KR20150109427A

KR20150109427A - WT1 mRNA의 발현량 정량 방법

Info

Publication number: KR20150109427A
Application number: KR1020157022395A
Authority: KR
Inventors: 요코 사이죠; 류타 이토; 다이스케 고가
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-10-01
Also published as: CN104937112A; WO2014115779A1; US20160333415A1; EP2949760B1; EP2949760A4; EP2949760A1; JP6636247B2; CA2898965A1; AU2014208593A2; US10280467B2; EP2949760A9; CN104937112B; AU2014208593A1; JPWO2014115779A1; KR20180043401A; ES2731780T3

Abstract

백혈병이나 고형암 등의 암의 진단이나 골수 이식 시기의 결정에 이용할 수 있는 인간 WT1의 mRNA의 발현량을 간편 또한 단시간에, 감도 좋게 정량하기 위한 방법을 제공한다. 당해 방법은 인간 WT1 mRNA의 발현량을 1스텝 RT-PCR법을 사용하여 정량하는 방법이며, 인간 WT1 mRNA 및 하우스키핑 유전자(mRNA)의 역전사 반응 및 신장 반응을, 동시 또한 동일 용기 내에서 연속해서 진행시키는 것을 특징으로 하는, 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법이다.

Description

WT1 mRNA의 발현량 정량 방법 {QUANTIFICATION METHOD FOR EXPRESSION LEVEL OF WT1 mRNA}

본 발명은 백혈병이나 고형암 등의 암의 진단이나 골수 이식 시기의 결정에 이용할 수 있는 인간 WT1의 mRNA의 발현량을 정량하는 새로운 방법에 관한 것이다.

윌름스 종양-1(Wilms tumor gene-1. 이하, 「WT1」이라고 칭함) 유전자는 1990년에 Call 등에 의해 소아 윌름스 종양의 원인 유전자로서 동정된 유전자이다(비특허문헌 1). 그 후, WT1 mRNA는 소아 윌름스 종양뿐만 아니라, 고형암 세포주인 위암 세포주, 대장암 세포주, 폐암 세포주 및 유방암 세포주 등의 고형암 세포에서도 높은 비율로 발현하고 있는 것이 나타나고(비특허문헌 2), 현재는, WT1 유전자는 소아 윌름스 종양뿐만 아니라, 많은 암에 관련되는 암 관련 유전자라고 여겨지고 있다.

Call 등은 백혈병 세포주인 K562 세포 및 CCRF-CEM 세포에서 WT1 mRNA의 발현을 보고하고 있고(비특허문헌 1 참조), Miwa 등은 노던ㆍ블롯 해석에 의해 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia. 이하, 「AML」이라고 함.)의 22예 중 15예에 WT1 mRNA가 발현하는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 3). 또한 Inoue 등에 의해, WT1 mRNA는 AML의 초진 시에 100％(45/45)의 증례로 발현이 인정되었다고 보고되고 있다(비특허문헌 4). 또한, 진단 시의 WT1 mRNA 발현량이 예후와 관계되어 있는 것(비특허문헌 5), WT1 mRNA 발현량은 치료에 의해 한번 음성화해도 재발 시에 재상승하는 것(비특허문헌 6), 또한 재발 시의 WT1 mRNA 발현량은 진단 시의 발현량보다도 증가하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7).

이와 같이, WT1 유전자가, 단일의 유전자로서 AML 환자에게 고빈도로 출현하는 것 및 치료에 의해 음성화하여 재발 시에 재상승하는 등의 사실로부터, WT1 유전자는 AML의 치료에 있어서 새로운 미소 잔존 병변(minimal residual disease. 이하, 「MRD」라고도 칭함.)의 모니터링 마커로서 유용하다고 하여, 종래부터 체외 진단용 의약품으로서 판매되고 있다.

인간 WT1 mRNA의 측정 방법으로서는, 종래, β-엑틴을 기준하는 경합 정량법이 알려져 있다(특허문헌 1). 그러나, 그 측정 방법에서는, WT1 mRNA와 β-엑틴의 mRNA를 개별로 측정할 뿐만 아니라, 역전사 반응시킨 후에 신장 반응을 행하는, 소위 2스텝 RT-PCR법을 행할 필요가 있어, 시간을 매우 필요로 한다.

또한 별도의 인간 WT1 mRNA의 측정 방법으로서, 특허문헌 2에는 WT1 mRNA의 1스텝 RT-PCR법이 개시되어 있다. 그러나, 이 측정 방법에서는 WT1 유전자의 발현량을 보정하기 위한 하우스키핑 유전자의 발현량을 별도 측정할 필요가 있어, 번잡하다.

일본 특허 출원 공개 평11-89599호 공보 일본 특허 출원 공개 평11-89596호 공보

Call, K. M. et al., Cell 1990; 60: 509-520 Jpn. J. Cancer Res. 1999; 90: 194-204 Miwa, H., et al., Leukemia 1992; 6: 405-409 Inoue, K., et al., Blood, 1994, 84(9), 3071-3079 Blood 1997; 90: 1217-1225 Blood 1996; 88: 2267-2278 Blood 1996; 88: 4396-4398

전술한 바와 같이, WT1 유전자의 발현량을 정량하는 방법으로서, 공지의 방법은 많은 시간을 필요로 하고, 또한 번잡하다는 문제가 있어, 간편하고 또한 단시간에 인간 WT1 유전자의 발현량을 정량할 수 있는 방법이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 간편하고 또한 단시간에 실시할 수 있는 새로운 WT1 mRNA의 정량법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 인간 WT1 mRNA와 하우스키핑 유전자의 양자의 발현량을 동시에 정량함으로써, 간편하고 또한 단시간에서의 실시를 가능하게 한 새로운 WT1 mRNA의 정량법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본건 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 하고 있었던바, 목적 유전자인 인간 WT1 유전자(mRNA)와 보정용 유전자인 하우스키핑 유전자(mRNA)의 역전사 반응 및 신장 반응을, 동시 또한 동일 용기 내에서 연속해서 진행시킴으로써(1스텝), 단시간이고 또한 간편하게, 목적으로 하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량할 수 있는 것을 발견하였다. 게다가 당해 1스텝 RT-PCR법을 사용함으로써, 목적 유전자와 보정용 유전자의 증폭을 따로따로 행하는 2스텝 RT-PCR법보다도, 간편하고, 또한 대략 동일 정도의 단시간에, 목적 유전자를 보다 감도 높게 검출하는 것이 가능해지는 것을 확인하였다.

