JP2024510270A - 病原体の等温増幅 - Google Patents

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Abstract

本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列の検出に使用するための方法、組成物、及びキットが含まれる。この方法は、試料を処理し、標的核酸配列の存在を検出するために、溶解剤及び／又は還元剤を含む溶解緩衝液を使用することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、この方法は、増幅剤、及び溶解剤を隔離することが可能な１種又は複数種の保護剤（例えば、シクロデキストリン化合物）を含む試薬組成物を、例えば等温条件下で処理試料と接触させて増幅反応混合物を生成し、検出することを含む。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年３月１９日に出願された米国特許仮出願第６３／１６３，３９９号及び２０２２年２月５日に出願された米国特許仮出願第６３／３０７，０９９号に対する、米国特許法１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。こうした出願の全内容は、ここでそれらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０２２年３月１７日に作成された、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿６８ＥＢ－３１７３０９－ＷＯという名称のファイルとして提供され、サイズは１６．０キロバイトである。配列表の電子形式での情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、核酸を増幅（例えば、等温増幅）するための方法及び組成物に関する。
核酸に基づく診断は、感染症、疾患、及び／又は遺伝的変異の迅速な検出に有用であり得る。例えば、試料中の細菌核酸又はウイルス核酸の識別は、特定のタイプの感染症を診断するのに有用であり得る。他の例としては、疾病管理又は法医学のための一塩基多型の識別、及び遺伝子改変食品であること示す遺伝的変異の識別が挙げられる。多くの場合、核酸に基づく診断アッセイでは、試料中の核酸の特定部分を増幅することが必要である。核酸増幅の一般的な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この技法では、典型的には、変性（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）複合体の鎖の分離）、オリゴヌクレオチドプライマー（相補的なＤＮＡ配列の短い鎖）のアニーリング、及びポリメラーゼによる相補的標的に沿ったプライマーの伸長というステップを進行させるために温度サイクル（つまり、熱サイクル）が必要である。このような熱サイクルは、一般的に特殊な機械を必要とする時間のかかるプロセスであり得る。したがって、熱サイクルをせずに実施することができる、より速い核酸増幅法に対する必要性が存在する。そのような方法は、例えば、オンサイト検査及びポイントオブケア診断に有用であり得る。さらに、生物学的実体（例えば、ウイルス粒子、細菌）を溶解するために使用される溶解剤が、増幅試薬（例えば、ポリメラーゼ）を不活化することを防止し、ヌクレアーゼ（例えば、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ）の有害活性がすべての段階で阻害される、核酸検出の組成物及び方法に対する必要性が存在する。
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するための方法が含まれる。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）生物学的実体を含む試料を溶解緩衝液と接触させて、処理試料を生成するステップであって、溶解緩衝液は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能な１種又は複数種の溶解剤を含み、試料核酸は標的核酸配列を含むことが疑われている、ステップを含む。この方法は、（ｂ）試薬組成物（例えば、乾燥組成物）を処理試料と接触させて、増幅反応混合物を生成するステップであって、試薬組成物は、１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む、ステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｃ）増幅反応混合物中で標的核酸配列を増幅し、それにより核酸増幅産物を生成するステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｄ）核酸増幅産物を検出するステップであって、検出は、試薬組成物を処理試料と接触させた時点から約２０分未満に実施される、ステップを含んでいてもよい。
溶解緩衝液及び／又は試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤を含んでいてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のｐＨは約１．０～約１０．０（例えば、約２．２）である。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、ＥＤＴＡ、及びＥＧＴＡの１種又は複数種を含む。一部の実施形態では、試料核酸は、試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸を含む。試料リボ核酸は、細胞ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。１種又は複数種の増幅試薬は、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、逆転写酵素活性を有する。一部の実施形態では、乾燥組成物と処理試料との接触は、乾燥組成物を処理試料に溶解させることを含む。一部の実施形態では、試薬組成物は、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、第１のプライマー、第２のプライマー、及び逆転写プライマーの１種又は複数種を含む。増幅は等温増幅条件で実施することができる。核酸増幅産物の検出は、リアルタイム検出法の使用を含んでいてもよい。１種又は複数種の還元剤は、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、還元型グルタチオン、システアミン、トリ－ｎ－ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオエリトリオール、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びヒドロキシエチルジスルフィド（ＨＥＤ）の１種又は複数種を含んでいてもよい。
試薬組成物は、凍結乾燥及び／又は加熱乾燥されていてもよい。試薬組成物は、１種又は複数種の添加剤（例えば、アミノ酸、ポリマー、糖、又は糖アルコール）を含んでいてもよい。糖又は糖アルコールは、スクロース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、フィコール、アルブミン、ポリペプチド、コラーゲンペプチド、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。
１種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の増幅試薬のモル比は、約１０：１～約１：１０（例えば、約２：１）であってもよい。１種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の溶解試薬のモル比は、約１０：１～約１：１０（例えば、約２：１）であってもよい。１種又は複数種の添加剤は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント（例えば、非イオン性界面活性剤）、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、１種又は複数種の添加剤は、反応組成物の凍結乾燥及び／又は乾燥ペレットの溶解を支援する。１種又は複数種の添加剤は、試薬組成物（例えば、乾燥ペレットなどの乾燥組成物）中に約０．０１％の濃度の非イオン性デタージェントを含んでいてもよい。一部の実施形態では、乾燥ペレット中に１種又は複数種の添加剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０＋Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００、非イオン性デタージェント）が低濃度（０．０１％など）で存在すると、ＡＰＡ反応再現性が向上する。一部の実施形態では、凍結乾燥ペレット中に非イオン性デタージェントが存在しない場合でさえ、１種又は複数種の保護剤（例えば、ＨＰ－ベータＣＤ）単独によるイオン性デタージェントの中和は十分である。一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤は、式（Ｉ）のシクロデキストリン化合物、又はその塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物を含む。
Figure 2024510270000002
 （式中、
各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり；
各Ｒ1は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、－ＣＮ、－ＣＦ3、－Ｎ3、－ＮＯ2、－ＯＲB、－ＳＲB、－ＳＯＲB、－ＳＯ2ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）－ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）ＮＲAＲB、－ＮＲAＲB、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲB、又は－Ｎ（ＲB）Ｃ（Ｏ）ＲBであり；これらの各々は置換されていてもよく；
各ＲAは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
各ＲBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり；
各ｍは、独立して、０、１、２、３、４、又は５である。）
一部の実施形態では、各Ｒは、独立して、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBである。一部の実施形態では、ｎは、１、２、又は３である。一部の実施形態では、各Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、又はオクチルであり；各々は直鎖又は分枝鎖である。一部の実施形態では、シクロデキストリン化合物は、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２ＨＰβＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、若しくはγ－シクロデキストリン、又はそれらの塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物である。一部の実施形態では、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリンは、ＨＰβＣＤよりも、より小型の阻害剤に対してより効果的である。
