KR100857125B1 - 단일클론 항체 생산을 증가시키는 폴리펩타이드, 이를코드하는 핵산 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵 세포에서 단일클론 항체 (Monoclonal Antibody)의 생산을 증가시킬 수 있는 폴리펩타이드, 이를 코드하는 핵산, 및 상기 핵산으로 형질전환된 진핵 세포에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산은 진핵 세포진핵 세포진핵 세포로서 유용한 단일클론 항체의 생산량을 증가시키는데 사용될 수 있다.

Description

단일클론 항체 생산을 증가시키는 폴리펩타이드, 이를 코드하는 핵산 및 이의 용도 {POLYPEPTIDE INCREASING THE MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION, NUCLEIC ACID ENCODING SAME AND USE THEREOF}
본 발명은 진핵 세포에서 단일클론 항체 (Monoclonal Antibody)의 생산을 증가시키는 폴리펩타이드, 이를 코드하는 핵산 및 상기 폴리펩타이드 또는 핵산으로 형질전환된 진핵 세포에 관한 것이다.
1980년대 초에 인간 성장호르몬을 DNA 재조합 기술로 최초로 생산한 이래 많은 재조합 단백질이 개발되어 다양한 질병의 치료제로 사용되고 있다. 나아가, 1998년에 미국 FDA에서 전이된 유방암의 치료제로 사용 승인을 받은 허셉틴 (herceptin)은 단일클론 항체 (monoclonal antibody)가 치료제로서 효과적임을 입증하였을 뿐만 아니라 기존의 치료제 개념을 확장하였다. 그 이래 단일클론 항체를 이용한 치료제가 암을 비롯한 여러 질병에 대한 치료제로서 계속 개발되고 있다. 이러한 단백질 치료제, 특히 단일클론 항체 치료제는 생물학의 전반적인 발전으로 인하여 그 종류가 더욱 다양해지고 있다.
이러한 단백질 제제는 성장호르몬과 같은 소수를 제외하고는 대부분이 동물 세포주에서 생산해야만 그 치료 역가가 유지되는 특징이 있다. 그 이유는 이들 단백질이 생체 내 활성을 유지하기 위해서는 특정 아미노산 위치에서의 단백질 절단 (proteolytic cleavage), 인산화 (phosphorylation) 및 당화 (glycosylation)와 같은 번역 후 수정 (post-translational modification)을 거쳐야 하는데 이는 세균이나 효모에선 불가능하거나 비효율적으로 진행되기 때문이다.
최근 유용한 의약품으로 인정되는 단일클론 항체의 임상실험수가 증가함에 따라, 이러한 단백질 치료제를 만들 수 있는 대량 배양시설의 수요는 폭발적으로 증가하고 있다 (문헌 [Dove A, Nature Biotech. (2001) 19:117-120] 참조). 이를 해소하기 위한 방안으로는 배양시설의 확충과 현재의 시설에서 생산수율을 증가시키는 방안을 들 수 있다 (문헌 [Fussenegger M, et al., Trends Biotechnol. (1999) 17:35-42] 참조). 생산수율을 증가시키는 시도는 크게 두 가지로 구분될 수 있는데, 단일 세포에서의 단위생산량을 증가시키기 위한 연구와 (문헌 [Lim L.H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) 316:991-996] 참조), 성장배지를 최적화시켜 동일한 부피에서 더 많은 세포가 자라게 하는 연구이다 (문헌 [Lee G. M. et al., J. Biotechnol. (1999) 69:85-93] 참조). 전자의 방향에 대한 연구의 예로는; 표적 단백질을 생산하기 위한 벡터를 최적 및 최대의 생산성을 가진 벡터로 개조하거나 (문헌 [Ted, H. J. et al., Nature Biotech. (2003), 21:553-558] 참조), 유전자 증식 후 고생산성을 가진 세포클론을 빠르게 스크리닝하는 방법의 개발 (문헌 [Charles, G. et al., Biotechnol. & Bioeng. (2002), 80:670-676] 참조), 고생산성 클론의 증식을 조절하거나, 그 세포사멸을 방지하는 방법 (문헌 [Lai, D. et al., Biotechnol. & Bioeng. (2004), 85:20-28] 참조) 등이 있다. 이러한 대부분의 시도들은 표적 단백질의 유전자 발현을 증가시키는 것에 목표를 두고 있다.
재조합 단백질 생산을 위해 사용되는 세포는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary)에서 유래한 CHO 세포, 생쥐의 하이브리도마 세포인 NS-O 및 인간세포의 일종인 Per.C6 등이며, 세계적으로 치료용 단백질 생산을 위해 가장 많이 이용되는 것은 CHO 세포이다. CHO 세포에서의 재조합 단백질 생산은, 일반적으로 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자 및 Methotrexate (MTX)를 이용한 유전자 증폭 (gene amplification) 과정에 의해 최대화 된다 (문헌 [Kim, S. J., et al., Biotechnol Bioeng. (1998) 58:73-84] 참조).
이상에서 설명한 시도들은 그 대부분이 세포 내의 유전자 수를 증가시켜 그 유전자의 mRNA 양을 증가시키는 기작이다. 하지만, 세포 내에서 전사 이후 단계인 번역, 번역 후 수정 및 분비 등의 일련의 과정에 작용하는 세포 내 시스템이 이 mRNA의 증가만큼 늘어나지 않으면 더 이상의 단백질 생산 증가는 일어날 수 없다. 실제로 유전자 수가 어느 정도 이상으로 증가하면 단백질 생산은 더 이상 증가하지 않고 포화된다 (문헌 [Schr
Figure 112006087195426-pct00001
der, M. et al ., Biotechnol . & Bioeng . (1997), 53:547-559] 참조). 따라서, 만약 이 병목현상을 일으키는 전사 이후 과정의 결정적인 단계에 관여하는 단백질을 증가시켜 병목현상을 개선해 줄 수 있다면 획기적인 단백질 생산량 증가가 이루어질 수 있을 것이다.
본 발명은 징크핑거로 만든 인공전사인자를 이용한 유전자의 전사 조절 기술을 세포 내 단백질 생산성 향상과 연결시키는 것이다. 징크핑거를 이용하여 특정 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시킨 예는 이미 여러 편의 논문으로 학계에 보고되었다 (문헌 [Zhang L, et al., J Biol Chem. (2000) 275:33850-33860, Liu PQ, et al., J Biol Chem. (2001) 276:11323-11334, Beerli RR, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) 97:1495-1500, Beerli RR, et al., J Biol Chem. (2000) 275:32617-32627 및 Bae K.-H. et al. Nature Biotech. (2003) 21:275-280] 참조). 그러나, 이들 예는 모두 특정 유전자의 프로모터에 결합하는 징크핑거를 이용하여 그 유전자의 전사를 조절하는 방법이었다.
본 발명자들은 징크핑거 도메인을 무작위로 배열하여 만든 인공전사인자 라이브러리를 이용하여 불특정 유전자를 조절하여 특정 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 시도하였다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 진핵 세포 내에서 단일클론 항체 생산량을 증가시키는 폴리펩타이드 및 이를 코드하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 핵산으로 형질전환된 진핵 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진핵 세포 내에서 단일클론 항체 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 다수의 징크 핑거 도메인 (zinc finger domain)을 포함하는 DNA 결합 도메인 (DNA binding domain)을 포함하고, 진핵 세포 (eukaryotic cell)에서 단일클론 항체 (monoclonal antibody)의 생산을 이를 포함하지 않는 세포에 비해 증가시킬 수 있는 폴리펩타이드 및 이를 코드하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 단일클론 항체를 코드하는 유전자 및 상기 폴리펩타이드를 코드하는 서열을 포함하는 핵산을 갖는 진핵 세포를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 폴리펩타이드 또는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 진핵 세포에서 단일클론 항체의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
도 1은 pLNCX1, pLNCX2 및 pLNCX2-(ZFD)4-Kid 라이브러리의 제작 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2는 바이러스 생산 과정 및 효소면역측정 (ELISA)을 포함하는, 포유동물에서 단일클론 항체의 생산량을 증가시킬 수 있는 징크 핑거 단백질을 스크리닝하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 3은 LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid에 의한 AKA 세포에서의 단일클론 항체 생산량 증가를 대조군 세포 (LNCX2-Kid 및 LNCX2)와 비교한 그래프이고,
도 4는 LK52-Kid와 이의 돌연변이 (mLK52-Kid)에 의한 AKA 세포에서의 배양 기간에 따른 단일클론 항체 생산량 증가를 대조군 (LNCX2-Kid) 세포와 비교한 그래프이고,
도 5는 1개의 ZFD를 포함하는 플라스미드 p3의 서열이고,
도 6은 pLNCX2-Kid의 서열이고,
도 7은 pLNCX2-(ZFD)4-Kid의 서열로서, (ApaI/ClaI)은 삭제된 제한효소 부위를 나타내고, F1 내지 F4는 각각 하나의 징크핑거 도메인을 나타내고,
도 8은 pLNCX2-LK52-Kid에서 LK52에 돌연변이를 삽입하는 과정을 나타낸 모식도로서, "* 수직선"은 돌연변이 위치를 나타내는 것이며,
도 9는 징크핑거 단백질 (ZFP)를 갖는 AKA 세포에서의 단일클론 항체의 mRNA를 RT-PCR로 정량한 그래프이다.
