ES2731780T3 - Método de cuantificación para nivel de expresión de ARNm de WT1 - Google Patents

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Abstract

Un método para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano en una muestra de prueba por medio de PCR-TR de una etapa, el método comprende someter simultáneamente el ARNm de WT1 humano y un ARNm de gen constitutivo a reacciones de transcripción inversa y de extensión llevadas a cabo secuencialmente en la muestra de prueba en el mismo recipiente, en donde un conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del gen constitutivo comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 6 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en los SEQ ID NO: 7 o 12; en donde el gen constitutivo es ARNm de GAPDH; y en donde un primer conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del ARNm de WT1 humano comprende lo siguiente (a) o (b): (a) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 4, o (b) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de cuantificación para nivel de expresión de ARNm de WT1
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método innovador para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano que se puede utilizar para diagnosticar el cáncer, tal como leucemia o cáncer sólido, o para determinar cuándo realizar un trasplante de médula ósea.
Antecedentes de la invención
El gen 1 del tumor de Wilms ("WT1") es un gen que se ha identificado como gen causante de un tumor de Wilms pediátrico por Call et al. en 1990 (Literatura no patente 1). A partir de entonces, se ha evidenciado que el ARNm de WT1 se expresa a una alta tasa no solo en el tumor de Wilms pediátrico sino también en células cancerosas sólidas, tales como líneas celulares de cáncer sólido, por ejemplo, líneas celulares de cáncer gástrico, líneas celulares de cáncer de colon, líneas celulares de cáncer de pulmón y líneas celulares de cáncer de mama (Literatura no patente 2) . Hoy en día, se considera que el gen WT1 es un gen relacionado con el cáncer no solo en el tumor de Wilms pediátrico sino también en muchos cánceres.
Call et al. informan de la expresión de ARNm de WT1 en células K562 y en células CCRF-CEM, que son ambas líneas celulares de leucemia (véase Literatura no patente 1). Miwa et al. informan de que el ARNm de WT1 se expresó en 15 de 22 casos de leucemia mieloide aguda ("LMA") en análisis de Northern blot (Literatura no patente 3) . Además, Inoue et al. informan de que la expresión del ARNm de WT1 se ha observado en un 100 % (45/45) de los casos en el primer reconocimiento médico para LMA (Literatura no patente 4). Asimismo, se ha informado de que el nivel de expresión del ARNm de WT1 en el diagnóstico se asocia con prognosis (Literatura no patente 5), de que, incluso, la expresión del ARNm de WT1 vuelve a niveles normales con tratamiento, aumenta de nuevo cuando se da recidiva (Literatura no patente 6), y de que el nivel de expresión del ARNm de WT1 en recidiva es mayor que en diagnóstico (Literatura no patente 7).
El gen WT1 se ha vendido como un producto farmacéutico de diagnóstico extracorpóreo que es útil como nuevo marcador para monitorizar la enfermedad mínima residual (o "EMR") en el tratamiento de lMa , debido al hecho de que el gen WT1 aparece con una alta frecuencia como gen único en pacientes con LMA y de que la expresión del gen WT1 aumenta otra vez en recidiva después de volver a niveles normales con tratamiento.
Un método conocido hasta el momento para medir el ARNm de WT1 humano es el método de cuantificación competitiva utilizando p-actina como estándar (Literatura patente 1). Sin embargo, este método requiere no solo medir el ARNm de WT1 y el ARNm de p-actina por separado, sino también realizar reacciones de extensión después de que se ha hecho una reacción de transcripción inversa, es decir, PCR-TR de dos etapas, requiriendo así mucho tiempo.
Como otro método para medir el ARNm de WT1, la Literatura patente 2 describe una PCR-TR de una etapa para el ARNm de WT1. Sin embargo, este método requiere el nivel de expresión de un gen constitutivo utilizado para corregir el nivel de expresión del gen WT1 para medirlo por separado y, por lo tanto, es complicado.
La Literatura patente 3 se refiere a composiciones y a métodos para inducir la diferenciación de células madre en células progenitoras renales. Los métodos de PCR-TR se describen en la presente memoria.
La Literatura no patente 8 estudia los efectos de curcumina pura, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina en la expresión del gen WT1 en líneas celulares leucémicas. Los niveles del ARNm de WT1 se evaluaron por medio de PCR-TR.
Lista de referencias
Literatura patente
LP 1: JPH11-089599A
LP 2: JPH11-089596A
LP 3: US 2007/031966 A1
Literatura no patente
LNP 1: Call, K. M. et al., Cell 1990; 60: 509-520.
LNP 2: Jpn. J. Cancer Res. 1999; 90: 194-204.
LNP 3: Miwa, H., et al., Leukemia 1992; 6: 405-409.
LNP 4: Inoue, K., et al., Blood, 1994, 84(9), 3071-3079.
LNP 5: Blood 1997; 90: 1217-1225.
LNP 6: Blood 1996; 88: 2267-2278.
LNP 7: Blood 1996; 88: 4396-4398.
LNP 8: Anuchapreeda, S. et al., Cáncer Chemother Pharmacol 2008; 62:585-594
Compendio de la invención
Problema técnico
Como se describió anteriormente, los métodos conocidos para cuantificar el nivel de expresión del gen WT1 son problemáticos, ya que requieren mucho tiempo y son complicados. Por consiguiente, existe una necesidad de un método que pueda cuantificar el nivel de expresión del gen WT1 humano de manera conveniente y en un periodo de tiempo corto. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método innovador para cuantificar el ARNm de WT1 de manera conveniente y en un periodo de tiempo corto. En particular, un objeto de la presente invención es proporcionar un método innovador que permita que se cuantifique de manera conveniente el ARNm de WT1 y en un periodo de tiempo corto por medio de cuantificación simultánea tanto del nivel de expresión del ARNm de WT1 humano como del nivel de expresión del gen constitutivo.
