CN111500519B - 一种触发及强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法。本发明发现节杆菌在好氧环境中生长时合成并外泌去铁胺(一种铁络合物)，当去铁胺积累到一定浓度时，给碳源饥饿的菌株补充碳源(例如葡萄糖、麦芽糖等)能够触发菌株产生胞外超氧自由基；此外，向节杆菌生长体系中添加金属络合物(例如去铁胺、乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸等)能够强化上述菌株在碳源恢复时产生胞外超氧自由基。人工合成的过氧化氢和羟基自由基被广泛应用于氧化降解有机污染物，但需要专门设备和能源供给。微生物生成的胞外超氧自由基能被转化成过氧化氢和羟基自由基，因此该发明提供的强化微生物生成胞外活性氧方法在污染修复方面具有明显优势。

Description

一种触发及强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法。
背景技术
水体中日益增多的新型持久性有机污染物对污水生物处理提出新挑战。目前，具有人工合成的具有广谱强氧化活性的活性氧(包括臭氧(O3)、超氧阴离子自由基(·O2 ˉ)、过氧化物(H2O2)、羟基自由基(·OH)等)被广泛用于氧化降解难降解有机污染物，比如芳香类化合物、环境激素类化合物、个人护理品等。但是人工合成活性氧需要购买相关设备、动力和试剂，提高了运行成本并限制了使用范围。因此，开发低成本、使用范围广的活性氧产生方法在污染修复方面具有很强应用潜力。
O2+e–→·O2 – (1)
2H++2·O2 –→H2O2+O2 (2)
H2O2+e–→OH–+·OH (3)
·O2 ˉ是氧气单电子还原的产物(1)，可转换成氧化性更强的H2O2(2)和·OH(3)，是氧气向活性氧转换中的关键步骤。节杆菌属于异养好氧细菌，依靠摄取有机物维持生活、质膜上有电子传递链。本发明首先利用微生物外泌的或者人工合成的金属络合物破坏菌体的电子传动链的功能，再给菌体提供可代谢的碳源以便在其代谢碳源时产生电子，这些电子在菌体的功能受损的电子传递链传递时易泄露到胞外并与胞外的氧气反应生成·O2ˉ。
发明内容
本发明提供了一种强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法，包括如下步骤：
将节杆菌在碳源饥饿和铁元素饥饿的条件下生长；
给所述节杆菌补充其能代谢的补充碳源。
其中，在本发明申请中的碳源饥饿的含义为菌株难以摄取胞外的碳源；所述铁元素饥饿的含义为菌株难以直接摄取胞外的铁元素，除非借助铁载体。
具体地，给所述节杆菌补充其能代谢的补充碳源，同时补充金属络合物。
具体地，所述金属络合物的浓度不低于2μmol/L。
具体地，所述的金属络合物包括铁载体。
具体地，所述金属络合物包括去铁胺(英文全称为Deferoxamine，英文简称为DFO)、铁色素(英文全称为Ferrichrome，英文简称FericR)、肠杆菌素(英文全称为Enterobactin，英文简称EnteroB)、去铁胺E(英文名称为Deferrioxamine E，英文简称De-E)、乙酰氧肟酸(英文全称为Aasacetohydroxamic acid，英文简称Ac)、乙二胺四乙酸(英文全称为 Ethylene diamine tetraacetic acid，英文简称EDTA)、二乙基三胺五乙酸(英文全称为 Diethylenetriamine pentaacetic acid，英文简称DTPA)任一种或多种。
具体地，所述补充碳源浓度大于或等于15mg/L。
具体地，所述补充碳源或所述碳源包括但不限于葡萄糖、柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、果糖、蔗糖、麦芽糖、乙酸一种或多种。甚至补充碳源和原有培养基中的碳源可以不尽相同。
具体地，所述节杆菌在碳源饥饿和铁元素饥饿的条件下生长24h以上，在24h后铁载体的累积使得补充碳源添加后胞外超氧自由基的产生更加明显。