진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하지 않는 세포에 비해 단일클론 항체의 생산량을 증가시킬 수 있는 본 발명의 폴리펩타이드는 다수의 징크 핑거 도메인 (zinc finger domain; ZFD)을 포함하는 DNA 결합 도메인을 포함한다.
ZFD는 대략 30개의 아미노산 잔기로 된 작은 폴리펩타이드 도메인으로서, 그 중 시스테인 또는 히스티딘인 4 개의 아미노산 잔기가 적절히 배치되어 아연 이온과 배위결합을 할 수 있다 (검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Klug and Rhodes, Trends Biochem. Sci. (1987) 12: 464-469; Evans and Hollenberg, Cell (1988) 52:1-3; Payre and Vincent, FEBS Lett. (1988) 234: 245-250; Miller et al., EMBO J. (1985) 4:1609-1614; Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85:99-102; 및 Rosenfeld and Margalit, J. Biomol. Struct. Dyn. (1993) 11: 557-570] 참조). 따라서, ZFD는 아연 이온과 배위결합을 하는 잔기의 종류에 따라, 예를 들어 Cys2-His2류, Cys2-Cys2류, Cys2-CysHis류 등으로 분류할 수 있다. Cys2-His2 징크 핑거에서 아연과 배위결합하는 잔기는 전형적으로 다음과 같이 배치되어 있다:
NH2-Xa-X-C-X2-5-C-X3-Xa-X5-Ψ-X2-H-X3-5-H-COOH
여기에서 "Ψ (프사이)"는 소수성 잔기이고 (문헌 [Wolfe et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (1999) 3:183-212), "X"는 임의의 아미노산이고, "Xa"는 페닐알라닌 또는 타이로신이고, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 가리키고, 하이픈으로 연결된 두 숫자의 아래 첨자는 개재하는 아미노산의 전형적인 범위를 가리킨다. 비록 역평행 (anti-parallel) β-시트 (sheet)는 짧고 비이상적이고 존재하지 않을 수 있지만, 전형적으로, 개재하는 아미노산은 폴딩되어 α-나선에 대하여 충전되는 역평행 β-시트를 형성한다. 폴딩으로 인해, 아연과 배위결합하는 측쇄가 아연 이온과 배위결합하기에 적합한 사면체 구조를 갖도록 배치된다. 염기 접촉잔기는 핑거의 N-말단 및 선행 (preceding) 루프 (loop) 영역 내에 있다.
편의를 위해, ZFD의 주요 DNA 접촉잔기는 다음 예에 의거하여, -1, 2, 3 및 6으로 번호를 매긴다:
Figure 112006087195426-pct00002
여기에서, Xa는 페닐알라닌 혹은 타이로신이고, Xb는 전형적으로 소수성 잔기이다. 상기 예에서 명기한대로, DNA 접촉잔기는 시스테인 (C), 세린 (S), 아스파라긴 (N) 및 알지닌 (R)이다. 상기 모티프는 CSNR로 축약하여 표기할 수 있다. 본 명세서에서, 이러한 축약 표기는 특정 폴리펩타이드를 의미한다. 두 서열이 같은 모티프를 가질 경우, 숫자는 서열을 지시하는데 사용될 수 있다. 문맥에서 분명하게 알 수 있는 경우에, 네 글자 압축형은 일반적으로 모티프를 지칭한다.
"징크 핑거 단백질"이란 용어는 ZFD를 포함하는 모든 단백질을 지칭한다. 징크 핑거 단백질은 전형적으로 직렬로 배치된 두 개 이상의 ZFD를 포함한다.
ZFD는 가장 흔한 진핵생물 DNA-결합 모티프 중 하나로서, 효모로부터 고등 식물 및 인간에 이르는 다양한 종에서 발견된다. 인간 게놈에만도 수 천 가지 이상, 아마도 4,500가지 이상의 ZFD가 존재할 것으로 추측된다. ZFD는 징크 핑거 단백질로부터 분리될 수 있다. 징크 핑거 단백질의 비제한적인 예로는, CF2-II, 크룹펠 (Kruppel), WT1, 바소누클린 (basonuclin), BCL-6/LAZ-3, 적혈구 크룹펠-유사 전사 인자, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, 전사 억제제 YY1, EGR1/Krox24, EGR2/Krox20, EGR3/Pilot, EGR4/AT133, Evi-1, GLI1, GLI2, GLI3, HIV-EP1/ZNF40, HIV-EP2, KR1, ZfX, ZfY, 및 ZNF7 등이 있다.
하기에 서술될 전산법 (computational mothods)은 서열 분석된 게놈 혹은 핵산 데이터베이스에서 코딩된 모든 ZFD를 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 ZFD는 모두 활용가능하다. 또한, 인공 ZFD를 예컨대, 전산법을 사용하여 고안할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dahiyat and Mayo, Science (1997) 278:827] 참조).
적어도 일부의 ZFD가 DNA가 아닌 리간드, 예를 들어 RNA 또는 단백질에 결합한다는 사실도 주목할 만하다. 따라서, ZFD들의 키메라 또는 ZFD와 다른 종류의 도메인의 키메라는 DNA 뿐만 아니라 다양한 표적 화합물들을 인식하는데 사용될 수 있다.
2002년 4월 22일에 출원된 미국특허출원 제 60/374,355 호 "징크 핑거 도메인 라이브러리들"에 인공 징크 핑거 단백질을 구축하는데 사용할 수 있는 예시적 ZFD들이 기재되어 있다. 또한 하기 표 1을 참조하라.
바람직하게는, DNA 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 ZFD를 포함한다:
CX(2-5)CXXXBXRXXHJXTHX(3-5)H (서열번호: 2);
CX(2-5)CXXXBXQXXHJXRHX(3-5)H (서열번호: 3);
CX(2-5)CXXXBXQXXNJXKHX(3-5)H (서열번호: 4);
CX(2-5)CXXXBXQXXSJXRHX(3-5)H (서열번호: 5);
CX(2-5)CXXXBXQXXNJXRHX(3-5)H (서열번호: 6);
CX(2-5)CXXXBXQXXNJXIHX(3-5)H (서열번호: 7);
CX(2-5)CXXXBXRXXKJXRHX(3-5)H (서열번호: 8);
CX(2-5)CXXXBXQXXHJXVHX(3-5)H (서열번호: 9); 및
CX(2-5)CXXXBXQXXHJXQHX(3-5)H (서열번호: 10),
상기에서, B는 페닐알라닌 또는 타이로신이고, J는 소수성 아미노산이며, X는 임의의 아미노산이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 ZFD를 포함하는 DNA 결합 도메인에 연결된, 전사 활성화 도메인 (transctiption activation domain), 전사 억제 도메인 (transcription repression domain), 단백질 형질도입 도메인 (protein transduction domain; PTD) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명에서 각 ZFD는 그들의 DNA 접촉 아미노산 잔기, 즉, 알파 나선구조를 따라 -1, 2, 3 및 6 번째 위치의 아미노산 잔기의 약칭을 따서 명명한다. 예를 들어, 알파 나선구조를 따라 -1, 2, 3 및 6 번째 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌 (R), 아스파르트산 (D), 히스티딘 (H) 및 트레오닌 (T)인 ZFD는 RDHT로 표시된다.
본 명세서에서 사용된 "DNA 접촉잔기"라는 용어는, 징크 핑거 단백질 zif268 (문헌 [Kim and Pabo, J. Biol. Chem., (1997) 272(47):29795-800] 참조)의 핑거 3의 아르기닌 73, 아스파르트산 75, 글루탐산 76 및 아르기닌 79 아미노산에 구조적으로 대응되는 ZFD의 4개 아미노산들의 위치를 지칭한다. 이들 위치는 또한 각각 -1, 2, 3 및 6번 위치로 지칭되기도 한다. 이들 4개의 DNA 접촉잔기들 중, -1, 3 및 6번 위치의 아미노산 잔기들은 DNA 인식에 중요한 역할을 하고, 2번 위치의 아미노산 잔기는 보조적 역할을 한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 10의 아미노산 서열을 갖는 ZFD로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개 이상, 바람직하게는 2개 내지 6개의 ZFD를 포함할 수 있으며, 각 ZFD는 천연형 또는 비천연형이거나 이들의 조합일 수 있다. 또한, 각 ZFD들은 당 분야에 공지된 다양한 링커, 예를 들어 도메인들 사이의 펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
링커의 유용성과 디자인은 당업계에 공지되어 있다. 특히 유용한 링커는 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 링커이다. 따라서, 제1 DNA 결합 도메인, 펩타이드 링커 및 제2 DNA 결합 도메인을 코딩하는 합성 유전자를 제조할 수 있다. 이러한 디자인은 규모가 큰, 합성의, 복수-도메인 DNA 결합 단백질을 제조하기 위해 반복될 수 있다. 국제특허출원 제 WO 99/45132 호, 및 문헌 [Kim 및 Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:2812-7)는 징크 핑거 도메인들을 연결하는 데 적합한 펩타이드 링커의 디자인을 기술하고 있다.
