KR20110018167A

KR20110018167A - 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 실크 펩타이드

Info

Publication number: KR20110018167A
Application number: KR1020090075823A
Authority: KR
Inventors: 김재훈; 이주운; 최종일; 송범석; 윤요한; 변명우; 성낙윤; 김진규
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2011-02-23

Abstract

본원발명은 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 누에고치로부터 실크 피브로인 단백질을 분리하는 단계, 상기 실크 피브로인 단백질에 1 ~ 200 kGy의 방사선을 조사하는 단계 및 상기 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질을 가수분해하여 실크 펩타이드를 얻는 단계를 포함한다.

본원발명의 실크 펩타이드의 제조방법에 의해 제조된 실크 펩타이드는 항산화 특성, 면역 활성, 피부미백 등의 생리활성이 증가되었기 때문에, 식품학적 조성물, 화장품 조성물, 약학 조성물 등의 다양한 용도로 사용되어 소비자의 건강증진에 기여할 수 있다.

방사선 조사, 실크 피브로인 단백질, 실크 세리신 단백질, 실크 펩타이드, 가수분해

Description

생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 실크 펩타이드{Method For Preparation Of Physiologically Active Silk Peptide And The Silk Peptide Thereof}

본원발명은 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 실크 펩타이드에 관한 것이다.

누에고치에서 생산되는 실크는, 견사 전체 중량의 70 ~ 80% 정도를 차지하는 섬유상 단백질인 실크 피브로인 단백질(silk fibroin protein)과, 견사 전체 중량의 20 ~ 30% 정도를 차지하면서 실크 피브로인 단백질을 감싸고 있는 구형 단백질인 실크 세리신 단백질(silk sericin protein)으로 구성되어 있다. 상기 실크 피브로인 단백질 및 실크 세리신 단백질은 혈중 콜레스테롤, 혈당, 알코올 조절 효능 및 항바이러스 효과 등 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 실크 피브로인 단백질의 산 가수분해로 얻어진 실크 펩타이드(silk peptide) 역시 항종양 활성, 고지혈 및 콜레스테롤 조절, 항산화 활성 등 다양한 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.

그러나, 상기 실크 펩타이드의 항산화 활성, 면역 활성, 항암 활성, 피부미백 등의 기능 뿐만 아니라, 이러한 기능을 증강시킬 수 있는 방법에 대해 실질적으로 연구가 수행된 바가 없다.

본원발명은, 실크 펩타이드의 항산화 활성, 면역 활성, 항암 활성 및 피부미백 등의 기능을 증강시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본원발명은 누에고치로부터 실크 피브로인 단백질을 분리하는 단계, 상기 실크 피브로인 단백질에 1 ~ 200 kGy의 방사선을 조사하는 단계 및 상기 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질을 가수분해하여 실크 펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본원발명은 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 누에고치로부터 실크 피브로인 단백질을 분리하는 단계, 상기 실크 피브로인 단백질에 1 ~ 200 kGy의 방사선을 조사하는 단계 및 상기 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질을 가수분해하여 실크 펩타이드를 얻는 단계를 포함한다. 상기 생리활성의 예로서, 항산화 특성, 면역 활성, 피부미백 등의 특성을 들 수 있다.

상기 실크 피브로인 단백질의 분리는, 누에고치에 4 ~ 6% 농도의 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 또는 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 수용액을 처리하여, 누에고치의 실크 세리신 단백질을 제거함으로써 이루어질 수 있다.

상기 방사선은, 감마선, 전자선(베타선) 및 엑스선(X-선)으로 구성된 그룹으로 부터 선택된 어느 하나가 사용될 수 있다.

상기 감마선은 코발트-60(Co-60) 또는 세슘-137(Cs-137)의 방사성 동위원소로 부터 방출되는 것이 사용될 수 있다.

상기 방사선은 흡수선량이 10 ~ 150 kGy인 것이 사용될 수 있다.

상기 가수분해는 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질에 산 용액(acid solution)을 가하여 80 ~ 150 ℃에서 1 ~ 8 시간 동안 처리하는 것이 바람직하다.

상기 산 용액은, 염산, 인산 및 황산으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 또는 2종 이상 혼합물이 사용될 수 있다.

또한 본원발명은, 상기의 방법에 의해 제조된 실크 펩타이드에 관한 것이다.

또한 본원발명은, 상기 실크 펩타이드를 포함하는 항산화에 유용한 식품학적 조성물에 관한 것이다. 상기 실크 펩타이드는 필요에 따라 함유량을 다양하게 하여 항산화에 유용한 식품학적 조성물에 포함될 수 있다. 상기 항산화에 유용한 식품학적 조성물은 음료류, 면류, 냉동식품, 유가공 제품, 육가공 제품, 조미식품, 생식류 등과 같은 식품을 제조하는데 사용될 수 있다.

