPO;
100〜500ng/mLのFLT3−L、好ましくは250〜350ng/mLのFLT3−L;
10〜100ng/mLのBMP4、好ましくは10〜50ng/mLのBMP4;
50〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150〜250ng/mLのVEGF;
10〜100ng/mLのIL3、好ましくは20〜80ng/mLのIL3;
10〜100ng/mLのIL6、好ましくは20〜80ng/mLのIL6;
1〜20ng/mLのIL1、好ましくは1〜10ng/mLのIL1;
10〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50〜150ng/mLのGCSF;および/または、
10〜150ng/mLのIGF1、好ましくは10〜100ng/mLのIGF1;
を含み得る。
10〜100ng/mLのSCF、好ましくは10〜50ng/mLのSCF;
10〜100ng/mLのTPO、好ましくは10〜50ng/mLのTPO;
10〜100ng/mLのFLT3−L、好ましくは10〜50ng/mLのFLT3−L;
50〜300ng/mLのBMP4、好ましくは150〜250ng/mLのBMP4;
50〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150〜250ng/mLのVEGF;
10〜100ng/mLのIL3、好ましくは20〜80ng/mLのIL3;
10〜100ng/mLのIL6、好ましくは20〜80ng/mLのIL6;
1〜20ng/mLのIL1、好ましくは1〜10ng/mLのIL1;
10〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50〜150ng/mLのGCSF;および/または、
1〜20ng/mLのIGF1、好ましくは1〜10ng/mLのIGF1;
を含む。
1%〜20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%〜10%の血漿もしくは血清;または0.1%〜2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%〜1%の血小板溶解物;および
5μg/mL〜20μg/mL、好ましくは8μg/mL〜12μg/mLのインスリン;および
10μg/mL〜100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL〜60μg/mLのトランスフェリン;および
を含み得る。
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン受容体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+および/もしくはCD110+ならびに/またはAPLNR+、好ましくはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン受容体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+、CD110+および/またはAPLNR+、好ましくはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
多能性幹細胞、具体的にはiPSCまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトiPSCまたはヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトiPSCを提供すること、
胚様体(EB)の形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でEBを培養すること、および
EB細胞を解離すること
をさらに含み、
それにより、本発明の方法のステップa)で提供される上記のような細胞の集団を取得する。
細胞表面抗原CD135およびCD110の発現、ならびに、必要に応じてAPLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、ならびに、必要に応じてAPLNRおよびCD110の発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、および、必要に応じてAPLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、および、必要に応じてCD110の発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、必要に応じてAPLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD135の発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、ならびに、必要に応じてAPLNRおよびCD135の発現、または、
細胞表面抗原CD135およびCD110の発現、ならびに、APLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、および、APLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、APLNRの発現。または、
APLNRの発現、ならびに、必要に応じて細胞表面抗原CD135およびCD110の発現、または、
APLNRの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD135の発現、または、
APLNRの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD110の発現
に基づいて選別され得る。
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および、
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110の発現、ならびに/またはアペリン受容体(APLNR)の発現について、好ましくは、細胞表面抗原CD110の発現について前記細胞を評価すること、および、
c)CD135+および/もしくはCD110+ならびに/またはAPLNR+、好ましくはCD110+である細胞を同定および/または選択すること
を含む。
多能性幹細胞、具体的にはiPSCまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトiPSCまたはヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトiPSCを提供すること、