１種又は複数種の溶解試薬は、処理試料の約０．００１％（質量／容積）～約１．０％（質量／容積）、例えば、処理試料の約０．２％（質量／容積）を構成してもよい。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤は、デタージェントを含む。一部の実施形態では、デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種又は複数種を含む。アニオン性界面活性剤は、本明細書で開示のアニオン性界面活性剤のいずれか１種又は複数種であってもよい。一部の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、対イオンとしてＮＨ4 +、Ｋ+、Ｎａ+、又はＬｉ+を含む。カチオン性界面活性剤は、本明細書で開示のカチオン性界面活性剤のいずれか１種又は複数種であってもよい。一部の実施形態では、カチオン性界面活性剤は、対イオンとしてＩ-、Ｂｒ-、又はＣｌ-を含む。
試料核酸は、標的核酸配列を含む核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的核酸配列は、互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含む。一部の実施形態では、標的核酸配列の増幅は、互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅することを含み、増幅は、標的核酸配列を含む核酸を、ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有し、それにより核酸増幅産物を生成する酵素であって、核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であって、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含む、酵素と接触させることを含む。一部の実施形態では、増幅は、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素の使用を含まず、増幅は、核酸の熱変性及び／又は酵素変性を含まない。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｃ）の前又はステップ中に、核酸を一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と接触させることを含まない。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、逆転写反応の産物である。一部の実施形態では、核酸は、試料リボ核酸から生成される逆転写反応の産物である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、逆転写反応により核酸を生成することを含む。一部の実施形態では、この方法は、試料核酸の熱変性も酵素変性も含まない。
一部の実施形態では、試料核酸は、試料リボ核酸を含み、この方法は、試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させて、ｃＤＮＡを生成することを含む。一部の実施形態では、標的核酸配列の増幅は、（ｃ１）試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させて、ｃＤＮＡを生成するステップ；（ｃ２）ｃＤＮＡを、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成するステップであって、ｄｓＤＮＡは標的核酸配列を含み、標的核酸配列は、互いに相補的である第１の鎖及び第２の鎖を含む、ステップ；（ｃ３）標的核酸配列を等温増幅条件下で増幅するステップを含む。一部の実施形態では、増幅は、ｄｓＤＮＡを、（ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びに（ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有し、それにより核酸増幅産物を生成する酵素であって、核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であって、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含む、酵素と接触させることを含む。一部の実施形態では、この方法は、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素の使用を含まない。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、試料中の、標的核酸配列を含むｄｓＤＮＡ及び／又は核酸の量を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％同一であるか又は少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリメラーゼである。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、エキソヌクレアーゼ活性が低いか又は全くない。標的核酸配列の増幅は、約摂氏５５度（「℃」）～約７５℃、例えば約６５℃の一定の温度で実施することができる。
第１のプライマー、第２のプライマー、又はその両方は、約８～１７塩基長であってもよい。一部の実施形態では、第１のプライマー、第２のプライマー、又はその両方は、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、又はそれらの組合せの１種又は複数種を含む。核酸増幅産物は、約２０～４０塩基長であってもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的核酸配列の一部を含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は１～１０塩基長である。
一部の実施形態では、この方法は、核酸増幅産物を、増幅産物にハイブリダイズすることが可能なシグナル発生オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、シグナル発生オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、又はその両方を含む。一部の実施形態では、核酸増幅産物の検出は、蛍光シグナルを検出することを含む。一部の実施形態では、蛍光シグナルは、分子ビーコンからのものである。一部の実施形態では、この方法は、単一の反応ベッセル内で実施される。一部の実施形態では、試料リボ核酸を、逆転写酵素及び超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と同時に接触させる。一部の実施形態では、試料リボ核酸を、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、並びに第１の及び第２のプライマーと同時に接触させる。一部の実施形態では、試料リボ核酸を、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、第１のプライマー、第２のプライマー、及び逆転写プライマーと同時に接触させる。
一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤は、１種又は複数種の増幅試薬を変性させることが可能であり、１種又は複数種の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である。一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤を隔離（sequester）し、それにより１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤の約９０％よりも多くが、１種又は複数種の保護剤により隔離される。一部の実施形態では、１種又は複数種の増幅試薬の約１０％未満が、１種又は複数種の溶解剤により変性される。
一部の実施形態では、試料は、複数のヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）を含む。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤は、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）を変性させて、変性ヌクレアーゼ（例えば、変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ）を生成することが可能であり、１種又は複数種の還元剤は、ヌクレアーゼを還元して、還元型ヌクレアーゼ（例えば、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ）を生成することが可能であり、１種又は複数種の還元剤及び１種又は複数種の溶解剤は、還元型変性ヌクレアーゼ（例えば、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性リボヌクレアーゼ）を生成することが可能である。一部の実施形態では、変性リボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は１種若しくは複数の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元し、それにより復元リボヌクレアーゼを生成することが可能である。一部の実施形態では、変性デオキシリボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性デオキシリボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は１種又は複数種の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元し、それにより復元デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能である。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤の隔離は、１種又は複数種の溶解剤と、変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ、及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼとの物理的相互作用を低減する。一部の実施形態では、変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ、及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは酵素的に不活性であり、復元リボヌクレアーゼ及び／又は復元デオキシリボヌクレアーゼは酵素的に活性である。一部の実施形態では、還元型変性リボヌクレアーゼは、変性リボヌクレアーゼよりも少なくとも約１．１倍ゆっくりと復元する。一部の実施形態では、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼは、変性デオキシリボヌクレアーゼよりも少なくとも約１．１倍ゆっくりと復元する。一部の実施形態では、溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、約１．１倍多くの試料リボ核酸が、ｃＤＮＡを生成するための鋳型として逆転写酵素により使用される。一部の実施形態では、溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、約１．１倍多くの試料デオキシリボ核酸が、核酸増幅産物を生成するための鋳型として超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素により使用される。一部の実施形態では、増幅反応混合物は、溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）の１０分後に少なくとも１．１倍低いヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）活性を含む。