또한 본원발명은, 상기 실크 펩타이드를 포함하는 피부미백용 화장품 조성물에 관한 것이다. 상기 실크 펩타이드는 필요에 따라 함유량을 다양하게 하여 피부미백용 화장품 조성물에 포함될 수 있다. 상기 피부미백용 화장품 조성물은 로션, 크림, 젤 등의 화장품을 제조하는데 사용될 수 있다.

또한 본원발명은, 실크 펩타이드를 포함하는 면역활성 증강용 약학 조성물 또는 실크 펩타이드를 포함하는 항암활성 증강용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 실크 펩타이드는 필요에 따라 함유량을 다양하게 하여 면역활성 증강용 약학 조성물 또는 항암활성 증강용 약학 조성물에 포함되어, 정제, 과립제, 환제, 액제, 주사제, 크림제, 연고제 등과 같은 의약품을 제조하는데 사용될 수 있다.

이하에서, 본원발명의 바람직한 제조예, 비교예를 참조하여 상세히 설명한다. 아래의 제조예, 비교예는 본원발명의 내용을 이해하기 위해 제시된 것일 뿐이며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원발명의 기술적 사상 내에서 많은 변형이 가능할 것이다. 따라서 본원발명의 권리범위가 이러한 제조예, 비교예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

<제조예 1> : 본원발명의 실크 펩타이드

(1) 누에고치로부터 실크 피브로인 단백질을 분리

누에고치 50g에 5%(w/v)농도의 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 2,500 mL를 처리하여 1시간 동안 가열하고, 여과지로 여과하여 누에고치에 포함된 실크 세리신 단백질을 제거하였다. 그 후, 열수를 이용하여 잔사를 수차례 세척하여 남아있는 실크 세리신 단백질과 탄산나트륨을 완전히 제거하고 남은 것을 동결건조하여 분말 형태의 실크 피브로인 단백질을 분리해 냈다.

(2) 방사선 조사

상기에서 분리한 실크 피브로인 단백질을 증류수에 용해하여 20 mg/mL의 농도의 실크 피브로인 단백질 수용액을 만들었다. 상기 실크 피브로인 단백질 수용액에 대해, 10±0.5℃의 온도범위에서 코발트-60(Co-60)으로부터 방출되는 방사선(감마선)을 조사하였다.

(3) 가수분해

상기 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질 수용액에서 실크 피브로인 단백질(건조 상태) 1g을 채취하여 80 mL의 2N 염산 용액을 가하여, 130℃에서 4시간동안 가수분해를 실시하였다.

그 후, 여과지(Whatman No.4 filter paper ; Whatman International Ltd., England)를 이용하여 가수분해된 실크 피브로인 단백질을 여과하고, 여기에 2N 수산화나트륨 용액으로 중화시켰다. 그 후, 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 가수분해되지 않은 실크 피브로인 단백질을 제거하고, 여막투석(membrane dialysis ; MW cutoff 100 ~ 500)을 하여 남은 염을 제거하고 잔사를 동결건조하여 고체 형태의 실크 펩타이드를 얻었다.

<제조예 2> : 식품학적 조성물

본원발명의 실크 펩타이드를 포함하는 항산화에 유용한 식품학적 조성물을 이용하여, 음료류, 면류, 유가공 제품, 생식류를 제조하는 구체적인 제조예를 살펴본다.

(1) 음료류

통상의 제조방법에 따라 음료류를 제조하되, 제조예 1의 실크 펩타이드 1000 mg,　구연산　1000 mg, 올리고당 100 g,　매실 농축액 2 g, 타우린 1 g에 정제수를 가하여 전체　900 mL의 식품학적 조성물을 완성하였다. 그 후, 상기 식품학적 조성물을 약 1시간 동안 85℃에서 교반 및 가열 후, 여과하여 멸균된 2 L 용기에 넣고, 밀봉 멸균하여 음료류로 제조하였다.

상기 식품학적 조성물에 포함된 재료 및 배합비는, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라 임의로 변형 실시할 수 있다.

(2) 면류

통상의 제조방법에 따라 면류를 제조하되, 제조예 1의 실크 펩타이드 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하여 식품학적 조성물을 완성하였다. 그 후, 상기 식품학적 조성물을 이용하여 면류를 제조하였다.