具体地，所述节杆菌菌株包括但不限于节杆菌QXT-31(保藏号为6631，英文全称为Arthrobacter sp.QXT-31，英文简称A.QXT-31)、柏树节杆菌(英文全称为Arthrobactercupressi，英文简称A.cupressi)、居土节杆菌(英文全称为Arthrobacter humicola，英文简称A.humicola)。
有益效果：与现有技术相比，本技术方案中提供了一种微生物产生胞外超氧自由基的方法：当节杆菌在饥饿状态下获取大量碳源(比如葡萄糖、麦芽糖等)、金属络合物(如铁载体)后会产生胞外超氧自由基。
将该技术应用于污染修复(比如氧化降解水体中难降解物质)的优势如下：
(1)节杆菌是一种在环境中普遍存在的菌属，具有很强适应性和生存能力；
(2)节杆菌的碳源代谢能力比较强，在其生长所需碳源不足后，补充多数碳源都能促使其产生胞外超氧自由基。
附图说明
下面描述的附图仅是本发明的一些实施例，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图中的结构获得其他附图。
图1：碳源饥饿和铁饥饿的菌液中添加葡萄糖产生胞外超氧自由基的曲线图；
图2：碳源饥饿和铁饥饿的菌液中添加其他碳源产生胞外超氧自由基的曲线图；
图3：不同浓度的碳源触发菌体产生胞外超氧自由基的对比图；
图4：同时添加不同金属络合物和葡萄糖对菌体产生胞外超氧自由基的对比图；
图5：补充碳源对菌株A.cupressi(a)、A.humicola(b)产生胞外超氧自由基的对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。以下所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的实用新型构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
本技术方案中采用的节杆菌菌株(A.QXT-31)已保存在中国普通微生物保藏管理中心，保藏号为6631。实施例中均用无机盐培养基(简称：MSM)培养节杆菌，碳源种类及其浓度因实施例而异。
MSM组分如下：
250mg/L葡萄糖、500mg/L MgSO4·7H2O、60mg/L CaCl2·2H2O、4000mg/L Na2HPO4·12H2O、500mg/L KH2PO4、250mg/L(NH4)2SO4、0.5mg/L FeCl3·6H2O、1 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.5mg/L CuCl2、0.5mg/L MnCl2·2H2O、0.5mg/L ZnSO4·7H2O、 0.05mg/L NiCl2·6H2O、0.001mg/L维生素B1、0.001mg/L维生素B12、0.001mg/L生物素。
制备方法：将MgSO4 7H2O与CaCl2 2H2O的混合溶液在115℃下高压灭菌25 min；配置Na2HPO4 12H2O、KH2PO4和(NH4)2SO4的储存液(100X)；配置金属离子储备溶液(50X)：首先将FeCl3 6H2O溶解在预酸化(盐酸，pH～3.0，抑制Fe(III)水解)的超纯水(18.3MΩ)，然后依次加入并溶解其他金属(Na2MoO4 2H2O、CuCl2、 MnCl2 2H2O、ZnSO4 H2O、NiCl2 6H2O)；配置辅助因子储存液(1000X)，含有维生素B1、维生素B12和生物素。上述各种储存液、碳源和缓冲液(10mM HEPES，pH 7.2)在使用前用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤灭菌后使用。
菌株活化：用接种环从固体培养基上挑取一个A.QXT-31菌落，接种到MSM中进行活化培养48h(170rpm，30℃)，活化一次的菌液再次接种到新鲜MSM中再次活化培养24h。经过两次活化培养的菌液接种到新鲜培养基中用做实验培养，接种量为2％(v/v)。