본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성한 것으로, 하기의 실시 형태를 포함하는 것이다.

(I) 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법

(I-1) 인간 WT1 mRNA의 발현량을 1스텝 RT-PCR법을 사용하여 정량하는 방법이며, 인간 WT1 mRNA 및 하우스키핑 유전자(mRNA)의 역전사 반응 및 신장 반응을, 동시 또한 동일 용기 내에서 연속해서 진행시키는 것을 특징으로 하는 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법.

(I-2) 하우스키핑 유전자가 GAPDH mRNA인 (I-1)에 기재하는 방법.

(I-3) 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에,

(a) 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는

(b) 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트

를 사용하는 (I-1) 또는 (I-2)에 기재하는 방법.

(I-4) 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에,

(a') 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브, 또는

(b') 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브를 사용하는 (I-1) 또는 (I-2)에 기재하는 방법.

(I-5) 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에, 추가로

(c) 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트

를 사용하는 (I-3) 또는 (I-4)에 기재하는 방법.

(I-6) 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에, 추가로

(c') 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브

를 사용하는 (I-3) 또는 (I-4)에 기재하는 방법.

(II) 인간 WT1 mRNA의 발현량 정량용의 리얼타임 PCR용 키트

(II-1) (a) 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는

를 포함하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.

(II-2) (a') 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브, 또는

(b') 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브

(II-3) 추가로 (c) 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는,

(II-1) 또는 (II-2)에 기재하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.

(II-4) 추가로 (c') 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브

를 사용하는, (II-1) 또는 (II-2)에 기재하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.

본 발명의 방법에 의하면, 종래의 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법과 비교하여, 간편한 조작과 노력으로 게다가 단시간에 측정할 수 있는 WT1 mRNA 발현량의 정량 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 종래의 2스텝 RT-PCR법을 사용한 측정 방법보다도 높은 감도로 검출하는 것도 가능해진다. 즉, 본 발명의 방법 또는 리얼타임 PCR용 키트를 사용함으로써 간편 또한 단시간에, 감도 좋게 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하는 것이 가능해진다.

이렇게 하여 정량되는 인간 WT1 mRNA의 발현량은 백혈병이나 고형암의 발병 및 재발의 진단 및 예후 판단 및 골수 이식의 시기 결정에 있어서 유용한 지표가 된다.

도 1은 각종 농도(도면 중, 1: 2.5x10⁵ copies/test, 2: 2.5x10⁴ copies/test, 3: 2.5x10³ copies/test, 4: 2.5x10² copies/test, 5: 2.5x10¹ copies/test)의 WT1 RNA 표준품을 대상으로 하여, WT1 mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 WT1 mRNA 증폭 곡선을 나타낸다(실시예 1).
도 2는 각종 농도(도면 중, 1: 1.0x10⁸ copies/test, 2: 1.0x10⁷ copies/test, 3: 1.0x10⁶ copies/test, 4: 1.0x10⁵ copies/test, 5: 1.0x10⁴ copies/test)의 GAPDH RNA 표준품을 대상으로 하여, GAPDH mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 GAPDH mRNA 증폭 곡선을 나타낸다(실시예 1).
도 3은 각종 농도(도면 중, 1: 2.5x10⁵ copies/test, 2: 2.5x10⁴ copies/test, 3: 2.5x10³ copies/test, 4: 2.5x10² copies/test, 5: 2.5x10¹ copies/test)의 WT1 RNA 표준품을 대상으로 하여, WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 WT1 mRNA 증폭 곡선을 나타낸다(실시예 1).
도 4는 각종 농도(도면 중, 1: 1.0x10⁸ copies/test, 2: 1.0x10⁷ copies/test, 3: 1.0x10⁶ copies/test, 4: 1.0x10⁵ copies/test, 5: 1.0x10⁴ copies/test)의 GAPDH RNA 표준품을 대상으로 하여, WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 GAPDH mRNA 증폭 곡선을 나타낸다(실시예 1).
도 5는 WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 동시에 증폭하는 1스텝 RT-PCR을, 프라이머 및 프로브로 하여, (A) 표 8에 나타내는 세트(서열 세트 B) 및 (B) 표 9에 나타내는 세트(비교 세트)를 각각 사용하여 실시하고, 얻어진 증폭산물을, 아가로오스 겔전기영동한 결과를 나타낸다.

(I) 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법

본 발명의 방법은 인간 WT1 mRNA의 발현량을 1스텝 RT-PCR법을 사용하여 정량하는 방법이다.

본 발명이 측정의 대상으로 하는 인간 WT1 유전자는, 전술한 바와 같이 소아 윌름스 종양의 원인 유전자로서 동정된 3037bp를 포함하는 유전자이고, 「Homo sapiens Wilms tumor 1(WT1), transcript variant D, mRNA」로서, NCBI에 등록되어 있다(NM_024426.4). 그의 염기 서열을 서열표의 서열 번호 1에 나타낸다.