生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、ウイルス粒子、エキソソーム、プロトプラスト、及び微小胞（microvesicle）の１種又は複数種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、生物学的実体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物（protozoa）、それらの一部、又はそれらのあらゆる組合せを含む。一部の実施形態では、標的核酸配列は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物の核酸配列である。一部の実施形態では、試料核酸は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物に由来する。ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペス、ヘルペスウイルス６、ヘルペスウイルス７、エプスタインバーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザ、ロタウイルス、ヒトアデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトエンテロウイルス、生殖器ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、及びハンタウイルスの１種又は複数種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細菌は、マイコバクテリア・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、エールリッヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ・ドゥモフィ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｄｕｍｏｆｆｉｉ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、エーリキア種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の１種又は複数種を含む。一部の実施形態では、真菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、及びトリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）の１種又は複数種を含む。一部の実施形態では、原生動物は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、シクロスポラ種（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、及びエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐ．）の１種又は複数種を含む。一部の実施形態では、増幅ステップは、２種又はそれよりも多くの標的核酸配列のマルチプレックス増幅を含み、検出ステップは、前記２種又はそれよりも多くの標的核酸配列に由来する２種又はそれよりも多くの核酸増幅産物のマルチプレックス検出を含む。一部の実施形態では、２種又はそれよりも多くの標的核酸配列は、２種又はそれよりも多くの異なる生物に特異的である。一部の実施形態では、２種又はそれよりも多くの異なる生物は、クラミジア・トラコマティス、ナイセリア・ゴノレア、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及び／又はＣ型インフルエンザの１種又は複数種を含む。
一部の実施形態では、増幅は、以下のもの：ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ラミフィケーション（ＲＡＭ、Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、シグナル媒介性ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ、ｓｉｇｎａｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノム指数関数的増幅反応（ＧＥＡＲ、ｇｅｎｏｍｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、及び等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）の１種又は複数種を含み、及び／又は含まない。一部の実施形態では、増幅はＬＡＭＰを含まない。一部の実施形態では、この方法は、以下の１種又は複数種を含まない：（ｉ）処理試料を希釈すること；（ｉｉ）増幅反応混合物を希釈すること；（ｉｉｉ）処理試料を熱変性させること；（ｉｖ）処理試料を超音波処理すること；（ｖ）増幅反応混合物を超音波処理すること；（ｖｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤及び／又はデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤を処理試料に添加すること；（ｖｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤及び／又はデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤を増幅反応混合物に添加すること；（ｖｉｉｉ）試料を精製すること；（ｉｘ）試料核酸を精製すること；（ｘ）核酸増幅産物を精製すること；（ｘｉ）処理試料又は増幅反応混合物から１種又は複数種の溶解剤を除去すること；（ｘｉｉ）増幅前及び／又は増幅中に試料核酸を熱変性及び／又は酵素変性させること；並びに（ｘｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨを処理試料又は増幅反応混合物に添加すること。一部の実施形態では、試料は、増幅温度（例えば、６７℃）に保持される。一部の実施形態では、試料は、ＲＮＡ試料の逆転写反応を促進するために、増幅反応前に室温と反応温度との間の温度で１～２分間保持される。
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するためのキットが含まれる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）１種又は複数種の溶解剤を含む溶解緩衝液であって、１種又は複数種の溶解剤は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能であり、試料核酸は標的核酸配列を含むことが疑われている、溶解緩衝液；並びに（ｂ）１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む試薬組成物（例えば、乾燥組成物）であって、１種又は複数種の増幅試薬は、等温増幅条件下で標的核酸配列を増幅するための１種又は複数種の成分を含む、試薬組成物を含む。一部の実施形態では、前記成分は、（ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びに（ｉｉ）核酸増幅産物を生成することが可能な超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液及び／又は試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤を含む。１種又は複数種の還元剤は、２－メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ＤＴＥ、還元型グルタチオン、システアミン、ＴＢＰ、ジチオエリトリオール、ＴＨＰＰ、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ＤＴＢＡ、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びＨＥＤの１種又は複数種を含んでいてもよい。
キットは、核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１種の成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、リアルタイム検出活性は、分子ビーコンにより提供される。一部の実施形態では、試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーを含む。超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％同一又は少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリメラーゼである。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、約２０～４０塩基長であり、核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体及び（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であって、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含む。
１種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の増幅試薬のモル比は、約１０：１～約１：１０、例えば約２：１であってもよい。一部の実施形態では、１種又は複数種の添加剤は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント（例えば、非イオン性界面活性剤）、又はそれらのあらゆる組合せを含む。一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤は、式（Ｉ）のシクロデキストリン化合物を含む。一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤を隔離し、それにより１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解試薬は、処理試料の約０．００１％（質量／容積）～約１．０％（質量／容積）、例えば、処理試料の約０．２％（質量／容積）を構成する。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤は、デタージェントを含む。デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。
本明細書で提供される等温増幅反応の非限定的で例示的な概略図を示す図である。 ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）ＤＮＡ増幅に対するアニオン性デタージェントＳＤＳ及びＨＰ－βＣＤの効果に関するデータを図示する図である。保護剤を用いないアッセイ（図２Ａ）又は４％ＨＰ－βＣＤを用いたアッセイ（図２Ｂ）が示されている。 クラミジア・トラコマティスＤＮＡ増幅に対するカチオン性デタージェントＣＴＡＢの効果に関するデータを図示する図である。 クラミジア・トラコマティスの溶解に関するデータを図示する図である。 Ｂ型インフルエンザウイルス検出に対するヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）保護の効果に関するデータを図示する図である。 添加順序アッセイに関するデータを図示する図である。 種々の温度におけるＣＴＡＢの存在下でのＲＮａｓｅＡ不活化の不可逆性に対するＤＴＴの効果に関するデータを図示する図である。 ＲＮａｓｅＡ不活化に対するＤＴＴ及びＨＰ－βＣＤの効果に関するデータを図示する図である。 不可逆的ＲＮａｓｅ不活化の要件に関するデータを図示する図である。 鼻腔スワブリボヌクレアーゼからのＲＮＡの保護に関するデータを図示する図である。 保護の度合いを評価するためのアッセイ較正に関するデータを図示する図である。 βＣＤを用いない（図１１Ａ）及びβＣＤを用いた（図１１Ｂ）５８°におけるＲＮａｓｅＡ活性に関するデータを図示する図である。 ＥＬＢ（溶出／溶解緩衝液）中でのＤＴＴを用いたＢ型インフルエンザアッセイにおけるＲＮａｓｅＡ不活化に関するデータを図示する図である。 鼻腔リボヌクレアーゼ不活化の迅速な不可逆性に関するデータを図示する図である。 臨床マトリックスの存在下及び非存在下での等温Ｂ型インフルエンザウイルス検出のための直接溶解に関するデータを図示する図である。