Solución al problema
Los presentes autores de la invención llevaron a cabo una investigación exhaustiva para conseguir el objeto anterior y encontraron que el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano de interés se puede cuantificar de manera conveniente y en un periodo de tiempo corto sometiendo simultáneamente el gen WT1 humano (ARNm), que es un gen de interés, y un gen constitutivo (ARNm), que es un gen para corrección, a reacciones de transcripción inversa y de extensión llevadas a cabo secuencialmente en el mismo recipiente (una etapa). Los autores de la invención confirmaron que esta PCR-TR de una etapa permite detectar un gen de interés con mayor sensibilidad de una manera más conveniente que la PCR-TR de dos etapas, que amplifica un gen de interés y un gen para corrección por separado y en un periodo de tiempo casi tan corto.
La presente invención se ha consumado con base en el descubrimiento anterior e incluye las siguientes realizaciones.
(I) Método para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT 1 humano
(I-1) Un método para cuantificar el nivel de expresión de un ARNm de WT1 humano en una muestra de prueba por medio de PCR-TR de una etapa, el método comprende someter simultáneamente el ARNm de WT1 humano y un ARNm de gen constitutivo a reacciones de transcripción inversa y de extensión llevadas a cabo secuencialmente en la muestra de prueba en el mismo recipiente,
en donde un conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del gen constitutivo comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 6 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en los SEQ ID NO: 7 o 12;
en donde el gen constitutivo es ARNm de GAPDH; y
en donde un conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del ARNm de WT1 humano comprende lo siguiente (a) o (b):
(a) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base describa en el SEQ ID NO: 4, o
(b) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 10.
(I-2) El método según (I-1), en donde el conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del gen constitutivo comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 8, estando la sonda marcada; y
en donde el conjunto de cebadores (a) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 5, estando la sonda marcada; o
el conjunto de cebadores (b) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 11, estando la sonda marcada.
(II) Kit para PCR en tiempo real para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano
(II-1) Un kit para PCR en tiempo real para cuantificar el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano, el kit comprende (a) y (c), o (b) y (c) de lo siguiente:
(a) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 4,
(b) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 10,
(c) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 6 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en los SEQ ID NO: 7 o 12.
(II-2) El kit según (II-1), en donde si el kit comprende el conjunto de cebadores (a), el conjunto de cebadores (c) comprende el SEQ ID NO: 7; en donde si el kit comprende el conjunto de cebadores (b), el conjunto de cebadores (c) comprende el SEQ ID NO: 12.
(II-3) El kit según (II-1) o (II-2), en donde el conjunto de cebadores (a) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 5, estando la sonda marcada;
el conjunto de cebadores (b) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 11, estando la sonda marcada; y
el conjunto de cebadores (c) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 8, estando la sonda marcada.
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención hace posible proporcionar un método para cuantificar el nivel de expresión del ARNm de WT1 utilizando una operación más sencilla, con menos esfuerzo y en un periodo de tiempo más corto que con los métodos conocidos hasta el momento para cuantificar el nivel de expresión del ARNm de WT1. Además, el método de la presente invención permite detectar con una sensibilidad mayor que los métodos de medición conocidos hasta el momento que utilizan PCR-TR de dos etapas. Más específicamente, el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano se puede cuantificar de manera conveniente, en un periodo de tiempo corto, y con mayor sensibilidad utilizando el método o kit para PCR en tiempo real de la presente invención.
El nivel de expresión del ARNm de WT1 humano así cuantificado es un índice útil para diagnosticar la aparición y recidiva de leucemia o de cáncer sólido, determinando la prognosis de leucemia o de cáncer sólido, y determinando cuándo realizar un trasplante de médula ósea.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra curvas de amplificación del ARNm de WT1 para varias concentraciones (en el gráfico, 1: 2,5x105 copias/prueba, 2: 2,5x104 copias/prueba, 3: 2,5x103 copias/prueba, 4: 2,5x102 copias/prueba, y 5: 2,5x101 copias/prueba) del estándar de ARN de WT1 cuando se amplificó solo ARNm de WT1 (Ejemplo 1).
La Figura 2 muestra curvas de amplificación del ARNm de GAPDH para varias concentraciones (en el gráfico, 1: 1,0x108 copias/prueba, 2: 1,0x107 copias/prueba, 3: 1,0x106 copias/prueba, 4: 1,0x105 copias/prueba, y 5: 1,0x104 copias/prueba) del estándar de ARN de GAPDH cuando se amplificó solo ARNm de GAPDH (Ejemplo 1). La Figura 3 muestra curvas de amplificación del ARNm de WT1 para varias concentraciones (en el gráfico, 1: 2,5x105 copias/prueba, 2: 2,5x104 copias/prueba, 3: 2,5x103 copias/prueba, 4: 2,5x102 copias/prueba, y 5: 2,5x101 copias/prueba) del estándar de ARN de WT1 cuando se amplificaron simultáneamente ARNm de WT1 y ARNm de Ga p Dh (Ejemplo 1).
La Figura 4 muestra curvas de amplificación del ARNm de GAPDH para varias concentraciones (en el gráfico, 1: 1,0x108 copias/prueba, 2: 1,0x107 copias/prueba, 3: 1,0x106 copias/prueba, 4: 1,0x105 copias/prueba, y 5: 1,0x104 copias/prueba) del estándar de ARN de GAPDH cuando se amplificaron simultáneamente ARNm de WT1 y ARNm de Ga p Dh (Ejemplo 1).
La Figura 5 muestra los resultados obtenidos al realizar PCR-TR de una etapa en la que ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplifican simultáneamente, utilizando (A) el conjunto mostrado en la Tabla 8 (conjunto de secuencias B) como cebadores y sondas y también utilizando por separado (B) el conjunto mostrado en la Tabla 9 (conjunto comparativo) como cebadores y sondas, y sometiendo los productos de amplificación así obtenidos a electroforesis en gel de agarosa.