(3) 유가공 제품

통상의 제조방법에 따라 유가공 제품을 제조하되, 제조예 1의 실크 펩타이드 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하여 식품학적 조성물을 완성하였다. 그 후, 상기 식품학적 조성물을 이용하여 버터, 아이스크림과 같은 다양한 유가공 제품을 제조하였다.

(4) 생식류

통상의 제조방법에 따라 생식류를 제조하였다.

먼저, 제조예 1의 실크 펩타이드를 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍 건조기로 건조하였다. 상기 건조물을 입도 60 메쉬로 분쇄하여 실크 펩타이드 건조물을 준비하였다.

또한, 현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 입도 60 메쉬의 분말로 분쇄하여 곡물 건조물을 준비하였다.

또한, 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 입도 60 메쉬의 분말로 분쇄하여 종실류 건조물을 준비하였다.

상기 실크 펩타이드 건조물, 곡물 건조물, 종실류 건조물, 영지, 지황을 혼합하여 식품학적 조성물을 완성하였다. 이때, 식품학적 조성물 전체 중량 대비, 실크 펩타이드 건조물 3 중량부, 곡물 건조물 65 중량부(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부), 종실류 건조물 22 중량부(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부), 영지 0.5 중량부, 지황 0.5 중량부의 비율로 하여 식품학적 조성물을 완성하여, 생식류로 이용하였다.

<제조예 3> : 화장품 조성물

본원발명의 실크 펩타이드를 포함하는 피부미백용 화장품 조성물을 이용하여, 로션을 제조하는 구체적인 제조예를 살펴본다.

먼저, 스테아린산, 0.3 중량부, 스테알리 알콜 0.2 중량부, 글리세릴 모노스테아레이트 1.2 중량부, 밀납 0.4 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탈 모노라우린산 에스테르 22 중량부, 파라옥시안식향산 메틸 0.1 중량부, 파라옥시안식향산 프로필 0.05 중량부, 세틸에틸헥사노에이트 5 중량부, 트리글리세라이드 2 중량부, 사이클로메티콘 3 중량부, 글리세린 5 중량부, 트리에탄올아민 0.15 중량부, 폴리아크릴산 중합체 0.12 중량부, 색소 0.0001 중량부, 향 0.1 중량부 및 잔부로서 증류수를 혼합하여 혼합물을 준비하였다. 그 후, 상기 혼합물을 65 ~ 70℃로 가열하면서, 혼합물 중량 대비 1 중량부의 실크 펩타이드를 상기 가열된 혼합물에 천천히 첨가하면서, 8,000 rpm에서 2 ~ 3분간 유화시켜 화장품용 조성물을 완성하였다. 상기 화장품용 조성물에 소량의 물을 용해시킨 후 2분간 더 유화시킨 후 탈기과정을 거쳐 25 ~ 35℃로 냉각하여 로션을 제조하였다.

<제조예 4> : 약학 조성물

본원발명의 실크 펩타이드를 포함하는 면역활성 증강용 약학 조성물 또는 항암활성 증강용 약학 조성물을 이용하여, 정제, 과립제, 환제를 제조하는 구체적인 제조예를 살펴본다.

(1) 정제

본원발명의 실크 펩타이드 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당　100 ㎎, 스테아린산 마그네슘　2 ㎎을 혼합하여 약학 조성물을 완성하였다. 상기의 약학 조성물을 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(2) 과립제

본원발명의 실크 펩타이드 150 ㎎, 대두 추출물 50 ㎎, 포도당 200 ㎎, 전분 600 ㎎을 혼합하여 약학 조성물을 완성하였다. 상기의 약학 조성물을 30% 에탄올 100 ㎎에 첨가한 후, 섭씨 60℃에서 건조하여 과립제를 제조하였다.

(3) 환제

본원발명의 실크 펩타이드 1 g, 유당 1.5 g, 글리세린　1 g, 자일리톨 0.5 g을 혼합하여 약학 조성물을 완성하였다. 상기의 약학 조성물을 통상의 환제의 제조방법에 따라, 1 환 당 4 g의 약학 조성물이 포함되도록 제조하였다.

<비교예 1> : 실크 펩타이드의 가수분해 수율

상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 제조하는데 있어서, 방사선 조사가 실크 펩타이드의 수율에 미치는 영향을 확인하는 실험을 하였다. 이때, 방사선은 10 kGy의 선량율로 조사하였다.

먼저, 방사선으로서 감마선(Co-60)을 사용하되, 감마선의 흡수선량이 10, 30, 50, 100, 150 kGy가 되도록 하여 5종류의 실크 펩타이드를 제조하고, 각각 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4, 시료 5로 하였다. 상기 흡수선량은 세릭-세로스 선량계(ceric-cerous dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였고, 총 흡수선량의 오차는 ±0.1 kGy였다.