본 발명의 방법에서 측정 대상으로 하는 피검 시료는, 상기 인간 WT1 mRNA를 포함하는 것이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 인간 유래의 세포, 조직, 혈액, 객담, 분변, 소변과 같은 생체 시료 등, WT1 mRNA를 함유할 가능성이 있는 시료로부터 공지의 방법으로 처리함으로써 얻어지는 전체 RNA, 혹은 mRNA를 부화한 시료 등을 사용할 수 있다. RNA 시료는 수용액, 혹은 적절한 고상으로 흡착 또는 고정화한 상태에서 사용할 수 있다. 전체 RNA량으로서는 반응액 100μl당 0.01ng∼1㎍이 적합하다.

하우스키핑 유전자란, 세포의 분화에 관계없이, 어떤 세포에든 항상 발현하여 존재하고, 특수한 기능은 발휘하지 않지만 그들의 생존에 필수인 역할을 갖는 유전자이고, 예를 들어 RNA 합성 효소, 에너지 생성계 효소, 리보솜의 단백질, 세포 골격 단백질 등의 유전자를 예시할 수 있다. 구체적으로는, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), β-엑틴, β2-마이크로글로불린, HPRT 1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) 등의 유전자를 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 하우스키핑 유전자는 측정 목적인 인간 WT1 유전자와 RT-PCR에 의한 증폭이 경합하지 않는 것, 예를 들어 염기 서열의 상동성이 낮은 것인 것이 바람직하다. 바람직하게는 GAPDH이다.

GAPDH는 「Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), mRNA」로서 NCBI에 등록되어 있는 유전자이다(NM_002046.3). 그의 염기 서열을 서열표의 서열 번호 2에 나타낸다.

본 발명에 있어서 1스텝 RT-PCR법(역전사 반응 및 신장 반응)에 사용되는 반응 완충액으로서는, 역전사 활성을 갖는 효소가 활성을 나타내는 데 적합한 수용성 완충액이면 되고, 예를 들어 pH7∼10, 바람직하게는 pH8∼9의 완충액, 예를 들어 트리스 완충액을 들 수 있다. 또한, 이 완충액 중에는 역전사 활성을 갖는 효소 또는 DNA 폴리메라제의 활성에 필요한 다양한 이온을 포함한다. 그 중에서도 Na 이온이나 K 이온은 염의 형태로 5∼50mM의 농도로 첨가된다. Mg 이온은 염의 형태로 1∼10mM으로 첨가된다. 그 밖에, 필요에 따라 계면 활성제, 소 혈청 알부민(BSA), 젤라틴 등, 역전사 활성을 갖는 효소 또는 DNA 폴리메라제의 활성을 촉진 또는 안정화하는 약제를 배합할 수도 있다. 또한, 시료 중의 RNA 및 RNA 경합물의 분해를 억제하기 위해 리보뉴클레아제 저해제가 첨가되어 있어도 된다.

역전사 활성을 갖는 효소로서는, 조류 골아구증 바이러스 유래 역전사 효소(AMV), 라우스 관련 바이러스 유래 역전사 효소(RAV2), 모로니 마우스 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소(MMLV), 서머스 서모필러스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리메라제(Tth), 바실러스 카르도테낙스(Bacillus cardotenax) 유래 DNA 폴리메라제(Bca) 및 그들의 유도체를 들 수 있지만, 그 중에서 Tth가 가장 본 발명에 적합하다. Tth로서, 구체적으로는 Thermus species Z05에서 유래되는 Thermostable enzyme의 DNA 폴리메라제를 예시할 수 있다. 또한, 이들 효소는 그 본래의 기원으로부터 정제하여 취득된 것, 혹은 유전자 공학적으로 생산된 재조합 단백질 중 어떤 것이어도 된다.

반응액에는 cDNA 합성 및 PCR에서 기질이 되는 4종의 디옥시뉴클레오티드삼인산(dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 본 명세서에서는 이 4종을 총칭하여 「dNTP」라고도 함)이 첨가된다. 또한, dNTP는, 그의 모두 또는 일부가 프라이머로 합성되는 DNA쇄의 신장을 가능하게 하는 범위에서 수식 및/또는 표지된 dNTP로 치환할 수도 있다.

본 발명에 있어서 표적 RNA로부터의 cDNA 합성(역전사 반응 및 신장 반응)에 사용되는 프라이머로서는, 적어도 표적 RNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 채용되는 반응 조건에서 표적 RNA에 어닐하는 것일 필요가 있다. 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 6∼100뉴클레오티드, 바람직하게는 10∼30뉴클레오티드의 길이를 예시할 수 있다. 또한, 수식 및/또는 표지된 프라이머도 사용할 수 있다. 상기 프라이머는, 예를 들어 공지 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, PCR에서 사용되는 프라이머는 적어도 표적 RNA 유래의 cDNA를 주형으로 한 DNA의 증폭이 가능할 필요가 있다. 이를 위해서는, 적어도 주형 cDNA의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 채용되는 반응 조건에서 당해 cDNA에 어닐하는 것일 필요가 있다. 바람직하게는, 상기의 표적 RNA로부터 cDNA의 합성(역전사 반응 및 신장 반응)에 프라이머로서 기능함과 함께, cDNA를 주형으로 한 DNA에도 프라이머로서 기능하는 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 목적 유전자인 인간 WT1 mRNA를 cDNA로 역전사하여 신장, 증폭하기 위해 적절하게 사용되는 프라이머 세트로서는, 하기 표 1에 기재하는 (A1) Forward 프라이머 및 (A2) Reverse 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 A 및 표 2에 기재하는 (B1) Forward 프라이머 및 (B2) Reverse 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 B를 들 수 있다. 또한, 표 1 및 표 2에는 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 WT1 유전자 증폭물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브((A3) Probe, (B3) Probe)도 더불어 나타낸다. 또한, 이러한 프로브는 증폭물의 검출을 용이하게 하기 위해 표지되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서 하우스키핑 유전자로서 적절하게 사용되는 인간 GAPDH mRNA를 cDNA로 역전사하여 신장, 증폭하기 위해 적절하게 사용되는 프라이머 세트로서는, 하기 표 1에 기재하는 (a1) Forward 프라이머 및 (a2) Reverse 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 A 및 표 2에 기재하는 (b1) Forward 프라이머 및 (b2) Reverse 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 B를 들 수 있다. 또한, 표 1 및 표 2에는 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 GAPDH 유전자 증폭물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브((a3) Probe, (b3) Probe)도 더불어 나타낸다. 또한, 이러한 프로브는 증폭물의 검출을 용이하게 하기 위해 표지되어 있는 것이 바람직하다.