Descripción de las realizaciones
(I) Método para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano
El método de la presente invención es un método para cuantificar el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano por medio de PCR-TR de una etapa.
El gen WT1 humano que se mide en la presente invención es un gen que consiste en 3037 pb y que se identifica como gen causante del tumor de Wilms pediátrico como se describió anteriormente. El gen WT1 humano se registra con el NCBI como "Tumor de Wilms 1 ("WT1") de Homo sapiens, variante de transcrito D, ARNm" (NM_024426.4). La secuencia de base del gen WT1 humano se muestra en el SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.
La muestra de prueba que se mide en el método de la presente invención no está limitada particularmente mientras contenga el ARNm de WT1 humano mencionado anteriormente. Los ejemplos de muestras de prueba utilizables incluyen muestras de ARN total o enriquecidas con ARNm obtenidas tratando una muestra que puede contener el ARNm de WT1 por medio de un método conocido, por ejemplo, una muestra biológica, tal como células, tejido, sangre, esputo, heces, orina derivados de seres humanos, y similares. Las muestras de ARN de este tipo se pueden utilizar en forma de disoluciones acuosas o en el estado en el que se absorban o inmovilicen en una fase sólida apropiada. Es adecuado que la cantidad total de ARN sea de entre 0,01 ng a 1 pg por 100 pl de una mezcla de reacción.
Los genes constitutivos son genes que siempre se expresan en todas las células sin importar la diferenciación celular y que tienen un papel esencial en la supervivencia de las células, aunque no realicen funciones especializadas. Los ejemplos incluyen genes que codifican ARN sintetasas, enzimas metabolizantes de energía, proteínas ribosomales, proteínas citoesqueléticas, etc. Los ejemplos específicos incluyen genes que codifican gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH), p-actina, p2-microglobulina, hipoxantina-fosforribosiltransferasa 1 (HPRT 1), etc. El gen constitutivo puede ser un gen que no compite con el gen WT1 humano que se va a medir en amplificación por medio de PCR-TR; por ejemplo, puede ser un gen que tiene una homología de secuencia de base baja con el gen WT 1 humano. El gen constitutivo de la presente invención es el gen GAPDH.
El gen GAPDH es un gen registrado con el NCBI como "Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) de Homo sapiens, ARNm" (NM_002046.3). La secuencia de base de GAPDH se muestra en el SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias.
El tampón de reacción utilizado para la PCR-TR de una etapa (reacciones de transcripción inversa y de extensión) en la presente invención puede ser un tampón hidrosoluble adecuado para una enzima que tiene actividad de transcripción inversa para mostrar la actividad, y es, por ejemplo, un tampón con un pH de entre 7 a 10, y preferiblemente un pH de entre 8 a 9. Los ejemplos de tampones de este tipo incluyen tampones de tris. Además, el tampón puede contener varios iones necesarios para la actividad de una enzima que tiene actividad de transcripción inversa o de ADN polimerasa. Entre ellos, los iones de Na y los iones de K se pueden añadir individualmente en forma de sal en una concentración de entre 5 a 50 mM. Los iones de Mg se pueden añadir en forma de sal en una concentración de entre 1 a 10 mM. Si es necesario, el tampón puede contener un agente que promueva o estabilice la actividad de una enzima que tiene actividad de transcripción inversa o de ADN polimerasa, tal como un tensioactivo, albúmina de suero bovino (ASB), o gelatina. Asimismo, se puede añadir un inhibidor de ribonucleasa para inhibir la degradación de ARN y de ARN competidor en la muestra.
Los ejemplos de enzimas que tienen actividad de transcripción inversa incluyen transcriptasa inversa derivada del virus de la mieloblastosis aviar (VMA), transcriptasa inversa derivada del virus asociado a Rous (RAV2), transcriptasa inversa derivada del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMM), ADN polimerasa derivada de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa derivada de Bacillus caldotenax (Bca) y derivados de estos. Entre estas, Tth es la más adecuada para la presente invención. Los ejemplos específicos de Tth incluyen ADN polimerasas de enzimas termoestables derivadas de Z05 de la especie Thermus. Estas enzimas se pueden obtener por medio de purificación de sus fuentes originales o proteínas recombinantes producidas utilizando técnicas de ingeniería genética.
Cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP en la presente especificación, estos cuatro desoxinucleótidos trifosfato se pueden designar de manera colectiva como "dNTP") se añadieron como sustratos en la síntesis de ADNc y en PCR a la mezcla de reacción. Todos o una porción de los dNTP se pueden modificar y/o reemplazar con dNTP marcados en el intervalo que permita extensión de una cadena de ADN sintetizada a partir de un cebador.
Los cebadores utilizados en la síntesis de ADNc (reacciones de transcripción inversa y de extensión) a partir del ARN diana en la presente invención son oligonucleótidos que tienen una secuencia de base complementaria a al menos la secuencia de base del ARN diana, y que necesitan hibridarse al ARN diana en las condiciones de reacción empleadas. Los oligonucleótidos de este tipo tienen una longitud de, por ejemplo, entre 6 a 100 nucleótidos, y preferiblemente de entre 10 a 30 nucleótidos. También se pueden utilizar cebadores modificados y/o marcados. Los cebadores se pueden sintetizar químicamente por medio de, por ejemplo, un método conocido. Los cebadores utilizados en PCR necesitan permitir al menos amplificación de ADN utilizando ADNc derivado del ARN diana como plantilla. De este modo, los cebadores son oligonucleótidos que tienen una secuencia de base complementaria a al menos la secuencia de base del ADNc de plantilla, y que necesitan hibridarse al ADNc en las condiciones de reacción empleadas. Los oligonucleótidos de este tipo funcionan preferiblemente como cebadores para la amplificación de ADN utilizando ADNc como plantilla al igual que cebadores para la síntesis de ADNc a partir del ARN diana mencionado anteriormente (reacciones de transcripción inversa y de extensión).