胚様体(EB)形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でEBを培養すること、
EB細胞を解離すること、
細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン受容体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて解離EB細胞を選別すること、および、
CD135+、CD110+および/またはAPLNR+、好ましくはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
1%〜20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%〜10%の血漿もしくは血清、または、0.1%〜2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%〜1%の血小板溶解物、または、0.1%〜2%の血清アルブミン、好ましくは0.5%〜1%の血清アルブミン、および/または、
5μg/mL〜20μg/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、好ましくは8μg/mL〜12/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、および/または、
10μg/mL〜100μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、好ましくは30μg/mL〜60μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのSCF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのTPO、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのFLT3−L、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのFLT3−L、および/または、
100ng/mL〜500ng/mLのBMP4、好ましくは150ng/mL〜250ng/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL〜250ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL3、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL6、および/または、
1ng/mL〜20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL〜10ng/mLのIL1、および/または、
10ng/mL〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL〜150ng/mLのGCSF、および/または、
1ng/mL〜20ng/mLのIGF1、好ましくは1ng/mL〜10ng/mLのIGF1
を含む。
1%〜20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%〜10%の血漿もしくは血清、または、0.1%〜2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%〜1%の血小板溶解物、および/または、
5μg/mL〜20μg/mLのインスリン、好ましくは8μg/mL〜12μg/mLのインスリン、および/または、
10μg/mL〜100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL〜60μg/mLのトランスフェリン、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのSCF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのTPO、および/または、
100ng/mL〜500ng/mLのFLT3−L、好ましくは250ng/mL〜350ng/mLのFLT3−L、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのBMP4、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL〜250ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL3、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL6、および/または、
1ng/mL〜20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL〜10ng/mLのIL1、および/または、
10ng/mL〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL〜150ng/mLのGCSF、および/または、
10ng/mL〜150ng/mLのIGF1、好ましくは10ng/mL〜100ng/mLのIGF1
を含む。
1%〜20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%〜10%の血漿もしくは血清、または、0.1%〜2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%〜1%の血小板溶解物、および/または、
5μg/mL〜20μg/mLのインスリン、好ましくは8μg/mL〜12μg/mLのインスリン、および/または、
10μg/mL〜100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL〜60μg/mLのトランスフェリン、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのSCF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのTPO、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのFLT3−L、好ましくは10ng/mL〜50ng/mLのFLT3−L、および/または、
100ng/mL〜500ng/mLのBMP4、好ましくは150ng/mL〜250ng/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL〜250ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL3、および/または、