프로브의 표지법에는 RI법과 비RI법이 있지만, 비RI법을 사용하는 것이 바람직하다. 비RI법에는 형광 표지법, 비오틴 표지법, 화학 발광법 등을 들 수 있지만, 형광 표지법이 적절하게 사용된다. 형광 물질로서는, 핵산의 염기 부분과 결합할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 시아닌 색소(Cy DyeTM 시리즈의 Cy3이나 Cy5 등), 로다민6G 시약, N-아세톡시-N2-아세틸아미노플루오렌 및 그 요오드 유도체 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 RNA 표준품은 공지의 방법으로 제작할 수 있다. 예를 들어, 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 제87권, 제2725∼2729페이지(1990)」, 「Clinical Chemistry(Clin. Chem.), 제41권, 제819∼825페이지(1995)」, 「Blood, 제82권, 제1929∼1936 페이지(1993)」 등의 기재를 참조하여 제작할 수 있다.

구체적으로는 이하와 같다. 증폭 대상의 2본쇄 DNA 서열에, RNA 합성 효소, 예를 들어 T7 RNA 폴리메라제 등의 반응 기점이 되는 프로모터 서열을 부가하여, RNA 합성의 주형이 되는 DNA 서열을 작성한다. 반응 용기 내에, RNA 폴리메라제와, RNA 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄 DNA, 뉴클레오티드삼인산을 가하고, 37℃에서 30분∼2시간 반응함으로써, RNA 프로모터 하류의 주형 DNA에 상보적인 1본쇄 RNA를 합성한다.

본 발명에서 사용하는 1스텝 RT-PCR의 반응 조작 및 반응 조건으로서는, 제한되지 않지만, 하기를 예시할 수 있다.

반응 용기 내에, 예를 들어 cNTP, Mg염, 리보뉴클레아제 저해제, 역전사 활성을 갖는 효소, 프라이머 등을 포함하는 반응액을 가하고, 반응 개시까지는 4℃ 이하에서 보냉해 둔다. 이것에 측정하려고 하는 인간 WT1 mRNA를 포함할 수 있는 피검 시료 및 하우스키핑 유전자(예를 들어, GAPDH mRNA)를 첨가하여 50∼70℃, 바람직하게는 55∼65℃에서 2∼30분, 바람직하게는 2∼10분 정도, 복수회 반응시키는 cDNA 합성을 행한다(역전사 반응). 계속해서 90∼99℃에서 10초∼2분간 정도 가열하여, RNA-cDNA 복합체를 변성시킨다(열변성). 또한, 90∼99℃에서의 열변성, 45∼65℃의 어닐링 반응 및 60∼80℃의 DNA 신장 반응을 포함하는 온도 사이클 반응을 2∼50사이클 행하여 표적 RNA 유래의 DNA 단편을 증폭한다. 또한, 감도 및/또는 특이성을 향상시키기 위해 중첩된(nested) PCR을 행하는 경우에는, 1단계째, 2단계째의 PCR에 사용하는 프라이머를 모두 처음부터 반응 용기 내에 첨가해 두고, 2단계의 PCR을 연속해서 행할 수도 있다. 이 경우 1단계째의 PCR용 프라이머량은 2단계째의 PCR용 프라이머량보다 적게 하는 것이 필요하고, 바람직하게는 100배 이하의 양이 적합하다.

이상 설명하는 본 발명의 방법에 의하면, 인간 WT1 mRNA의 발현량을, 동일 용기 내에 있어서의 1스텝 반응에 의해 간편하게 측정할 수 있음과 함께, 실시예 2에 나타내는 바와 같이, 목적 유전자의 RT-PCR 반응과 하우스키핑 유전자의 RT-PCR 반응을 별개로 행하는 2스텝 RT-PCR보다도 감도 높게 검출할 수 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 방법에 의하면, 인간 WT1 mRNA의 발현량이 저농도인 시료라도 정밀도 높게 검출할 수 있다.

당해 방법은 하기에 설명하는 리얼타임 PCR 키트를 사용함으로써 보다 간편하게 실시할 수 있다.

(II) 인간 WT1 mRNA의 발현량 정량용의 리얼타임 PCR용 키트

본 발명의 RT-PCR용 시약 키트는 인간 WT1 mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트와, 하우스키핑 유전자, 바람직하게는 GAPDH mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트의 양쪽을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 당해 키트에는 RT-PCR법으로 증폭된 인간 WT1 mRNA의 증폭산물 및 하우스키핑 유전자의 증폭산물을 검출하기 위해 사용되는 프로브를 포함할 수 있다.

