JP2024516459A - 遺伝子治療のための新規プロモータ配列 - Google Patents
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Abstract
本発明は、導入遺伝子の効率的かつ十分な発現のためのプロモータ配列、並びに治療に使用するための当該プロモータ配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。特に、本発明は、中枢神経系の病理学的状態に対する遺伝子治療を提供するレンチウイルスベクターに関する。
Description
本発明は、導入遺伝子の効率的かつ十分な発現のためのプロモータ配列、並びに遺伝子治療に使用するための当該プロモータ配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。特に、本発明は、中枢神経系の病理学的状態に対する遺伝子治療を提供するレンチウイルスベクターに関する。
神経炎症は、他の現象に加えて、リソソーム蓄積症(LSD)を含むいくつかの遺伝性及び後天性神経変性疾患の発病及び進行において主要な役割を果たすミクログリア細胞活性化によって特徴付けられる。これらの状態のための遺伝子組換え造血幹細胞(HSC)の使用に基づくエクスビボ遺伝子治療(GT)の有益な効果は、移植された遺伝子組換えHSCに由来するミクログリア機能的に同等な細胞がレシピエントの中枢神経系(CNS)に移植され、そこで恒常性及びスカベンジング機能を発揮し、ミクログリア細胞の恒常性を正常化し、治療後の神経炎症を軽減することに依存している。更に、LSDに対するHSC GTでは、酵素コンピテントで遺伝的に修正された移植由来ミクログリア様細胞が、全ての常在CNS細胞に利用可能な治療因子(各LSDに対する目的の欠陥リソソーム酵素)を放出する。同様に、神経炎症及び神経変性を軽減するために、免疫調節因子又は他の抗酸化因子のミクログリア媒介送達を調べることができる。
神経変性疾患のためのこのGT戦略のための理想的なレンチウイルスベクター(LV)は、HSPC由来ミクログリア様細胞における治療導入遺伝子の調節された発現を促進するはずであり、神経炎症の存在下で上方制御され、恒常性CNS条件下で下方制御される。そのような転写パターンは、組織適合性白血球抗原のクラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC-II)α鎖免疫グロブリンドメインをコードするヒトHLA-DRA遺伝子に典型的である。クラスII分子は、ミクログリア細胞としてのプロフェッショナル抗原提示細胞によって低い基底レベルで構成的に発現され、それらの発現は炎症中に強く上方制御される(Jenny Pan-Yun Ting et al.Cell 2002)。
しかしながら、導入遺伝子の効率的かつ十分な発現を可能にするプロモータ配列、遺伝子導入ベクター、レトロウイルス、特にレンチウイルスベクターを開発する必要性が依然として存在する。
本発明によって提起され解決される技術的課題は、特にHSC移植に由来する関連するCNS関連骨髄/ミクログリア様細胞等の免疫細胞型における導入遺伝子の発現の効率的な制御を可能にするプロモータ配列を提供することである。このような問題は、本発明の請求項1に記載のプロモータ配列によって解決される。
内因性ヒトHLA-DRA遺伝子の推定調節領域の広範な分析に続いて、本発明の著者らは、最小の基礎転写活性を有し、ミクログリア細胞活性化時に高度に誘導可能であることを目的とした合成プロモータを特に設計した。この転写パターンを制御する調節エレメントを開示するために、本発明者らは、ヒト造血細胞株(K562細胞)及び非造血細胞株においてBroad Institute-Encode Projectによって作成された公的に利用可能な転写データ及びエピジェネティックデータを統合することによって、ヒトHLA-DRA遺伝子の推定調節領域を分析した。ヒトHLA-DRA転写開始部位の上流及び下流のゲノム領域のディープインシリコ分析により、彼らは、Chip-seqゲノムマップによって示されるように、造血特異的転写因子によって結合された活性プロモータ及び活性エンハンサとしてエピジェネティックにマークされた領域を同定した。エピジェネティックに同定されたプロモータ領域をRNA-seqデータによって確認した。
広い推定プロモータ領域が同定されると、本発明者らは、クラスII遺伝子発現を調節することが知られている一般的なDNAモチーフ(TATAボックス)及び特異的なDNAモチーフ(Beresford G.W,Nat Immunol 2001)を探索することによって、i)主要なMHC IIマスター調節因子、すなわちクラスII転写活性化因子(CIITA)を動員する多成分転写因子RFXの結合部位として働くW/S-ボックス及びX1-ボックス、ii)X2BP及びNF-Y転写因子に対する結合部位として作用するX2-ボックス及びY-ボックスとしてそれを改良した。
このインシリコ分析を、参照として、Beresford et al(Beresford G.W,Nat Immunol 2001)で公開されたS、X及びYボックス配列を使用して、モチーフベースの配列分析ソフトウェア(The MEME Suite,Bailey TL et al.,Nucleic Acids Res.2015)で行った。したがって、推定HLA-DRAコアプロモータ領域を同定し、レンチウイルス系に適合させて、最終的な合成HLA-DRAプロモータを作製した(以下、hHLA)。したがって、本発明のHLA-DRAベースのプロモータは、レンチウイルス系に適したコンパクトなサイズで設計される。
本明細書の実験節で報告された結果によって明確に実証されるように、免疫細胞型における所与の導入遺伝子の発現を制御するためにレンチウイルスベクターに挿入された場合、本発明の著者によって設計及び開発された新規hHLAプロモータは、HSC移植に由来する関連するCNS関連骨髄/ミクログリア様細胞においても、インビトロ及びインビボでmRNA及びタンパク質レベルで遺伝子発現を誘導することができる。
一実施形態では、本発明のプロモータ配列を合成し、標準的なLV骨格にクローニングして、生物学的に不活性なレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を制御して、レポーターLVを作製する。そのようなベクターは現在前臨床試験中であり、非常に高い感染力価で産生される能力、ヒト細胞株及び初代造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)をインビトロで効率的かつ安全に形質導入する能力、並びに野生型マウスにおいて行われる移植アッセイにおける長期の再増殖HSCにおいてインビボで高い導入遺伝子発現レベルを形質導入及び駆動する能力を実証した。
免疫細胞活性化に応答してその転写レベルを増加させる本発明のプロモータ配列の能力は、現在、ヒトミクログリア細胞において研究中である。特に、本発明の新規hHLAプロモータは、移植HSPCに由来する骨髄/ミクログリア細胞においてインビボで高い導入遺伝子発現を誘導することができ、エピジェネティックサイレンシング又は他の形態の望ましくない調節を受けていないミクログリア細胞への多能性細胞分化時に正しい調節プロファイルを維持するその能力を示唆する。
このタイプのプロモータは、小児期及び成人期の複数の遺伝性又は後天性の重度の神経変性疾患に典型的な病理学的状態である神経炎症の存在下で増加する治療用タンパク質の基底レベルの発現を必要とする細胞療法及び遺伝子治療アプローチに非常に有益であり得る。