10ng/mL〜100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL〜80ng/mLのIL6、および/または、
1ng/mL〜20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL〜10ng/mLのIL1、および/または、
10ng/mL〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL〜150ng/mLのGCSF、および/または、
1ng/mL〜20ng/mLのIGF1、好ましくは1ng/mL〜10ng/mLのIGF1
を含む。
材料および方法
hiPSC増幅
本研究は、3つの異なるhiPSC株:レトロウイルスベクターおよびトムソンの組み合わせで再プログラムされたFD136−25(Oct4、Sox2、NanogおよびLin28の内因性発現);エピソームで再プログラムされたPci−1426およびPci−1432株(Phenocell社)(Sox2、Oct4、KLF、cMyc)、を用いて行った。hiPSCは、TESR2培地(Stem Cell Technologies社、Bergisch Gladbach、Germany)において、CellStart(Invitrogen社、Carlsbad、USA)で維持し、細胞を、TRYpleセレクト(Invitrogen社)での標準クランプ継代を使用して5日ごとに新たにコーティングされたプレート上に1:6で継代した。
24時間後、細胞を、24ng/mLのSCF、21ng/mLのTPO、21ng/mLのFLT3L、194ng/mLのBMP4、200ng/mLのVEGF、50ng/mLのIL3、50ng/mLのIL6、5ng/mLのIL1、100ng/mLのGCSF、5ng/mLのIGF1を含む分化培地に移した(PeproTech社、Neuilly−sur−seine、フランス)。培地は1日おきに交換された。EBは、15、16、17日目に解離させた。
示された時間において、1×105の解離EB細胞または3×l04の異種移植レシピエントBMからの細胞を、SCF、IL−3、EPOおよびGM−CSFの存在下で3mLの完全メチルセルロース培地中に播種した(PeproTech社、Neuilly−sur−seine、フランス)。G−CSFがまたマウス前駆細胞を刺激するので、それは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)で置換された。混合物のアリコート(1mL)を2回、1つの30mmシャーレに分配し、14日間、加湿チャンバ中で維持した。コロニー形成細胞(CFC)は、14日目にスコアリングされた。
長期培養開始細胞(LTC−IC)アッセイを、EBについて17日目に、対照CD34+について0日目に、15〜100,000細胞/ウェルで、前述のように実施した(例えば、MillerおよびEaves、Hematopoietic Stem Cell Protocols、Methods in Molecular MedicineシリーズのVolume 63 pp123−141を参照されたい)。絶対LTC−ICカウントは、ポアソン統計を用いて37%の陰性ウェルをもたらす細胞濃度に相当した。
擬似微小管形成のために、細胞を、成長因子低減マトリゲル(Corning社)およびEGM2培地(Lonza社)での培養に移した。
BM細胞または解離EBの染色を、100μLの染色バッファ(2%FBSを含有するPBS)中の2×105細胞について、暗所において室温で20分間、各抗体の5:100希釈で行った。データ収集は、Becton Dickinson CantoIIサイトメータで行った。
1.750 106D16単一細胞またはhEPCおよび1.750 106hMSCを、100μlのマトリゲルフェノールレッドフリーおよび成長因子低減し(Corning社)と混合し、ヌードマウスの背中に皮下注入した(2つの異なるプラグ/マウス)。対照も同様に行ったが、3.5 106hMSCまたはD16単一細胞またはhEPCsであった:各条件についてn=3。2週間後、マウスを犠牲にし、マトリゲルプラグを切開し、パラフィン切片用に加工した。切片を、脱パラフィンし、水和させ、マッソントリクローム、ヘマトキシリンでの核染色を含む3色プロトコル、酸性フクシン/キシキジンポンソーでの細胞質染色およびライトグリーンSFでのコラーゲン染色(すべてVWR社から)で、または、ヒトフォンヴィレブランド因子(Dako社)で染色し、染色をヒストグリーン基質(Abcys社)で発色させ、Fast nuclear red(Dako Cytomation社)で対比染色し、脱水し、マウントし、または、一次抗体としてのhCD31(R&DSystem社)および二次抗体としてのロバ抗ウサギCy3(Jackson Immuno Reseach社)およびDAPIを用い、フルオロマウントGでマウントした。
上記のように、細胞を抗体hAPJ−APCで染色した。選別は、Moflo ASTRIOS Beckman Coulter社装置上で実行され、純度は98.1%のAPLNR陽性細胞であった。
NOD/SCID−LtSz−scid/scid(NOD/SCID)またはNOD.Cg−PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ(NSG)またはFoxn1−/−ヌードマウス(Charles River社、L’Arbresle、フランス)を、IRSN動物介護施設で飼育した。すべての実験および手順は、動物実験についてのフランス農務省規制を遵守して行われ、地元倫理委員会によって承認された。
3つの異なるhiPSC株のD17細胞の生着可能性について:
70匹のNSGマウスを次のように使用した:30匹の一次レシピエント、30匹の二次レシピエントおよび対照としての10匹。
APLNR+およびAPLNR−集団の生着可能性について:10匹のNOD−SCIDマウスを使用し、3匹のNOD−SCIDを対照とした。
マウスを12、18または20週で屠殺した。大腿骨、脛骨、肝臓、脾臓および胸腺を除去した。単一細胞懸濁液を標準的なフラッシングによって調製し、1×106個の細胞を含むアリコートを総容積200μLの染色緩衝液で染色した。
3匹のマウスの血液をプールしてhCD2マイクロビーズ選別(Miltenyi社)を可能にし、TCRαβおよびTCRγδの存在を、次のヒトマーカを用いてフローサイトメトリによって評価した:TCRαβクローンIP26AおよびTCRγδクローンIMMU510(すべてBeckman Coulter社、ブレア、USAの抗体から)。
3匹を致死量以下に照射したNOD/SCIDマウスにそれぞれ、300万のAPLNR陽性細胞を皮下注射した。奇形腫は、FDAガイドライン(材料および方法)による2ヶ月のフォローアップ後には発見されなかった。