무작위 코일, α-나선 또는 β-주름 (pleated)의 3차 구조를 형성하는 추가적인 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 적합한 유연성 링커 (flexible linker)를 형성하는 폴리펩타이드가 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34 (1998)] 참조). 유연성 링커는 전형적으로 글리신을 포함하는데, 이는 글리신이 측쇄가 결여되어 있어서 회전 자유도가 있는 유일한 아미노산이기 때문이다. 친수성을 증가시키기 위하여 세린 또는 트레오닌을 링커에 삽입할 수 있다. 아울러, 결합 친화도를 증가시키기 위해 DNA의 인산 골격과 상호작용할 수 있는 아미노산이 사용될 수 있다. 이러한 아미노산들의 현명한 사용으로 친화도의 증가와 서열 특이성의 감소 사이의 균형을 잡을 수 있다. 만약, 링커가 엄격한 신장성을 요구한다면, 문헌 [Pantoliano et al., Biochem. (1991) 30:10117-10125]에 기술된 나선형 링커와 같은 α-나선형 링커를 사용할 수 있다. 또한 링커는 컴퓨터 모델링에 의해 디자인될 수 있다 (미국특허 제 4,946,778 호 참조). 분자 모델링을 위한 소프트웨어는 상업적으로 입수할 수 있다 (예컨대, Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA). 이러한 링커는, 단백질 공학 분야에서 실시되는 표준 돌연변이 유도 기술 및 적절한 생물리학적 테스트, 및 본 명세서에 기술된 기능적 분석법을 사용하여, 예를 들어, 항원성을 감소시키고/시키거나 안정성을 증가시키기 위해 임의적으로 최적화된다.
ZFD를 활용한 구체예들을 위해, 징크 핑거 사이에서 자연적으로 발견되는 펩타이드를, 핑거들을 함께 연결하기 위한 링커로서 사용할 수 있다. 그러한 자연적으로 발견되는 링커로서 전형적인 것은 'Thr-Gly-(Glu/Gln)-(Lys/Arg)-Pro-(Tyr/Phe) (서열번호: 11) (문헌 [Agata et al., Gene (1998) 213:5564] 참조)'이다.
보다 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드의 DNA 결합 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로 제1, 제2, 제3 및 제4의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 여기에서
(1) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 K이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, S 및 R;
(2) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 I;
(3) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, K 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R; 또는
(4) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 V이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 Q이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, S 및 R이다.
본 발명의 폴리펩타이드로서 가장 바람직한 것들은 서열번호: 12 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지며, LK33, LK35, LK50 및 LK52로 각각 명명된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 진핵 세포에서 단일클론 항체의 생산량 증가를 유도하기 위하여 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인, 단백질 형질도입 도메인 (PTD) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
전사 활성화 도메인의 예로는 효모의 Gal4 활성화 도메인 (문헌 [Laughon, A. and Gesteland, R. F., Mol. Cell. Biol., (1984) 4: 260-267] 참조; NCBI accession number AAA45766의 아미노산 번호 768-878), 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 도메인 (문헌 [Pellett, P. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:5870-5874] 참조; NCBI accession number AAA45766의 아미노산 번호 402-479) 및 포유동물 세포의 p65 (문헌 [Nolan G. P. et al., Cell, (1991) 64:961-969; NCBI accession number NP_068810의 아미노산 번호 275-535)을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
진핵생물 전사 억제 도메인의 예로는 Kid, UME6, ORANGE, groucho 및 WRPW의 억제 도메인 (문헌 [Dawson et al., Mol. Cell Biol. (1995) 15:6923-6931] 참조)이 있다. 특히, 랫트 (rat)의 Kid 단백질의 "KRAB"　도메인 (문헌 [Witzgall R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1994) 91: 4514-4518] 참조) 및 인간 Kox1 단백질 (NCBI 단백질 데이터베이스 AAH24182; GI: 18848329)의 "KRAB" 도메인 (즉, Kox1의 아미노산 번호 2-97)을 들 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 Kid 전사억제 도메인을 사용하였으며, 이를 코드하는 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호: 69 및 68로 각각 나타내었다.
상기 전사 활성화 도메인 및 전사 억제 도메인은 DNA 결합 도메인에 연결되어 융합 단백질을 형성할 수 있다.
또한, 단백질 형질도입 도메인 (PTD)은 형질도입 도메인 및 이에 부착된 폴리펩타이드를 세포 내로 도입한다. 본 발명에서 유용한 대표적인 PTD로는 HIV TAT 단백질의 일부 (예를 들어, 인간 HIV-1 바이러스 Tat 단백질의 아미노산 47-57 부위), VP22 단백질의 일부 (예를 들어, HSV VP22의 C-말단 34 아미노산 잔기; 문헌 [Elliott and O'Hare, Cell, (1997) 88:223-234] 및 미국 특허 제6,184,038호 참조), 또는 안테나페디아 호메오도메인 (Antennapedia homeodomain)의 일부(문헌 [Derossi et al., J. Bio. Chem. (1994) 269:10444-10450)를 들 수 있다.
전형적으로 PTD는 징크 핑거 단백질의 DNA 결합도메인과 PTD를 하나의 폴리펩타이드 사슬로 만드는 것으로 징크 핑거 단백질과 연결되나, PTD를 물리적으로 결합시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, PTD는 비공유결합 반응 (예를 들어, 바이오틴-아비딘, 코일드 코일 (coiled-coil) 등)에 의하여 결합될 수 있다. 보다 전형적으로, 예를 들어 PTD는 유연성 링커를 사용하여 징크 핑거 단백질과 연결될 수 있다. 유연성 링커는 자유 회전을 부여하기 위하여 하나 또는 그 이상의 글라이신 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어 PTD는 전사인자의 DNA 결합 도메인으로부터 10, 20 또는 50개의 아미노산 이상 간격을 둘 수 있다. PTD는 DNA 결합 도메인을 기준으로 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 단일클론 항체 또는 이종 단백질의 생산량을 향상시키는 것과 관련 있는 유전자를 스크리닝하는데 유용하며, ZFD에 결합된 전사조절 도메인의 종류에 따라 이들 유전자의 발현을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다.
아울러, 본 발명은 세포 내로 직접 도입된 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 세포 내에 도입된 상기 폴리펩타이드-코딩 핵산으로부터 생산되는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 형질전환된 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명에 사용가능한 상기 세포의 예로는 CHO 세포, NS-O 세포, Per.C6 세포, HEK293 세포 및 HEK293T 세포 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, CHO 세포가 가장 바람직하다.
본 발명의 형질전환된 세포를 이용하면, DHFR 유전자를 이용한 방법 등의 기존 방법과는 달리, 동일한 배양조건에서 단일클론 항체의 수율을 현저하게 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 징크 핑거 단백질에 포유동물 세포의 전사 억제인자인 Kid를 융합하여 제조된 ZFP-Kid 인공전사인자 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 선별한다. 라이브러리의 구성단위가 되는 ZFD를 얻는 방법은 크게 두 가지가 있는데, 하나는 기존의 징크 핑거의 DNA 접촉잔기를 돌연변이시키는 것이고 (문헌 [Rebar E. J. & Pabo, C. O., Science (1994) 263:671-673] 참조), 다른 하나는 자연계에 존재하는 생명체의 유전체에 존재하는 ZFD를 분리하는 것이다 (문헌 [Bae K.-H. et al., Nature Biotechnol., (2003) 21:275-280] 참조). 이들 징크 핑거의 특이적인 표적 염기 서열은 파지 디스플레이나 효모의 원-하이브리드 (one-hybrid) 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 징크 핑거 라이브러리를 CHO 세포에 고효율로 형질전환시키기 위하여, 레트로바이러스 벡터인 pLNCX (Clontech, 미국)에서 두 개의 EcoRI 부위를 제거한 벡터 pLNCX2에 Kid 도메인과 기존의 징크 핑거 라이브러리 p3-(ZFD)4 (국제특허공개 제 WO03/048345 및 문헌 [Park K.-S. et al. Nature Biotech. (2003) 21:1208-1214] 참조)에서 얻은 (ZFD)4 도메인을 삽입하여 pLNCX2-(ZFD)4-kid 라이브러리를 제작한다 (도 1).
