CN117925759B

CN117925759B - 林蛙多肽制剂及其在食品和化妆品中的应用

Info

Publication number: CN117925759B
Application number: CN202410093313.XA
Authority: CN
Inventors: 林万君; 郑玲玲; 林东明; 张丹; 徐志雨
Original assignee: Tonghua Kang Yuan Biological Technology Co ltd
Current assignee: Tonghua Kang Yuan Biological Technology Co ltd
Priority date: 2024-01-23
Filing date: 2024-01-23
Publication date: 2024-07-02
Anticipated expiration: 2044-01-23
Also published as: CN117925759A

Abstract

本申请提供了林蛙多肽制剂及其在食品和化妆品中的应用。本申请的制剂是以林蛙干为原料，通过包含粉碎、配液、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶或者木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解、过滤步骤制备而成。本申请还提供了从制剂中的分离了多种有抗氧化、酪氨酸激酶抑制、免疫增强活性的多肽，可用于制备食品、保健品以及有美白作用的化妆品。

Description

林蛙多肽制剂及其在食品和化妆品中的应用

技术领域

本申请属于蛋白领域和药物/保健品领域，具体地，本申请提供了林蛙多肽制剂及其在食品和化妆品中的应用。

背景技术

中国林蛙(Rana temporaria chensinensis,David)，又称林蛙。林蛙、林蛙油、林蛙卵、林蛙皮均有药用、保健和食用用途，传统中医典籍和现代医学研究林蛙产品的效果包括补肾益精、养阴润肺、抗氧化、提高免疫力、增强性功能等。

拆去卵和林蛙油等部分的林蛙干(主要成分为林蛙皮)常可以食用或者药用，是我国历史悠久的名贵食品/保健品，其主要问题在于食用和保存均比较困难；更难以加工为现代药物或保健品，影响了其进一步应用和产品开发。

发明内容

为充分利用林蛙这一珍贵资源，申请人将林蛙干进行酶解后制备的林蛙多肽制剂，这些制剂具备增强免疫力、抗氧化等效果，其保存和应用比传统加工方法更为便利。申请人进一步在其中鉴定了具有抗氧化活性、免疫增强活性以及酪氨酸激酶抑制活性的林蛙多肽。

一方面，本申请提供了林蛙多肽制剂，所述制剂以去除林蛙油和卵后的林蛙干为原料，通过包含粉碎、配液、酶解、过滤的步骤制备而成。

进一步地，所述制剂为浸膏粉、提取液或者干粉形式。

进一步地，所述酶解中使用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，或者使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解。

进一步地，所述酶解的酶解体系中包含500U/mL木瓜蛋白酶和500U/mL胰蛋白酶。

另一方面，本申请提供了林蛙多肽，所述林蛙卵肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

另一方面，本申请提供了林蛙多肽在制备增强免疫力的药物或者保健品中的应用；所述林蛙多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3。

进一步地，所述药物或保健品为口服剂型。

进一步地，所述药物或保健品中还含有药物或保健品中可以接受的辅料。

另一方面，本申请提供了林蛙多肽在制备具有美白作用的化妆品中的应用；所述所述林蛙多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