다음으로, 방사선으로서 엑스선(X-선, 5 MeV)을 사용하되, 엑스선의 흡수선량이 50 kGy가 되도록 하여 엑스선을 조사하여 실크 펩타이드를 제조하고, 시료 6 으로 하였다.

다음으로, 방사선으로서 전자선(10 MeV)을 사용하되, 전자선의 흡수선량이 흡수선량이 50 kGy가 되도록 하여 전자선을 조사하여 실크 펩타이드를 제조하고, 시료 7로 하였다.

또한, 대조군 1로서, 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하되 방사선을 조사하지 않고(방사선의 흡수선량 0 kGy) 제조된 실크 펩타이드를 사용하였다.

가수분해 수율은 상기 제조예 1의 (3) 가수분해 단계에서 사용한 실크 피브로인 단백질(건조 상태) 1g으로부터 회수된 실크 펩타이드의 질량을 측정하여 백분율로 계산하여 하기의 표 1에 나타냈다.

<표 1> : 가수분해 수율

	방사선의 흡수선량(kGy)	가수분해 수율(%)
시료 1	10	65.5
시료 2	30	68.6
시료 3	50	73.2
시료 4	100	73.4
시료 5	150	76.6
시료 6	50	73.8
시료 7	50	74.1
대조군 1	0	64.5

상기의 표 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 7은 모두,대조군 1보다 높은 가수분해 수율(%)을 보였다. 즉, 실크 피브로인 단백질로부터 높은 수율의 실크 펩타이드를 얻기 위해서는, 실크 피브로인 단백질에 방사선을 조사하는 것이 효과적임을 확인할 수 있다.

또한, 방사선의 흡수선량을 50 kGy로 고정하고, 방사선의 종류만 달리 한 시료 3, 시료 6, 시료 7을 비교해 보면 가수분해 수율이 비슷한 값을 나타냈음을 알 수 있다. 즉, 방사선의 종류에 관계없이 방사선을 조사한 경우라면, 방사선을 조사하지 않은 경우에 비해, 실크 피브로인 단백질로부터 높은 수율의 실크 펩타이드를 얻을 수 있음을 의미한다.

<비교예 2> : 실크 펩타이드의 DPPH 라디칼 소거능

상기 제조예 1의 실크 펩타이드의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능을 측정함으로써 항산화 특성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 7 및 대조군 1을 사용하였다.

먼저, 상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 증류수에 용해하여 5 mg/mL 농도의 실크 펩타이드 수용액을 준비하였다.

상기 실크 펩타이드 수용액 2 mL과 2×10^-4M DPPH용액(dissolved in 99% Ethanol) 1 mL를 혼합(vortex mixing)하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액을 517nm에서 분광광도계(UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 하기의 수학식 1과 같이, DPPH 용액에 실크 펩타이드 수용액이 첨가되기 전과 첨가된 후의 흡광도 차이를 계산하여 DPPH 라디칼 소거능(%)으로 나타냈다.

<수학식 1>

DPPH 라디칼 소거능(%) =

상기의 방법에 의해 측정된 실크 펩타이드의 DPPH 라디칼 소거능(%)은 하기의 표 2에 나타냈다.

<표 2> : DPPH 라디칼 소거능(%)

	방사선의 흡수선량(kGy)	DPPH 라디칼 소거능(%)
시료 1	10	26.7
시료 2	30	28.3
시료 3	50	34.3
시료 4	100	26.0
시료 5	150	25.1
시료 6	50	36.8
시료 7	50	35.7
대조군 1	0	19.7

상기의 표 2의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 5는 모두,대조군 1보다 높은 DPPH 라디칼 소거능(%)을 보였다. 즉, 항산화 특성이 우수한 실크 펩타이드를 얻기 위해서는, 실크 피브로인 단백질에 방사선을 조사하는 것이 효과적임을 확인할 수 있다.

또한, 방사선의 흡수선량을 50 kGy로 고정하고, 방사선의 종류만 달리한 시료 3, 시료 6, 시료 7을 비교해 보면 DPPH 라디칼 소거능이 비슷한 값을 나타냈음을 알 수 있다. 즉, 방사선의 종류에 관계없이 방사선을 조사한 경우라면, 방사선을 조사하지 않은 경우에 비해, 높은 DPPH 라디칼 소거능을 얻을 수 있음을 의미한다.

<비교예 3> : 실크 펩타이드의 환원력

상기 제조예 1의 실크 펩타이드의 환원력을 측정함으로써 항산화 특성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였다.

