JP7036259B2

JP7036259B2 - Ｒｎアーゼ阻害剤組成物

Info

Publication number: JP7036259B2
Application number: JP2021050519A
Authority: JP
Inventors: 奈々山越; 哲大小林
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: JP2018139563A; JP2021100965A; JP6984140B2

Description

本発明は、ＲＮアーゼ（以下「ＲＮａｓｅ」という。）阻害剤の凝集を抑制するための組成物に関する。特に、界面活性剤を用いることを特徴とするＲＮａｓｅ阻害剤の凝集を抑制することができる組成物に関する。

ＲＮａｓｅ阻害剤はＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅの阻害剤として、遺伝子検査試薬や研究用試薬（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＴ－ＰＣＲなど）等に含まれる成分として重要であり、広く使用されている（特許文献２）。しかしながら、ＲＮａｓｅ阻害剤は酸化されやすく、ジスルフィド結合を形成しやすい特徴を持つタンパク質である。そのため、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む溶液は、酸化によりジスルフィド結合が形成されやすく、分子内部ジスルフィド結合または外部ジスルフィド結合により凝集が発生し、アクティブサイトがブロックされ活性が低下する可能性がある。あるいは水溶液中の疎水性相互作用や表面張力により凝集が形成される可能性がある。さらには、濃縮や混合等による物理的動作や凍結融解等による濃度勾配の発生により凝集が発生する可能性がある。また、凝集の発生は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤の濃度が高濃度であるほど発生しやすい。試薬の調製や使用する際に凝集物が生じることは、作業上あるいは測定上好ましくなく、また、凝集によりアクティブサイトがブロックされ活性が減少することは、試薬の性能に影響を及ぼすため許容されない（非特許文献１）。

従って、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液においては、凝集を抑制することが重要であるが、従来この凝集物の生成を効果的に防止することのできる組成は知られていなかった。

これまでにタンパク質の凝集を抑制する方法の例として、抗体を含む溶液に界面活性剤を添加することが提案されている（特許文献１）。この方法では限外濾過において界面活性剤を添加することで凝集物の生成や白濁化を抑制し、抗体を含む診断薬や治療剤、特に注射剤に効果を発揮している。このように、水溶液中のタンパク質凝集を抑制することは重要であるが、凝集の発生しやすい水溶液中のＲＮａｓｅの阻害剤が高い場合において、凝集を抑制する方法は知られていなかった。また上述のＲＴ－ＰＣＲのような遺伝子検査等において用いられるＲＮａｓｅ阻害剤の場合においては、反応阻害を引き起こすことなく、ＲＮａｓｅ阻害剤の凝集を効果的に抑制する方法は知られていなかった。

特許第４８１２２２８号公報特許第３３６６５９６号公報

プロメガ株式会社ホームページ；ＲＮａｓｉｎ（登録商標）ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｎａ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ／ｍａｎｕａｌ－ｒｎａ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍｓ／ｒｎａｓｉｎ－ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ－ｒｎａｓｉｎ－ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／？ａｃｔｉｖｅＴａｂ＝０）

本発明は、水溶液中におけるＲＮａｓｅ阻害剤の凝集を効果的に防止可能であり、かつ、ＲＴ－ＰＣＲのような遺伝子検査等において反応阻害を引き起こすことのない組成物の提供を目的とする。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液において、界面活性剤を添加することにより、ＲＴ－ＰＣＲのような遺伝子解析において悪影響を及ぼすことなく、ＲＮａｓｅ阻害剤の凝集を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下のような構成からなる。
項１．ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ）阻害剤を含む水溶液中において界面活性剤を含有せしめることを特徴とするＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項２．水溶液中における前期ＲＮａｓｅ阻害剤の濃度が５～２００Ｕ／μｌである項１に記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項３．水溶液中における前記界面活性剤の濃度が０．００１～１％である項１または２記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項４．水溶液中における前記界面活性剤の濃度が０．０１～０．１％である項３に記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項５．水溶液中に含まれる前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である項１から４のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項６．水溶液中における前記界面活性剤がＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群よりから選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１から４のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項７．水溶液中における前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ－２０、ノニデットＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｂｒｉｇ３５、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１から４のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項８．水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤凝集を抑制するために用いることを特徴とする項１から７のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
項９．項１から８のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物を含んでなることを特徴とするＲＴ－ＰＣＲ反応用キット。

本発明により、ＲＮａｓｅ阻害剤の凝集による作業上の問題や活性の低下を防ぐことができる。ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液を、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液を保管する場合においても凝集を抑制することが可能である。高濃度のＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液では凝集が発生しやすいため、よりその効果を発揮する。また、本発明における及び組成は、遺伝子検査薬や研究用試薬の性能に対して影響を与えることがない点で、非常に有用である。

本発明は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含有する水溶液に界面活性剤を添加することを特徴とするものであり、ＲＮａｓｅ阻害剤の凝集が抑制されたＲＮａｓｅ阻害剤組成物を提供する。