したがって、本発明の著者らによって得られた結果は、CNSの病理学的状態、特に神経炎症を特徴とするものを治療するための遺伝子及び細胞療法アプローチにおける治療分子又は免疫調節分子の調節された発現を決定するための、治療目的のためのこの新しいhHLAプロモータの使用を強く支持する。
したがって、以下は本発明の一部を形成する。
-配列番号1を有するか、又は配列番号1の配列と90%超、好ましくは95%超、より好ましくは99%超の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるプロモータ配列;
-本明細書及び請求項1に定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列を含む遺伝子導入ベクター、特にレンチウイルスベクター;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列又はベクターを含むウイルスベクター粒子;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列、又はベクター、又はウイルスベクター粒子を含む単離された宿主細胞;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター又は粒子を感染又は形質導入された単離宿主細胞;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、又は粒子、又は細胞と、1つ以上の賦形剤又は希釈剤又は担体とを含む医薬組成物;
-医薬品又はワクチンとして使用するための、遺伝子治療に使用するための、造血幹療法に使用するための、及び/又はCNSの病理学的状態、特に神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するための、本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、粒子、医薬組成物、細胞;
-宿主細胞、特に造血幹細胞又は造血前駆細胞における導入遺伝子の発現を調節するための、本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター又は粒子のインビトロでの使用。
-配列番号1を有するか、又は配列番号1の配列と90%超、好ましくは95%超、より好ましくは99%超の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるプロモータ配列;
-本明細書及び請求項1に定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列を含む遺伝子導入ベクター、特にレンチウイルスベクター;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列又はベクターを含むウイルスベクター粒子;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによるプロモータ配列、又はベクター、又はウイルスベクター粒子を含む単離された宿主細胞;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター又は粒子を感染又は形質導入された単離宿主細胞;
-本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、又は粒子、又は細胞と、1つ以上の賦形剤又は希釈剤又は担体とを含む医薬組成物;
-医薬品又はワクチンとして使用するための、遺伝子治療に使用するための、造血幹療法に使用するための、及び/又はCNSの病理学的状態、特に神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するための、本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、粒子、医薬組成物、細胞;
-宿主細胞、特に造血幹細胞又は造血前駆細胞における導入遺伝子の発現を調節するための、本明細書及び特許請求の範囲で定義される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター又は粒子のインビトロでの使用。
本発明の好ましい特徴は、従属請求項の目的である。本発明の様々な態様の更なる特徴及び利点は、添付の図面と共に、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。好ましい実施形態は、本発明の特定の態様を説明及び例示することを意図しているが、その保護範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本発明及びその好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図を参照してよりよく理解することができる。
以下では、本発明のいくつかの実施形態を説明する。様々な実施形態の特徴は、適合する場合、組み合わせることができることが意図されている。一般に、後続の実施形態は、前述の実施形態との相違点に関してのみ開示される。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
プロモータ配列
「プロモータ」及び「プロモータ配列」は交換可能に使用され、コード配列又は機能性RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般に、コード配列はプロモータ配列の3’側に位置する。プロモータは、その全体が天然の遺伝子に由来していてもよく、天然に見出される異なるプロモータに由来する異なる因子から構成されていてもよく、又は合成DNA断片を含有していてもよい。
「プロモータ」及び「プロモータ配列」は交換可能に使用され、コード配列又は機能性RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般に、コード配列はプロモータ配列の3’側に位置する。プロモータは、その全体が天然の遺伝子に由来していてもよく、天然に見出される異なるプロモータに由来する異なる因子から構成されていてもよく、又は合成DNA断片を含有していてもよい。
本発明の一態様によれば、配列番号1を有するポリヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるプロモータ配列が提供される。
本発明の一態様によれば、配列番号1の配列と90%超、好ましくは95%超、より好ましくは98%超、より好ましくは99%超の同一性を共有するプロモータ配列が提供される。本明細書に記載の機能を果たすプロモータの能力を損なわない限り、プロモータ配列に異なる変異を導入してもよいことを理解されたい。
参照ポリヌクレオチド配列に関して本明細書で使用される「配列同一性パーセント(%)」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリヌクレオチド配列中の核酸と同一である候補配列中の核酸のパーセンテージとして定義される。核酸又はアミノ酸配列同一性のパーセントを決定するためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、又はMegalignソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。例えば、パーセント配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムBLASTを使用して生成され得る。