상기 라이브러리로부터 단일클론 항체의 생산을 증가시키는 징크 핑거 단백질을 스크리닝하는 과정을 도 2에 나타내었다. 라이브러리의 각 DNA를 pGag-Pol (Takara, 일본) 및 pVpack-VSV-G (Stratagene, 미국)와 함께 HEK 293T 세포에 도입하여 형질전환시킨 다음, 각각 다른 ZFP 인공 전사 인자가 팩키지된 바이러스 입자를 함유하는 배지 상등액을 회수한다.
상기 상등액을, TAG72에 대한 인간화된 항체 (humanized antibody)의 유전자로 CHO 세포를 형질전환시킨 뒤 20 nM의 MTX에서 증폭시켜 제조된 AKA 세포에 첨가하여 ZFP-Kid 인공 전사 인자의 다른 유전자가 각 웰의 AKA 세포의 유전체 내에 삽입되도록 한다.
ZFP-Kid 유전자에 의한 단일클론 항체 생산량의 증가는 ZFP가 없는 pLNCX-Kid를 갖는 AKA 대조에 의한 항체 생산량과 비교한다. 인간 면역글로불린 (immunoglobulin)에 대한 항체를 이용한 ELISA로 단일클론 항체를 정량한 다음, AKA 세포에서 단일클론 항체 생산량을 증가시키는 ZFP, 예를 들어 LK-33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid를 최종 확정하였다 (도 3 및 표 2).
징크 핑거 단백질인 LK52-Kid는 배양기간에 따라, Kid 대조군에 비하여 단일클론 항체 생산을 약 3 내지 9배 증가시킨다 (도 4). 또한, LK52-Kid의 두 징크 핑거 도메인에서 각각 한 아미노산씩 돌연변이 시켰을 때, 단일클론 항체의 생산량 증가가 관찰되지 않았다 (도 4). 이는 본 발명의 폴리펩타이드가 세포 내 유전자의 전사를 조절하여 단일클론 항체 생산의 증가를 초래하는 유전자의 발현을 조절하기 때문으로 추정된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 코드하는 핵산을 이용하여 단일클론 항체 생산의 증가를 초래하는 유전자를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 단일클론 항체의 생산이 현저하게 증가하게 하는 유전자를 탐색하는 방법은 다음과 같다. 단일클론 항체를 생산하는 포유동물 세포주, 예를 들어 단일클론 항체 유전자로 형질전환된 CHO 세포인 AKA 세포를 2개 이상, 바람직하게는 2개 내지 6개의 ZFD 및 여기에 연결된 전사 억제 도메인을 포함하는 징크 핑거 폴리펩타이드, 또는 상기 징크 핑거 폴리펩타이드를 코드하는 핵산으로 형질전환한다. 상기 형질전환된 AKA 세포로부터 RNA를 추출한 다음, 역전사 반응으로 cDNA 탐침을 제조한다. 상기 탐침을 CHO 세포 유전자가 배열된 DNA 칩과 마이크로어레이를 실시함으로써 ZFP에 의해 발현이 억제되어 단일클론 항체 생산의 증가를 초래하는 유전자를 선별한다. 본 발명에서 마이크로어레이는 공지의 방법 (문헌 [Schena M. et al.,Science, (1995) 270:467-470] 참조)에 따라 실시할 수 있다.
ZFP 라이브러리를 이용한 본 발명의 스크리닝 방법은 유용한 형질 (예: 단백질 생산 증가 및 세포 사멸 방지)의 개선을 목적으로 이종의 유용한 단백질을 생산하기 위하여 산업적으로 이용되는 다른 동물세포 (예: CHO, NS-O, Per.C6, HeLa, HEK293 및 293T 세포)에도 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: pLNCX-(ZFD) 4 -Kid 라이브러리의 구축
(단계 1) 징크 핑거 단백질 발현 라이브러리 p3-(ZFD)4의 제작
인간 유전체로부터 PCR 또는 클로닝에 의해 분리되고 효모의 원-하이브리드 방법에 의해 각각의 특이적인 표적 염기 서열 (한국특허공개 제 10-2001-0084880 호, 국제특허공개 제 WO 01/60970 호 및 문헌 [Bae K.-H. et al., Nature Biotechnol., (2003) 21:275-280)이 결정되어 있는 표 1의 ZFD를 이용하여, 문헌 [Bae, K.-H. et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 따라 징크 핑거 라이브러리를 제작하였다.
구체적으로, 플라스미드 pCDNA3 (Invitrogen, 미국)의 다중 클로닝 부위에 HA-tag (서열번호: 16) 및 핵 위치화 신호 (nuclear localization signal; NLS, 서열번호: 17) 서열을 삽입하고, 플라스미드 p3로 명명하였다 (문헌 [Bae, K.-H. et al., 상기 문헌] 참조).
Figure 112006087195426-pct00003
플라스미드 p3의 EcoRI/NotI 제한효소 부위에 상기 표 1에 기재된 각 ZFD를 코드하는 어느 하나의 DNA 서열을 클로닝하여 플라스미드 p3-ZFD를 제작하였다 (도 5). 표 1에 기재된 총 25개의 도메인 중 하나를 포함하는 플라스미드 p3를 각각 동일한 양으로 모아서 도메인 풀 (domain pool)을 만들었다. 이 풀의 일부를 XmaI 및 NotI 제한효소로 절단하여 ZFD 삽입체들 (inserts)을 얻고, 다른 일부는 AgeI 및 NotI 제한효소로 잘라 한 개의 ZFD를 포함하는 벡터에 상응하는 긴 DNA 절편들을 얻었다. 상기 DNA 삽입체들을 긴 DNA 절편들에 클로닝하여 2개의 ZFD를 포함하는 징크 핑거 단백질을 발현하는 벡터 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리의 일부를 다시 AgeI 및 NotI 제한효소로 절단하여 2개의 ZFD로 이루어진 삽입체들을 준비하고, 이 삽입체들을, 로 자른 두 개 ZFD를 포함하는 라이브러리 벡터들의 AgeI 및 NotI 제한효소 부위에 삽입하여 4개의 ZFD를 포함하는 징크 핑거 단백질을 발현하는 벡터 p3-(ZFD)4의 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리에서 4개의 ZFD를 포함하는 징크 핑거 단백질을 코드하는 DNA는 상기 라이브러리의 벡터의 EcoRI 및 NotI 제한효소 부위를 절단하여 라이브러리 벡터로부터 분리할 수 있다.
(단계 2) pLNCX2-(ZFD)4-Kid 라이브러리의 제작
전사 억제 도메인과 결합된 징크 핑거 단백질을 발현하는 벡터를 다음과 같이 제조하였다 (도 1).
우선, 레트로바이러스 벡터 pLNCX (Clontech)의 1475번 염기에 있는 EcoRI 부위를 제거하기 위해, 전방향 올리고머 LNCX1-F (서열번호: 70, 5'-TAGGCGCCGGAATTtCGATCTGATCAAGA-3'; 이하, 소문자는 돌연변이시킨 염기를 나타냄) 및 역방향 올리고머 LNCX1-R (서열번호: 71, 5'-TCTTGATCAGATCGaAATTCCGGCGCCTA-3') 쌍과 뮤타제네시스 키트 (Stratagene, 미국)를 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis)을 실시함으로써 플라스미드 pLNCX1을 제작하였다. 플라스미드 pLNCX1을 EcoRI으로 절단한 후, T4 폴리머라제 (T4 polymerase)를 처리하여 평활말단 (blunt end)을 만든 다음, EcoRI 부위를 자가 연결 (self-ligation)함으로써 두 EcoRI 위치가 모두 제거된 플라스미드 pLNCX2를 제작하였다.
한편, 다음과 같은 방법으로 전사 억제 도메인을 얻었다. 플라스미드 pTet-tTS (Clontech)를 주형으로 하고 전방향 올리고머 Kid-F (서열번호: 72, 5'-GGGCGGCCGCTAAATTCGTGTCAGTGACA-3') 및 역방향 올리고머 Kid-R1 (서열번호: 73, 5'-CCGCTCGAGTTACCAGGGATCCTCTCC-3') 쌍을 이용하여 랫트 (rat)의 Kid 도메인을 PCR로 증폭한 후, 그 산물을 NotI 및 XhoI 제한효소로 절단하고 NotI/XhoI-절단된 플라스미드 pLFD-p65 (문헌 [Bae K.-H. et al., 상기 문헌] 참조)에 삽입하여 플라스미드 pLFD-Kid를 제작하였다. pLFD-Kid에 ApaI 및 T4 폴리머라제를 순차적으로 처리하여 평활말단을 만든 다음, HindIII를 처리하여 Kid 절편을 얻었다.
상기 플라스미드 pLNCX2에 ClaI 및 T4 폴리머라제를 순차적으로 처리하여 평활말단을 만든 다음, HindIII로 절단하였다. 여기에 상기에서 얻은 Kid 절편을 삽입하여 플라스미드 pLNCX2-Kid를 제작하였다 (도 6). 도 6에서 (ApaI/ClaI)은 상기와 같은 제작과정에 의해 두 효소 부위가 모두 없어진 것을 나타낸다.