総mRNAを、RNAミニキット(Qiagen社、クルタブフ、フランス)を用いて単離した。mRNA完全性を、バイオアナライザー2100(Agilent Technologies社、マッシー、フランス)で確認した。cDNAを、スーパースクリプト(Life Technologies社、カールスバード、USA)での逆転写により構築した。TaqManPCRマスターミックス(Life Technologies社)および選択された遺伝子(下記の表を参照)についての特異的プライマー(Applied BioSystems社、カールスバード、USA)を配列検出システム(QuantStudio12K FlexReal−TimePCRシステム、Life Technologies社)とともに用いて、PCRアッセイを実施した。各サンプルにおいて、各標的遺伝子の蛍光PCR信号は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の蛍光シグナルに正規化された。
すべての統計は、Rソフトウェア3.1.1(2014年7月10日)(Rコアチーム社、2013)、INGENUITYおよびSAMソフトウェアを用いて決定した。データは、階層的クラスタリングおよびPCAで表現されている。
第1の移植可能HSCは、内皮細胞(EC)の特殊化集団から胚発生時に産生され、造血内皮と呼ばれる。内皮造血移行(EHT)に続き、これらの造血ECは、HSCを含む造血細胞(HC)に分化し、循環に入り、胎児の肝臓で増幅され、定着の決定的な部位であるBMを実現する。発達上の造血のこれらの初期ステップは、胚様体(EB)の培養、特に、造血ECの生成およびHCの出芽に完全に繰り返される。
材料および方法
hiPSC増幅、EB分化、ヒト細胞生着の評価、T細胞の成熟および機能性アッセイ、定量的PCRを、上述のように行った。
解離されたEB細胞を、抗体CD110−PE(MPL)またはCD135−PE(FLT3)で染色し、そしてPEマイクロビーズ(Miltenyi社)で再染色し、最終的にMACS(登録商標)細胞分離装置で選別した。
NOD.Cg−PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ(NSG)(Charles River社、ラルブレル、フランス)を、IRSN動物介護施設で飼育した。すべての実験および手順は、動物実験についてのフランス農務省規制を遵守して行われ、地元倫理委員会によって承認された。
3つの異なるhiPSC株のD17細胞の生着可能性について:
50匹のNSGマウスを次のように使用した:25匹の一次レシピエント、25匹の二次レシピエント。
バイオインフォマティクス分析を、R環境ソフトウェア バージョン3.0.2で行った。公開利用可能なトランスクリプトームデータセットが、遺伝子発現オムニバス(GEO)データベースで、正規化されたマトリックス(GSEフォーマット:遺伝子発現マトリックス)としてダウンロードされた(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
多能性細胞(IPSC:人工多能性細胞)の分化に由来するscid再増殖細胞(SRC)を良好に特徴付けるために、本発明者らは、行われる一次または二次移植の成功への異種移植能力を考慮してトランスクリプトームのサンプルを分析した。トランスクリプトームシリーズは統合され、一次異種移植能力のみを有するIPSCのグループ(グループGI、n=3)、ならびに、一次および二次異種移植能力を有するIPSCのグループ(グループGIおよびGII、n=3)と比較して、造血幹細胞(CD34+CD38−CD90+の表現型を有するHSC、n=3)を選別する対照グループを構築した。バッチ効果の数学的補正後、一方向ANOVA(分散分析、p値1E−4未満)の教師あり分析を、3つの定義サンプルグループ(HSC、GI、GI&II)間で行った。教師なし主成分分析を、グループ間の5859個の差次的遺伝子上で行い、主要マップ(図6)上で4.75E−8のp値を有するサンプルのグループを有意に識別することができた。これらの結果は、一次および/または二次移植を与える能力を考慮すると選択遺伝子がSRC−IPSCの異種移植表現型の研究に潜在的に関連があることを示唆している。また、トランスクリプトームデータセットに関連するバッチ効果は、この教師なし分析の間に表現型グループ判別に影響を与えないことを示した。各異種移植グループとHSCグループとの間のマイクロアレイ有意分析(SAM)による教師あり分析を、SRC−IPSCの各グループ内のHSCバイオマーカを発見するために行った。リレーショナルサーコスプロット(図7)において、HSCバイオマーカのより大きな多様性が、GIグループよりもGI&GIIグループについて見出された。GI&GIIグループについてのこの特定の多様性は、中胚葉、多能性幹細胞およびIPSCなどの機能カテゴリを構成した。GIグループについてのバイオマーカの特異性は、骨芽細胞および脂肪細胞などのより間葉系の表現型に関係する。他の方法では、共通のバイオマーカは、造血前駆細胞、赤芽球前駆細胞、CD34+細胞、骨髄およびCD14+細胞などの造血系統でより多く発見された。SRC−IPSCの特性におけるHSC発現プロファイル(CD34+38−90+)の影響を見るために、SRC−IPSCグループを比較するための教師あり分析にHSCグループが導入された。教師なし分類によって行われる発現ヒートマップは、各異種移植SRC−IPSCグループが、いくつかのHSC関連バイオマーカ、すなわち、SRC−IPSCのGIグループとの関係でのHSCバイオマーカ、SRC−IPSCのGIおよびGIIグループとの関係でのHSCバイオマーカを発現することを示した(データは示さず)。SRC−IPSCの各グループにおいて濃縮されたHSCバイオマーカを比較するベン図は、共通に任意の遺伝子を示した(図8)。GIおよびGII能力を有するSRC−IPSC細胞は、GIグループ:FLT3(CD135)およびMPL(CD110)と比較していくつかの細胞表面分子を特に発現した。
各一次マウスについて、700万個の骨髄細胞を、二次マウスに移植した。20週後、これらの二次マウスを屠殺し、上記のように分析した。
Claims (20)
- 造血細胞移植片を調製する、または長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞の細胞の集団を濃縮する、インビトロの方法であって、前記方法は、
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/またはCD110の発現に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+および/またはCD110+である細胞を回収すること
を含む、方法。 - ステップb)において、細胞は、細胞表面抗原CD110の前記発現に基づいて選別され、ステップc)において、回収された細胞は、CD110+である、請求項1に記載の方法。