一実施形態によれば、プロモータ配列は合成配列である。
本発明は更に、配列番号2を含むか若しくはそれからなるmRNA配列、又は配列番号2の配列と98%を超える、より好ましくは99%を超える同一性を有するmRNA配列を包含する。
遺伝子導入ベクター/レンチウイルスベクター
本発明の一態様によれば、本発明のプロモータ配列を含む遺伝子治療に使用するための遺伝子導入ベクターが提供される。
本発明の一態様によれば、本発明のプロモータ配列を含む遺伝子治療に使用するための遺伝子導入ベクターが提供される。
一実施形態では、遺伝子導入ベクターは、当該プロモータ配列の転写制御下で、導入遺伝子、特に導入遺伝子配列であるヌクレオチド配列も含む。
本明細書に記載の発現ベクターは、転写され得る核酸含有配列の領域を含む。したがって、mRNA、tRNA及びrRNAをコードする配列は、この定義内に含まれる。
ベクトルは、ある環境から別の環境への実体の導入を可能にする、又は容易にするツールである。例として、組換えDNA技術で使用されるいくつかのベクターは、DNAの断片(例えば異種DNA断片、例えば異種cDNA断片)等の実体を標的細胞に導入することを可能にする。場合により、標的細胞内に入ると、ベクターは次いで、細胞内の異種DNAを維持するのに役立ち得るか、又はDNA複製の単位として作用し得る。組換えDNA技術で使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体又はウイルスが挙げられる。
特に、本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、追加のDNA断片がライゲーションされ得る染色体外環状二本鎖DNA分子を指す。プラスミドは、ベクターの一種であり、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌プラスミド及びエピソーム哺乳動物プラスミド)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。
非ウイルス送達系としては、限定されないが、DNAトランスフェクション法が挙げられる。ここで、トランスフェクションは、遺伝子を標的哺乳動物細胞に送達するために非ウイルスベクターを使用するプロセスを含む。
一実施形態では、遺伝子導入ベクターは、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターであるか、又は非ウイルスベクターである。
本発明に従って使用され得る非ウイルス遺伝子導入ベクターの適切な例としては、転移可能要素に基づく全ての非ウイルス遺伝子導入ベクター、例えば、sleeping beautyトランスポゾンシステム又はPiggyBacトランスポゾンシステムが挙げられる。
好ましい実施形態では、遺伝子導入ベクターはレンチウイルスから誘導可能であり、特にレンチウイルスベクターである。
本発明の文脈内で、「レンチウイルスベクター」はまた、シス作用性レンチウイルスRNA又はDNA配列を含み、トランスで提供されるレンチウイルスタンパク質を必要とする導入遺伝子を有する宿主細胞の形質導入のための非複製ベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、当該レトロウイルスベクターの産生又は発達の段階に応じて、RNA又はDNA分子の形態で存在し得る。
レンチウイルスベクターは、プラスミド等の組換えDNA分子の形態であり得る。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスと他のタンパク質との複合体内のRNA分子(複数可)等のレンチウイルス粒子ベクターの形態であり得る。典型的には、改変又は組換えレンチウイルス粒子に対応するレンチウイルス粒子ベクターは、2コピーの一本鎖RNAから構成されるゲノムを含む。これらのRNA配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖DNA配列(プロウイルスベクターDNA)からの転写によって得ることができ、又は形質転換された宿主細胞におけるプラスミドDNA(プラスミドベクターDNA)の一過性発現から得ることができる。
レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV-1又はHIV-2)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ウマ感染性脳炎ウイルス(EIAV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)及びネコ免疫不全ウイルス(FN)に由来し、病原性に関与する遺伝子決定基を除去し、治療効果を得るのに有用な新しい決定基を導入するように改変されている。
レンチウイルスベクターの多くの異なる供給源を使用することができ、本明細書に記載の機能を果たすベクターの能力を損なわない限り、特定のレンチウイルスベクターにおける多くの置換及び変更に対応することができることを理解されたい。
様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる本発明のプロモータ配列を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクターは、1つ以上のレポーター遺伝子配列を含む。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子配列」は、発現されると、その存在又は活性を監視することができるタンパク質の産生をもたらす任意の遺伝子配列である。本発明の一実施形態では、レポーター遺伝子配列は、標的細胞に通常は存在しない酵素又は他のタンパク質をコードし、したがって、その存在は、そのような細胞におけるベクターの存在を確定的に確立することができる。
本発明は更に、レンチウイルスベクター粒子を作製するための方法を包含する。そのような方法は、レンチウイルスベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクトする工程と、レトロウイルスの少なくとも構造タンパク質及びインテグラーゼタンパク質をコードするウイルスDNA配列を含有するパッケージングプラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程と、当該レンチウイルスベクターの発現及び当該レンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、当該トランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程と、当該培養された宿主細胞における発現及びパッケージングから生じるレンチウイルスベクター粒子を回収する工程と、を含み得る。
本発明は更に、本発明のレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター粒子を包含する。レンチウイルスベクター粒子は、本発明のプロモータの制御下で導入遺伝子配列を含むことができる。好ましくは、プロモータ配列は、配列番号1のプロモータ配列と90%超、好ましくは95%超、より好ましくは99%超の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に、本明細書に開示されるDNA構築物のセットを宿主細胞に導入することと、ウイルスベクター粒子を得ることと、を含むレンチウイルスベクターを作製するための方法を包含し、一実施形態では、そのような方法は、