단계 1에서 제작된 p3-(ZFD)4 라이브러리를 EcoRI 및 XhoI으로 절단하여 (ZFD)4 DNA 절편을 준비한 후, 이 절편을 역시 EcoRI 및 XhoI으로 절단한 pLNCX2-Kid 벡터에 삽입하여 플라스미드 pLNCX2-(ZFD)4-Kid를 제작하였다 (도 7). 도 7에서, F1, F2, F3 및 F4는 각각 하나의 ZFD를 나타내고, (ApaI/ClaI)은 도 6에서 정의한 바와 같다.
라이브러리를 제조하기 위해, pLNCX2-(ZFD)4-Kid 벡터들을 대장균에 형질전환한 후, 아쿠프렙 (Accuprep) 플라스미드 추출 키트 (Bioneer, 한국)를 이용하여 5,000개 이상의 대장균 콜로니로부터 라이브러리 플라스미드들을 분리하였다.
실시예 2: 단일클론 항체 생산량을 증가시키는 ZFP의 스크리닝
(단계 1) 293T 세포에서 ZFP를 포함하는 바이러스의 생산
열처리된 10% FBS (JBI, 한국)를 포함한 DMEM (JBI, 한국)이 들어 있는 96-웰 배양판의 각 웰에, 293T 세포 (ATCC CRL-11268) 6x104개씩을 분주하여 37℃의 CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다.
형질전환은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 실시예 1에서 제작한 플라스미드 pLNCX2-(ZFD)4-Kid 또는 ZFP가 없는 pLNCX2-Kid 대조군 벡터 100 ng, pGag-Pol 바이러스 벡터 (Takara, 일본) 50 ng 및 플라스미드 pVpack-VSV-G (Stratagene, 미국) 50 ng을 Opti-MEM (Invitrogen, 미국) 25 ㎕와 혼합하였다 (혼합액 A). 이와 별도로 리포펙타민 2000 (Invitrogen, 미국) 0.5 ㎕를 Opti-MEM 25 ㎕와 혼합하였다 (혼합액 B). 상기 혼합액 B를 상온에서 5분 동안 방치한 후, 혼합액 A와 섞어 상온에서 20분 동안 방치하였다 (혼합액 C). 상기 배양판의 각 웰에서 배지를 제거하고 여기에 상기 혼합액 C를 첨가하여 293T 세포를 형질전환하였다. 상기 세포를 10시간 동안 배양한 다음, 바이러스 생산량을 높이기 위해서 배지를 10 mM 소듐부티레이트 (sodium butyrate) 및 10% FBS (JBI, 한국)를 포함한 DMEM 배지로 교체해 주었다. 그리고 나서, 약 12시간 동안 배양한 후, 배지를 10% FBS (JBI, 한국)-함유 DMEM 배지로 교환하고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양액으로부터 바이러스를 함유한 상등액을 수거하였다.
(단계 2) ZFP-함유 바이러스를 사용한 AKA 세포의 형질도입 (transduction)
징크 핑거 라이브러리를 삽입하여 스크린하기 위하여, AKA 세포 (한국생명공학연구원의 홍효정 박사로부터 분양받음)를 사용하였다. 상기 AKA 세포는 당 분야에서 일반적으로 사용하는 방법 (문헌 [Kim, S. J., et al., Biotechnol Bioeng. (1998) 58:73-84] 참조)에 따라 TAG72 당단백질에 대한 인간화 항체 (humanized antibody)의 유전자 (한국특허공개 제 2000-0005885 호)로 CHO 세포를 형질전환시킨 뒤, 20 nM의 MTX로 증폭시켜 제조되었다.
단계 1에서 상등액을 수거하기 하루 전날, 투석 (dialysis)된 10% FBS (JBI, 한국)가 함유된 알파-MEM (JBI, 한국)이 들어 있는 96-웰 배양판의 각 웰에 AKA 세포를 1.5×104개씩 분주하여 37℃의 CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 단계 1에서 얻은 상등액 25 ㎕를 투석된 10% FBS 및 폴리브렌 (polybrene, 80 ㎍/㎖) 0.05㎕가 함유된 알파-MEM 25 ㎕와 혼합한 다음, 배양된 AKA 세포가 있는 각 웰에 가함으로써 AKA 세포를 형질전환시켰다. 24시간 후, 배지를 새로운 알파-MEM으로 교체하고 24시간 동안 더 배양하였다. 형질전환된 AKA 세포 배양액으로부터 상등액 50 ㎕를 수거하여 냉동 보관하였다.
(단계 3) 단일클론 항체 생산을 증가시키는 ZFP의 스크리닝을 위한 ELISA
항-마우스 IgG (Sigma) 0.5 ㎍을 함유한 0.05 M 소듐카보네이트 (Sodium carbonate, pH 9.6) 50 ㎕를 96-웰 면역 배양판 (immuno plate, Nunc, 덴마크)의 각 웰에 분주하고 37℃ 항온기에서 2시간 동안 두었다. 그리고 나서, 배양판을 증류수로 3번 세척하고, 단계 2의 상등액을 0.25% BSA 및 0.05% 트윈 (Tween)-20을 포함한 PBS (0.01 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨, 0.137 M 염화나트륨, pH 7.4)로 100배 희석한 용액 50 ㎕를 배양판의 각 웰에 분주했다. 상온에서 2시간이 지난 후 다시 증류수로 3번 세척하고, 항-인간 IgG-퍼옥사이드 컨쥬게이트 (Sigma)를 0.25% BSA 및 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 10,000배 희석하여 배양판의 각 웰에 50 ㎕씩 분주하였다. 분주 1시간이 지난 후, 다시 증류수로 3번 세척하고, 각 웰에 TMB 용액 (Sigma) 70 ㎕를 넣은 다음, 10분 동안 반응시켰다. 각 웰의 흡광도를 파워웨이브 340 (powerwave 340, Bio-TEK Instruments, INC., 미국)을 사용하여 655 nm 파장에서 측정하였다. 그 결과, 대부분의 웰은 ZFP가 없는 pLNCX2-Kid 대조군 벡터와 비슷한 흡광도를 보였으나, 4개의 pLNCX2-(ZFD)4-Kid 플라스미드가 대조군보다 높은 흡광도를 보였으므로, 추가 실험을 실시하였다.
실시예 3: AKA 세포에서 4개의 ZFP에 의한 단일클론 항체 생산량의 변화
4개의 ZFP의 항체 생산량이 pLNCX2-Kid를 삽입한 대조군에 비하여 높았다. 이를 확인하기 위해, 반응 혼합액을 상온에서 방치하는 시간을 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
리포펙타민 2000을 Opti-MEM과 혼합하여 상온에서 20분 동안 방치한 후, 상기 혼합액을 플라스미드 pLNCX2-ZFP-Kid, pGag-Pol 및 pVpack-VSV-G를 포함하는 Opti-MEM과 혼합하여 상온에서 40분 동안 방치하였다. 상기 용액으로 96웰 플레이트에서 키운 293T 세포를 형질전환하였으며, 플라스미드 pLNCX2 및 pLNCX2-Kid를 대조군 플라스미드로 각각 사용하였다.
실시예 2의 단계 2의 방법에 따라 AKA 세포를 바이러스로 형질전환한 후, 24시간 뒤에 새 배지로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 항체가 포함된 각 상등액을 250 및 500배 희석한 다음, ELISA를 수행하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 네 개의 ZFP-Kid, 즉 LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid가 AKA 세포에서 약 2-6배의 항체 생산량 증가를 나타내었다. 이들 ZFP의 ZFD 및 표적 서열을 확인하여 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112006087195426-pct00004
실시예 4: 시간에 따른 AKA 세포에서 LK52에 의한 단일클론 항체 생산량의 변화
항체 생산량을 가장 많이 증가시키는 LK52-Kid에 대해 배양일을 늘렸을 때 항체 생산량의 변화를 관찰하였다.
(단계 1) 293T 세포에서 ZFP-함유 바이러스 생산
열처리된 10% FBS (JBI, 한국)를 포함한 DMEM (JBI, 한국)이 들어 있는 24-웰 배양판의 각 웰에, 293T 세포 (ATCC CRL-11268)를 5x105개씩 분주하여 37℃의 CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다.
플라스미드 pLNCX2-LK52-Kid 400 ng, pGag-Pol 바이러스 벡터 (Takara, 일본) 200 ng 및 플라스미드 pVpack-VSV-G (Stratagene, 미국) 200 ng을 Opti-MEM (Invitrogen, 미국) 50 ㎕와 혼합하였다 (혼합액 A). 이와 별도로 리포펙타민 2000 (Invitrogen, 미국) 2 ㎕를 Opti-MEM (Invitrogen, 미국) 50 ㎕와 혼합하였다 (혼합액 B). 혼합액 B를 상온에서 20분 동안 방치한 후, 혼합액 A와 섞어 상온에서 40분 동안 방치하였다 (혼합액 C). 상기 배양판의 각 웰에서 배지를 제거하고, 혼합액 C를 넣어 293T 세포를 형질전환시켰다. 약 10시간 동안 배양한 후, 바이러스 생산량을 높이기 위해서 배지를 10 mM 소듐부티레이트 (sodium butyrate) 및 10% FBS (JBI, 한국)를 포함한 DMEM으로 교체해 주었다. 약 12시간 동안 배양한 다음, 배지를 10% FBS (JBI, 한국)를 포함한 새 DMEM으로 교환하였다. 상기 세포를 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 바이러스를 포함하는 형질전환된 293T 세포의 상등액을 수거하였다.