먼저, 상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 증류수에 용해하여 100 ㎍/mL 농도의 실크 펩타이드 수용액을 준비하였다.

상기 실크 펩타이드 수용액 1 mL에 0.2M 나트륨 인산염 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 2.5 mL와 1% 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide, (K₃Fe(CN₆)) 용액 2.5 mL를 가하여 혼합하고, 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 용액 2.5 mL를 첨가한 후 50℃에서 20분간 반응시켰다. 이 혼합액을 25°C에서 5분 동안 750×g(g : 중력가속도)로 원심분리(VS-5500, Vision scientific Co. Ltd., Seoul, Republic of Korea)하였다. 원심분리한 상등액 5 mL에 증류수 5 mL와 1% 염화제일철(ferric chloride) 1 mL를 혼합하여 반응시켰다. 상기 반응액을 700 nm에서 분광광도계(UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도를 이용하여 Oyaizu의 방법(Oyaizu, M (1986) Jap. J. Nutr, 44, 307-315.)에 준하여 환원력을 측정하였다.

상기의 방법에 의해 측정된 실크 펩타이드의 환원력은 하기의 표 3에 나타냈다.

<표 3> : 환원력

	방사선의 흡수선량(kGy)	환원력
시료 1	10	0.290
시료 2	30	0.318
시료 3	50	0.340
시료 4	100	0.336
시료 5	150	0.332
대조군 1	0	0.269

상기의 표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 5는 모두,대조군 1보다 높은 환원력을 보였다. 즉, 항산화 특성이 우수한 실크 펩타이드를 얻기 위해서는, 실크 피브로인 단백질에 방사선을 조사하는 것이 효과적임을 확인할 수 있다.

<비교예 4> : 실크 펩타이드의 티로시나아제의 활성 저해 효과

상기 제조예 1의 실크 펩타이드의 티로시나아제의 활성 저해 효과를 측정함으로써 피부미백 특성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였다.

또한, 0.175M 나트륨 인산염 버퍼(pH 6.8) 0.5 mL에 10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine ; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA)를 용해시켜서 기질액을 준비하였다. 상기 기질액 0.4 mL에 5 mg/mL 농도의 실크 펩타이드 수용액 0.2 mL 및 버섯 티로시나제(mushroom tyrosinase ; 100 U/ml, sigma USA) 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 15분간 반응시킨 후, 생성된 DOPA 크롬(chrome)을 흡광도 475 nm에서 측정하였다. 티로시나제의 저해 효과는, 하기의 수학식 2와 같이, 기질액과 버섯 티로시나제를 혼합한 용액에 실크 펩타이드 수용액를 첨가하기 전과 첨가한 후의 흡광도 차이를 계산하여 본원발명의 실크 펩타이드에 의한 티로시나제의 저해율(%)로 나타냈다.

<수학식 2>

티로시나제의 저해율(%) =

상기의 방법에 의해 측정된 티로시나아제의 활성 저해율(%)은 하기의 표 4에 나타냈다.

<표 4> : 티로시나아제의 활성 저해율(%)

	방사선의 흡수선량(kGy)	티로시나아제의 활성 저해율(%)
시료 1	10	84.1 ± 2.35
시료 2	30	86.0 ± 0.23
시료 3	50	89.8 ± 0.33
시료 4	100	90.5 ± 1.07
시료 5	150	84.9 ± 0.31
대조군 1	0	78.5 ± 1.71

상기의 표 4의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 5의 티로시나아제의 활성 저해율(%) 대조군 1보다 높았다. 즉, 피부미백 효과가 우수한 실크 펩타이드를 얻기 위해서는, 실크 피브로인 단백질에 방사선을 조사하는 것이 효과적임을 확인할 수 있다.

<비교예 5> : 실크 펩타이드의 멜라닌의 생합성 저해 효과

상기 제조예 1의 실크 펩타이드의 멜라닌의 생합성 저해 효과를 측정함으로써 피부미백 특성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였다.

먼저, B16BL6 멜라노사이트(melanocyte)를 24공 평판배양기에 각 웰당 1×10⁵ 농도로 분주하고 100 nM α-MSH를 첨가하여 세포를 배양한 후 독성을 유발하지 않는 농도로 실크 펩타이드 수용액을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 PBS(phosphate buffered saline, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)로 2회 세척한 후 1N NaOH 100 mL를 첨가하여 70℃에서 1시간 동안 배양하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 흡광광도계를 이용하여 405 ㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정하였다.