a)本明細書に開示される実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクトする工程と、
b)当該レンチウイルスベクターの発現及びレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、当該トランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程と、
d)当該培養された宿主細胞において工程c)の発現及びパッケージングから生じるレンチウイルスベクター粒子を回収する工程と、
を含む。
a)本明細書に開示される実施形態のいずれかによるレンチウイルスベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクトする工程と、
b)当該レンチウイルスベクターの発現及びレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、当該トランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程と、
d)当該培養された宿主細胞において工程c)の発現及びパッケージングから生じるレンチウイルスベクター粒子を回収する工程と、
を含む。
本発明によるレンチウイルスベクターは、全身、局所、又は皮膚、皮内、例えば腫瘍内投与経路を含む既知の投与経路を介して患者に直接投与することができる。本明細書で使用される場合、「投与すること」、「投与」等の用語は、任意の有効な経路によって患者に治療剤(例えば、レンチウイルスベクター又は本発明の改変宿主細胞の集団)を直接与えることを指す。
エクスビボ投与、例えば標的細胞のエクスビボ形質導入、その後の治療細胞の治療される患者への投与も本発明に包含される。
導入遺伝子
本発明の文脈内で、「導入遺伝子」は、遺伝子導入ベクター、特に遺伝子導入ベクターで形質導入される細胞中に通常存在しないか又は正しく発現されないレンチウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター内の核酸配列であり得る。レンチウイルスベクターは、この配列を形質導入細胞に導入するのに役立つ。「導入遺伝子」という用語は、導入遺伝子の形質導入を促進するベクターの配列を含まない。導入遺伝子は、センス核酸分子又はアンチセンス核酸分子であり得る。本発明の一実施形態では、導入遺伝子は外因性核酸配列である。本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、特定の生物(例えば、ヒト)又は生物内の特定の位置(例えば、器官、組織、又はヒト細胞等の細胞)に天然には見られない核酸配列、又は細胞に添加された核酸配列を記載し、本発明の文脈では、外因性導入遺伝子は、細胞又は細胞が生じた親前駆細胞に導入されたものである(例えば、改変HSPCからのミクログリア細胞)。
本発明の文脈内で、「導入遺伝子」は、遺伝子導入ベクター、特に遺伝子導入ベクターで形質導入される細胞中に通常存在しないか又は正しく発現されないレンチウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター内の核酸配列であり得る。レンチウイルスベクターは、この配列を形質導入細胞に導入するのに役立つ。「導入遺伝子」という用語は、導入遺伝子の形質導入を促進するベクターの配列を含まない。導入遺伝子は、センス核酸分子又はアンチセンス核酸分子であり得る。本発明の一実施形態では、導入遺伝子は外因性核酸配列である。本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、特定の生物(例えば、ヒト)又は生物内の特定の位置(例えば、器官、組織、又はヒト細胞等の細胞)に天然には見られない核酸配列、又は細胞に添加された核酸配列を記載し、本発明の文脈では、外因性導入遺伝子は、細胞又は細胞が生じた親前駆細胞に導入されたものである(例えば、改変HSPCからのミクログリア細胞)。
本発明の好ましい実施形態によれば、導入遺伝子配列は、ポリペプチド、特に治療用ポリペプチド又は酵素をコードし、当該酵素は、例えば、リソソーム又は触媒酵素、炎症又は免疫応答の調節に関与する分子、成長/栄養因子、それらの組合せ等の群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、当該導入遺伝子は、中枢神経系(CNS)の病理学的状態、より具体的には神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態と診断された、又は罹患が疑われる対象に治癒的、予防的、又は改善的利益を提供するポリペプチドをコードする。
一実施形態では、本明細書に開示されるプロモータ配列は、導入遺伝子に「作動可能に連結される」される。「作動可能に連結される」という用語は、記載された構成要素が意図された方法で機能することを可能にする関係にあることを意味する。
宿主細胞
本発明は更に、プロモータ配列又は遺伝子導入ベクター、特に本発明のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。
本発明は更に、プロモータ配列又は遺伝子導入ベクター、特に本発明のレンチウイルスベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。
本発明の別の態様によれば、本発明による遺伝子導入ベクター又は粒子に感染した又は形質導入された細胞が提供される。細胞は、当技術分野で公知の任意のアプローチを使用することによって、インビボ又はインビトロシナリオで形質導入又は感染され得る。
例えば、インビトロで形質導入又は感染された場合、所望のレシピエント細胞は、治療を必要とする対象から取り出され、本発明による遺伝子導入ベクター又は粒子で形質導入又は感染され、対象に再導入され得る。インビトロで形質導入された細胞は、サザンブロット及び/又はPCR等の従来の技術を使用して、又は選択マーカーを使用することによって、目的の遺伝子を有する細胞についてスクリーニングすることができる。次いで、形質導入又は感染に成功した細胞は、導入された遺伝子又は他のポリヌクレオチド及び/又はウイルスベクター核酸又はその一部を細胞内で発現することができなければならない。
次いで、形質導入又は感染した細胞を医薬組成物に製剤化することができ、組成物は、1つ以上の用量で、以下に更に記載されるような様々な技術によって対象に導入することができる。
細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来し得るか、又はその一部を形成し得る。本明細書に開示される実施形態のいずれかによる宿主細胞は、特に、健康な個体又は治療される疾患を有する個体、例えば診断された疾患又は障害を有する個体に由来し得る。
本発明の遺伝子治療方法における形質導入/トランスフェクション及び投与に適した細胞には、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。