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照される。図面では、状況が別様に指示しない限り、類似の記号は典型的には類似の成分を識別する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載の例示的な実施形態は、限定を意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、他の変更をなすことができる。本明細書で一般的に説明され、図に例示されている本開示の態様は、幅広く様々な異なる構成で配置、置換、組合せ、分離、及び設計することができ、それらのすべては、本明細書において明示的に企図されており、本明細書の開示の一部をなすことが容易に理解されるだろう。
本明細書で参照されているすべての特許、公開特許出願、他の出版物、及びＧｅｎＢａｎｋの配列、及び他のデータベースは、関連技術に関してそれらの全体が参照により組み込まれる。
別様の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照。本開示の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するための方法が含まれる。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）生物学的実体を含む試料を溶解緩衝液と接触させて、処理試料を生成するステップであって、溶解緩衝液は、１種又は複数種の溶解剤を含み、１種又は複数種の溶解剤は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能であり、試料核酸は、標的核酸配列を含むことが疑われている、ステップを含む。この方法は、（ｂ）試薬組成物（例えば、乾燥組成物）を処理試料と接触させて、増幅反応混合物を生成するステップであって、試薬組成物は、１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む、ステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｃ）増幅反応混合物中で標的核酸配列を増幅し、それにより核酸増幅産物を生成するステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｄ）核酸増幅産物を検出するステップであって、検出は、試薬組成物を処理試料と接触させた時点から約２０分、約１５分、約１０分、約５分、又は約２．５分未満に実施される、ステップを含んでいてもよい。
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するためのキットが含まれる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）１種又は複数種の溶解剤を含む溶解緩衝液であって、１種又は複数種の溶解剤は、生物学的実体を溶解して、それらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能であり、試料核酸は標的核酸配列を含むことが疑われている、溶解緩衝液；及び（ｂ）１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む試薬組成物（例えば、乾燥組成物）であって、１種又は複数種の増幅試薬は、等温増幅条件下で標的核酸配列を増幅するための１種又は複数種の成分を含む、試薬組成物を含む。一部の実施形態では、前記成分は、（ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びに（ｉｉ）核酸増幅産物を生成することが可能な超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含む。溶解緩衝液及び／又は試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤（２－メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ＤＴＥ、還元型グルタチオン、システアミン、ＴＢＰ、ジチオエリトリオール、ＴＨＰＰ、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ＤＴＢＡ、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びＨＥＤの１種又は複数種を含むが、これらに限定されない）を含んでいてもよい。
本明細書では、核酸を増幅するための方法及び組成物が提供される。従来の核酸増幅法は、典型的には、熱サイクルプロセス、核酸変性、鎖解巻、鎖分離、及び／若しくは鎖交換を促進するタンパク質（例えば、酵素）（例えば、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ）、並びに／又はエンドヌクレアーゼ剤（例えば、制限酵素、ニッキング酵素）を必要とし、最低でも２０～３０分間の反応時間を必要とすることが多い。本明細書で提供される核酸増幅法は、熱サイクルをせずに、試料核酸の熱変性及び／又は酵素変性をせずに、鎖解巻、鎖分離、及び／又は鎖交換を促進するタンパク質（例えば、酵素）を添加せずに、エンドヌクレアーゼ剤を用いずに、並びに約１０～１５分以内の反応時間で実施することができる。
核酸増幅の方法
本明細書で提供されるものには、試料に由来する核酸を、例えば、イオン性デタージェントに基づく溶解溶液中で増幅（例えば、等温増幅）するための方法及び組成物が含まれる。一部の実施形態では、この方法は、試料中の生物学的実体（例えば、病原体）の溶解、その直後の等温増幅、及び放出されたＲＮＡ標的配列のリアルタイム検出を含む。一部の実施形態では、こうした方法には、臨床試料及び生理学的試料におけるヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）の不活化並びにＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分解の防止を示すという利点がある。いかなる精製ステップ又は分離ステップも用いずに、等温核酸増幅及びリアルタイム検出の前に臨床試料中のウイルス病原体及び細菌病原体を直接溶解するための方法及び組成物も本明細書で提供される。本明細書では、一部の実施形態では、ヌクレアーゼを不活化する溶解剤を使用して、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）を含む臨床試料中のウイルス粒子又は細菌細胞を化学的に溶解する第１のステップと、それに続いて、化学剤が酵素活性に有利なその後の反応条件下でヌクレアーゼの再活性化を防止ことができる第２のステップとで構成される２段階法が開示される。一部の実施形態では、本明細書で提供される２段階法は、試料精製及び／又は核酸単離／精製を含まない。本明細書では、溶解剤及び還元剤が両方とも溶解緩衝液中に存在する場合、化学的溶解及びヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）不活化が同時に行われることを含む１段階法も提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は２段階法である。
本明細書で提供されるものには、古細菌ポリメラーゼを使用する等温増幅及び核酸のリアルタイム検出を可能にする、臨床試料中での直接病原体溶解のための方法及び組成物が含まれる。試料精製を必要としない迅速なポイントオブケア（ＰＯＣ）診断を開発することができる。ウイルス粒子、細菌細胞、又は他の病原体は、それらのＤＮＡ及びＲＮＡが細胞から放出され、増幅反応に利用可能になり得るように溶解する必要が依然としてある。従来の化学的溶解法（例えば、強塩基、イオン性デタージェント、及びカオトロピック剤を使用する）は、ＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素も不活化することになるため、酵素機能と適合性がない。したがって、酵素機能と適合性であり、溶解試薬を除去するための核酸精製ステップを一切必要としない、効果的な化学的溶解法には著しい価値がある。
一部の実施形態では、病原体を含む臨床試料を、デタージェント（例えば、強力なイオン性デタージェント）を含む溶解緩衝液に添加して、生物学的実体（例えば、標的病原体）を溶解して核酸を放出させる。溶解溶液を、凍結乾燥増幅試薬、及び溶解緩衝液に使用されている化学デタージェントを効果的に中和する、イオン性デタージェントに対する保護剤を含む反応へと直接移すことができ、それにより中間精製又は分離ステップを用いずに反応を進行させることが可能である。本明細書で提供される方法及び組成物は、有利なことには、患者試料での直接的で迅速な標的増幅反応を可能にする（本明細書で使用される場合、「直接」という用語は、標的生物の保護被膜を解体するように設計されたイオン性デタージェントに基づく溶解溶液への送達後に、核酸の精製又は試料の希釈を行わないことを意味することができる）。次いで、この溶液を使用して、乾燥反応試薬を溶解することができる。溶解性イオン性デタージェントは増幅化学と非適合性であるため、その化学を達成するための乾燥試薬は、イオン性デタージェントを隔離して、そうでなければ反応化学における酵素との有害相互作用であると考えられるものを防止するシクロデキストリンを含んでいてもよい。イオン性デタージェントは酵素が非常に短時間曝露されただけでも酵素を不活化するのに十分であると考えられるため、本明細書で提供される試薬及び乾燥条件は、溶解溶液が乾燥試薬に送達されると、シクロデキストリンが酵素よりも迅速に溶解し、及び／又は酵素を保護するのに十分に迅速に機能するものであってもよい。ＰＣＲ及びＲＴ－ＰＣＲアッセイなどの核酸増幅法では、理論上の検出限界は１反応あたり１ゲノムコピーであるが、臨床試料中に阻害剤が存在すると、核酸増幅のための酵素の機能が制限される可能性がある。したがって、臨床試料中の病原体の分子検出の場合、現在利用可能な方法は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）増幅のための精製ステップ又は分離ステップを含むことが多い。イオン性デタージェントは、細菌細胞溶解及びＲＮＡ又はＤＮＡ抽出に一般的に使用されている。イオン性デタージェントは、Ｔａｑポリメラーゼが使用されるＰＣＲなどの増幅法に対して強力な変性効果及び阻害作用を示すため、分離ステップ又は精製ステップを用いずにイオン性デタージェントを病原体溶解に使用することはできない。他の方法とは対照的に、本開示の組成物及び方法は、イオン性デタージェントを使用した臨床試料中の病原体の直接溶解を提供し、精製ステップ又は分離ステップを用いずに、放出された核酸の等温増幅及びリアルタイム検出を可能にし、それによりアッセイ時間及び複雑さ並びに夾雑リスクを低減する。