또한, 합성 멜라닌(Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, USA)을 사용하여 멜라닌 표준곡선(standard curve)을 작성하고, 상기 405 nm 에서 측정된 멜라닌의 흡광도를 대입하여 상기의 실험에 의해 생성된 멜라닌 농도(㎍/mL)를 도출하였다. 상기 멜라닌 농도를 통해서 본원발명의 실크 펩타이드에 의한 멜라닌 생합성의 저해 효과를 살펴볼 수 있다.

상기의 방법에 의해 측정된 멜라닌의 생합성 저해 효과는 하기의 표 5에 나타냈다.

<표 5> : 멜라닌의 생합성 저해 효과

	방사선의 흡수선량(kGy)	멜라민 농도 (㎍/mL)
시료 1	10	109.0 ± 3.62
시료 2	30	103.1 ± 2.03
시료 3	50	87.2 ± 2.55
시료 4	100	94.4 ± 7.07
시료 5	150	103.6 ±2.35
대조군 1	0	116.6 ± 6.51

상기의 표 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 5의 경우, 생성된 멜라민 농도는 대조군 1보다 낮았으며, 이러한 결과는 본원발명의 실크 펩타이드가 멜라민의 생합성을 저해한다는 것을 보여주는 것이다. 즉, 피부미백 효과가 우수한 실크 펩타이드를 얻기 위해서는 실크 피브로인 단백질에 방사선을 조사하는 것이 효과적임을 확인할 수 있다.

<비교예 6> : 마우스 복강 대식세포의 증식 활성

상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 처리한 마우스 복강 대식세포의 증식활성을 측정함으로써 본원발명의 실크 펩타이드의 면역활성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였다.

(1) 마우스 복강 대식세포의 준비

먼저, 다음과 같은 과정을 거쳐서, 실험에 사용할 마우스 복강 대식세포를 준비하였다.

7주령의 암컷 BLAB/c 마우스에 타이오글라이콜산염 배지(thioglycollate broth, 3%, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 1 mL를 복강주사 하였다. 복강 주사한 날부터 3일 후 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 10 mL를 이용하여 복강 내를 세척하였다. 그 후, 차가운 PBS(phosphate buffered saline, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 용액을 이용하여 2회 스핀다운(spin down) 하여 PBS를 제거하였다.

그 후 10% 소의 태아 혈청(fetal calf serum, FCS, GIBCO Laboratories), 2 mM L-글루타민, 15 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 5 ㎍/mL genta-마이신이 함유된 RPMI 1640 배지를 페트리디쉬 (100 × 15 mm) 에 넣어 2 시간동안 5% CO₂가습된 분위기(humidified atmosphere)에서 배양하였다. 부유하는 세포는 PBS 용액을 이용하여 모두 제거하였다. 그 결과, 실험에 사용될 마우스 복강 대식세포가 준비되었다.

(2) 마우스 복강 대식세포의 증식 활성

이하에서는, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 측정법을 이용하여 상기의 준비된 마우스 복강 대식세포의 증식 활성을 살펴보았다.

준비된 마우스 복강 대식세포를 96공 평판배양기에 각 웰당 5×10⁵ 농도로 분주하고 18시간동안 배양한 후 시료 1 내지 시료 5와 대조군 1을 각각 1 ㎎/ml 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

또한, 준비된 마우스 복강 대식세포를 96공 평판배양기에 각 웰당 5×10⁵ 농 도로 분주하고 18시간동안 배양한 후 대조군 2인 PBS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

또한, 준비된 마우스 복강 대식세포를 96공 평판배양기에 각 웰당 5×10⁵ 농도로 분주하고 18시간동안 배양한 후, 대조군 3인 0.5 ㎍/mL LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 24시간동안 배양하였다. 상기 LPS는 B 림프구를 자극하는 미토젠(mitogen)이다.

그리고, PBS 용액에 MTT를 녹여서 5 mg/mL의 농도의 MTT 용액을 준비하였다. 상기 MTT 용액 30 μL를 상기 시료 1 내지 시료 5, 대조군 1 내지 대조군 3을 처리한 각각의 마우스 복강 대식세포에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 원심분리기를 이용하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 배양액은 제거하고 마우스 대식 세포 내부에 형성된 포마잔 결정(formazan crystals)을 100 μL의 DMSO(dimethylsulfoxide, Sigma, St. Louis. Mo)에 넣어 37℃에서 5분간 반응 시켜 용해한 후 흡광광도계로 595㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 마우스 복강 대식세포의 증식 활성(proliferation)(%)을 계산하여 도 1에 나타냈다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원발명의 시료 1 내지 시료 5의 경우에는, 대조군 1 내지 대조군 3에 비해 마우스 복강 대식세포의 증식 활성이 높았다. 특히, 시료 3의 경우 마우스 복강 대식세포의 증식 활성이 약 120%에 육박할 정도로 매우 높았다.