本発明における凝集とは、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液中に目視にて判別される不溶物のことである。凝集の発生要因は特に限定されるものではない。水溶液中に目視される凝集はＲＮａｓｅ阻害剤を保管することで発生するものを含み、混合等による物理的動作によるものも含まれる。具体的には、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液をＭＩＸ－ＲＯＴＡＲＭＲ－５（ＡＳＯＮＥ）を用いて、回転数４０ｒｐｍで６時間撹拌させたときに、水溶液中に目視にて物質が判別される場合における該物質のことである。

本発明におけるＲＮａｓｅ阻害剤としては、特に限定されないが、例えばヒト胎盤由来、ラット肺由来やブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。また、大腸菌等の宿主を用いて発現させた組換え体から取得することが可能である。その方法としては、ＲＮａｓｅ阻害剤遺伝子の単離、プラスミドの構築、宿主への導入および細胞融解と遠心によるＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質単離のステップを含む方法がある。この方法には単離したＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質化学試薬による可溶化、精製のステップが含まれる（特許文献２参照）。

本発明における界面活性剤とは、特に限定されるものではない。界面活性剤の種類としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれであっても良い。具体的には、特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ－２０、ノニデットＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｂｒｉｇ３５、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ、ＢＩＧＣＨＡＰ、ＮＩＫＫＯＬＢＬ－９ＥＸ、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９、ＭＥＧＡ－１０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、Ｔｗｅｅｎ－４０、Ｂｒｉｇ５８、ＮＰ－４０、ＤＤＭ、Ｔｗｅｅｎ－８０、サルコシル、尿素、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ＳｏｒｂｉｔａｎＴｒｉｏｌｅａｔｅ、ＩＧＥＰＡＬＣＡ－６３０、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、サポニン、ｎ－Ｈｅｐｔｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ－Ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ－Ｏｃｔｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ－Ｎｏｎｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ、Ｏｃｔｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２、Ｄｏｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｉｄｅ等が好ましい。より好ましい界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ－２０、ノニデットＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｂｒｉｇ３５、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、及びデオキシコール酸ナトリウム等が例示される。これらの界面活性剤は、単独で用いても良いし、複数種を組み合わせて用いても良い。

本発明におけるＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液中における界面活性剤の濃度は、凝集抑制効果やＲＴ－ＰＣＲ等の反応に用いられる際の影響などの観点を考慮すると、０．００１から１％であることが好ましい。より好ましくは０．００５から０，０５％であり、更に好ましくは０．０１％から０．１％である。

ＲＮａｓｅ阻害剤は、ｃＤＮＡ合成やｉｎｖｉｔｒｏＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ等、ＲＮＡを使用するあらゆる実験におけるＲＮＡの安定化、ＲＮＡプローブの作製やｉｎｖｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ等、ＲＮＡを産生する種々の実験におけるＲＮＡの安定化において広く使用される。

本発明におけるＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤の濃度としては、好ましくは５～２００Ｕ／μｌ、より好ましくは１５～６０Ｕ／μｌ、さらに好ましくは２０～４０Ｕ／μｌであるが、特に限定されない。ここで、１Ｕとは、５ｎｇのＲＮａｓｅの活性を５０％阻害するのに必要なＲＮａｓｅ阻害剤量である。酵素活性の測定方法としては、レート法を用いる。レート法とは目的成分と試薬を反応させて、その反応が進行しているときの速度を単位時間当たりの吸光度変化量として測定し、目的成分を定量する方法である。本発明における測定は、反応温度２５℃で、ｃｙｃｌｉｃ２，３’－ＣＭＰの加水分解をＲＮａｓｅの一つであるＲＮａｓｅを阻害する効率を２８６ｎｍの吸光度変化で測定を行う。

また、ＲＮａｓｅ阻害剤の形状バッファーとしては、例えばＨｅｐｅｓ－ＫＯＨ、Ｈｅｐｅｓ－ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌなどが挙げられる。バッファー終濃度は特に限定されないが、１０ｍＭから１００ｍＭ程度が好ましく、２０ｍＭから５０ｍＭ程度がより好ましい。バッファーのｐＨは４から９程度が好ましく、５から８程度がより好ましい。更には終濃度、１ｍＭから２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭから１００ｍＭのＤＴＴ、３０から７０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ等を含んでも良い。

本発明の別な態様としては、上述したようなＲＮａｓｅ阻害剤を含む逆転写反応用組成物である。更には、上述したようなＲＮａｓｅ阻害剤を含むＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物が挙げられる。これらの組成物を含むＲＴ－ＰＣＲ反応用試薬またはＲＴ－ＰＣＲ反応用キットであってもよい。逆転写反応に必要なものとして、逆転写酵素を存在させる。ＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物を構成するものとしては、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーとなるオリゴヌクレオチド、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、マグネシウムイオン等の金属イオンなどを、実施する核酸増幅方法により、必要に応じて存在させる。

リアルタイムＲＴ－ＰＣＲに用いる場合は、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。また、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例により、特に限定されるものではない。