- ステップb)において、細胞は、細胞表面抗原CD135の前記発現に基づいてさらに選別され、ステップc)において、回収された細胞は、CD110+CD135+である、請求項2に記載の方法。
- ステップb)の前、後、またはそれと同時に、アペリン受容体(APLNR)の前記発現に基づいて細胞を選別すること、および、APLNR+である細胞を回収することをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ステップa)で提供される細胞の前記集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、肝臓および/もしくは脾臓から得られる造血幹細胞を含み、ならびに/または、不死化造血幹細胞を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ステップa)において提供される細胞の前記集団は、多能性幹細胞のインビトロ分化から得られる、好ましくは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞から選択される、造血幹細胞を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記方法はさらに、ステップa)の前に、
多能性幹細胞、好ましくは、胚様体(EB)の形成を誘導する人工多能性幹細胞を提供すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地中でEBを培養すること、および
EB細胞を解離すること
を含み、
それによって、ステップa)で提供される細胞の前記集団を得る、
請求項6に記載の方法。 - 前記液体培養培地は、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)リガンド、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、14〜19日間、好ましくは15〜18日間、より好ましくは17日間、前記液体培養培地で培養される、請求項7または8に記載の方法。
- 生着、具体的には、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞のマーカとしてのCD135および/またはCD110の使用。
- 細胞および薬学的に許容可能なキャリアを含む造血細胞移植片であって、細胞の少なくとも10%は、CD135+および/またはCD110+造血幹細胞であり、好ましくは細胞の少なくとも10%は、CD110+造血幹細胞である、造血細胞移植片。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法に従って調製される造血細胞移植片。
- 多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性リンパ球性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、卵巣癌および生殖細胞腫瘍などの悪性疾患、または、自己免疫疾患、アミロイドーシス、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群および先天性代謝異常などの非悪性疾患の処置に使用するための請求項11または12に記載の造血細胞移植片。
- 前記移植片は自家、同系または同種異系移植において使用される、請求項13に記載の使用のための造血幹細胞移植片。
- (i)血漿、血清、血小板溶解物および/または血清アルブミン、ならびに(ii)トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3−L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む液体細胞培養培地。
- (i)血漿、血清および/または血小板溶解物、ならびに(ii)トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3−L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む、請求項15に記載の液体細胞培養培地。
- 10〜100ng/mLのSCF、好ましくは10〜50ng/mLのSCF;および/または、
10〜100ng/mLのTPO、好ましくは10〜50ng/mLのTPO;および/または、
10〜100ng/mLのFLT3−L、好ましくは10〜50ng/mLのFLT3−L;および/または、
50〜300ng/mLのBMP4、好ましくは150〜250ng/mLのBMP4;および/または、
50〜300ng/mLのVEGF、好ましくは150〜250ng/mLのVEGF;および/または、
10〜100ng/mLのIL3、好ましくは20〜80ng/mLのIL3;および/または、
10〜100ng/mLのIL6、好ましくは20〜80ng/mLのIL6;および/または、
1〜20ng/mLのIL1、好ましくは1〜10ng/mLのIL1;および/または、
10〜200ng/mLのGCSF、好ましくは50〜150ng/mLのGCSF;および/または、
1〜20ng/mLのIGF1、好ましくは1〜10ng/mLのIGF1;
を含む、請求項15または16に記載の液体細胞培養培地。 - 1%〜20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%〜10%の血漿もしくは血清;または0.1%〜2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%〜1%の血小板溶解物;または0.1%〜2%の血清アルブミン、好ましくは0.5%〜1%の血清アルブミン;および/または、
5μg/mL〜20μg/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、好ましくは8μg/mL〜12μg/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン;および/または、
10μg/mL〜100μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、好ましくは30μg/mL〜60μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン;
を含む、請求項15〜17のいずれかに記載の液体細胞培養培地。 - 前記液体培養培地は、請求項15〜18のいずれかに定義された通りである、請求項8または9に記載の方法。
- 造血系統の細胞の成長および/または分化のため、胚様体の分化のため、および/または、造血細胞移植片の産生のための、請求項15〜18のいずれかに記載の液体細胞培養培地の使用。
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