(단계 2) ZFP-함유 바이러스를 사용한 AKA 세포의 형질도입 (transduction)
단계 1에서 상등액을 수거하기 하루 전날, 투석된 10% FBS (JBI, 한국)가 포함된 알파-MEM(JBI, 한국)이 들어 있는 24-웰 배양판의 각 웰에 AKA 세포를 3×104개씩 분주하여 37℃의 CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 단계 1의 상등액 125 ㎕를 투석된 10％ FBS 및 폴리브렌 (80 ㎍/㎖) 0.25 ㎕가 포함된 알파-MEM 125 ㎕와 혼합하여 배양된 AKA 세포가 있는 각 웰에 가함으로써 AKA 세포를 형질전환시켰다. 24시간 후, 배지를 10％ FBS를 함유한 새로운 알파-MEM으로 교체하고 24, 48, 72, 96 및 120 시간 (즉, 도 4의 3, 4, 5, 6 및 7일) 동안 배양하였다. 형질전환 후 각 상등액 200 ㎕, 형질전환 전 각 상등액 (도 4의 1일) 200 ㎕ 및 형질전환 뒤 배지 교체 전 각 상등액 (도 4의 2일) 200 ㎕을 형질전환된 AKA 세포 배지에서 수거하여 냉동 보관하였다.
(단계 3) 단일클론 항체 생산을 증가시키는 ZFP의 스크리닝을 위한 ELSIA
단계 2에서 보관된 상등액들을 이용하여 실시예 2의 단계 3과 동일한 방법으로 ELISA를 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, LK52-Kid는 Kid 대조군에 비해 AKA 세포에서 단일클론 항체의 생산량을 배양시간에 따라 계속 증가시켜 최고 약 9배, 37 ㎍/㎖까지 증가시켰다.
실시예 5: 돌연변이된 ZFP가 형질도입된 mK52-Kid의 활성
ZFP가 단일클론 항체의 생산량 증가를 유도하는 직접적인 원인인지 확인하기 위하여, LK52-Kid의 첫 번째 핑거인 RDHT의 DNA 접촉잔기 -1번의 아르기닌과, 네 번째 핑거인 QSSR1의 DNA 접촉잔기 6번의 아르기닌을 알라닌으로 동시에 돌연변이시켜 LK52의 DNA 결합 부위를 변화시켰다. 돌연변이의 도입은 도 8에 따라 실시하였다.
먼저, 플라스미드 pLNCX2-LK52-Kid를 주형으로 하고, ① NLS-F (서열번호: 78, 5'-CCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3')와 mutRDHT-R (서열번호: 79, 5'-CAGGTGGTCGGAggcGGAGAACTTTCG-3)의 올리고머 쌍, ② mutRDHT-F (서열번호: 80, 5'-CGAAAGTTCTCCgccTCCGACCACCTG-3')와 QTHQ-R (서열번호: 81, 5'-CCTAAAGGACTTTCCGCAATCGTGACACTC-3')의 올리고머 쌍, ③ QTHQ-F (서열번호: 82, 5'-GAGTGTCACGATTGCGGAAAGTCCTTTAGG-3')와 mutQSSR1-R (서열번호: 83, 5'-GTGTCCGCTGGTGGgcAATGAGGCTGGAAC-3')의 올리고머 쌍, ④ mutQSSR1-F (서열번호: 84, 5'-GTTCCAGCCTCATTgcCCACCAGCGGACAC-3')와 Kid-R2 (서열번호: 85, 5'-CCGCTCGAGCCAGGGGTCCTCTCC-3')의 올리고머 쌍들을 프라이머로 이용하여 PCR 방법으로 1차 산물을 얻었다. ①과 ②의 1차 PCR 산물을 주형으로 하고, NLS-F (서열번호: 78)와 QTHQ-R (서열번호: 81)의 올리고머 쌍 (⑤)을 이용하여 2차 PCR을 수행하고; ③과 ④의 1차 PCR 산물을 주형으로 하고, QTHQ-F (서열번호: 82)와 Kid-R2 (서열번호: 85)의 올리고머 쌍 (⑥)을 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 최종적으로 ⑤와 ⑥의 2차 PCR 산물을 주형으로 하고, NLS-F (서열번호: 78)와 Kid-R2 (서열번호: 85)의 올리고머 쌍을 이용하여 3차 PCR을 수행하여 원하는 돌연변이를 가진 DNA 산물을 제작하고 분리하였다. 최종 산물을 EcoRI 및 NotI으로 절단하여 돌연변이된 mLK52 DNA 절편을 얻었다. 상기 DNA 절편을 EcoRI/NotI 쌍으로 처리하여 야생형 LK52를 잘라 낸 플라스미드 pLNCX2-LK52-Kid의 EcoRI/NotI 제한효소 부위에 클로닝한 다음, 대장균 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 얻어진 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 염기서열 확인을 통해 돌연변이된 mLK52 유전자를 포함하는 플라스미드 pLNCX2-mLK52-Kid를 얻었다.
AKA 세포를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스를 이용하여 상기 돌연변이된 pLNCX2-mLK52-Kid로 형질전환시킨 다음, 이 ZFP가 단일클론 항체 생산성의 향상을 유도하는지를 조사하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, mLK52-Kid를 함유한 AKA 세포는 ZFP없이 전사 억제도메인인 Kid만 발현하는 대조군 세포와 비슷한 수준의 단일클론 항체 생산량을 보였다. 동일한 실험에서 LK52-Kid로 형질전환된 AKA 세포가 약 9배까지의 생산량 증가를 보였던 것을 고려할 때, 상기 결과는 LK52의 특이적인 DNA 결합능력이 단일클론 항체의 생산량 증가에 필수적임을 증명한다.
실시예 6: 다양한 세포에서 LK52에 의한 단일클론 항체 생산량 변화
LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid가 AKA 세포 외의 다른 단일클론 항체를 생산하는 세포에서도 단일클론 항체의 생산량 증가를 유도하는지를 조사하기 위하여, 단일클론 항체를 생산하는 CHO 세포인 SH2-0.32 및 ISU-ABC 세포 (한국과학기술원의 이균민 교수로부터 제공받음)에 상기 ZFP-Kid를 도입한 후 단일클론 항체 생산량을 조사하였다. 상기 SH2-0.32 세포는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 단일클론 항체의 유전자로 CHO 세포를 형질전환시킨 후 단일클론 항체의 생산을 증가시키도록 상기 유전자를 증폭시킨 세포주이다 (문헌 [Kim, N. S. et al., Biotech & Bioeng. (2001) 71:184-193] 참조). 또한, ISU-ABC 세포는 인간 혈소판의 당단백질 수용체에 대한 단일클론 항체의 유전자로 CHO 세포를 형질전환시킨 후 단일클론 항체의 생산을 증가시키도록 상기 유전자를 증폭시킨 세포주이다. CHO 세포에서 특정 유전자를 증폭하는 방법은 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자 및 MTX를 이용한 유전자 증폭(gene amplification) 과정과 같은 당업계에서 공지된 방법에 따라 수행하였다 (문헌 [Kim, S. J., et al., Biotechnol Bioeng. (1998) 58:73-84] 참조).
실험은 바이러스를 세포에 전달하고 하루 뒤에 배지를 동일한 새 배지 100 ㎕로 교환하고; 1일 후, 상등액 30 ㎕를 수거하고; 3일 후에 남은 상등액을 수거하고; 배지에 분비된 항체농도를 상등액을 이용하여 결정한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 각 플라스미드 시료당 3-4개의 웰을 사용하여 평균과 표준편차를 구하였고, ELISA는 다음과 같이 수행하였다.