本明細書で開示の組成物及び方法は、患者呼吸器試料中のインフルエンザ又はコロナウイルスのようなＲＮＡウイルスの迅速なポイントオブケア等温標的増幅／検出のための系を開発する際に遭遇する一連の障害を克服することができる。最も効果的なウイルス溶解法として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの強力なイオン性デタージェントを原理実証実験のために選択した。ＳＤＳは、試料中に通常存在する様々な有害な酵素を阻害することができる。直接試験では、有害な酵素を阻害することができる同じ溶解剤が、増幅／検出反応を達成するために必要な酵素も阻害する可能性がある。この障害を克服するために、放出されたリボ核酸をその後に増幅するための酵素を含んでいた凍結乾燥反応混合物にシクロデキストリン化合物を含めることによりＳＤＳを隔離した。しかしながら、次いで、この隔離は、試料に由来する有害なリボヌクレアーゼ酵素活性の急速な再活性化も可能にすることが見出された。この再活性化障害を克服するために、溶解ステップ中に還元剤を含めることができる。したがって、有害なリボヌクレアーゼ活性を迅速に及び不可逆的に不活化することができ、増幅にそのまま使えるインタクトなリボ核酸が分離又は精製を必要とせずにもたらされる。より正確には、ＲＮＡウイルスを含む患者の呼吸器試料には、遍在性リボヌクレアーゼが必然的に含まれている可能性がある。こうしたウイルスＲＮＡの迅速な分子古細菌ポリメラーゼ増幅（ＡＰＡ）試験の意図されている手順中に、標的ＲＮＡがこうしたリボヌクレアーゼによる破壊を受け易いと考えられる２つのステップが存在する可能性がある。第１の溶解ステップは、その保護被膜からウイルスＲＮＡを放出させてライセートを産生するように設計されている溶解剤を含む溶解緩衝液に試料を送達した後に生じる。したがって、放出されたＲＮＡは、リボヌクレアーゼ活性からもはや保護されなくなるだろう。第２の反応ステップは、このライセートに乾燥ＡＰＡ試薬を直接溶解することにより開始させることができ、試料リボヌクレアーゼに対するＲＮＡの感受性は継続したままである。ＲＮＡ破壊のリスクは、ＡＰＡプロセス又はあらゆる等温プロセスによるＤＮＡコピーの増幅及び検出の前段階として、含まれている酵素逆転写酵素がＲＮＡ標的セグメントのＤＮＡコピーを完了するまで持続する可能性がある。ＳＤＳ及び／又はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのイオン性デタージェントは、本明細書で提供される方法及び組成物において溶解剤として使用することができ、効率的な溶解を可能にし、変性によりリボヌクレアーゼを阻害することもでき、したがって溶解ステップ中に標的ＲＮＡを保護することができる。しかしながら、分離又は核酸精製をせずに乾燥反応ミックスを溶解試料に直接溶解することにより開始されるその後の直接的で迅速な分子試験反応では、ＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）は、反応に必要な酵素である逆転写酵素及びポリメラーゼも変性させることになるため、迅速に除去することが必要とされる可能性がある。しかしながら、リボヌクレアーゼの変性に使用される一部の作用剤を除去すると、リボヌクレアーゼの再活性化、つまりその酵素活性の回復を可能にする可能性がある。本明細書に開示のように、乾燥反応ミックス中にシクロデキストリンを含めることにより、ＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）の迅速な除去を可能にすることができる。実際、この迅速な除去は、一部の変性タンパク質のリフォールディングも加速させる可能性がある。本明細書に開示のように、シクロデキストリンの存在下ではリボヌクレアーゼの再活性化が非常に迅速であり、標的ＲＮＡを未保護のままにしたことが実際に示された。一部の変性剤によるリボヌクレアーゼ変性中に還元剤を添加すると、変性剤及び還元剤を比較的ゆっくりと通常は数時間かけて除去した後の再活性化を遅延させることができる。本明細書に記載のように、ＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）と組み合わせた溶解ステップ中の還元剤の添加は、短時間の溶解ステップ後のシクロデキストリンによるＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）の迅速な除去のため、リボヌクレアーゼリフォールディングが加速される可能性が高いにも関わらず、リボヌクレアーゼ不活化を、即座に、酵素媒介性分子検出を可能にするのに十分な程度に不可逆的なものにした。還元剤は、酵素検出と適合性であり得るため、一部の実施形態では除去する必要がない。
本明細書で提供される方法及び組成物は、現在利用可能な核酸検出法及び組成物、例えば、米国特許第５７０５３４５号、第５４２２２４１号、第６７７７２１０号、及び第６２０４３７５号；米国特許出願公開第２０１７０１５２５４６号及び第２０１４０３２２７６１号、Anfinsen, Christian B., et al. (Proc Natl Acad Sci USA 47.9 (1961):1309)、Anand (IJC 2013)、及びYamaguchi, Hiroshi (Biomolecules 4.1 (2014): 235-251)に記載されているものよりも、種々の予想外の利点を提供する。
例えば、現在利用可能な方法では、シクロデキストリンを使用して、イオン性デタージェント含有溶解溶液を中和し、その後の湿式反応での（乾燥試薬を用いない）増幅を可能にする。こうした利用可能な方法では、シクロデキストリンをデタージェントライセートに添加することが必要であるが、これは本明細書に開示のようなポイントオブケア分子診断とは相容れない余分なステップである。本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、酵素よりも先にＣＤを溶解させることができる条件下で、ＣＤを含む乾燥試薬にライセートを添加する。対照的に、現在利用可能な方法では、０．５％ＳＤＳのデタージェントの中和後、増幅反応混合物での希釈を使用してＳＤＳを最終的に０．０５％にする（つまり、増幅反応物で希釈する。これはポイントオブケアと相容れない）。本明細書で提供される場合、中和及び増幅は、同じ溶液中にて０．２％ＳＤＳで生じさせることができる。また、現在利用可能な方法は、ＦＴＥ紙などの固体支持体に核酸を固定化し、溶解試薬を固体マトリックスに埋め込むことを含む。しかしながら、試料タイプを、溶解させ易いヒト血液へと拡張することができるとしても、そのような方法では、溶解させ難い病原体の効率的な溶解も増幅も提供されない。したがって、こうした現在利用可能な方法は、臨床試料での使用が制限を受けており、また、本明細書に開示のものとは大幅に異なる。さらに、現在利用可能な方法では、逆転写酵素によるＲＮＡ標的に関して、ＳＤＳ又はＳＤＳ＋シクロデキストリンを用いずに等価な性能を達成することができない。
現在利用可能な組成物及び方法は（例えば、リボヌクレアーゼ不活化のための）、本明細書で企図されている応用の状況では不十分であることが示されている。例えば、現在利用可能な組成物及び方法は、不活化後にのみ有効性を示し、不活化中（例えば、この状況では、それぞれ反応ステップ中及び溶解ステップ中）には有効性を示さない。さらに、現在利用可能な方法では、不可逆性のためには６０℃で少なくとも４分間が必要であるが、本明細書で提供される組成物及び方法では、６８℃で事実上即座に不可逆的な不活化を可能にすることができ、より迅速な溶解ステップが可能になる。これは、ポイントオブケア応用に不可欠な要素である。例えば、Myhrvold et al (Science. 2018 April 27;360(6387):444-448)には、多段階の煩雑で許容できないほど遅い従来技術の方法によるＲＮａｓｅの不活化が開示されており、本明細書で提供される組成物（例えば、溶解緩衝液、保護剤）及び方法は開示されていない。加えて、現在利用可能な方法では、残留リボヌクレアーゼ活性を評価するために、感度が未知の非較正方法が使用されるが、本明細書で提供される場合、不活化後のリボヌクレアーゼ活性の評価では、意図されている分子診断試験が有効性試験として使用される。さらに、現在利用可能な方法では、最大２００ｎｇ／ｍｌにて不可逆的なリボヌクレアーゼ不活化を達成することができるに過ぎないが、本明細書で提供される組成物及び方法は、患者試料中の潜在的により大きな量に対応するために１０μｇ／ｍｌにおいて有用性を示した。さらに、現在利用可能な方法では、リボヌクレアーゼ不活化後に有効性を示し、不活化中には示さないようすることが試みられている。加えて、現在利用可能な方法は、純粋なＲＮＡ及びリボヌクレアーゼを変性剤の添加前に意図的に混合してインキュベートし、未消化のＲＮＡ及びリボヌクレアーゼを沈殿により精製することになる試薬で処理することを含む追加の抽出、分離、又は精製ステップを有する分析応用向けに設計されているが、リボヌクレアーゼ活性の回復に対する効果は未解明であり、このプロセスは迅速なポイントオブケア応用には非適合性である。変性剤尿素及び還元剤の存在下で長時間変性させ、次いで両方を比較的ゆっくりと除去した後でリボヌクレアーゼの遅延再活性化を示す現在利用可能な方法とは異なり、本明細書では、変性イオン性デタージェントのみを迅速に除去することにより迅速な復元を達成した場合、リボヌクレアーゼ再活性化の適切な防止に対して、同様ではあるが迅速で即時的な効果を達成する条件が提供される。さらに、シクロデキストリンは、種々のタンパク質のリフォールディングに影響を及ぼすが、それらの再活性化には必ずしも影響を及ぼすわけではないという現在の仮説は、リボヌクレアーゼには適用されていない。さらに、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）のシクロデキストリン処理後の復元及び再活性化に関与する時間スケールが、研究されたモデルタンパク質と同じアンフォールディング及びリフォールディング経路に従うか否かは、現時点では不明である。さらに、現在利用可能な方法では、イオン性デタージェントの除去後にプロセスが次の酵素ステップに進むことができるように、リボヌクレアーゼ阻害剤を含めることが企図されている（不活化中に還元剤を含めるのではなく）。
現在利用可能な方法では、還元剤によるリボヌクレアーゼ不活化の直後に核酸精製を行わずに、リボヌクレアーゼを含む試料中のＲＮＡを効果的に逆転写することが企図されているが、本明細書に記載の迅速分子診断に必要な、アニオン性デタージェントＳＤＳ又はカチオン性デタージェントＣＴＡＢなどの過酷な化学的ウイルス溶解試薬を含めることを可能にするように設計されたものは存在しなかった。予想外のことであったが、本明細書に示されているように、変性剤及び還元剤によるリボヌクレアーゼの不活化が本質的に瞬時に起こり、本明細書で企図される応用に必要とされる程度に迅速に、その直後の逆転写が可能になった。
予想外なことであったが、本明細書に記載のように、迅速分子試験に必要な条件下でのリボヌクレアーゼ不可逆性操作には、デタージェントの選択的迅速除去がその後に続く場合、還元剤に加えてイオン性デタージェントが必要だった。Bender et al (J Mol Diagn. 2020 Aug;22(8):1030-1040)には、長時間のインキュベーション、プロテイナーゼＫ、及び／又は高いインキュベーション温度を含む方法を使用する内在性リボヌクレアーゼの不活化が開示されているが、こうした条件は、有利なことには、本明細書で提供される方法及び組成物により回避される。本明細書で提供される方法及び組成物は、現在利用可能な方法における種々の問題を克服して、患者試料における実際的で直接的な迅速分子ＲＮＡ試験を達成する。具体的には、本明細書で提供される溶解剤は、溶解ステップ中にヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）も不活化する、ＳＤＳ又はＣＴＡＢなどのイオン性デタージェントであってもよい。第２の成分であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はシステインなどの還元剤を含めることにより、反応ステップ中にシクロデキストリンによりデタージェントを除去すると、少なくともウイルスＲＮＡのＤＮＡコピーが産生されるまでの十分な時間、リボヌクレアーゼ再活性化を確実に防止することができる。本明細書に開示のように、リボヌクレアーゼ不活化の不可逆性操作は、６８℃での溶解中に事実上直ちに達成することができる。還元剤を用いずにイオン性デタージェントのみを用いると、溶解中の（デタージェントの存在下で）リボヌクレアーゼ活性が防止されたが、シクロデキストリンで処理してデタージェントを除去した後、リボヌクレアーゼ活性は完全に及び迅速に回復し、ウイルスＲＮＡ検出が妨害された。本明細書に開示のように、イオン性デタージェントを用いないが、還元剤のみを用いた場合、リボヌクレアーゼ活性は、おそらくは溶解中の及び反応中の両方のリボヌクレアーゼ活性のため、ＲＮＡを検出不能にした。したがって、本明細書に記載のように、こうした条件下で検出を成功させるためには、イオン性デタージェント及び還元剤による同時処理が必要だった。