Los ejemplos del conjunto de cebadores utilizado de manera adecuada para transcripción inversa del ARNm de WT1 humano, que es un gen de interés de la presente invención, en ADNc, extensión y amplificación incluyen un conjunto de cebadores A que comprende un cebador directo (A1) y un cebador inverso (A2) mostrados en la Tabla 1 y un conjunto de cebadores B que comprende un cebador directo (B1) y un cebador inverso (B2) mostrados en la Tabla 2. Las Tablas 1 y 2 muestran también sondas de unión específica de secuencia (sonda (A3) y sonda (B3)) utilizadas para detectar productos de amplificación del gen WT1 humano amplificado con estos conjuntos de cebadores. Preferiblemente, estas sondas se marcan para facilitar la detección de los productos de amplificación.
Los ejemplos del conjunto de cebadores utilizado de manera adecuada para transcripción inversa del ARNm de GAPDH humano utilizado de manera adecuada como un gen constitutivo en el método de la presente invención, en ADNc, extensión y amplificación incluyen un conjunto de cebadores A que comprende un cebador directo (a1) y un cebador inverso (a2) mostrados en la Tabla 1 y un conjunto de cebadores B que comprende un cebador directo (b1) y un cebador inverso (b2) mostrados en la Tabla 2. Las Tablas 1 y 2 muestran también sondas de unión específica de secuencia (sonda (a3) y sonda (b3)) utilizadas para detectar productos de amplificación del gen GAPDH humano amplificado con estos conjuntos de cebadores. Preferiblemente, estas sondas se marcan para facilitar la detección de los productos de amplificación.
Como métodos para marcar una sonda, existen métodos IR y métodos no IR. Es preferible que se utilice un método no IR. Los ejemplos de métodos no IR incluyen métodos de marcaje con fluorescencia, métodos de biotinilación, métodos de quimioluminiscencia y similares. Es preferible que se utilice un método de marcaje con fluorescencia. No existe una limitación particular sobre la sustancia fluorescente mientras la sustancia se pueda unir a un resto base de un ácido nucleico. Se pueden utilizar un colorante de cianina (como Cy3 o Cy5 en la serie Cy DyeTM), un reactivo de rodamina 6G, N-acetoxi-N2-acetilaminofluoreno, un derivado yodado de estos, o similares.
Tabla 1
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
Un único asterisco indica una región del gen WT1 humano (NM_024426.4: SEQ ID NO: 1).
Los dobles asteriscos indican una región del gen GAPDH humano (NM_002046.3: SEQ ID NO: 2).
Tabla 2
Figure imgf000007_0001
Un único asterisco indica una región del gen WT1 humano (NM_024426.4: SEQ ID NO: 1).
Los dobles asteriscos indican una región del gen GAPDH humano (NM_002046.3: SEQ ID NO: 2).
Los estándares de ARN se pueden preparar por medio de un método conocido. Por ejemplo, los estándares de ARN se pueden preparar con referencia a la descripción de "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America" (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.), Vol. 87, pp. 2725 a 2729 (1990), "Clinical Chemistry (Clin. Chem.)," Vol. 41, pp. 819 a 825 (1995), "Blood," Vol. 82, pp. 1929 a 1936 (1993) y similares.
Los detalles son como sigue. Una secuencia promotora que sirve como origen de una reacción de ARN sintetasa, como ARN polimerasa T7, se añade a una secuencia de ADN de doble cadena que se va a amplificar, preparando así una secuencia de ADN utilizada como plantilla para la síntesis de ARN. Una ARN polimerasa, el ADN de doble cadena que comprende la secuencia promotora de ARN y nucleósidos trifosfato se añaden a un recipiente de reacción, y se realiza una reacción a 37 °C durante de entre 30 minutos a 2 horas para sintetizar un ARN de cadena sencilla que es complementario al ADN de plantilla en dirección 3' del promotor de ARN.
No existe una limitación en el procedimiento de la reacción y en las condiciones de la reacción de la PCR-TR de una etapa utilizada en la presente invención. Lo siguiente es un ejemplo.
Por ejemplo, una mezcla de reacción que contiene dNTP, sal de Mg, un inhibidor de ribonucleasa, una enzima que tiene actividad de transcripción inversa, cebadores y similares se añade a un recipiente de reacción y se mantiene fresca a 4 °C o menos hasta el comienzo de la reacción. Una muestra de prueba que contiene ARNm de WT1 humano que se va a medir y un gen constitutivo (por ejemplo, ARNm de GAPDH) se añaden al recipiente, y la mezcla se reacciona múltiples veces a de entre 50 a 70 °C, y preferiblemente de entre 55 a 65 °C, durante de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 30 minutos, y preferiblemente de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10 minutos para sintetizar ADNc (reacción de transcripción inversa). Inmediatamente después, se realiza un tratamiento térmico a de entre 90 a 99 °C durante de entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 minutos para desnaturalizar el complejo ARN-ADNc (desnaturalización térmica). Posteriormente, se realizaron de entre 2 a 50 ciclos de reacción a temperatura, cada uno consiste en desnaturalización térmica a de entre 90 a 99 °C, una reacción de hibridación a de entre 45 a 65 °C, y una reacción de extensión de ADN a de entre 60 a 80 °C, amplificando así el fragmento de ADN derivado del ARN diana. Posteriormente, cuando se realiza PCR anidada para mejorar la sensibilidad y/o especificidad, los cebadores utilizados en la primera PCR y los cebadores utilizados en la segunda PCR se pueden añadir juntos a un recipiente de reacción desde el principio, y la PCR de dos etapas se puede realizar de una manera sucesiva. En este caso, se requiere que la cantidad de los cebadores para la primera PCR sea inferior a la cantidad de los cebadores para la segunda PCR, y es adecuado que la cantidad de los cebadores para la primera PCR sea preferiblemente 100 veces inferior a la cantidad para la segunda PCR, o menor.