키트의 일례로서, 인간 WT1 mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트로서 표 1에 나타내는 「(A1) Forward 프라이머(서열 번호 3)」 및 「(A2) Reverse 프라이머(서열 번호 4)」를 포함하는 프라이머 세트 A 및 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 WT1 유전자 증폭물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브로서 표 1에 나타내는 「(A3) Probe(서열 번호 5)」를 포함하고, 또한 하우스키핑 유전자로서 적절하게 사용되는 인간 GAPDH mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트로서 표 1에 나타내는 「(a1) Forward 프라이머(서열 번호 6)」 및 「(a2) Reverse 프라이머(서열 번호 7)」를 포함하는 프라이머 세트 A 및 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 GAPDH 유전자 증폭산물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브로서 표 1에 나타내는 「(a3) Probe(서열 번호 8)」를 포함하는 것을 들 수 있다.

또한, 프로브는 증폭물의 검출을 용이하게 하기 위해 표지되어 있는 것이 바람직하다.

키트의 다른 일례로서, 인간 WT1 mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트로서 표 2에 나타내는 「(B1) Forward 프라이머(서열 번호 9)」 및 「(B2) Reverse 프라이머(서열 번호 10)」를 포함하는 프라이머 세트 B 및 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 WT1 유전자 증폭물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브로서 표 2에 나타내는 「(B3) Probe(서열 번호 11)」를 포함하고, 또한 하우스키핑 유전자로서 적절하게 사용되는 인간 GAPDH mRNA를 RT-PCR법에 제공하기 위한 프라이머 세트로서 표 2에 나타내는 「(b1) Forward 프라이머(서열 번호 6)」 및 「(b2) Reverse 프라이머(서열 번호 12)」를 포함하는 프라이머 세트 B 및 이들 프라이머 세트에서 증폭된 인간 GAPDH 유전자 증폭산물을 검출하기 위해 사용되는 서열 특이적 결합 프로브로서 표 2에 나타내는 「(b3) Probe(서열 번호 8)」를 포함하는 것을 들 수 있다.

본 발명의 RT-PCR용 키트는 상기 성분 외에, 역전사 반응과 PCR의 2개의 반응에 필요한 각종 성분(dNTP, Mg염, pH 조정을 위한 완충 성분 등), 역전사 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있다. 또한 효소를 안정화하는 성분이나 리보뉴클레아제 저해제 등이 첨가된 것이어도 된다.

해당 반응액은 그 필요량을 적당한 반응 용기에 취하여, 측정하려고 하는 시료를 첨가하는 것만으로 반응을 개시할 수 있으므로, 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량을 간편하게 행할 수 있다. 특히, 다수의 피검 시료에 대해 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하는 경우에 유용하다. 또한, 미리 해당 반응액의 1회분의 필요량이 분주된 반응 용기를 준비해 둠으로써, 조작 효율을 더욱 개선할 수 있다. 본 발명의 RT-PCR용 키트는 상기의 방법에 따라, 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량을 간편하고, 신속하고, 또한 크로스 콘터미네이션의 문제없이 행할 수 있는 키트이다. 상기 키트로서는, 예를 들어 상기 방법에 사용하는 각종 시약을 함유하는 키트, 상기의 본 발명에 사용되는 반응액을 함유하는 키트, 해당 반응액의 1회분이 분주된 반응 용기를 함유하는 키트 등을 들 수 있다. 상기 키트는 특히 다양한 검사, 그 중에서 임상 진단용 키트로서 유용하고, 백혈병의 검사, 고형암의 미소 전이의 검사, 잔존 미소 병변의 검사, 감염증의 검사 등에 널리 이용할 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 1스텝 또한 멀티플렉스 RT- PCR의 측정

(1) 프라이머와 프로브의 설계

측정 대상의 목적 유전자로서 인간 WT1 mRNA, 측정 대상의 발현량을 보정하는 내재성 컨트롤 유전자(보정용 유전자)로서 GAPDH mRNA를 선택하고, 각각의 유전자에 대해 특이적 증폭과 검출을 가능하게 하는 프라이머 세트 및 프로브를 설계하여, 합성하였다.

형광 표지 프로브는 목적 유전자(인간 WT1 mRNA)와 보정용 유전자(GAPDH mRNA)를 동시에 검출하기 위해, 목적 유전자를 검출하기 위한 프로브의 5' 말단을 FAM(6-카르복시플루오레세인)으로 표지하고, 보정용 유전자를 검출하기 위한 프로브 5' 말단을 HEX(6-헥사클로로플루오레세인)로 표지하였다. 또한 각각의 프로브의 3' 말단을 소광 색소로 하여 ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH사)로 표지하였다.

본 실시예에서 사용한 프라이머 및 프로브의 서열을 표 3에 나타낸다.

(2) 표준품(WT1 mRNA , GAPDH mRNA )의 제조

표준품은 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 발현하고 있는 백혈병 세포주 K562로부터 RNA를 추출하고, 이 RNA를 주형으로 하여, WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA의 염기 서열에 각각 상보적인 프라이머를 사용하여, RT-PCR을 행하고, WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA의 일부의 염기 서열을 얻었다. 얻어진 WT1 mRNA 서열 및 GAPDH mRNA 서열을 pT7blue 플라스미드 벡터에 클로닝하여, 대장균 DH5α주를 형질 전환하였다. 계속해서 이 형질 전환 대장균을 배양하여, 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA 중, WT1 mRNA 서열 및 GAPDH mRNA 서열이 삽입되어 있는 부분보다 뒤에 있는 서열을, 제한 효소 EcoRI를 사용하여 절단하고, 직쇄상의 DNA로 하였다. 플라스미드 DNA에 포함되는 T7 프로모터 서열을 인식하고, DNA를 주형으로 하여 RNA를 합성하는 효소인 T7 RNA 폴리메라제를 사용하여, WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA의 RNA 서열을 합성하였다. 합성한 RNA를, 반응 용기로의 비특이적인 흡착을 방지하기 위해 50ng/μL의 대장균 트랜스퍼 RNA를 포함하는 TE 버퍼로 희석하고, 각각의 유전자(WT1 및 GAPDH)의 RNA 표준품을 제조하였다.