一部の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、臨床試料中の直接病原体溶解のために、ポイントオブケア分子診断のための試料を分離又は精製することを必要としない核酸の等温増幅及びリアルタイム検出を可能にする。一部の実施形態では、臨床試料中の病原体を溶解するために使用することができる強力なイオン性デタージェントを含む溶解緩衝液が提供される。増幅試薬は、溶解試薬に対する保護剤を含んでいてもよく、乾燥されていてもよく（例えば、凍結乾燥、加熱乾燥）、放出された核酸を増幅するためにポイントオブケア設定において使用することができる。
本明細書で提供される組成物及び方法は、デオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を増幅するために、分離、精製、又は抽出を必要とせずにヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）を迅速に及び不可逆的に不活化することできる、臨床試料中のＲＮＡ／ＲＮＡウイルスのポイントオブケア分子診断を可能にする。本明細書で提供される方法及び組成物は、アニオン性デタージェント、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、胆汁酸塩、及び種々のアルキル鎖長を有するアルキルトリメチルアンモニウム界面活性剤を含むカチオン性デタージェントを含むが、これらに限定されない、様々な溶解緩衝液及び溶解剤と適合性である。
イオン性デタージェントは、細胞溶解のための強力な化学薬品である。ＳＤＳなどのイオン性デタージェントは、細胞膜のリン脂質及びタンパク質成分を可溶化し、細胞溶解及び細胞内容物の放出をもたらす。ＳＤＳは、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ並びに古細菌ポリメラーゼによる増幅の場合、０．０１％（質量／容積）よりも高い濃度では阻害効果を示す可能性がある。シクロデキストリン（ＣＤ）は、疎水性内部空洞及び親水性外部表面を有する円錐台に似た環状オリゴサッカリドである。天然シクロデキストリンとしては、α、β、及びγ－ＣＤが挙げられる。こうしたＣＤの溶解度は限定的であり得るが、ヒドロキシプロピルβ－ＣＤなどの化学修飾ＣＤ誘導体は、水性媒体中での溶解度を最大５０％向上させることができる。β－ＣＤは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのイオン性デタージェントと、主に１：１の化学量論で強力な包接複合体（α－ＣＤ及びγ－ＣＤよりも強力な）を形成する。イオン性デタージェントは、細胞溶解／試料調製用の溶解緩衝液に使用することができる。本明細書に記載のように、シクロデキストリンは、イオン性デタージェントによる有害な効果に対する保護剤として、酵素及び他のアッセイ成分を含む乾燥（例えば、凍結乾燥、加熱乾燥）ペレットに組み込むことができる。溶解ステップの後、試料溶液を、シクロデキストリンを含む乾燥（例えば、凍結乾燥、加熱乾燥）ペレットと混合して、ＣＤ及びＳＤＳ包接複合体形成を促進することができる。
呼吸器試料中のＲＮＡウイルスの迅速で直接的な分子試験には、炭水化物、脂肪、及びタンパク質で構成される保護被膜からウイルスＲＮＡを放出させるための初期溶解ステップが必要である。溶解は、ＲＮＡをインタクトにしたまま、その後の酵素媒介性増幅ステップに利用することができるように、タンパク質構造を不可逆的な様式で十分に破壊し、例えば変性させなければならない。直接分子試験とは、この同じ過酷な溶解溶液が、次いで反応試薬／酵素を溶解させるため、酵素媒介性増幅ステップに適合性でなければならないことを意味する。酵素はタンパク質であるため、溶解を達成したタンパク質変性要素を除去しなければならず、この状況ではそれは迅速に行われなければならない。溶解溶液を増幅ステップと適合性にするために、一部の実施形態では、乾燥試薬を溶解溶液に溶解すると直ちに、イオン性デタージェントが増幅酵素を変性させる前にイオン性デタージェントを隔離するシクロデキストリン化合物を含む乾燥増幅試薬が提供される。一部の実施形態では、乾燥試薬の溶解は、この溶解順序が得られるように設計されている。一部の実施形態では、乾燥試薬の溶解は、事象がこの順序で生じるように設計されている。ＲＮＡウイルスを含む呼吸器試料には、干渉する可能性のあるリボヌクレアーゼ酵素も含まれている。溶解を達成するために使用される方法に応じて、ウイルスＲＮＡの放出は、こうしたリボヌクレアーゼによる破壊を受け易くする可能性がある。イオン性デタージェントによる溶解の利点は、タンパク質であるリボヌクレアーゼも変性し、したがって溶解ステップ中に不活化されることである。しかしながら、リボヌクレアーゼは、ほとんどの他のタンパク質と比較して、変性が可逆的であり得る、例えば、変性作用剤を除去すると復元（酵素活性の回復を伴う）が生じるという非常に珍しい特性を示す。したがって、乾燥試薬を溶解した後、本明細書で提供されるシクロデキストリンによりイオン性デタージェントが除去されると、試料リボヌクレアーゼが再活性化される可能性があり、ＲＮＡ逆転写を妨げることができる。処理後のイオン性デタージェントの隔離がリボヌクレアーゼの復元を加速させたことはこれまで示されていなかった。例えばデタージェントではなく尿素などの変性剤によるリボヌクレアーゼの変性中に還元剤を添加すると、両方の除去が比較的遅い場合、復元を遅延させることができる。これは、還元剤が、リボヌクレアーゼのスルフヒドリルアミノ酸残基の修飾を引き起こし、リボヌクレアーゼのリフォールディング及び酵素活性の回復を導くという重要な役割を防止したためであると考えられる。本明細書に記載のように、還元剤は、シクロデキストリンによるイオン性デタージェント変性剤の隔離の際にＲＮＡ検出を妨げることになるリボヌクレアーゼのその後の再活性化を防止するか又は十分に遅延させる。本開示は、本開示の処理の組合せ、例えばイオン性デタージェントによる還元剤が有効であり、シクロデキストリンによるイオン性デタージェントの選択的で迅速な除去後、リボヌクレアーゼ不活化が十分に迅速及び持続的であることの最初の実証を提供する。こうした特性はすべて、呼吸器試料中のＲＮＡウイルスの迅速で直接的な分子試験に不可欠であり得る。
本明細書で提供される方法及び組成物は、精製又は分離を行わずに試料を調製する他の増幅法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、又は他の等温増幅法に適用することができる。本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製ステップを必要とするゲノムシーケンシング法又はあらゆる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）増幅若しくは検出法にも適用することができる。本明細書で提供される方法及び組成物は、遺伝子型決定、診断、及び法医学においても使用を見出すことができる。本開示の方法及び組成物は、等温増幅法に限定されず、むしろ他の増幅／検出法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ＷＧＳシーケンシングに適用することができ、分離を行わないＲＮＡ精製／抽出にも適用することができる。
本明細書に記載のように、予想外のことだが、ヒドロキシプロピルβ－ＣＤの動力学は、ヒドロキシプロピルβ－ＣＤ及びＳＤＳのモル比２：１で十分に迅速であることが見出された。還元剤の存在下での変性によるリボヌクレアーゼの不活化、及び不活化剤の除去中又は除去後の再活性化が、生じる可能性がある。しかしながら、還元剤の存在下でのイオン性デタージェントによる変性の後、シクロデキストリンによる迅速なデタージェント除去時の再活性化の動力学は、これまで示されていなかった。予想外のことだが、本明細書に記載のように、還元剤の非存在下におけるこうした条件下での再活性化の動力学は、逆転写酵素により媒介されるＲＮＡのＤＮＡコピーのその後の産生を妨げることができるほど十分に迅速であったことが見出された。これは、非常に短い約３０ヌクレオチドのＲＮＡセグメントのみがほんの数秒間で逆転写されたという事実にも関わらず、該当した。当技術分野ではこれまで示されていないが、本明細書に記載のように、予想外のことだが、シクロデキストリン処理の前に還元剤を含めることにより、逆転写の完了並びにその後の増幅及びＤＮＡコピーの検出を可能にするのに十分な程度にリボヌクレアーゼの再活性化が遅延されることが見出された。有利なことには、本明細書に開示の方法、キット、及び組成物の実施中にこのように観察されたリボヌクレアーゼの実質的に不可逆的な不活化は、熱に基づく現在利用可能な方法とは異なり、事実上瞬時であり、種々の異なる条件下での上記に記載のものなどの現在利用可能な方法は、本明細書に記載の条件下では、迅速な診断応用に効果的であるほど十分には不可逆的ではなかった。
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するための方法が挙げられる。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）生物学的実体を含む試料を溶解緩衝液と接触させて、処理試料を生成するステップであって、溶解緩衝液は、１種又は複数種の溶解剤を含み、１種又は複数種の溶解剤は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能であり、試料核酸は、標的核酸配列を含むことが疑われている、ステップを含む。この方法は、（ｂ）試薬組成物（例えば、乾燥組成物）を処理試料と接触させて、増幅反応混合物を生成するステップであって、試薬組成物は、１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む、ステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｃ）増幅反応混合物中で標的核酸配列を増幅し、それにより核酸増幅産物を生成するステップを含んでいてもよい。この方法は、（ｄ）核酸増幅産物を検出するステップであって、検出は、試薬組成物を処理試料と接触させた時点から約２０分未満（例えば、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１分、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲）に実施される、ステップを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は同時に実施される（例えば、乾燥組成物及び処理試料の接触が生じると増幅が始まる）。一部の実施形態では、試薬組成物は、２種又はそれよりも多くの試薬組成物（同じ又は異なる成分を含む）を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、２種又はそれよりも多くの溶解緩衝液（同じ又は異なる成分を含む）を含む。
試料核酸は、試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸を含んでいてもよい。試料リボ核酸は、細胞ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。１種又は複数種の増幅試薬は、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、逆転写酵素活性を有する。試薬組成物（例えば、乾燥組成物）と処理試料との接触は、試薬組成物を処理試料に溶解させることを含んでいてもよい。試薬組成物は、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、第１のプライマー、第２のプライマー、及び逆転写プライマーの１種又は複数種を含んでいてもよい。増幅は、等温増幅条件で実施することができる。核酸増幅産物の検出は、リアルタイム検出法の使用を含んでいてもよい。