항-마우스 IgG (Sigma) 0.2 ㎍을 포함한 0.05 M 소듐카보네이트 (Sodium carbonate, pH 9.6) 100 ㎕를 96-웰 면역 배양판 (Nunc, 덴마크)의 각 웰에 분주하고 37℃ 항온기에서 2시간 동안 방치하였다. 배양판을 PBST (0.05% 트윈-20이 포함된 PBS)로 3번 세척하였다. 2% BSA 300 ㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 방치하여 비특이적 반응을 차단 (blocking)한 뒤, PBST로 3번 세척하였다. 상기에서 얻은 상등액을 0.25% BSA 및 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 1,000배 희석한 후 그 용액 100 ㎕를 각 웰에 분주하였다. 상온에서 2시간이 지난 후, 배양판을 PBST로 3번 씻고, 0.25% BSA 및 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 2,000배 희석된 항-인간 IgG-HRP 컨쥬게이트 (Sigma)를 배양판의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 1시간 후, 배양판을 증류수로 3번 세척하였다. 배양판의 각 웰에 기질혼합용액 (PC 완충액 [증류수 500 ㎖에 C6H8O7·H2O 2.55 g 및 Na2HPO4 3.65 g을 녹여서 pH를 5.0으로 맞춘 용액] 10 ㎖, O-페닐렌다이아민 12 ㎕ 및 H2O2 4 ㎕의 혼합액) 100 ㎕를 넣고 2∼3분 동안 반응시켰다. 각 웰에 1 M H2SO4를 50 ㎕씩 분주하여 반응을 정지시켰다. 반응 결과는 ELISA 리더 (reader) (Bio-rad, model-680)를 사용하여 490 nm 파장에서 측정하고 표 3 및 4에 나타내었다.
Figure 112006087195426-pct00005
Figure 112006087195426-pct00006
상기 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid 모두가 SH2-0.32 세포와 ISU-ABC 세포에서의 3일 후 단일클론 항체 생산량을 각각 2.5-4.1배, 1.3-1.8배로 증가시켰고, 이 중 LK52-Kid가 가장 좋은 효과를 보였다. 이러한 결과로부터, AKA 세포에서 스크리닝한 ZFP가 다른 항체를 생산하는 CHO 세포에서도 유사하게 작용함을 알 수 있다. 따라서, 한 세포에서 ZFP를 스크린하면 유사한 기능을 갖는 동종의 다른 세포에서도 비슷한 효과를 기대할 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 실시간 (Real time) PCR
AKA 세포에서 단일클론 항체 생산을 증가시키는 LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid의 기작을 조사하기 위하여, 이들 4개의 ZFP를 발현하는 AKA 세포의 단일클론 항체의 mRNA를 실시간 PCR로 정량하였다.
실시예 3과 동일한 방법으로 LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid를 지닌 바이러스를 생산하여 AKA 세포에 형질전환하였다. 이 때 대조군으로 pLNCX2-Kid를 사용하였다. 24시간 후에 배지를 교체한 후 이틀 뒤에 세포를 모은 다음, 트리졸 (Trizol, Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 1 ㎍ 과 슈퍼스크립트 II 키트 (SuperScript II kit, Invitrogen)를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 산물 8 ㎕과 2×SYBR (Qiagen) 10 ㎕를 혼합하고, 상기 혼합물과 AKA-F (서열번호 86: 5'-GATGGGCCCTTGGTGCTGGCT-3') 1 ㎕ 및 AKA-R (서열번호 87: 5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3') 1 ㎕의 올리고머 쌍, 또는 GAPDH-F (서열번호 88: 5'-CCGAGTATGTTGTGGAATCTACTG-3') 1 ㎕ 및 GAPDH-R (서열번호 89: 5'-GACAATCTTGAGGGAGTTGTCATA-3') 1 ㎕의 올리고머 쌍을 사용하여, 실시간 PCR (Rotor-Gene 2000, Corbett research, 호주)을 실시하였다. 이 때 사용한 각 올리고머의 농도는 10 pmol/㎕이었다. 도 9에 나타난 바와 같이, LK33-Kid, LK35-Kid, LK50-Kid 및 LK52-Kid의 4개 ZFP 모두가 단일클론 항체 mRNA 양을 GAPDH mRNA양에 비해 3-6배 증가시켰다. 또한, 상기 ZFP는 단일클론 항체의 번역 및 분비에 관여하는 단백질 유전자에도 작용할 수도 있다.
본 발명에 관한 많은 실시 태양을 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시 태양들도 후술하는 청구항의 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> TOOLGEN, Inc. et al. <120> Polypeptide increasing the monoclonal antibody production, nucleic acid encoding same and use thereof <130> FPL/200611-0124 <150> KR 10-2004-0037513 <151> 2004-05-25 <160> 89 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 1, 13 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2, 4-8, 10-12, 14, 16, 20, 23-27 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 1 Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Ser Asn 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 2 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa His 1 5 10 15 Xaa Xaa Thr His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 3 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa His 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 4 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 5 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 6 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 7 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Xaa Xaa Ile His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 8 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 9 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa His 1 5 10 15 Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = phenylalanine or tyrosine <221> VARIANT <222> 2-6, 8-10, 12, 14-15, 18, 21-25 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = a hydrophobic residue <400> 10 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa His 1 5 10 15 Xaa Xaa Gln His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Naturally occurring linker peptide <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Glu or Gln <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Lys or Arg <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Tyr or Phe <400> 11 Thr Gly Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFP LK33 <400> 12 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys His 20 25 30 Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu Thr Arg His Arg 35 40 45 Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys 50 55 60 Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu Thr Lys His Lys Lys Ile His Thr 65 70 75 80 Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln 85 90 95 Ser Ser Ser Leu Ile Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFP LK35 <400> 13 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Glu Cys Lys 20 25 30 Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu Ile Arg His Gln 35 40 45 Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys 50 55 60 Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu Thr Arg His Arg Arg Ile His Thr 65 70 75 80 Gly Glu Lys Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln 85 90 95 Lys Ser Asn Leu Thr Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFP LK50 <400> 14 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Arg Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Val Cys Asp 20 25 30 Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Lys Leu Asn Arg 35 40 45 His Lys Lys Arg His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys 50 55 60 Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 65 70 75 80 His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe 85 90 95 Arg Gln Ser Thr His Leu Thr Arg His Arg Arg Ile His Thr Gly Glu 100 105 110 Lys <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFP LK52 <400> 15 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asp 20 25 30 His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu Asn Val His Lys 35 40 45 Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys 50 55 60 Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu Thr Gln His Arg Arg Ile His Thr 65 70 75 80 Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln 85 90 95 Ser Ser Ser Leu Ile Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 16 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization signal <400> 17 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 18 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD CSNR1 <400> 18 tat aaa tgt aag caa tgt ggg aag gct ttt gga tgt ccc tca aac ctt 48 Tyr Lys Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Gly Cys Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 cga agg cat gga agg act cac 69 Arg Arg His Gly Arg Thr His 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Lys Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Gly Cys Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Gly Arg Thr His 20 <210> 20 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD DSAR2 <400> 20 tac tcc tgt ggc att tgt ggc aaa tcc ttc tct gac tcc agt gcc aaa 48 Tyr Ser Cys Gly Ile Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15 agg aga cac tgc att cta cac 69 Arg Arg His Cys Ile Leu His 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Tyr Ser Cys Gly Ile Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15 Arg Arg His Cys Ile Leu His 20 <210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD DSCR <400> 22 tac aca tgc agt gac tgt ggg aag gct ttc aga gat aaa tca tgt ctc 48 Tyr Thr Cys Ser Asp Cys Gly Lys Ala Phe Arg Asp Lys Ser Cys Leu 1 5 10 15 aac aga cat cgg aga act cat 69 Asn Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Tyr Thr Cys Ser Asp Cys Gly Lys Ala Phe Arg Asp Lys Ser Cys Leu 1 5 10 15 Asn Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 24 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD DGNV <400> 24 ttt caa tgt cgt att tgt atg cgt aat ttt tct gat tct ggt aat ttg 48 Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 cgt gtt cat att cgt act cat 69 Arg Val His Ile Arg Thr His 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg Val His Ile Arg Thr His 20 <210> 26 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(75) <223> FPD DSNR <400> 26 tat gct tgc cct gtc gag tcc tgc gat cgc cgc ttt tct gat tcg tcg 48 Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Asp Ser Ser 1 5 10 15 aac ctt acc cgc cat atc cgc atc cac 75 Asn Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His 20 25 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Asp Ser Ser 1 5 10 15 Asn Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His 20 25 <210> 28 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(72) <223> ZFD ISNR <400> 28 tac agg tgt aag tac tgc gac cgc tcc ttc agc atc tct tcg aac ctc 48 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 cag cgg cac gtc cgg aac atc cac 72 Gln Arg His Val Arg Asn Ile His 20 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gln Arg His Val Arg Asn Ile His 20 <210> 30 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QFNR <400> 30 tat aag tgt cat caa tgt ggg aaa gcc ttt att caa tcc ttt aac ctt 48 Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 cga aga cat gag aga act cac 69 Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 32 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSHV <400> 32 tat gag tgt gat cac tgt gga aaa tcc ttt agc cag agc tct cat ctg 48 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 aat gtg cac aaa aga act cac 69 Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 34 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSNI <400> 34 tac atg tgc agt gag tgt ggg cga ggc ttc agc cag aag tca aac ctc 48 Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 acc ata cac cag agg aca cac 69 Thr Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 36 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSNK <400> 36 tac aag tgt gaa gaa tgt ggc aag gct ttt acc caa tcc tca aac ctt 48 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 act aaa cat aag aaa att cat 69 Thr Lys His Lys Lys Ile His 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Lys