一態様において、細胞は造血幹細胞又は造血前駆細胞である。用語「造血幹細胞」又は「HSC」は、それだけに限らないが、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞及びリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞及びT細胞)を含む多様な系統の成熟血液細胞に自己再生及び分化する能力を有する多能性幹細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、骨髄、臍帯血、末梢循環(動員末梢血を含む)、胎盤血、胎児肝臓、及びリンパ系軟組織から単離される造血幹細胞及び/又は前駆細胞である。更に、HSCは、長期再増殖HSC(LT-HSC)及び短期再増殖HSC(ST-HSC)も指す。LT-HSC及びST-HSCは、機能的可能性及び細胞表面マーカー発現に基づいて区別される。これらのHSCのいずれも、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて使用され得る。
造血前駆細胞(HPC)は、特殊化された細胞になるように更に分化することができるHSCの子孫である。自己再生する幹細胞は、より多くの幹細胞を産生し、分化の経路を開始する幹細胞は、前駆細胞を産生する。HSC及び/又はHPCを含む集団は、本明細書ではHSPCと呼ばれる。
宿主細胞はまた、同様にCNS外適用のためのミクログリア細胞(すなわち、インビボ遺伝子導入によって直接形質導入される)又は単球/マクロファージであり得る。本明細書で使用される「ミクログリア」という用語は、中枢神経系の免疫細胞を意味する。
本発明の実施形態のいずれかによるプロモータは、循環単球及びマクロファージにおいても高発現することが予想される。
特定の実施形態では、形質導入又はトランスフェクトされた細胞は、移植によって、例えば骨髄移植の一部として、本発明に従ってそれを必要とする対象に投与され得る。
1つの好ましい実施形態において、本発明は、脳ミクログリア細胞に発達する可能性を有する形質導入細胞又はトランスフェクト細胞を提供する。一実施形態では、細胞は、移植された造血幹細胞/前駆細胞に由来する骨髄細胞又はミクログリア細胞である。
本発明の更なる態様によれば、導入遺伝子、特に治療用ポリペプチド又は酵素をコードする導入遺伝子を発現するように改変された宿主細胞、特に造血幹細胞の集団を産生するための方法であって、ベクター、ウイルス粒子又は組成物が宿主細胞に形質導入することを可能にする条件下で、宿主細胞の試料を本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子又は組成物と接触させることを含む方法も提供される。適切には、この方法はエクスビボで実施される。
1つの実施形態において、上記方法は、形質導入された宿主細胞における当該導入遺伝子の発現レベルを定性的及び/又は定量的分析によって決定する工程を更に含む。「定性的及び/又は定量的分析」という用語は、目的の導入遺伝子の発現レベルの決定及び/又は定量に適しているであろう、当技術分野で利用可能な任意の標準的な技術又はアッセイを包含することを意味する。上述のマーカーのいずれかの発現レベルを決定及び/又は定量するのに適したアッセイの非限定的な例としては、免疫学的アッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、RNA発現レベルのアッセイ又はそれらの組合せが挙げられる。上記の全ての試験は当業者に公知であり、その発現を決定及び/又は定量しなければならない導入遺伝子及び使用される細胞の種類を知ることにより、最も適切なプロトコルを選択することができる。
1つの好ましい実施形態では、導入遺伝子発現レベルは、目的の遺伝子によってコードされる対応するポリペプチド及び/又は酵素産物の濃度又は相対存在量を測定することによって決定することができる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したタンパク質発現アッセイには、プロテオミクスアプローチ、免疫組織化学的及び/又はウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ELISA、酵素結合免疫濾過アッセイ(ELIFA)、質量分析、質量分析イムノアッセイ、及び生化学的酵素活性アッセイが含まれる。
組成物
本発明の別の態様によれば、本発明による遺伝子導入ベクター又は粒子又は宿主細胞を、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と一緒に含む医薬組成物が提供される。本発明は更に、医薬品、特に遺伝子治療、より具体的にはエクスビボ及び/又はインビボ遺伝子治療として使用するためのそのような組成物を包含する。
本発明の別の態様によれば、本発明による遺伝子導入ベクター又は粒子又は宿主細胞を、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と一緒に含む医薬組成物が提供される。本発明は更に、医薬品、特に遺伝子治療、より具体的にはエクスビボ及び/又はインビボ遺伝子治療として使用するためのそのような組成物を包含する。
本発明はまた、遺伝子治療によって個体を治療するための医薬組成物であって、1つ以上の送達可能な治療用及び/又は診断用導入遺伝子(複数可)又はそれによって産生される若しくはそれから得られるウイルス粒子を含む治療有効量の本発明のベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、好ましくはヒト使用のためのものであり得る。組成物は、場合により、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含み得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される細胞培養培地を含む、生理学的に適合性であれば、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含む。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な製薬慣行に関して選択することができる。それらは、例えば非経口的に、例えば空洞内に、静脈内に、CNSの実質内に(intra-parenchimally)、脳脊髄液(脳室内又は髄腔内)中に、筋肉内又は皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖類を含有し得る滅菌水溶液の形態で最もよく使用され得る。
滅菌注射溶液は、必要量の本発明の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。
当業者は、投与される組成物中の遺伝子ベクター、ウイルス粒子又は細胞並びに任意の添加剤、ビヒクル及び/又は担体の量を容易に決定することができる。特に、治療を必要とする対象に投与される本発明による細胞の量及び投与経路は、例えば、細胞中の所望のタンパク質(複数可)の発現レベル、首尾よく形質導入された細胞の割合、ベクターコピー数(VCN)、患者の年齢、体重、性別、医薬製剤方法、並びに治療される疾患の重症度等の多数の要因に依存し得る。
組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。組成物は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量の密封容器で提供することができる。