（実施例１）
界面活性剤の添加検討
（１）ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液の作製
特許文献２に基づき大腸菌を宿主としてＲＮａｓｅ阻害剤を発現させ、精製することによりＲＮａｓｅ阻害剤を取得した。取得したＲＮａｓｅ阻害剤の活性を、レート法を用いて測定し、１、５、２０、４０、２００Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む、以下の組成からなる水溶液を作製した。
２０ｍＭＨｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
５０ｍＭＫＣｌ
８ｍＭＤＴＴ
５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ

（２）界面活性剤の添加
作製した１、５、２０、４０、２００Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液１ｍＬに対して各界面活性剤の終濃度が１～０．００００１％になるように表１に示すように調整した。その後、調製したＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液を１５ｍＬチューブに入れ、ＭＩＸ－ＲＯＴＡＲＭＲ－５（ＡＳＯＮＥ）にて回転数４０ｒｐｍにて６時間撹拌し、目視により凝集の有無を判別した。結果を表２および表３に示す。凝集が見られない場合を○、凝集が見られる場合を×を表記する。

（３）結果
４０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液に界面活性剤を添加した結果を表２、表３に示す。界面活性剤を添加しない場合は凝集が確認されたが、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液に対して界面活性剤を０．００１～１％添加することで凝集が発生しないことが確認できた。同様の結果が、５、２０、２００Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液でも得られた。

表４は凝集有無と水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤濃度と界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ－２０）濃度の関係性を示す。１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液では界面活性剤を添加しない場合でも凝集が確認されない。水溶液中の界面活性剤の濃度が５Ｕ／μｌ以上であると、界面活性剤を含まない場合や濃度が低い場合に凝集が発生した。これらの結果から、水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤の濃度が高いほど凝集が発生しやすいことが示唆され、界面活性剤を添加することで凝集の発生の抑制可能であるといえる。

（実施例２）
界面活性剤の有無がＲＴ－ＰＣＲの反応系に与える影響の確認
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、ＨｅＬａ細胞より精製したＴｏｔａｌＲＮＡを使用した。
（２）ＲＴ－ＰＣＲ反応
界面活性剤の反応系への影響の確認を行うためにＴｗｅｅｎ－２０を０．０１％含む４０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤溶液を実施例１に記載の方法で調整し、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の調整に使用した。反応液中に含まれるＴｗｅｅｎ－２０の終濃度は０．０００２５％となる。
ＲＴ－ＰＣＲは、以下のような組成及びサイクル条件により行った反応系の指標としてＰＣＲの反応効率、相関係数、Ｃｔ値を使用し、β－Ａｃｔｉｎを標的としたＲＴ－ＰＣＲを行った。
ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（東洋紡）１ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡）１ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）１ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡ｒＴｔｈＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭｄＮＴＰｓ（東洋紡）１．０μＬ、
５０μＭ β－ａｃｔｉｎフォアードプライマー（配列番号１）０．３μＬ、
１００μＭ β－ａｃｔｉｎプローブ（配列番号２）０．１μＬ、
５０μＭ β－ａｃｔｉｎリバースプライマー（配列番号３）０．３μＬ、
ＲＮＡ５μＬ、
血液１０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルでＰＣＲ反応を行った。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒４５サイクル
（３）結果
その結果を表５に示す。

Ｔｗｅｅｎ－２０を添加した反応系と、していない反応系を比較した結果、Ｃｔ値、ＰＣＲ効率、相関係数に差は見られなかった。この結果によりＴｗｅｅｎ－２０によるＲＴ－ＰＣＲの阻害は見受けられないと言える。このほかにも、ノニデットＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｂｒｉｇ３５、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムでも同様に実験を実施し、ＲＴ－ＰＣＲの阻害は見受けらなかった。

本発明は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む水溶液を使用または保存する際に水溶液中の凝集を抑制することができ、特に有用である。水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤の濃度が高いほど、凝集は発生しやすい。凝集の発生は作業上好ましくなく、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む試薬の性能に影響を及ぼすため許容されない。本発明は界面活性剤を添加することで凝集を抑制することが可能であり、ＲＴ－ＰＣＲなどＲＮａｓｅ阻害剤を含む実験系において、阻害などの影響を与えないため、産業上も非常に有用である。

Claims

タンパク質からなるＲＮａｓｅ阻害剤を５～２００Ｕ／μｌ濃度で含む水溶液中において、イオン性界面活性剤を０．００１～０．０１％濃度で含有せしめることを特徴とするＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
タンパク質からなるＲＮａｓｅ阻害剤を５～２００Ｕ／μｌ濃度で含む水溶液中において、０．００１～０．０１％のＳＤＳ、０．００１～１％のＣＨＡＰＳ、０．００１～１％のコール酸ナトリウムおよび０．００１～１％のデオキシコール酸ナトリウムからなる群よりから選ばれる少なくとも１種類のイオン性界面活性剤を含有せしめることを特徴とするＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
水溶液中における前記イオン性界面活性剤の濃度が０．００１～０．０１％である請求項２に記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
水溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤の凝集発生が抑制されていることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物。
請求項１～４のいずれかに記載のＲＮａｓｅ阻害剤組成物を含んでなることを特徴とするＲＴ－ＰＣＲ反応用キット。