进一步地，所述化妆品中还含有化妆品中可以接受的辅料。

附图说明

图1为四种多肽和林蛙多肽粉肽酪氨酸酶抑制活性和ATBS自由基清除活性测定结果。

具体实施方式

实施例1林蛙多肽制剂的基本制备方法

(1)挑选

将林蛙干(去除林蛙油、卵等后的林蛙皮肉制成)置台案上进行挑选，挑出渣子、非有用部位等。

(2)粉碎

将林蛙干放入粉碎机中进行粉碎，粉碎后的细粉过100目筛，用洁净的容器装好。

(3)配液

将过筛后的细粉加入4倍细粉质量的，含有500U/mL木瓜蛋白酶和300U/mL碱性蛋白酶的水中，将PH值调节至7.5，置配液罐中备用(林蛙多肽制剂1)。

或者将过筛后的细粉加入4倍细粉质量的，含有500U/mL木瓜蛋白酶和500U/mL胰蛋白酶的水中，将PH值调节至7.5，置配液罐中备用(林蛙多肽制剂2)。

(4)酶解

酶解温度50℃，酶解时间6小时，搅拌速度30转/分钟；继续加热至煮沸，灭活温度95℃，灭活时间为10分钟，待温度降至65℃以下，取上清液作为酶解原液。

(5)陶瓷过滤

酶解原液加入活性碳处理脱腥，经陶瓷层柱过滤，吸附脱色。

(8)钠膜过滤

吸附脱色后的酶解原液，再经5000D纳膜过滤器纯化分离。

(9)真空减压浓缩

钠膜过滤处理的酶解原液，流入真空浓缩罐，经真空减压浓缩，浓缩至原体积的1/5，相对密度1.05，再次过滤，得到作为林蛙多肽液体原料。

(10)林蛙多肽液体原料进一步加工：

林蛙多肽浸膏粉：

林蛙多肽液体原料与麦芽糊精1:1进行混合搅拌，搅拌均匀后放在烘盘内，移至烘箱中，控制蒸气压力0.1－0.2Mpa，温度60-80℃，时间30分钟，干燥。将干燥产物在粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得到的林蛙卵肽浸膏粉。

林蛙多肽粉：

将林蛙多肽液体原料装入全自动真空低温干燥喷雾机，55℃进风温度快速离心干燥，制得林蛙卵肽粉，粒径≥400目。

林蛙多肽提取液

将林蛙多肽液体原料进行过滤，过滤要求≥800目，得到林蛙多肽提取液。

产品中粗蛋白含量(干基计，GB5009.5)应大于70％；肽含量(干基计，GB/T22492附录B)应大于45％；大于等于80％肽段的分子量(GB/T 22492附录A)应小于5000。

实施例2林蛙多肽的鉴定

通过超滤从林蛙多肽制剂1和制剂2(提取液)中获得<3kDa级分；以C18除盐柱进行除盐；经由配备分析柱Acclaim PepMap C18的LC-MS/MS分析(A相：0.1％甲酸水溶液，B相：含0.1％甲酸的80％的ACN溶液；从5％的B相起始，升高到40％，进而升高到100％)。串联质谱图经过PEAKS Studio分析；对uniprot-Vigna数据库搜库，肽段卡值为：-10lgP≥20；通过ToxinPrep对肽进行毒性预测；通过PeptideRanker预测肽的活性；通过PeptideCutter基于胃蛋白酶和胰蛋白酶对肽进行胃肠道消化性预测。

选择无毒、高生物活性(阈值大于0.5)和不消化的肽，筛选到三个多肽:LWS-1(PQKCYWIV，SEQ ID NO.1)、LWS-2(DVKSAPE，SEQ ID NO.2)、LWS-3(ERWCTET，SEQ ID NO.3)、LWS-4(EWIQL，SEQ ID NO.4)。

委托南京金斯瑞使用固相法合成上述多肽，基本过程包括：

(1)DMF溶胀活化Wang树脂；

(2)接第一个氨基酸；

(3)Fmoc保护基脱除；

(4)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；

(5)重复步骤(4)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；

(7)树脂的脱落及纯品分离；

(8)使用质谱检测，通过分子量验证。

SEQ ID NO.1-4的质谱分子量分别为1034.9、744.5、923.1、687.9，与理论计算值相符。

实施例3林蛙多肽的抗氧化和增强免疫力效果

抗氧化活性实验：

使用实施例2中固相合成的多肽产品，按照0.05mg/mL的浓度配制多肽溶液样品(使用实施例1中的制剂1和制剂2的林蛙多肽粉产品配制0.2mg/mL的样品溶液作为比较)；取待测液体样品2.5mL，与2.5mL 0.1mM的DPPH无水乙醇溶液(样品)或者2.5mL无水乙醇混合(对照)，25℃下避光反应30min；以分光光度计测定样品反应液、对照反应液以及参比反应液(2.5mL无水乙醇加2.5mL0.1mM的DPPH无水乙醇溶液)517nm处的吸光度；三组重复。

DPPH自由基清除率％＝(1-(A_样品-A_对照)/A_参比)×100％。

结果如表1所示

表1四种多肽和林蛙多肽粉的DPPH自由基清除率结果

结果表明，四种多肽均有明显的抗氧化效果。两种制剂的抗氧化效果与酶解方式有明显关联，使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组合效果更好。