１種又は複数種の溶解試薬は、処理試料の約０．００１％（質量／容積）～約１．０％（質量／容積）、例えば、処理試料の約０．２％（質量／容積）を構成してもよい。試料核酸は、標的核酸配列を含む核酸を含んでいてもよい。標的核酸配列は、互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含んでいてもよい。
標的核酸配列の増幅は、互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅することを含んでいてもよく、増幅は、標的核酸配列を含む核酸を、ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有し、それにより核酸増幅産物を生成する酵素であって、核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であって、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含む、酵素と接触させることを含む。
一部の実施形態では、増幅は、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素を使用することを含まず、増幅は、核酸を変性させることを含まない。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｃ）の前又はステップ（ｃ）中に、核酸を一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と接触させることを含まない。一部の実施形態では、この方法は、試料核酸の熱変性も酵素変性も含まない。
核酸は、二本鎖ＤＮＡであってもよい。核酸は、逆転写反応の産物であってもよい。核酸は、試料リボ核酸から生成される逆転写反応の産物であってもよい。ステップ（ｃ）は、逆転写反応により核酸を生成することを含んでいてもよい。
試料核酸は、試料リボ核酸を含んでいてもよい。この方法は、試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させて、ｃＤＮＡを生成することを含んでいてもよい。標的核酸配列の増幅は、（ｃ１）試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させてｃＤＮＡを生成するステップ；（ｃ２）ｃＤＮＡを超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させてｄｓＤＮＡを生成するステップであって、ｄｓＤＮＡは標的核酸配列を含み、標的核酸配列は、互いに相補的である第１の鎖及び第２の鎖を含む、ステップ；（ｃ３）標的核酸配列を等温増幅条件下で増幅するステップであって、増幅は、ｄｓＤＮＡを、（ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであり、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びに（ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有し、それにより核酸増幅産物を生成する酵素であり、核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であり、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含む、酵素と接触させることを含む、ステップを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、この方法は、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素の使用を含まない。ステップ（ｄ）は、試料中の、標的核酸配列を含むｄｓＤＮＡ及び／又は核酸の量を決定することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであってもよい。一部の実施形態では、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、エキソヌクレアーゼ活性が低いか又は全くない。
標的核酸配列の増幅は、約５５℃～約７５℃、例えば約６５℃の一定の温度で実施することができる。第１のプライマー、第２のプライマー、又はその両方は、約８～１７塩基長であってもよい。第１のプライマー、第２のプライマー、又はその両方は、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、又はそれらの組合せの１種又は複数種を含んでいてもよい。核酸増幅産物は、約２０～４０塩基長であってもよい。スペーサー配列は、標的核酸配列の一部を含んでいてもよい。スペーサー配列は１～１０塩基長であってもよい。
一部の実施形態では、この方法は、核酸増幅産物を、増幅産物にハイブリダイズすることが可能なシグナル発生オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。シグナル発生オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、又はその両方を含んでいてもよい。核酸増幅産物の検出は、蛍光シグナルを検出することを含んでいてもよい。蛍光シグナルは分子ビーコンからのものであってもよい。この方法は、単一の反応ベッセル内で実施することができる。試料リボ核酸を、逆転写酵素及び超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と同時に接触させてもよい。試料リボ核酸を、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、並びに第１の及び第２のプライマーと同時に接触させてもよい。一部の実施形態では、試料リボ核酸を、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、第１のプライマー、第２のプライマー、及び逆転写プライマーと同時に接触させる。試料リボ核酸の逆転写は、逆転写プライマーの添加により生じさせることができる。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、又は標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一部の実施形態では、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）＋テイルに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、試料リボ核酸の様々な相補的部位に結合することができる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的の試料リボ核酸を選択的にプライミングする。第１のプライマー及び／又は第２のプライマーは、逆転写プライマーであってもよい。
増幅ステップは、２種又はそれよりも多くの標的核酸配列のマルチプレックス増幅を含んでいてもよい。検出ステップは、前記２種又はそれよりも多くの標的核酸配列に由来する２種又はそれよりも多くの核酸増幅産物のマルチプレックス検出を含んでいてもよい。２種又はそれよりも多くの標的核酸配列は、クラミジア・トラコマティス、ナイセリア・ゴノレア、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及び／又はＣ型インフルエンザの１種又は複数種を含むが、これらに限定されない、２種又はそれよりも多くの異なる生物に特異的であってもよい。
一部の実施形態では、増幅は、以下の増幅法：ＡＰＡ、ＬＡＭＰ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＮＥＡＲ、ＲＣＡ、ＭＤＡ、ＲＡＭ、ｃＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＳＭＡＲＴ、３ＳＲ、ＧＥＡＲ、及びＩＭＤＡの１種又は複数種を含む。一部の実施形態では、増幅は、以下のもの：ＬＡＭＰ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＮＥＡＲ、ＲＣＡ、ＭＤＡ、ＲＡＭ、ｃＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＳＭＡＲＴ、３ＳＲ、ＧＥＡＲ、及びＩＭＤＡの１種又は複数種を含まない。一部の実施形態では、増幅はＬＡＭＰを含まない。
一部の実施形態では、この方法は、以下の１種若しくは複数を含まないか又はいずれも含まない：（ｉ）処理試料を希釈すること；（ｉｉ）増幅反応混合物を希釈すること；（ｉｉｉ）処理試料を熱変性させること；（ｉｖ）処理試料を超音波処理すること；（ｖ）増幅反応混合物を超音波処理すること；（ｖｉ）ヌクレアーゼ阻害剤を処理試料に添加すること；（ｖｉｉ）ヌクレアーゼ阻害剤を増幅反応混合物に添加すること；（ｖｉｉｉ）試料を精製すること；（ｉｘ）試料核酸を精製すること；（ｘ）核酸増幅産物を精製すること；（ｘｉ）処理試料又は増幅反応混合物から１種又は複数種の溶解剤を除去すること；（ｘｉｉ）増幅前及び／又は増幅中に試料核酸を熱変性及び／又は酵素変性させること；並びに（ｘｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨを処理試料又は増幅反応混合物に添加すること。一部の実施形態では、試料は、増幅温度（例えば、６７℃）に保持される。ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、及び／又はステップ（ｄ）は、約２０、１５、１０、５、２．５、又は１分間実施することができる。一部の実施形態では、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、及び／又はステップ（ｄ）は、超音波処理、浸透圧ショック、化学処理、加熱、又はそれらのあらゆる組合せを含む。
１種又は複数種の溶解剤は、１種又は複数種の増幅試薬を変性させることが可能であってもよい。１種又は複数種の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能であってもよい。１種又は複数種の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤を隔離し（例えば、複合体形成）、それにより１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能であってもよい。一部の実施形態では、増幅反応混合物中の１種又は複数種の溶解剤の少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲）が、１種又は複数種の保護剤により隔離される。一部の実施形態では、１種又は複数種の増幅試薬の約４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％、０．１％、０％未満、又はこうした値のいずれかの間の数値若しくは範囲未満が、１種又は複数種の溶解剤により変性する。