이렇게 하여 제조한 WT1 RNA 표준품의 농도를 2.5×10¹, 2.5×10², 2.5×10³, 2.5×10⁴, 2.5×10⁵ copies/test로, 또한 GAPDH RNA 표준품의 농도를 1.0×10⁴, 1.0×10⁵, 1.0×10⁶, 1.0×10⁷, 1.0×10⁸ copies/test로 조정하였다.

(3) RT- PCR 반응

RT-PCR 반응은 역전사 반응과 PCR 반응을 하나의 튜브 내에서 연속해서 행하는 1스텝 RT-PCR법을 행하였다.

(3-1) 역전사 효소:

Z05 DNA polymerase(Thermus species Z05 유래의 Thermostable enzyme: Roche Diagnostics사)를 사용하였다.

(3-2) 반응 조건:

(a) 역전사 반응과 PCR 반응

55℃에서 5분간, 60℃에서 5분간, 65℃에서 5분간의 총 15분간 걸려서 역전사 반응을 행한 후, 92℃에서 15초간의 열변성, 60℃에서 40초간의 어닐링 및 DNA 신장 반응을 포함하는 PCR 반응을 45사이크로 반복하였다.

(b) 시약 농도

반응액의 용량을 20μL로 하고, 그 중의 Primer 농도는 Forward primer 및 Reverse primer 각각 최종 농도를 0.2μM로 하였다. Probe 농도는 최종 농도를 0.1μM로 하였다.

(3-3) 반응ㆍ측정 장치:

RT-PCR법은 Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system(라이프 테크놀로지스사)을 사용하여 행하였다.

(4) 결과

(4-1) 형광 증폭 곡선의 확인

(a) WT1 RNA 표준품을 WT1 mRNA를 단독으로 증폭을 행한 경우, (b) GAPDH RNA 표준품을 GAPDH mRNA를 단독으로 증폭을 행한 경우 및 (c) WT1 RNA 표준품 및 GAPDH RNA 표준품의 각각에 대해 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭을 행한 경우의, 형광 증폭 곡선과 증폭 사이클수를 확인하였다.

도 1에 (a) 각종 농도의 WT1 RNA 표준품을 WT1 mRNA를 단독으로 증폭을 행한 경우의 WT1 mRNA 증폭 곡선, 도 2에 (b) 각종 농도의 GAPDH RNA 표준품을 GAPDH mRNA 단독으로 증폭을 행한 경우의 GAPDH mRNA 증폭 곡선, 도 3에 (c) 각종 농도의 WT1 RNA 표준품을 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 WT1 mRNA 증폭 곡선 및 도 4에 (d) 각종 농도의 GAPDH RNA 표준품을 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 GAPDH mRNA 증폭 곡선을 각각 나타냈다. 표 4에, 각종 농도의 WT1 RNA 표준품에 대해 WT1 mRNA를 단독으로 증폭한 경우 및 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 WT1 mRNA의 증폭 사이클수를 나타냈다. 표 5에 각종 농도의 GAPDH RNA 표준품에 대해 GAPDH mRNA를 단독으로 증폭한 경우 및 WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 GAPDH mRNA의 증폭 사이클수를 나타냈다.

WT1 mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 WT1 mRNA 증폭 곡선을 도 1에 도시한다. 여기에 도시한 바와 같이, WT1 mRNA를 단독으로 증폭한 경우, WT1 mRNA를 2.5×10⁵∼2.5×10¹ copies/test까지 검출하는 것이 가능했다. WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우도, 도 3에 도시한 바와 같이, WT1 mRNA를 2.5×10⁵∼2.5×10¹ copies/test까지 검출하는 것이 가능했다.

또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, WT1 mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 증폭 사이클수(증폭 사이클수 18.63∼32.09)와, WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 각각 동시에 증폭한 경우의 증폭 사이클수(증폭 사이클수 18.67∼31.94)의 차는 -0.15∼0.06으로 작고, 단독 증폭과 동시 증폭에서 증폭 사이클수에 유의한 차는 없었다. 이것으로부터, 목적 유전자인 WT1 mRNA와 보정용 유전자를 동시에 증폭해도, 목적 유전자(WT1 mRNA)를 단독으로 증폭하는 경우와 마찬가지로, 동일 정도의 증폭 사이클수로, WT1 mRNA를 검출하는 것이 가능하다고 생각되었다.

GAPDH mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 GAPDH mRNA 증폭 곡선을 도 2에 도시한다. 여기에 도시한 바와 같이, GAPDH mRNA를 단독으로 증폭한 경우, GAPDH mRNA를 1.0×10⁸∼1.0×10⁴ copies/test까지 검출하는 것이 가능했다.

표 5에 나타내는 바와 같이, GAPDH mRNA를 단독으로 증폭한 경우의 증폭 사이클수(10.18∼23.68)와, WT1 mRNA 및 GAPDH mRNA를 동시에 증폭한 경우의 증폭 사이클수(10.30∼23.85)의 차는 0.10∼0.20으로, 단독 증폭과 동시 증폭에서 증폭 사이클수의 차는 크지 않았다. 이것으로부터, 보정용 유전자인 GAPDH mRNA와 목적 유전자인 WT1 mRNA를 동시에 증폭하는 경우라도, 또한 보정용 유전자(GAPDH mRNA)를 단독으로 증폭하는 경우와 마찬가지로, 동일 정도의 증폭 사이클수로, GAPDH mRNA를 검출하는 것이 가능하다고 생각되었다.