El método descrito anteriormente para la presente invención no solo hace posible medir de manera conveniente el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano por medio de PCR-TR de una etapa en el mismo recipiente, sino que también permite una detección con mayor sensibilidad que la PCR-TR de dos etapas, que realiza PCR-TR para un gen de interés y PCR-TR para un gen constitutivo por separado, como se muestra en el Ejemplo 2. En otras palabras, el método de la presente invención permite una detección sumamente precisa incluso cuando la concentración del ARNm de WT1 humano expresada en una muestra es baja.
Este método se puede realizar de una manera más conveniente utilizando el kit para PCR en tiempo real descrito a continuación.
(II) Kit para PCR en tiempo real para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano
El kit de reactivos para PCR-TR de la presente invención comprende tanto un conjunto de cebadores para someter el ARNm de WT1 humano a PCR-TR como un conjunto de cebadores para someter un gen constitutivo, es decir, ARNm de GAPDH, a PCR-TR. El kit comprende también sondas utilizadas para detectar productos de amplificación de ARNm de WT1 humano amplificado por medio de PCR-TR y productos de amplificación del gen constitutivo amplificado por medio de PCR-TR.
Un ejemplo del kit es uno que comprende un conjunto de cebadores A que comprende un cebador directo (A1) (SEQ ID NO: 3) y un cebador inverso (A2) (SEQ ID NO: 4) mostrados en la Tabla 1 como un conjunto de cebadores para someter el ARNm de WT1 humano a PCR-TR, al igual que una sonda (A3) (SEQ ID NO: 5) mostrada en la Tabla 1 como una sonda de unión específica de secuencia utilizada para detectar productos de amplificación del gen WT1 humano amplificado con este conjunto de cebadores, y que comprende también un conjunto de cebadores A que comprende un cebador directo (a1) (SEQ ID NO: 6) y un cebador inverso (a2) (SEQ ID NO: 7) mostrados en la Tabla 1 como un conjunto de cebadores para someter el ARNm de GAPDH humano utilizado de manera adecuada como gen constitutivo a PCR-TR, al igual que una sonda (a3) (SEQ ID NO: 8) mostrada en la Tabla 1 como una sonda de unión específica de secuencia utilizada para detectar productos de amplificación del gen GAPDH humano amplificado por medio de este conjunto de cebadores.
Preferiblemente, las sondas se marcan para facilitar la detección de los productos de amplificación.
Como métodos para marcar una sonda, existen métodos IR y métodos no IR. Es preferible que se utilice un método no IR. Los ejemplos de métodos no IR incluyen métodos de marcaje con fluorescencia, métodos de biotinilación, métodos de quimioluminiscencia y similares. Es preferible que se utilice un método de marcaje con fluorescencia. No existe una limitación particular sobre la sustancia fluorescente mientras la sustancia se pueda unir a un resto base de un ácido nucleico. Se pueden utilizar un colorante de cianina (como Cy3 o Cy5 en la serie Cy DyeTM), un reactivo de rodamina 6G, N-acetoxi-N2-acetilaminofluoreno, un derivado yodado de estos, o similares.
Otro ejemplo del kit es uno que comprende un conjunto de cebadores B que comprende un cebador directo (B1) (SEQ ID NO: 9) y un cebador inverso (B2) (SEQ ID NO: 10) mostrados en la Tabla 2 como un conjunto de cebadores para someter el ARNm de WT1 humano a PCR-TR, al igual que una sonda (B3) (SEQ ID NO: 11) mostrada en la Tabla 2 como una sonda de unión específica de secuencia utilizada para detectar productos de amplificación del gen WT1 humano amplificado con este conjunto de cebadores, y que comprende también un conjunto de cebadores B que comprende un cebador directo (b1) (SEQ ID NO: 6) y un cebador inverso (b2) (SEQ ID NO: 12) mostrados en la Tabla 2 como un conjunto de cebadores para someter el ARNm de GAPDH humano utilizado como gen constitutivo a PCR-TR, al igual que una sonda (b3) (SEQ ID NO: 8) mostrada en la Tabla 2 como una sonda de unión específica de secuencia utilizada para detectar productos de amplificación del gen GAPDH humano amplificado con este conjunto de cebadores.
El kit para PCR-TR de la presente invención puede comprender no solo los componentes anteriores sino también varios componentes necesarios para dos reacciones, es decir, una reacción de transcripción inversa y PCR, (dNTP, sal de Mg, componente amortiguador para ajuste del pH, etc.), y una enzima que tiene actividad de transcripción inversa. El kit puede comprender además un componente para estabilizar una enzima, un inhibidor de ribonucleasa, etc.
Las reacciones se pueden iniciar colocando solo una cantidad requerida de la mezcla de reacción en un recipiente de reacción adecuado y añadiendo una muestra que se va a medir. Por consiguiente, el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano se puede cuantificar de manera conveniente. En particular, es útil para cuantificar el nivel de expresión del ARNm de WT1 humano en múltiples muestras de prueba. Asimismo, la eficacia de la operación se puede mejorar aún más preparando de antemano un recipiente de reacción en el que se dispensa una cantidad requerida de la mezcla de reacción para una vez. Según el método descrito anteriormente, el kit para PCR-TR de la presente invención permite una cuantificación conveniente y rápida del nivel de expresión del ARNm de WT1 humano sin problemas de contaminación cruzada. Los ejemplos del kit incluyen un kit que comprende varios reactivos utilizados para el método, un kit que comprende la mezcla de reacción utilizada en la presente invención, un kit que comprende un recipiente de reacción en el que se dispensa la cantidad de la mezcla de reacción para una vez, y similares. El kit es particularmente útil como kit para varias pruebas, en particular, como kit para diagnóstico clínico. El kit se puede utilizar ampliamente en examen para leucemia, examen para micrometástasis de cáncer sólido, examen para enfermedad mínima residual, examen para enfermedad infecciosa, y similares.