이러한 결과로부터, 본원발명의 실크 펩타이드는 세포독성 없이 마우스 복강 대식세포의 증식을 활성화 시킨다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 면역 활성의 지표인 대식세포의 증식이 활성화 되었다는 것은, 본원발명의 실크 펩타이드가 면역 활성을 증진시킨다는 것을 의미한다. 이와 같은 면역 활성의 증진효과는, 방사선을 조사하여 제조한 본원발명의 실크 펩타이드의 영향에 기인한 것이다.

<비교예 7> : 마우스 복강 대식세포의 일산화질소(NO) 생성량

상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 처리한 마우스 복강 대식세포의 일산화질소(NO) 생성량을 측정함으로써 본원발명의 실크 펩타이드의 면역활성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였고, 상기 비교예 6에서 준비한 마우스 복강 대식세포를 이용하였다.

마우스 복강 대식세포의 일산화질소(NO) 생성량을 측정하기 위하여 그리스 시약(griess regeant)를 사용하였고, 상기 그리스 시약은 일반적으로 NO의 부산물인 니트라이트(nitrite)를 측정하는 시약이다.

준비된 마우스 복강 대식세포를 48공 평판배양기에 각 웰당 1×10⁶ 농도로 분주하고 18시간 동안 배양 한 후 시료 1 내지 5 및 대조군 1을 각각 처리하고 24시간동안 배양하였다. 이때, 시료 1 내지 5 및 대조군 1의 농도(sample concentration)는 각각 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL 씩 3가지 농도로 처리하였다.

24시간 배양 후 상등액을 100 μL를 취하여 그리스 시약(Sigma, St. Louis. Mo) 100 μL와 혼합하여 니트라이트의 생성량을 측정하고 흡광광도계로 595㎚에서 흡광도를 측정하였다. 소듐 니트라이트(NaNO₂)를 이용하여 작성한 표준화 곡선을 작성하고, 상기 표준화 곡선을 통해 측정된 NO의 생성량(NO production)을 도 2에 나타냈다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원발명의 시료 1 내지 시료 5의 경우에는 대조군 1에 비해 마우스 복강 대식세포의 NO 생성량이 높았다. 또한, 본원발명의 실크 펩타이드의 농도에 의존적으로 마우스 복강 대식세포의 NO 생성량이 증가하였다. NO의 생성량이 높다는 것은 마우스 복강 대식세포의 증식이 활발하였음을 의미한다. 이러한 결과는, 방사선을 조사하여 제조한 본원발명의 실크 펩타이드의 영향에 기인한 것이다.

<비교예 8> : 마우스 복강 대식세포의 사이토카인(cytokine) 분비능

상기 제조예 1의 실크 펩타이드를 처리한 마우스 복강 대식세포의 사이토카인(cytokine) 분비능을 측정함으로써 본원발명의 실크 펩타이드의 면역활성을 살펴보았다. 이때, 상기 비교예 1의 시료 1 내지 시료 5 및 대조군 1을 사용하였고, 상기 비교예 6에서 준비한 마우스 복강 대식세포를 이용하였다.

준비된 마우스 복강 대식세포를 48공 평판배양기에 각 웰당 1×10⁶ 농도로 분주하고 18시간 동안 배양 한 후 시료 1 내지 5 및 대조군 1을 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 시료 1 내지 5 및 대조군 1의 농도(sample concentration)는 각각 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL 씩 3가지 농도로 처리하였다.

24시간 배양 후 상등액을 취하여, BD OptEIA^TMcytokine detection kit(BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 96-well ELISA plates(costar 3595, Corning, NY)에서 세가지 종류의 사이토카인(IL-6, IFN-γ, TNF-α)의 분비량을 측정하여 각각 도 3, 도 4, 도 5에 나타냈다.

도 3 내지 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 본원발명의 시료 1 내지 시료 5의 경우에는, 대조군 1에 비해 사이토카인의 분비량이 높았다. 또한, 본원발명의 실크 펩타이드의 농도에 의존적으로 사이토카인의 분비량이 증가하였다. 사이토카인의 분비량이 높다는 것은 마우스 복강 대식세포가 활성화되었음을 의미한다. 이러한 결과는, 방사선을 조사하여 제조한 본원발명의 실크 펩타이드의 영향에 기인한 것이다.

<비교예 9> : 실크 펩타이드의 항암활성

상기 제조예 1의 실크 펩타이드의 항암활성을 살펴보기 위하여, 상기 비교예 1의 시료 3 및 대조군 1을 사용하였다.