所望であれば、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、小分子又は様々な薬学的に活性な薬剤と組み合わせて投与されてもよい。追加の薬剤が意図する遺伝子治療を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさない限り、組成物に含まれてもよい他の成分に実質的に制限はない。
治療
本発明は更に、医薬品として使用するための、特に遺伝子治療で使用するための、好ましくはエクスビボ及び/又はインビボ遺伝子治療で使用するための、より好ましくは造血幹細胞/前駆細胞療法で使用するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物、宿主細胞を包含する。特に、中枢神経系(CNS)の病理学的状態、より具体的には、神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するためのものである。特定の一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子又は医薬組成物は、実質内又は脳室内又は髄腔内遺伝子移入によるミクログリア細胞のインビボ形質導入に使用することができる。
本発明は更に、医薬品として使用するための、特に遺伝子治療で使用するための、好ましくはエクスビボ及び/又はインビボ遺伝子治療で使用するための、より好ましくは造血幹細胞/前駆細胞療法で使用するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物、宿主細胞を包含する。特に、中枢神経系(CNS)の病理学的状態、より具体的には、神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するためのものである。特定の一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子又は医薬組成物は、実質内又は脳室内又は髄腔内遺伝子移入によるミクログリア細胞のインビボ形質導入に使用することができる。
本発明は、本明細書中に記載される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物、宿主細胞もまた、CNSの病理学的状態を予防及び/又は改善するために使用され得ることを意図する。本明細書で使用される「病理学的状態を改善する」という表現は、治療なしの場合の程度又は時間経過と比較して、疾患、障害、又は状態の程度及び/又は望ましくない臨床症状が軽減され、並びに/あるいは進行の時間経過が遅くなるか又は長くなることを意味する。
本発明は更に、遺伝性又は後天性神経変性疾患(例えば、リソソーム蓄積症、例えば、異染性白質ジストロフィー(MLD)、グロボイド細胞白質ジストロフィー(GLD)、GM1ガングリオシドーシス、GM2ガングリオシドーシス、ムコ多糖症(MPS)等、ペルオキシソーム病、例えば、X連鎖副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、副腎脊髄ニューロパチー(AMN)等、成人発症後天性神経変性状態、例えば、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、多発性硬化症(MS)等)から選択される疾患を治療するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物、宿主細胞を包含する。
本発明は更に、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物又は宿主細胞を対象に投与する工程を含む、対象を治療する方法も包含する。
以下の工程:
-対象が中枢神経系の病理学的状態に罹患しているかどうかを決定する工程と、
-対象がそのような状態に罹患している場合、当該対象に、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物又は宿主細胞を投与する工程と、
を含む対象の治療方法も本明細書に開示される。
-対象が中枢神経系の病理学的状態に罹患しているかどうかを決定する工程と、
-対象がそのような状態に罹患している場合、当該対象に、本明細書に開示される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター、ウイルス粒子、医薬組成物又は宿主細胞を投与する工程と、
を含む対象の治療方法も本明細書に開示される。
いくつかの態様において、治療を受ける対象は、対象に再投与される前に、先に記載された方法のいずれかに従ってその後に改変される細胞(例えば造血幹細胞及び/又は前駆細胞)を提供するドナーである。そのような場合、取り出された細胞(例えば、HSPC)は、例えば、本明細書に開示される実施形態のいずれか1つによる治療用ポリペプチド又は酵素をコードする導入遺伝子の組込み後に対象に再注入され得る。治療を受けている対象が細胞ドナーを兼ねる場合、移植された細胞は移植拒絶を受けにくい。
あるいは、当該治療を受けている対象と細胞ドナーとは異なっていてもよい。
宿主細胞、特に造血幹細胞又は造血前駆細胞における導入遺伝子の発現を調節するための、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる遺伝子導入ベクター又は粒子のインビトロでの使用も本発明の一部を形成する。好ましい一実施形態では、当該遺伝子導入ベクター又は粒子を使用して、神経炎症の存在下で当該導入遺伝子の発現を特異的に上方制御し、当該宿主細胞において恒常性CNS条件下でそれを下方制御する。本明細書で使用される「上方制御された」という用語は、健康な状態で一般に決定される同じ発現と比較して、及び/又は標準と比較して、mRNA転写レベルの増加を指す。
このように本発明の異なる実施形態を説明してきたが、当業者であれば、本明細書の開示は例示にすぎず、本発明の範囲内で様々な他の代替、適合、及び修正を行うことができることに留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に示される特定の実施形態に限定されない。
本明細書に開示された実施形態をよりよく説明する目的を有する例を以下に報告するが、そのような例は、決して先行する説明及び後続の特許請求の範囲の限定と見なされるべきではない。
例
例1
ヒトHLA_DRA推定調節領域に基づく新規プロモータの設計
ヒト細胞におけるBroad Institute-Encode Projectによって作成された公的に利用可能な転写及びエピジェネティックデータを統合することによって、6番染色体上のヒトHLA-DRA転写開始部位(TSS)の周囲のゲノム領域において、推定転写調節エレメントのいくつかのクラスターを同定した。4つの活性エンハンサを、H3K4me1及びH3K27acヒストン修飾が濃縮され、Chip-seqゲノムマップによって示されるように造血特異的転写因子によって結合される領域として同定し(図1)、RNA-seqデータによる活性転写の証拠と組み合わせて、H3K4me3、H3K27ac及びポリメラーゼ-II結合のピークによって活性プロモータとしてエピジェネティックにマークされた領域を同定した。これらのゲノム領域を、ENCODE候補のシス調節エレメント(cCRE)分析によって、エンハンサ様及びプロモータ様のシグネチャ(図1のオレンジ色及び赤色の水平バー)として更に定義した。
例1
ヒトHLA_DRA推定調節領域に基づく新規プロモータの設計