Ejemplos
A continuación se ofrecen ejemplos para ilustrar la presente invención con más detalle.
Ejemplo 1
Medición por medio de PCR-TR de una etapa y multiplex
(1) Diseño de cebadores y sondas
Se seleccionó ARNm de WT1 humano como gen de interés que se va a medir, y se seleccionó ARNm de GAPDH como gen de control endógeno (gen para corrección) para corregir el nivel de expresión del gen que se va a medir. Se diseñaron y sintetizaron conjuntos de cebadores y sondas que permiten amplificación y detección específicas de los genes individuales.
Se prepararon sondas marcadas con fluorescencia para detectar el gen de interés (ARNm de WT1 humano) y el gen para corrección (ARNm de GAPDH) simultáneamente como a continuación. El extremo 5' de la sonda para detectar el gen de interés se marcó con FAM (6-carboxifluoresceína) y el extremo 5' de la sonda para detectar el gen para corrección se marcó con HEX (6-hexaclorofluoresceína). El extremo 3' de la sonda se marcó con ATTO-540Q (ATTO-TEC GmbH) como colorante de desactivación.
La Tabla 3 muestra las secuencias de los cebadores y sondas utilizados en los Ejemplos.
Tabla 3
Figure imgf000009_0001
(2) Preparación de estándares (ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH)
Los estándares se prepararon como sigue. El ARN se extrajo de la línea celular K562 de leucemia que expresa el ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH, y se realizó PCR-TR utilizando el ARN como plantilla y utilizando cebadores complementarios a las secuencias de base del ARNm de WT1 y cebadores complementarios a las secuencias de base del ARNm de GAPDH, obteniendo así la secuencia de base de parte del ARNm de WT1 y la secuencia de base de parte del ARNm de GAPDH. La secuencia del ARNm de WT1 y la secuencia del ARNm de GAPDH así obtenidas se clonaron en un vector plasmídico pT7blue y se transformó en la cepa de E. coli DH5a. Entonces, se cultivó la E. coli transformada y se extrajo el ADN plasmídico. Una secuencia que sigue a una porción en la que la secuencia del ARNm de WT1 y la secuencia del ARNm de GAPDH se insertaron en el ADN plasmídico se escindió con la enzima de restricción EcoRi para obtener ADN lineal. Las secuencias de ARN del ARNm de WT 1 y ARNm de GAPDH se sintetizaron con ARN polimerasa T7, que es una enzima que reconoce la secuencia promotora de T7 en el ADN plasmídico y que sintetiza ARN utilizando ADN como plantilla. El ARN sintetizado se diluyó con un tampón de TE que contenía 50 ng/pL de ARN de transferencia de E. coli para evitar absorción no específica en un recipiente de reacción, preparando así estándares de ARN de los genes (WT1 y GAPDH).
La concentración del estándar del ARN de WT1 así preparado se ajustó a 2,5x101; 2,5x102; 2,5x103; 2,5x104 y 021,57x10 copias/prueba. La concentración del estándar del ARN de GAPDH así preparado se ajustó a 1,0x104; 1,0x105 ; 1,0x106; 1,0x107 y 1,0x108 copias/prueba.
(3) Reacción de PCR-TR
La PCR-TR se realizó por medio de una PCR-TR de una etapa en la que una reacción de transcripción inversa y PCR se llevaron a cabo secuencialmente en un único tubo.
(3-1) Transcriptasa inversa
Se utilizó ADN polimerasa Z05 (enzima termoestable de Z05 de la especie Thermus: Roche Diagnostics).
(3-2) Condiciones de la reacción
(a) Reacción de transcripción inversa y reacción de PCR
Se realizó una reacción de transcripción inversa durante un total de 15 minutos, es decir, 5 minutos a 55 °C, 5 minutos a 60 °C y 5 minutos a 65 °C. Entonces, se realizó PCR en las siguientes condiciones: desnaturalización térmica a 92 °C durante 15 segundos, hibridación a 60 °C durante 40 segundos y se repitió una reacción de extensión de ADN durante 45 ciclos.
(b) Concentración del reactivo
El volumen de la mezcla de reacción fue 20 pL. La concentración de cebadores en la mezcla de reacción fue tal que la concentración final de cebadores directos y la concentración final de cebadores inversos fueron 0,2 pM. La concentración final de sondas fue 0,1 pM.
(3-3) Aparato de reacción/medición
Se realizó PCR-TR utilizando un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 Fast (Life Technologies). (4) Resultados
(4-1) Confirmación de curvas de amplificación de fluorescencia
Se confirmaron curvas de amplificación de fluorescencia y el número de ciclos de amplificación (a) para el estándar de ARN de WT1 cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo, (b) para el estándar de ARN de gAp DH cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo, y (c) para el estándar de ARN de WT1 y para el estándar de ARN de GAPDH cuando ARNm de WT1 y de ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente.
La Figura 1 muestra (a) curvas de amplificación de ARNm de WT1 para varias concentraciones del estándar de ARN de WT1 cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo, la Figura 2 muestra (b) curvas de amplificación de ARNm de GAPDH para varias concentraciones del estándar de ARN de GAPDH cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo, la Figura 3 muestra (c) curvas de amplificación de ARNm de WT1 para varias concentraciones del estándar de ARN de WT1 cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente, y la Figura 4 muestra (d) curvas de amplificación de ARNm de GAPDH para varias concentraciones del estándar de ARN de GAPDH cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente. La Tabla 4 muestra el número de ciclos de amplificación del ARNm de WT1 para varias concentraciones del estándar de ARN de WT1 cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo y cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente. La Tabla 5 muestra el número de ciclos de amplificación del ARNm de GAPDH para varias concentraciones del estándar de ARN de GAPDH cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo y cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente.