His Lys Lys Ile His 20 <210> 38 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSNR1 <400> 38 ttt gag tgt aaa gat tgc ggg aag gct ttc att cag aag tca aac ctc 48 Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc aga cac cag aga act cac 69 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 34 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSNV2 <400> 40 tat gtt tgc tca aaa tgt ggg aaa gcc ttc act cag agt tca aat ctg 48 Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 act gta cat caa aaa atc cac 69 Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 42 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QSSR1 <400> 42 tat aag tgc cct gat tgt ggg aag agt ttt agt cag agt tcc agc ctc 48 Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 att cgc cac cag cgg aca cac 69 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 44 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QTHQ <400> 44 tat gag tgt cac gat tgc gga aag tcc ttt agg cag agc acc cac ctc 48 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 act cag cac cgg aga atc cac 69 Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 46 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD QTHR1 <400> 46 tat gag tgt cac gat tgc gga aag tcc ttt agg cag agc acc cac ctc 48 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 act cgg cac cgg aga atc cac 69 Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 48 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(75) <223> ZFD RDER1 <400> 48 tat gta tgc gat gta gag gga tgt acg tgg aaa ttt gcc cgc tca gat 48 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gag ctc aac aga cac aag aaa agg cac 75 Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 49 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 50 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD RDHT <400> 50 ttc cag tgt aaa act tgt cag cga aag ttc tcc cgg tcc gac cac ctg 48 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 aag acc cac acc agg act cat 69 Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 52 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(75) <223> ZFD RDKR <400> 52 tat gta tgc gat gta gag gga tgt acg tgg aaa ttt gcc cgc tca gat 48 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 aag ctc aac aga cac aag aaa agg cac 75 Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD RDNQ <400> 54 ttt gcc tgc cct gag tgt cct aag cgc ttc atg aga tcc gac aac ctg 48 Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu 1 5 10 15 acc cag cat atc aag acc cac 69 Thr Gln His Ile Lys Thr His 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Ile Lys Thr His 20 <210> 56 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD RSHR <400> 56 tat aag tgc atg gag tgt ggg aag gct ttt aac cgc agg tca cac ctc 48 Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 aca cgg cac cag cgg att cac 69 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 57 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 58 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD RSNR <400> 58 tat att tgc aga aag tgt gga cgg ggc ttt agt cgg aag tcc aac ctt 48 Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc aga cat cag agg aca cac 69 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 60 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD VSNV <400> 60 tat gaa tgc gat cac tgt ggg aaa gcc ttc agc gtc agc tcc aac ctg 48 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 aac gtg cac aga aga atc cac 69 Asn Val His Arg Arg Ile His 20 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Asn Val His Arg Arg Ile His 20 <210> 62 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD VSSR <400> 62 tat aca tgt aaa cag tgt ggg aaa gcc ttc agt gtt tcc agt tcc ctt 48 Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 cga aga cat gaa acc act cac 69 Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 64 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD VSTR <400> 64 tat gag tgt aat tac tgt gga aaa acc ttt agt gtg agc tca acc ctt 48 Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 att aga cat cag aga atc cac 69 Ile Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 66 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> ZFD WSNR <400> 66 tac aga tgt gag gaa tgt ggc aaa gcc ttt agg tgg ccc tca aac ctt 48 Tyr Arg Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Trp Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 act aga cat aag aga ata cac 69 Thr Arg His Lys Arg Ile His 20 <210> 67 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Arg Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Trp Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Arg Ile His 20 <210> 68 <211> 189 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 68 gtgtcagtga catttgaaga tgtggctgtg ctctttactc gggacgagtg gaagaagctg 60 gatctgtctc agagaagcct gtaccgtgag gtgatgctgg agaattacag caacctggcc 120 tccatggcag gattcctgtt taccaaacca aaggtgatct ccctgttgca gcaaggagag 180 gatccctgg 189 <210> 69 <211> 63 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(63) <223> Kid transcription repression domain <400> 69 Val Ser Val Thr Phe Glu Asp Val Ala Val Leu Phe Thr Arg Asp Glu 1 5 10 15 Trp Lys Lys Leu Asp Leu Ser Gln Arg Ser Leu Tyr Arg Glu Val Met 20 25 30 Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Leu Ala Ser Met Ala Gly Phe Leu Phe Thr 35 40 45 Lys Pro Lys Val Ile Ser Leu Leu Gln Gln Gly Glu Asp Pro Trp 50 55 60 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer LNCX1-F <220> <221> mutation <222> (15) <400> 70 taggcgccgg aatttcgatc tgatcaaga 29 <210> 71 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer LNCX1-R <220> <221> mutation <222> (15) <400> 71 tcttgatcag atcgaaattc cggcgccta 29 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer Kid-F <400> 72 gggcggccgc taaattcgtg tcagtgaca 29 <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer Kid-R1 <400> 73 ccgctcgagt taccagggat cctctcc 27 <210> 74 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of ZFP LK33 <220> <221> variation <222> (10) <223> A or G or C or T <400> 74 gyadaavgan gg 12 <210> 75 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of ZFP LK35 <220> <221> variation <222> (10) <223> A or G or C or T <400> 75 maavgagaan gg 12 <210> 76 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of ZFP LK50 <220> <221> variation <222> (4) <223> A or G or C or T <400> 76 vganggrggv ga 12 <210> 77 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of ZFP LK52 <220> <221> variation <222> (10) <223> A or G or C or T <400> 77 gyahgahgan gg 12 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer NLS-F <400> 78 cctccaaaaa agaagagaaa ggta 24 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer mutRDHT-R <220> <221> mutation <222> (13)..(15) <400> 79 caggtggtcg gaggcggaga actttcg 27 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutRDHT-F <220> <221> mutation <222> (13)..(15) <400> 80 cgaaagttct ccgcctccga ccacctg 27 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer QTHQ-R <400> 81 cctaaaggac tttccgcaat cgtgacactc 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer QTHQ-F <400> 82 gagtgtcacg attgcggaaa gtcctttagg 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer mutQSSR1-R <220> <221> mutation <222> (15)..(16) <400> 83 gtgtccgctg gtgggcaatg aggctggaac 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer mutQSSR1-F <220> <221> mutation <222> (15)..(16) <400> 84 gttccagcct cattgcccac cagcggacac 30 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer Kid-R2 <400> 85 ccgctcgagc caggggtcct ctcc 24 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer AKA-F <400> 86 gatgggccct tggtgctggc t 21 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer AKA-R <400> 87 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer GAPDH-F <400> 88 ccgagtatgt tgtggaatct actg 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer GAPDH-R <400> 89 gacaatcttg agggagttgt cata 24

Claims (21)

  1. N-말단에서 C-말단 방향으로 아래의 아미노산 서열을 갖는 Cys2-His2 류 징크 핑거 도메인 4개를 포함하는 DNA 결합 도메인(DNA binding domian) 및 전사 억제 도메인(transcription repression domain)을 포함하는 폴리펩타이드로서,
    Figure 112008005944352-pct00016
    여기에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 나타내며, 하이픈으로 연결된 두 개의 아래 첨자는 개입하는 아미노산의 범위를 나타내고, Xa는 페닐알라닌 또는 타이로신이며, Xb는 소수성 아미노산 잔기이고,
    상기 DNA 결합 도메인에 포함된 징크 핑거 도메인에서,
    (1) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기(DNA contacting residue)가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 K이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, S 및 R이고;
    (2) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, N 및 I이고;
    (3) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, K 및 R이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 R이거나;
    (4) -1, 3 및 6 위치의 DNA 접촉잔기가, 제1 징크 핑거 도메인에서는 각각 R, H 및 T이고; 제2 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 V이고; 제3 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, H 및 Q이며; 제4 징크 핑거 도메인에서는 각각 Q, S 및 R인,
    진핵 세포 (eukaryotic cell)에서 단일클론 항체 (monoclonal antibody)의 생산을 이를 포함하지 않는 세포에 비해 증가시키는 폴리펩타이드.
  2. 삭제
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  4. 제 1 항에 있어서,
    DNA 결합 도메인이 서열번호: 12 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    전사 억제 도메인이 Kid 또는 KOX 억제 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    진핵 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    포유동물 세포가 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, HEK293T 세포, HEK293 세포, Per.C6 세포 및 NS-O 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  11. 제 1 항의 폴리펩타이드를 코드하는 서열을 포함하는 핵산.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 11 항에 있어서,
    전사 억제 도메인이 Kid 또는 KOX 억제 도메인인 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 단일클론 항체를 코드하는 유전자 및 제 1 항의 폴리펩타이드를 코드하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 진핵 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
  17. 제 16 항에 있어서,
    포유동물 세포가 CHO 세포, HEK293T 세포, HEK293 세포, Per.C6 세포 및 NS-O 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 15 항에 있어서,
    전사 억제 도메인이 Kid 또는 KOX 억제 도메인인 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
  21. 제 1 항의 폴리펩타이드 또는 제 11 항의 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 단일클론 항체의 생산을 증가시키는 방법.
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