먼저, 7주령의 암컷 C57BL6/c 마우스에 마우스 유래 암세포인 B16BL6를 5X10⁵cell/cyte로 마우스의 등에 피내주사(Intradermal injection)하였다. 시료 1 및 대조군 1을 각각 7일 동안 2.5 mg/마우스로 경구투여 하였고, 2주 후에 마우스의 등에서 암세포를 적출하여, 그 무게(tumor weight)를 측정하여 도 6에 나타냈다.

또한, 7주령의 암컷 C57BL6/c 마우스에 마우스 유래 암세포인 B16BL6를 5X10⁵cell/cyte로 마우스의 등에 피내주사(Intradermal injection)하고, 2주 후에 암세포를 적출하여, 그 무게를 측정하여 도 6에 암 대조군(tumor control)로 나타냈다.

도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 실크 펩타이드를 처리하지 않은 암 대조군에 비해, 시료 1 및 대조군의 실크 펩타이드를 처리한 경우의 암세포의 무게가 적았다. 그리고, 방사선 조사를 하지 않은 실크 펩타이드(대조군 1)를 처리한 경우의 암세포에 비해, 방사선을 조사한 실크 펩타이드(시료 3)를 처리한 경우의 암세포의 무게가 적었다. 이러한 결과는, 방사선을 조사하여 제조한 본원발명의 실크 펩타이드는 마우스의 암세포의 성장을 유의적으로 감소시켰음을 의미하며, 이와 같이 항암 활성이 증진된 것은 실크 펩타이드의 제조과정에서 방사선을 조사한 것에 기인한 것이다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

본원발명의 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법은 누에고치의 실크 피브로인 단백질로 부터 고수율의 실크 펩타이드를 얻을 수 있기 때문에, 종래 기술에 비해 실크 펩타이드의 생산성을 증가시켜 그 제조비용을 절감할 수 있다.

또한, 본원발명의 실크 펩타이드는 항산화 특성, 면역 활성, 피부미백 등의 생리활성이 증가되었기 때문에, 식품학적 조성물, 화장품 조성물, 약학 조성물 등의 다양한 용도로 사용되어 소비자의 건강증진에 기여할 수 있다.

도 1은 비교예 6의 마우스 복강 대식세포의 증식 활성을 보여주는 그래프이다.

도 2는 비교예 7의 마우스 복강 대식세포의 일산화질소 생성량을 보여주는 그래프이다.

도 3은 비교예 8의 마우스 복강 대식세포의 사이토카인(IL-6) 분비능을 보여주는 그래프이다.

도 4는 비교예 8의 마우스 복강 대식세포의 사이토카인(IFN-γ) 분비능을 보여주는 그래프이다.

도 5는 비교예 8의 마우스 복강 대식세포의 사이토카인(TNF-α) 분비능을 보여주는 그래프이다.

도 6은 비교예 9의 마우스의 등에서 적출한 암세포의 무게를 측정한 그래프이다.

Claims

누에고치로부터 실크 피브로인 단백질을 분리하는 단계;

상기 실크 피브로인 단백질에 1 ~ 200 kGy의 방사선을 조사하는 단계; 및

상기 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질을 가수분해하여 실크 펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 실크 피브로인 단백질의 분리는, 누에고치에 4 ~ 6% 농도의 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 또는 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 수용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 방사선은, 감마선, 전자선(베타선) 및 엑스선(X-선)으로 구성된 그룹으로 부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 3 항에 있어서,

상기 감마선은 코발트-60(Co-60) 또는 세슘-137(Cs-137)의 방사성 동위원소로 부터 방출되는 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 방사선은 흡수선량이 10 ~ 150 kGy인 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 가수분해는 방사선이 조사된 실크 피브로인 단백질에 산 용액(acid solution)을 가하여 80 ~ 150 ℃에서 1 ~ 8 시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 6 항에 있어서,

상기 산 용액은, 염산, 인산 및 황산으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 또는 2종 이상 혼합물인 것을 특징으로 하는 생리활성이 증가된 실크 펩타이드의 제조방법.
제 1 항 내지 제 7 항의 방법 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 실크 펩타이드.
제 8 항의 실크 펩타이드를 포함하는 항산화에 유용한 식품학적 조성물.
제 8 항의 실크 펩타이드를 포함하는 피부미백용 화장품 조성물.
제 8 항의 실크 펩타이드를 포함하는 면역활성 증강용 약학 조성물.
제 8 항의 실크 펩타이드를 포함하는 항암활성 증강용 약학 조성물.