Tabla 4
Figure imgf000010_0001
Tabla 5
Figure imgf000011_0001
La Figura 1 muestra curvas de amplificación del ARNm de WT1 cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo. Como se muestra en la Figura 1, fue posible detectar el ARNm de WT1 a de entre 2,5x105 a 2,5x1o1 copias/prueba cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo. Como se muestra en la Figura 3, fue posible detectar el ARNm de WT1 a de entre 2,5x105 a 2,5x101 copias/prueba cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente.
Asimismo, como se muestra en la Tabla 4, la diferencia entre el número de ciclos de amplificación cuando el ARNm de WT1 se amplificó solo (número de ciclos de amplificación: de entre 18,63 a 32,09) y el número de ciclos de amplificación cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente (número de ciclos de amplificación: de entre 18,67 a 31,94) fue tan pequeña como de entre -0,15 a 0,06 y, por lo tanto, no hubo una diferencia significativa en el número de ciclos de amplificación entre amplificación en solitario y amplificación simultánea. De este resultado, se cree que, incluso, cuando el ARNm de WT1, que es un gen de interés, y el gen para corrección se amplifican simultáneamente, se puede detectar ARNm de WT1 en un número comparable de ciclos de amplificación, como es el caso en el que el gen de interés (ARNm de WT1) se amplifica solo.
La Figura 2 muestra curvas de amplificación del ARNm de GAPDH cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo. Como se muestra en la Figura 2, fue posible detectar el ARNm de GAPDH a de entre 1,0x108 a 1,0x104 copias/prueba cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo.
Como se muestra en la Tabla 5, la diferencia entre el número de ciclos de amplificación cuando el ARNm de GAPDH se amplificó solo (de entre 10,18 a 23,68) y el número de ciclos de amplificación cuando ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente (de entre 10,30 a 23,85) fue de entre 0,10 a 0,20, es decir, la diferencia en el número de ciclos de amplificación entre amplificación en solitario y amplificación simultánea no fue muy grande. A partir de este resultado, se cree que, incluso, cuando ARNm de GAPDH, que es un gen para corrección, y ARNm de WT1 que es gen de interés, se amplifican simultáneamente, se puede detectar ARNm de GAPDH en un número comparable de ciclos de amplificación, como es el caso en el que el gen para corrección (ARNm de GAPDH) se amplifica solo.
Ejemplo 2
Prueba de dilución utilizando ARN extraído de K562
En este ejemplo, la sensibilidad de medición se comparó entre PCR-TR de una etapa y multiplex en las que ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente, y PCR-TR de dos etapas en la que una reacción de transcripción inversa y PCR se realizaron individualmente en diferentes recipientes y el ARNm de WT1 y el ARNm de GAPDH se amplificaron por separado. La PCR-TR de dos etapas se realizó utilizando un kit Otsuka para medir ARNm de WT1 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
(1) Secuencias de cebadores y sondas
La Tabla 6 muestra las secuencias de los cebadores y sondas utilizados para medir ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH por medio de PCR-TR de una etapa. Ya que se utilizó un kit de Otsuka para medir ARNm de WT1 en PCR-TR de dos etapas, no se conocían los cebadores y la sonda en la PCR-TR de dos etapas.
Tabla 6
Figure imgf000012_0001
(2) Preparación de los estándares
Se utilizaron estándares de ARN preparados de la misma manera que en el método descrito en el Ejemplo 1 como estándares (ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH) en PCR-TR de una etapa. Se ajustó la concentración del estándar de ARN de WT1 a 2,5x1o1; 2,5x103; 2,5x105 y 2,5x107 copias/prueba. La concentración del estándar de ARN de GAPDH se ajustó a 1,0x103; 1,0x105; 1,0x107 y 1,0x109 copias/prueba. Se utilizaron los estándares incluidos en un kit Otsuka para medir ARNm de WT 1 en PCR-TR de dos etapas.
(3) Muestras de prueba
Se utilizó ARN extraído de la línea celular K562 de leucemia positiva para WT1 como muestras de prueba. Más específicamente, el ARN total extraído de K562 se diluyó con un tampón de TE en concentraciones finales de 2, 5 y 10 pg/pL para evitar la absorción de ácidos nucleicos no específica en un tubo, obteniendo así muestras de prueba. El tampón de TE contenía ARN de transferencia de E. coli como ARN transportador de antemano de modo que la concentración final fue 50 ng/pL.
(4) Reacción de PCR-TR
Se realizó PCR-TR de una etapa de la misma manera que en el Ejemplo 1. La PCR-TR de dos etapas se realizó utilizando un kit Otsuka para medir ARNm de WT1 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) según su prospecto. Se realizó la medición por duplicado para cada muestra de prueba. Se calcularon los resultados de la medición como copia/pgARN, que es el número de ARNm de WT1 por pg del ARN total, según el prospecto del kit Otsuka para medir ARNm de WT1.
(5) Resultados
(5-1) Resultados de la medición de la dilución utilizando ARN extraído de K562
La Tabla 7 muestra los resultados de una prueba de dilución realizada utilizando ARN extraído de K562 como muestras de prueba por medio de PCR-TR de una etapa y PCR-TR de dos etapas.
Tabla 7
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0002
Como se muestra en la tabla 7, en la PCR-TR de una etapa, fue posible medir ARN extraído de K562 incluso cuando se diluyó hasta una concentración de ARN de 2,5 pg/pL. Por el contrario, en la PCR-TR de dos etapas, no se detectó señal de amplificación por medio de PCR cuando se diluyó ARN extraído de K562 hasta una concentración de ARN de 2,5 pg/pL, y los datos de medición duplicados para 5 pg/pL mostraron una discrepancia, es decir, 17,2 y 1,9 copias/pgARN. Por consiguiente, el intervalo medible como un valor eficaz se consideró que era hasta 10 pg/pL. Estos resultados desvelan que la sensibilidad de medición es mejor en PCR-TR de una etapa que en PCR-TR de dos etapas.