[ 실시예 2] K562 추출 RNA를 사용한 희석 시험

본 실시예에서는 WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 동시에 증폭하는, 1스텝이고 또한 멀티플렉스한 RT-PCR법과, 역전사 반응과 PCR을 별도의 용기에서 각각 행하고, WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 별개로 증폭하는 2스텝 RT-PCR법으로, 측정 감도를 비교했다. 또한, 2스텝 RT-PCR법은 WT1 mRNA 측정 키트 「오츠카」(오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤)를 사용하여 행하였다.

(1) 프라이머와 프로브의 서열

1스텝 RT-PCR법에 의한 WT1 mRNA 측정 및 GAPDH mRNA 측정에 사용한 프라이머 및 프로브의 서열을 표 6에 나타낸다. 또한, 2스텝 RT-PCR법은 WT1 mRNA 측정 키트 「오츠카」를 사용하였으므로, 프라이머 및 프로브는 불분명하다.

(2) 표준품의 제조

표준품(WT1 mRNA, GAPDH mRNA)으로서, 1스텝 RT-PCR법에서는, 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 제조한 RNA 표준품을 사용하였다. WT1 RNA 표준품의 농도를 2.5×10¹, 2.5×10³, 2.5×10⁵, 2.5×10⁷ copies/test, GAPDH RNA 표준품의 농도를 1.0×10³, 1.0×10⁵, 1.0×10⁷, 1.0×10⁹ copies/test로 하였다. 2스텝 RT-PCR법에서는 WT1 mRNA 측정 키트 「오츠카」에 구비된 표준품을 사용하였다.

(3) 피검 시료

피검 시료로서, WT1 양성 백혈병 세포주 K562로부터 추출한 RNA를 사용하였다. 구체적으로는, K562로부터 추출한 Total RNA를, 튜브로의 비특이적인 핵산의 흡착을 방지하기 위해 캐리어 RNA로서 대장균 트랜스퍼 RNA를 최종 농도 50ng/μL가 되도록 미리 첨가한 TE buffer를 사용하여, 최종 농도가 2, 5, 10pg/μL가 되도록 희석하고, 이를 피검 시료로 하였다.

(4) RT- PCR 반응

1스텝 RT-PCR 반응은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 2스텝 RT-PCR은 WT1 mRNA 측정 키트 「오츠카」(오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤)를 사용하여 그 첨부 문서에 따라 행하였다. 측정은 각 피검 시료에 대해 2중 측정으로 행하였다. 측정 결과는 WT1 mRNA 측정 키트 「오츠카」의 첨부 문서에 따라, Total RNA 1㎍당의 WT1 mRNA수인 copy/㎍RNA로서 산출하였다.

(5) 결과

(5-1) K562 추출 RNA에 의한 희석 측정 결과

표 7에 K562 추출 RNA를 피검 시료로 하여, 1스텝 RT-PCR법 및 2스텝 RT-PCR법을 사용하여 실시한 희석 시험의 결과를 나타낸다.

표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 1스텝 RT-PCR법에서는, K562 희석 RNA를 RNA 농도가 2.5pg/μL가 될 때까지 희석해도 측정 가능했던 것에 비해, 2스텝 RT-PCR법에서는, K562 희석 RNA를 RNA 농도가 2.5pg/μL가 될 때까지 희석하면 PCR에 의한 증폭 시그널이 검출되지 않았고, 5pg/μL에서도, 2중 측정의 데이터가 17.2 및 1.9 copy/㎍RNA로 괴리되어, 유효값으로서 측정 가능한 범위는 10pg/μL까지라고 생각되었다. 이들 결과로부터, 1스텝 RT-PCR법은 2스텝 RT-PCR법보다도 측정 감도가 양호한 것이 판명되었다.

[ 실시예 3] 교차 반응성 시험

본 실시예에서는, WT1 mRNA와 GAPDH mRNA를 동시에 증폭하는 1스텝 RT-PCR을, 프라이머 및 프로브로서 표 8에 나타내는 세트(서열 세트 B) 및 표 9에 나타내는 세트를 각각 사용하여 실시하여, 교차 반응성을 평가하였다.

피검 시료로서, Human Genome DNA(Merck KGaA, Darmstadt, German, Cat No.69237) 250ng, 50ng 및 10ng 및 WT1 양성 백혈병 세포주 K562(WT1 K562)로부터 추출한 Total RNA 250ng을 사용하였다.

1스텝 RT-PCR 반응은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 또한, Human Genome DNA 및 WT1 K562 mRNA를 PCR하여 얻어진 증폭산물을, 하기 조건으로 아가로오스 겔 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다. 아가로오스 전기영동의 방법은 통상법을 따랐다.

<아가로오스 겔 전기영동 조건>

영동 조건: 15min, 4％E-gal,

Photo 조건: SYBR용 filter,

E-gal 장치로부터 직접 photo,

셔터 스피드: 1/15,

조리개: 4.5

Apply 조건: Sample 2.5μL+dH₂O 16.5μL

Marker 2.5μL+dH₂O 16.5μL

[결과]

Human Genomic DNA에는 GAPDH의 유전자는 존재하지 않지만, GAPDH의 위유전자(pseudogene)가 존재하는 것이 알려져 있다. 본 실시예에서는, 표 8에 나타낸 프라이머 및 프로브 서열을 사용하여 1스텝 RT-PCR을 실시하면, 도 5의 (A)의 레인 1∼3에 나타낸 바와 같이, Human Genome DNA에 있어서 전기영동으로 GAPDH와 일치하는 밴드는 인정되지 않았다. 즉, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용한 1스텝 RT-PCR에 의하면, GAPDH와 GAPDH의 위유전자를 명확하게 식별할 수 있고, GAPDH의 위유전자를 GAPDH라고 오인하는 일이 없는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 표 9에 나타낸 프라이머 및 프로브 서열을 사용하여 1스텝 RT-PCR을 실시하면, 도 5의 (B)의 레인 1∼3에 나타낸 바와 같이, 전기영동으로 GAPDH와 일치하는 밴드가 인정되었다. 즉, 당해 프라이머 및 프로브를 사용한 1스텝 RT-PCR에서는 GAPDH와 GAPDH의 위유전자를 구별할 수 없었다.