ヒト細胞におけるBroad Institute-Encode Projectによって作成された公的に利用可能な転写及びエピジェネティックデータを統合することによって、6番染色体上のヒトHLA-DRA転写開始部位(TSS)の周囲のゲノム領域において、推定転写調節エレメントのいくつかのクラスターを同定した。4つの活性エンハンサを、H3K4me1及びH3K27acヒストン修飾が濃縮され、Chip-seqゲノムマップによって示されるように造血特異的転写因子によって結合される領域として同定し(図1)、RNA-seqデータによる活性転写の証拠と組み合わせて、H3K4me3、H3K27ac及びポリメラーゼ-II結合のピークによって活性プロモータとしてエピジェネティックにマークされた領域を同定した。これらのゲノム領域を、ENCODE候補のシス調節エレメント(cCRE)分析によって、エンハンサ様及びプロモータ様のシグネチャ(図1のオレンジ色及び赤色の水平バー)として更に定義した。
推定上のHLA-DRAプロモータとして広い領域が同定されると、「The UCSC Genome Browser」(https://genome.ucsc.edu/)による対応するゲノム領域を入手し、重要な調節DNAモチーフW/Sボックス、Xボックス及びYボックスを同定するために詳細に分析した(図2A)。分析される2つの配列、HLA-DRA TSSのより近位の領域からなる短い配列(図2B、HLA-DRA-SHORT)、又はエピジェネティックマークのピークを含む拡張バージョン(図2B、HLA-DRA-LONG)を定義した。これらのゲノム配列をMEME Suiteでスキャンして、Beresford et al.で公開されている配列を参照として使用して、基底のS、X及びYボックスを同定した(図2B)。分析から、HLA-DRA-SHORT配列はW/S-X-Yカセット全体を含み、適切なHLA-DRA転写調節を再現するためにレンチウイルス系で使用されるHLA-DRAベースの合成プロモータを生成するための追加の配列最適化のために選択された。本発明者らは、HLA-DRA-SHORT配列を徹底的に研究して、パッケージング細胞におけるレンチウイルスゲノム産生の早期停止をもたらし得るポリ-アデニル化の全てのカノニカル及び潜在的シグナル、並びに組み込まれたプロウイルスと宿主ゲノムとの間で生じるトランススプライシング事象によって形質導入細胞における転写変化を誘導し得るスプライシングのシグナルを排除した。配列最適化の後、最終的なHLA-DRAベースの合成プロモータ(hHLA)は361bp長をもたらした。
例2
GFP発現を駆動するための新しいhHLAプロモータを有するレンチウイルスベクターの作製
hHLAプロモータをGenewiz(Leipzig,Germany)によって合成し、標準的な自己不活性化レンチウイルス骨格にクローニングして緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を駆動し、LV.hHLA.GFP(hHLA-GFP)を作製した。対照ベクターとして、GFPの発現を駆動する強力な構成的ヒトリン酸グリセラートキナーゼ(PGK)プロモータを有する同一の構築物を使用した(hPGK-GFP)。レンチウイルス粒子を、標準的な操作手順に従ってHEK293T細胞の一過性トランスフェクションによって第3世代レンチウイルス系によって産生させた。次いで、LVを超遠心分離によって濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、使用するまで-80℃で保存した。培養2週間後に、各LVストックの段階希釈で形質導入されたHEK293T細胞において得られたベクターコピー数(VCN)を評価することによって、ウイルスストック1ml当たりの形質導入単位(TU/ml)としてLV感染力価を決定した。VCNは、デジタル液滴PCR(ddPCR)によって決定した。いくつかの製造では、全てのLVは、一般に109TU/mlを超える感染力価で製造することができた。
GFP発現を駆動するための新しいhHLAプロモータを有するレンチウイルスベクターの作製
hHLAプロモータをGenewiz(Leipzig,Germany)によって合成し、標準的な自己不活性化レンチウイルス骨格にクローニングして緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を駆動し、LV.hHLA.GFP(hHLA-GFP)を作製した。対照ベクターとして、GFPの発現を駆動する強力な構成的ヒトリン酸グリセラートキナーゼ(PGK)プロモータを有する同一の構築物を使用した(hPGK-GFP)。レンチウイルス粒子を、標準的な操作手順に従ってHEK293T細胞の一過性トランスフェクションによって第3世代レンチウイルス系によって産生させた。次いで、LVを超遠心分離によって濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、使用するまで-80℃で保存した。培養2週間後に、各LVストックの段階希釈で形質導入されたHEK293T細胞において得られたベクターコピー数(VCN)を評価することによって、ウイルスストック1ml当たりの形質導入単位(TU/ml)としてLV感染力価を決定した。VCNは、デジタル液滴PCR(ddPCR)によって決定した。いくつかの製造では、全てのLVは、一般に109TU/mlを超える感染力価で製造することができた。
図3に示すように、hHLA-GFP LVは、ヒトHEK293T線維芽細胞に効率的に形質導入することができ、ウイルス調製物の量が増加すると導入遺伝子発現の増加が決定される。
例3
インビボでのhHLAプロモータによって駆動されるGFP発現の評価
中枢神経系(CNS)におけるミクログリア細胞によって代表される臨床的に関連する細胞型及び器官においてインビボで導入遺伝子の発現を駆動する新たに設計されたhHLAプロモータの能力を、野生型C57BL/6JマウスにおけるHSPC移植アッセイによって調べた。骨髄が完全に破壊されたレシピエントマウスにおけるHSPC移植後、これらの細胞は、レシピエントCNSを再増殖させ、元の骨髄細胞区画をドナー由来の骨髄/ミクログリア様細胞で置き換えることができる。
インビボでのhHLAプロモータによって駆動されるGFP発現の評価
中枢神経系(CNS)におけるミクログリア細胞によって代表される臨床的に関連する細胞型及び器官においてインビボで導入遺伝子の発現を駆動する新たに設計されたhHLAプロモータの能力を、野生型C57BL/6JマウスにおけるHSPC移植アッセイによって調べた。骨髄が完全に破壊されたレシピエントマウスにおけるHSPC移植後、これらの細胞は、レシピエントCNSを再増殖させ、元の骨髄細胞区画をドナー由来の骨髄/ミクログリア様細胞で置き換えることができる。
系統陰性(Lin-)HSPCをCD45.1ドナーマウスの骨髄(BM)から回収し、100のMOIで16時間、hHLA-GFP又はhPGK-GFPベクターで最初に形質導入した。形質導入後、細胞を洗浄し、完全骨髄破壊CD45.2レシピエントC57BL/6Jマウス(N=3/LV)に脳室内(ICV)投与によって移植した。細胞の一部を、10を超える平均値で、2つのLVについて同等の結果をもたらしたVCN測定のために2週間培養で維持した。ICV細胞投与の5日後、移植されたマウスは、全身造血再構成を支持するために総BM細胞を静脈内投与された。