Ejemplo 3
Prueba de reactividad cruzada
En este ejemplo, PCR-TR de una etapa en la que ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH se amplificaron simultáneamente se realizó utilizando el conjunto mostrado en la Tabla 8 (conjunto de secuencias B) como cebadores y sondas y también utilizando por separado el conjunto mostrado en la Tabla 9 como cebadores y sondas, y se evaluó la reactividad cruzada.
Tabla 8
Secuencias de cebadores y sondas para amplificar ARNm de WT1 y ARNm de GAPDH (Conjunto de secuencias B)
Figure imgf000013_0001
Un único asterisco indica una región del gen WT1 humano (NM_024426.4: SEQ ID NO: 1).
Los dobles asteriscos indican una región del gen GAPDH humano (NM_002046.3: SEQ ID NO: 2).
Tabla 9
Figure imgf000013_0002
Un único asterisco indica una región del gen WT1 humano (NM_024426.4: SEQ ID NO: 1).
Los dobles asteriscos indican una región del gen GAPDH humano (NM_002046.3: SEQ ID NO: 2).
Como muestras de prueba, se utilizaron 250 ng, 50 ng y 10 ng de ADN del genoma humano (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, N.° cat. 69237) y 250 ng del ARN total extraído de la línea celular K562 de leucemia positiva para WT1 (WT1 K562).
Se realizó PCR-TR de una etapa de la misma manera que en el Ejemplo 1. Además, los productos de amplificación obtenidos al someter ADN del genoma humano y ARNm de WT1 K562 a PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa en las siguientes condiciones para confirmar los productos de amplificación. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa según un método ordinario.
Condiciones de la electroforesis en gel de agarosa
Condiciones de la electroforesis: 15 min, E-gal al 4 %,
Condiciones de foto: Filtro para SYBR,
Fotografiado directamente con un aparato de E-gal
Velocidad del obturador: 1/15
Apertura: 4,5
Condiciones de aplicación: Muestra 2,5 pL dh^O 16,5 pL
Marcador 2,5 pL dhhO 16,5 pL
Resultados
Se sabe que los pseudogenes GAPDH están presentes en el ADN genómico humano. En este Ejemplo, cuando se realiza PCR-TR de una etapa utilizando las secuencias de los cebadores y sondas mostrados en la Tabla 8, no se observó ninguna banda correspondiente a GAPDH en el ADN del genoma humano por medio de electroforesis, como se muestra en las columnas de 1 a 3 de la Figura 5(A). Más específicamente, se confirmó que la PCR-TR de una etapa utilizando los cebadores y sondas de la presente invención permite que GAPDH se distinga claramente de los pseudogenes GAPDH y que no se confundan los pseudogenes GAPDH con GAPDH. Por el contrario, cuando se realizó PCR-TR de una etapa utilizando las secuencias de los cebadores y sondas mostrados en la Tabla 9, se observaron bandas correspondientes a GAPDH por medio de electroforesis, como se muestra en las columnas de 1 a 3 de la Figura 5(B). Esto es, no fue posible distinguir GAPDH de pseudogenes GAPDH en la PCR-TR de una etapa utilizando estos cebadores y sondas.
Como referencia, las Tablas 10 y 11 muestran respectivamente el número de ciclos de amplificación para GAPDH y WT1 cuando se realizó PCR-TR de una etapa utilizando las secuencias de los cebadores y sondas mostrados en la Tabla 8 (Ejemplo) y cuando se realizó PCR-TR de una etapa utilizando las secuencias de los cebadores y sondas mostrados en la Tabla 9 (Ejemplo comparativo). En las tablas, "ND" significa no detectable.
Tabla 10
Figure imgf000014_0001
ND: No detectado
Tabla 11
Figure imgf000014_0002

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano en una muestra de prueba por medio de PCR-TR de una etapa, el método comprende someter simultáneamente el ARNm de WT1 humano y un ARNm de gen constitutivo a reacciones de transcripción inversa y de extensión llevadas a cabo secuencialmente en la muestra de prueba en el mismo recipiente,
en donde un conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del gen constitutivo comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 6 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en los SEQ ID NO: 7 o 12;
en donde el gen constitutivo es ARNm de GAPDH; y
en donde un primer conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del ARNm de WT1 humano comprende lo siguiente (a) o (b):
(a) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 4, o
(b) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 10.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el conjunto de cebadores utilizado para amplificación PCR del gen constitutivo comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 8, estando la sonda marcada; y
en donde el conjunto de cebadores (a) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 5, estando la sonda marcada; o
el conjunto de cebadores (b) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 11, estando la sonda marcada.
3. Un kit para PCR en tiempo real para cuantificar el nivel de expresión de ARNm de WT1 humano, el kit comprende (a) y (c), o (b) y (c) de lo siguiente:
(a) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 3 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 4,
(b) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 10,
(c) un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 6 y un cebador inverso de PCR que consiste en la secuencia de base descrita en los SEQ ID NO: 7 o 12.
4. El kit según la reivindicación 3, en donde si el kit comprende el conjunto de cebadores (a), el conjunto de cebadores (c) comprende el SEQ ID NO: 7; en donde si el kit comprende el conjunto de cebadores (b), el conjunto de cebadores (c) comprende el SEQ ID NO: 12.
5. El kit según las reivindicaciones 3 o 4, en donde el conjunto de cebadores (a) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 5, estando la sonda marcada; el conjunto de cebadores (b) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 11 estando la sonda marcada; y
el conjunto de cebadores (c) comprende además una sonda que consiste en la secuencia de base descrita en el SEQ ID NO: 8, estando la sonda marcada.
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