测定胞外超氧自由基产生速率：黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶在菌液中混合产生胞外超氧自由基，利用其定量胞外超氧自由基产生速率(见下式)与化学发光信号强度之间的校准曲线，得到测定体系中胞外超氧自由基的产生速率。化学发光信号强度由酶标仪进行测定。SOD用于消除体系中产生的胞外超氧自由基，作为空白对照组。
Figure GDA0003391311910000041
式中pK1＝6.6(黄嘌呤的pKa)，pK2＝8.2(黄嘌呤氧化酶的pKa)，反应体系的pH控制在7.3，U代表黄嘌呤氧化酶的酶活单位。
每个样品重复三次，依次在待测孔中添加试剂(顺序不可颠倒)，添加试剂时避免混合。实验操作如下：
(1)用超纯水(18.3MΩ)配制125μmol·L-1的MCLA，3U·L-1的黄嘌呤氧化酶，5mmol·L-1的黄嘌呤和480U·mL-1的SOD。
(2)上述试剂在使用前放置于室温避光解冻并恢复至室温。在96孔酶标板的所有待测孔中添加10μL黄嘌呤储备液(终浓度250μmol·L-1)。
(3)在空白孔中添加5μL SOD(终浓度120kU·L-1)。
(4)在标准孔中分别添加5μL不同浓度的黄嘌呤氧化酶(标准品1终浓度2.5 mU·L-1，标准品2终浓度175mU·L-1，标准品3终浓度350mU·L-1)。
(5)在样品孔中添加5μL碳源，碳源浓度和种类根据实验选择。
(6)在所有待测孔中迅速加入180μL菌液，并将上述试剂混匀，并立即放入酶标仪中测定化学发光信号背景值。
(7)在待测孔中加入5μL MCLA(终浓度为3.125μmol·L-1)，并用移液枪将该试剂与孔中样品液混匀，并立即把酶标板放入酶标仪中测定化学发光信号值。以添加碳源的时间为0s开始计时，在120min内连续监测体系化学发光信号值。
(8)绘制胞外超氧自由基产生速率与化学发光信号之间的校正曲线，用于校正样品中胞外超氧自由基产生速率。用120min内胞外超氧自由基的最大化学发光值计算胞外超氧自由基的最大生成速率。
葡萄糖浓度测定：用葡萄糖测定试剂盒(E1010，普利莱，中国)测定葡萄糖残留浓度，具体实验步骤参考该产品说明书。
本发明申请设置了5个实施例，以清楚介绍本发明的5个发明要点以及可实施性：
1)碳源饥饿和铁饥饿的菌液中添加葡萄糖能产生胞外超氧自由基；
2)碳源饥饿和铁饥饿的菌液中添加其他碳源也能产生胞外超氧自由基；
3)能够促使菌体产生胞外超氧自由基的葡萄糖最低浓度；
4)添加不同种类的金属络合物对菌体产生胞外超氧自由基的影响；
5)A.cupressi和A.humicola菌液中添加葡萄糖对菌体产生胞外超氧自由基的影响。
本发明展开了以下几个方面的实验。
实施例1碳源饥饿和铁饥饿的A.QXT-31菌液中添加葡萄糖对菌体产生胞外超氧自由基的影响
实施条件：菌株A.QXT-31在铁饥饿条件合成并外泌DFO，测定菌株培养过程胞外DFO 的浓度；测定培养48h内菌液中葡萄糖(唯一碳源)残留浓度；培养0-40d的菌液样品中补充以及没有补充葡萄糖(50mg/L)两组实验处理，考察添加葡萄糖对菌株产生胞外超氧自由基的影响。
结果如图1显示：DFO的浓度在考察的培养时间内(0-48h)持续增加，根据DFO(一种铁载体)的生理学意义(菌体在铁元素缺乏时合成并外泌铁载体，辅助摄取胞外Fe(III))，判断菌株处于越来越严重的铁饥饿状态；MSM中葡萄糖残留浓度在24h后浓度不再下降，表明24h后菌体不再能够摄取胞外的葡萄糖，菌体从24h起处于碳饥饿状态；0-40d的菌液中未检测到胞外超氧自由基，说明菌液在不补充碳源时不能产生胞外超氧自由基。
对照实验，0-40d向菌液中添加葡萄糖，培养时间大于24h的菌液中产生了胞外超氧自由基，说明添加碳源触发菌株产生胞外超氧自由基的前提之一是菌体处于碳饥饿状态。进一步地，发现培养24h、48h的菌体同处于碳饥饿状态，在48h菌液中补充葡萄糖能够触发更高的胞外超氧自由基生成速率，部分原因是DFO能促进菌体产生胞外超氧自由基，48h菌液中DFO浓度比24h菌液更高，DFO触发/强化菌体胞外超氧自由基的实验结果和分析详见实施例4。
实施例2碳源饥饿和铁饥饿的A.QXT-31菌液中添加其他碳源对菌体产生胞外超氧自由基的影响