移植後45日目に、LVhHLA-GFPを形質導入されたHSPCを受けたマウス(N=3)及びLVhPGK-GFPを形質導入されたHSPCを受けたマウス(N=3)を屠殺した。脳を灌流し、回収し、単一細胞ホモジネートに処理して、ドナー-細胞キメラ現象及びGFP発現について細胞蛍光測定によって分析した。全骨髄性/ミクログリア細胞を、CD45及びCD11b発現によって同定した(図4A、左)。ドナー細胞キメラ現象を、全CD11b+細胞集団におけるCD45.1+細胞対CD45.2+細胞の割合として決定した(図4A、中央)。最後に、LV+骨髄系/ミクログリア細胞の割合を、CD11bCD45.1+細胞集団におけるGFP発現を定量することによって決定した(図4A、右)。
hHLA-GFP又は対照LVのいずれかを形質導入した2セットのLin-細胞を移植したマウスの脳において、同程度のレベルのドナー-細胞キメラ現象が観察された。同様に、hHLA-GFPベクターは、HSC由来ミクログリア細胞において、対照LVと同等の形質導入効率を達成した(図4B、中央)。最後に、hHLAプロモータは、強力で構成的なhPGKプロモータよりもわずかに低い、インビボでのミクログリア細胞における、MFIとして定量される高いGFP発現(図4B、左)を駆動することを示した。
結論
ここでは、免疫細胞型において所与の導入遺伝子の発現を制御するためにレンチウイルスベクターに挿入された場合に設計及び開発された新規hHLAプロモータが、HSC移植に由来する関連するCNS関連骨髄/ミクログリア様細胞においても、インビトロ及びインビボでmRNA及びタンパク質レベルで遺伝子発現を誘導することができることが実証された。実際、この新規hHLAプロモータは、移植HSPCに由来する骨髄/ミクログリア細胞においてインビボで高い導入遺伝子発現を誘導することができ、エピジェネティックサイレンシング又は他の形態の望ましくない調節を受けていないミクログリア細胞への多能性細胞分化時に正しい調節プロファイルを維持するその能力を示唆する。
ここでは、免疫細胞型において所与の導入遺伝子の発現を制御するためにレンチウイルスベクターに挿入された場合に設計及び開発された新規hHLAプロモータが、HSC移植に由来する関連するCNS関連骨髄/ミクログリア様細胞においても、インビトロ及びインビボでmRNA及びタンパク質レベルで遺伝子発現を誘導することができることが実証された。実際、この新規hHLAプロモータは、移植HSPCに由来する骨髄/ミクログリア細胞においてインビボで高い導入遺伝子発現を誘導することができ、エピジェネティックサイレンシング又は他の形態の望ましくない調節を受けていないミクログリア細胞への多能性細胞分化時に正しい調節プロファイルを維持するその能力を示唆する。
これらの結果は、神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するための遺伝子及び細胞療法アプローチにおける治療分子又は免疫調節分子の調節された発現を決定するための、治療目的のためのこの新しいhHLAプロモータの使用を強く支持する。
明細書の配列部分:
配列番号1-hHLAプロモータ配列
配列番号2-hHLAプロモータの対応するmRNA配列
配列番号1-hHLAプロモータ配列
配列番号2-hHLAプロモータの対応するmRNA配列
配列表1 <223>配列番号1-hHLAプロモータ配列
配列表2 <223>配列番号2-hHLAプロモータの対応するmRNA配列
配列表2 <223>配列番号2-hHLAプロモータの対応するmRNA配列
Claims (17)
- 配列番号1を有するか、又は配列番号1の配列と99%を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるプロモータ配列。
- 請求項1に記載のプロモータ配列を含む遺伝子導入ベクター。
- 前記ベクターがウイルス又は非ウイルス遺伝子導入ベクターである、請求項2に記載の遺伝子導入ベクター。
- レンチウイルスベクターであるか、又はレンチウイルスから誘導可能である、請求項2又は3に記載の遺伝子導入ベクター。
- 導入遺伝子配列を含み、前記導入遺伝子配列が前記プロモータ配列の転写制御下にある、請求項1~4のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター。
- 前記導入遺伝子が酵素をコードし、特に前記酵素が、リソソーム酵素若しくは触媒酵素、炎症若しくは免疫応答の調節に関与する分子、成長/栄養因子又はそれらの組合せの群から選択される、請求項5に記載の遺伝子導入ベクター。
- 請求項1に記載のプロモータ配列又は請求項2~6のいずれか一項に記載のベクターを含むウイルスベクター粒子。
- 請求項1に記載のプロモータ配列又は請求項2~6のいずれか一項に記載のベクター又は請求項7に記載のウイルスベクター粒子を含む単離宿主細胞。
- 請求項2~6又は7のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター又は粒子に感染又は形質導入された単離宿主細胞。
- 造血幹細胞又は造血前駆細胞である、請求項8又は9に記載の細胞。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター又は請求項7に記載の粒子又は請求項8~10のいずれか一項に記載の細胞と、1種又は複数の賦形剤又は希釈剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 医薬品又はワクチンとして使用するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター、請求項7に記載の粒子、請求項11に記載の医薬組成物、請求項8~11に記載の細胞。
- 遺伝子治療に使用するための、特にエクスビボ及び/又はインビボ遺伝子治療に使用するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター、請求項7に記載の粒子、請求項11に記載の医薬組成物、請求項8~11に記載の細胞。
- 造血幹療法に使用するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター、請求項7に記載の粒子、請求項11に記載の医薬組成物、請求項8~11に記載の細胞。
- CNSの病理学的状態、特に神経炎症を特徴とするCNSの病理学的状態を治療するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター、請求項7に記載の粒子、請求項11に記載の医薬組成物、請求項8~11に記載の細胞。
- リソソーム蓄積症(LSD)、例えば異染性白質ジストロフィー(MLD)、グロボイド細胞白質ジストロフィー(GLD)、GM1ガングリオシドーシス、GM2ガングリオシドーシス、ムコ多糖症(MPS)及び他のLSD、ペルオキシソーム病、例えばX連鎖副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、副腎脊髄ニューロパチー(AMN)、及び/又は成人発症後天性神経変性状態、例えばアルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病(PD)、多発性硬化症(MS)から選択される疾患を治療するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター、請求項7に記載の粒子、請求項11に記載の医薬組成物、請求項8~11に記載の細胞。
- 宿主細胞、特に造血幹細胞又は造血前駆細胞における導入遺伝子の発現を調節するための、請求項2~6のいずれか一項に記載の遺伝子導入ベクター又は請求項7に記載の粒子のインビトロでの使用。
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