脾脏系数和胸腺系数：

选用6周-7周，20g-23g体重的ICR母鼠48只，平均分为6组。经过1周适应新饲养之后，分别按照每日50mg的剂量灌胃给予LWS-1、LWS-2或LWS-3，按照每日100mg的剂量灌胃给予实施例1中的制剂1和制剂2的林蛙多肽粉产品，以及蒸馏水。连续灌胃30日，期间自由饮水进食(期间无死亡或明显异常活动情况)。在第31日处死动物，摘取内脏，计算脾脏系数和胸腺系数。

表2四种多肽和林蛙多肽粉对脾脏系数和胸腺系数的影响

结果表明：LWS-1、LWS-3明显增加的脾脏系数和胸腺系数，其他多肽和制剂对脾脏系数和胸腺系数的影响并不显著。

RAW264.7增殖活性实验

RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞，科佰生物)在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，取对数生长期细胞，调至1×10⁶细胞/mL浓度；将100微升加入孔板中，37摄氏度、5％二氧化碳下培养2小时，细胞贴壁，去掉上清液；加入100微升含0.05mg/mL LWS-1、LWS-2、LWS-3、LWS-4的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，或者含0.2mg/mL实施例1中的制剂1和制剂2林蛙多肽粉的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，以含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基作为对照；37摄氏度、5％二氧化碳下培养24小时；加入5毫克/mL的MTT工作液10微升，继续培养4小时；弃培养基，清洗后加入150微升DMSO溶解液，振荡15分钟后测定570nmOD值；三组重复。

增殖率＝样品OD₅₇₀/空白OD₅₇₀×100％

表3四种多肽和林蛙多肽粉对巨噬细胞增殖的影响

产品	巨噬细胞增殖率％
		对照	100％
LWS-1	138.5±4.1
		LWS-2	110.8±1.8
LWS-3	140.2±2.4
		LWS-4	106.2±4.3
制剂1林蛙多肽粉	113.5±2.6
		制剂2林蛙多肽粉	121.9±3.7

结果表明，与脏器系数实验结果类似，LWS-1、LWS-3对巨噬细胞增殖有明显刺激作用，制剂2也体现出了一定效果。

实施例4林蛙多肽酪氨酸酶抑制活性和ATBS自由基清除活性测定

根据现有技术的启示和验证，林蛙中的蛋白和多糖成分有美白、均匀肤色等化妆品用效果，申请人进一步验证了四种多肽和两种制剂在此方面的效果。同时为了更全面的检测抗氧化效果，进一步进行了ABTS抗氧化性试验。

黑色素合成过程中酪氨酸激酶(TYR)是唯一一种必需酶，市售化妆品中的美白成分多是基于酪氨酸激酶抑制机理，因此酪氨酸激酶抑制活性也是检测美白性能/潜力的主要指标。

使用多巴色素法检测酪氨酸激酶抑制活性

使用0.1M的PBS(pH 7.5)配制1mM L-多巴溶液作为底物溶液，按照表4配制检测体系：

表4酪氨酸激酶抑制活性检测体系

配制上述体系后，至于30摄氏度水浴中反应10分钟；向体系2、3中加入30ug/mL的酪氨酸酶(默克标准品)溶液0.5mL，测定加入后15秒时体系在475nm的吸光度。酪氨酸酶抑制率＝[1-(A₄-A₃/A₂-A₁)]×100％(三组平行)。

ABTS自由基清除率测定

配制7mmol/L的ABTS二铵盐储备液以及2mol/L的二硫酸钾储备液；等体积混合二者，室温避光保存12小时，作为工作液；将工作液稀释至734nm吸光度0.75左右；将待测样品溶液(LWS-1/LWS-2/LWS-3、LWS-4的0.05mg/mL溶液；制剂1/2的林蛙多肽粉溶液0.2mg/mL溶液；蒸馏水对照)与稀释后的ABTS工作液(或蒸馏水空白)充分混合，静置5分钟，记录734nm吸光度。ABTS自由基清除率＝[1-(A_样品-A_空白)/A_对照]×100％(三组平行)。

Claims

1.林蛙多肽，其特征在于，所述林蛙多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

2. 林蛙多肽在制备增强免疫力的药物或者保健品中的应用，所述林蛙多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3。

3.根据权利要求2所述的应用，所述药物或保健品为口服剂型。

4.根据权利要求3所述的应用，所述药物或保健品中还含有药物或保健品中可以接受的辅料。

5. 林蛙多肽在制备具有美白作用的化妆品中的应用，所述林蛙多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

6.根据权利要求5所述的应用，所述化妆品中还含有化妆品中可以接受的辅料。