将MSM中碳源换为250mg/L的其他碳源，包括乙酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸、蔗糖、麦芽糖、果糖一种或多种。A.QXT-31在上述培养基中分别培养48h后添加相应的碳源(50mg/L)，测定添加碳源后胞外超氧自由基产生速率。
结果如图2，A.QXT-31在以上述碳源为唯一碳源的MSM中培养48h后，添加相应的碳源能触发菌液中产生胞外超氧自由基。
实施例3考察触发A.QXT-31产生胞外超氧自由基的葡萄糖最低浓度
A.QXT-31在以葡萄糖为唯一碳源的MSM中培养48h，然后向菌液中添加0、10、15、25、50mg/L的葡萄糖，并检测菌液中胞外超氧自由基的信号。
结果如图3，添加高于15mg/L的葡萄糖的菌液中出现明显的胞外超氧自由基信号，说明触发培养48h的A.QXT-31产生胞外超氧自由基的最低葡萄糖浓度为15mg/L；优选地，碳源浓度大于20mg/L有更明显的效果。
实施例4不同种类的金属络合物对菌体产生胞外超氧自由基的影响
向培养24h的菌液中补充葡萄糖(50mg/L)和7种金属络合物，测定体系产生胞外超氧自由基的最大速率。
7种金属络合物信息如下：
Ferrichrome(FericR)：铁色素，2μmol/L(2μM)；
Enterobactin(EnteroB)：肠杆菌素，2μmol/L(2μM)；
Deferrioxamine E(De-E)：去铁胺E，2μmol/L(2μM)；
Deferoxamine(DFO)：去铁胺，2μmol/L(2μM)；
Aasacetohydroxamic acid(Ac)：乙酰氧肟酸，人工合成的金属络合物，2μmol/L(2μM)；
Diethylenetriamine pentaacetic acid(DTPA)：二乙基三胺五乙酸，人工合成的金属络合物，5-10μmol/L(5-10μM)；
Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)：乙二胺四乙酸，人工合成的金属络合物， 5-10μmol/L(5-10μM)。
结果如图4，与只添加葡萄糖的处理相比，添加葡萄糖和金属络合物的处理中胞外超氧自由基的产生速率更高；说明金属络合物的引入能够强化菌体产生胞外超氧自由基的速率。
实施例5补充葡萄糖对菌株A.cupressi、A.humicola产生胞外超氧自由基的影响
向培养4d的A.cupressi菌液和24h的A.humicola菌液中分别添加50mg/L的葡萄糖，然后测定菌液中的胞外超氧自由基信号。
结果如图5，与不添加葡萄糖的菌液中胞外超氧自由基信号相比，补充了葡萄糖的菌液中有更强的胞外超氧自由基信号，说明添加葡萄糖触发/强化这两株菌的菌液中产生胞外超氧自由基。

Claims (4)

1.一种强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将节杆菌在不补充碳源和铁元素的条件下生长24h以上；此时，节杆菌处于碳源饥饿和铁元素饥饿状态下；
给所述节杆菌补充碳源，同时补充金属络合物；所述金属络合物包括去铁胺、铁色素、肠杆菌素、去铁胺E、乙酰氧肟酸、乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸任一种或多种；
所述碳源包括葡萄糖、柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、果糖、蔗糖、麦芽糖、乙酸的一种或多种。
2.根据权利要求1所述强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法，其特征在于，所述金属络合物的补充浓度不低于2μmol/L。
3.根据权利要求1所述强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法，其特征在于，所述补充碳源浓度不小于15mg/L。
4.根据权利要求1所述强化节杆菌产生胞外超氧自由基的方法，其特征在于，所述节杆菌菌株包括节杆菌QXT-31、柏树节杆菌、居土节杆菌。
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