또한, 참고로, 표 8(실시예) 및 표 9(비교예)의 프라이머 및 프로브 서열을 각각 사용하여 1스텝 RT-PCR을 행한 경우의 증폭 사이클수를, GAPDH에 대해서는 표 10에, WT1에 대해서는 표 11에 각각 나타낸다. 표 중, 「ND」는 검출할 수 없었다는 것을 의미한다.

서열 번호 3∼12에 나타내는 염기 서열은 표 3에 기재하는 프라이머 및 프로브를 의미한다. 대응 관계는 표 3에 상세하게 서술한 바와 같다. 서열 번호 13에 나타내는 염기 서열은 표 9에 기재하는 프라이머의 염기 서열을 의미한다. 당해 염기 서열은 인간 GAPDH 유전자(NM_002046.3: 서열 번호 2)의 56∼74 영역의 염기 서열에 상당한다.

SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Method for determining WT1 mRNA expression level <130> P13-172 <150> JP 2013-008984 <151> 2013-01-22 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 3037 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agctggggta aggagttcaa ggcagcgccc acacccgggg gctctccgca acccgaccgc 60 ctgtccgctc ccccacttcc cgccctccct cccacctact cattcaccca cccacccacc 120 cagagccggg acggcagccc aggcgcccgg gccccgccgt ctcctcgccg cgatcctgga 180 cttcctcttg ctgcaggacc cggcttccac gtgtgtcccg gagccggcgt ctcagcacac 240 gctccgctcc gggcctgggt gcctacagca gccagagcag cagggagtcc gggacccggg 300 cggcatctgg gccaagttag gcgccgccga ggccagcgct gaacgtctcc agggccggag 360 gagccgcggg gcgtccgggt ctgagccgca gcaaatgggc tccgacgtgc gggacctgaa 420 cgcgctgctg cccgccgtcc cctccctggg tggcggcggc ggctgtgccc tgcctgtgag 480 cggcgcggcg cagtgggcgc cggtgctgga ctttgcgccc ccgggcgctt cggcttacgg 540 gtcgttgggc ggccccgcgc cgccaccggc tccgccgcca cccccgccgc cgccgcctca 600 ctccttcatc aaacaggagc cgagctgggg cggcgcggag 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atgacatcaa gaaggtggtg 960 aagcaggcgt cggagggccc cctcaagggc atcctgggct acactgagca ccaggtggtc 1020 tcctctgact tcaacagcga cacccactcc tccacctttg acgctggggc tggcattgcc 1080 ctcaacgacc actttgtcaa gctcatttcc tggtatgaca acgaatttgg ctacagcaac 1140 agggtggtgg acctcatggc ccacatggcc tccaaggagt aagacccctg gaccaccagc 1200 cccagcaaga gcacaagagg aagagagaga ccctcactgc tggggagtcc ctgccacact 1260 cagtccccca ccacactgaa tctcccctcc tcacagttgc catgtagacc ccttgaagag 1320 gggaggggcc tagggagccg caccttgtca tgtaccatca ataaagtacc ctgtgctcaa 1380 ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1401 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (A1) Forward Primer <400> 3 cgctattcgc aatcagggtt ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (A2) Reverse Primer <400> 4 ggatcctcat gcttgaatga gt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (A3) Probe <400> 5 agcacggtca ccttcgacgg ga 22 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (a1) Forward Primer <400> 6 cagccgagcc acatcg 16 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (a2) Reverse Primer <400> 7 gtcaatgaag gggtcattga tg 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (a3) Probe <400> 8 ttggtcgtat tgggcgcctg g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (B1) Forward Primer <400> 9 gataaccaca caacgcccat c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (B2) Reverse Primer <400> 10 cacacgtcgc acatcctgaa t 21 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (B3) Probe <400> 11 aatacacacg cacggtgtct tcagag 26 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (b2) Reverse Primer <400> 12 tgatggcaac aatatccact ttacc 25 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 12 ccgcatcttc ttttgcgtc ??? 19

Claims

피검 시료에서의 인간 WT1 mRNA의 발현량을 1스텝 RT-PCR법을 사용하여 정량하는 방법이며,
인간 WT1 mRNA 및 하우스키핑 유전자(mRNA)의 역전사 반응 및 신장 반응을, 당해 피검 시료에서 동시 또한 동일 용기 내에서 연속해서 진행시키는 것을 특징으로 하는, 인간 WT1 mRNA의 발현량의 정량 방법.
제1항에 있어서, 하우스키핑 유전자가 GAPDH mRNA인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에,
(a) 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는
(b) 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에,
(a') 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브, 또는
(b') 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브
를 사용하는, 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에, 추가로
(c) 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트
를 사용하는, 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 인간 WT1 mRNA의 PCR 증폭에, 추가로
(c') 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브
를 사용하는, 방법.
(a) 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는
(b) 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트
를 포함하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.
(a') 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브, 또는
(b') 서열 번호 9에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 10에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 11에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브
를 포함하는 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.
제7항 또는 제8항에 있어서, 추가로 (c) 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는,
인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.
제7항 또는 제8항에 있어서, 추가로 (c') 서열 번호 6에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 PCR 프라이머와 서열 번호 7 혹은 12에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 PCR 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 표지된 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프로브
를 사용하는, 인간 WT1 mRNA의 발현량을 정량하기 위한 리얼타임 PCR용 키트.