試料は、複数のヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）を含んでいてもよい。１種又は複数種の溶解剤は、ヌクレアーゼを変性させて変性ヌクレアーゼ（例えば、変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ）を生成することが可能であってもよい。１種又は複数種の還元剤は、リボヌクレアーゼを還元して還元型ヌクレアーゼ（例えば、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ）を生成することが可能であってもよい。１種又は複数種の還元剤及び１種又は複数種の溶解剤は、還元型変性ヌクレアーゼ（例えば、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性リボヌクレアーゼ）を生成することが可能であってもよい。変性リボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は１種若しくは複数の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元し、それにより復元リボヌクレアーゼを生成することが可能であってもよい。一部の実施形態では、変性デオキシリボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性デオキシリボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は１種若しくは複数種の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元し、それにより復元デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能であってもよい。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤の隔離は、１種又は複数種の溶解剤と、変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ、及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼとの物理的相互作用を低減する。変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ、及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは、酵素的に不活性であり得る。復元ヌクレアーゼは、酵素的に活性であり得る。復元は、リフォールディングを含んでいてもよい。「リフォールディング」には、本明細書で使用される場合、その通常の意味が与えられるものとし、また、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、不適切にフォールディングした状態又はアンフォールディングした状態から、ジスルフィド結合に関して天然の又は正しくフォールディングした立体構造へと変換するあらゆるプロセス、反応、又は方法を記述するものとする。
還元型変性ヌクレアーゼ（例えば、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性リボヌクレアーゼ）は、少なくとも約１．１倍（例えば、１．１倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、又はこうした値のいずれかの間の数値若しくは範囲）、変性ヌクレアーゼ（例えば、変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ）よりも遅く復元することができる。溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、少なくとも約１．１倍（例えば、１．１倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、又はこうした値のいずれかの間の数値若しくは範囲）多くの試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸を、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素が鋳型として使用して、それぞれｃＤＮＡ及び／又は核酸増幅産物を生成することができる。
増幅反応混合物は、本明細書で提供される方法のステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び／又は２０分後に、溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、少なくとも１．１倍（例えば、１．１倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、又はこうした値のいずれかの間の数値若しくは範囲）低いヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）活性を含んでいてもよい。一部の実施形態では、試料、処理試料、及び／又は増幅反応混合物中のヌクレアーゼの少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲）は、酵素的に不活性である。
一部の実施形態では、ｃＤＮＡ及び／又は核酸増幅産物は、それぞれ試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸の少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲）から生成される。一部の実施形態では、試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸の約３０％未満（例えば、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％、０．１％、又はこうした値のいずれかの間の数値若しくは範囲）は、それぞれ逆転写反応及び／又は増幅反応において鋳型として使用される前にヌクレアーゼにより分解される。
「等温増幅反応」という用語には、その通常の意味が与えられるものとし、反応中に温度が著しく変化しない反応も含むものとする。一部の実施形態では、等温増幅反応の温度は、増幅が起こる主要酵素反応ステップ中に、１０℃よりも大きく逸脱せず、例えば、５℃以下、又は２℃以下しか逸脱しない。核酸の等温増幅の方法に応じて、異なる酵素を増幅に使用することができる。等温増幅組成物及び方法は、ＷＯ２０１７１７６４０４として公開されているＰＣＴ出願に記載されており、この文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び成分は、保管安定溶解緩衝液を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、保管条件下で一定期間にわたって沈殿物の形成に対して耐性である（例えば、保管安定溶解緩衝液）。溶解緩衝液が沈殿に対して耐性である組成物、キット、及び方法は、２０２２年２月５日に出願された、「ＮＯＮ－ＯＰＡＱＵＥ ＬＹＴＩＣ ＢＵＦＦＥＲ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」という題名の米国特許仮出願第６３／３０７，０９２号に記載されており、この文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される方法及び組成物の一部の実施形態は、酸及び／又は低ｐＨ条件以外に、核酸を変性させる（例えば、鎖分離を促進及び／又は解巻を促進する）作用剤及び／又は条件を含まない。核酸鎖を低ｐＨ条件下で（例えば、酸性溶解緩衝液との接触により）解離させ、その後の迅速な増幅及び検出を促進する、核酸検出のための組成物、キット、及び方法は、２０２２年２月５日に出願された、「ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＳＥＰＡＲＡＴＩＮＧ ＧＥＮＯＭＩＣ ＤＮＡ ＦＯＲ ＳＥＰＡＲＡＴＩＮＧ ＧＥＮＯＭＩＣ ＤＮＡ ＦＯＲ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＨＯＲＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＡＲＧＥＴＳ」という題名の米国特許仮出願第６３／３０７，０８５号に記載されている。この文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるものには、核酸を増幅するための方法が含まれる。一部の実施形態では、この方法は、試料核酸を、等温増幅条件下で、ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及びｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１種の成分と接触させ、それにより核酸増幅産物を生成することを含む。一部の実施形態では、この方法は、試料核酸を、等温増幅条件下で、ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、及びｂ）超好熱菌ポリメラーゼ又は超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分と接触させ、それにより核酸増幅産物を生成することを含む。一部の実施形態では、この方法は、試料核酸を、等温増幅条件下で、ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、並びにｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性及びｉｉ）任意に、逆転写酵素活性からなる酵素活性と接触させ、それにより核酸増幅産物を生成することを含む。
また、本明細書で提供されるものには、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、又は量を決定するための方法であって、ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであり、標的配列は第１の鎖及び第２の鎖を含み、第１鎖及び第２鎖は互いに相補的であり、増幅は、試料核酸を、無ヘリカーゼ及び／又は無リコンビナーゼ等温増幅条件下で、ｉ）第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドであり、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の鎖の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含むか又はからなり、第２のオリゴヌクレオチドは、第２の鎖の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含むか又はからなる、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチド；並びにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供し、それにより核酸増幅産物を生成する少なくとも１種の成分であり、核酸増幅産物は、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドと連続的に相補的又は実質的に同一である第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドと連続的に相補的又は実質的に同一である第２のヌクレオチド配列、並びに３）第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列によりフランキングされている１～１０塩基を含むスペーサー配列を含むか又はからなる、少なくとも１種の成分と接触させることを含む、ステップ；並びにｂ）核酸増幅産物を検出するステップであり、核酸増幅産物の検出は、リアルタイム検出法の使用を含み、試料核酸を（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）と接触させた時点から１０分又はそれよりも短い時間で実施され、それにより試料核酸中の標的配列の存在、非存在、又は量が決定される、ステップを含む方法が含まれる。
核酸、対象、試料、及び核酸処理
本明細書には、核酸を増幅するための方法及び組成物が提供される。「核酸」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では同義的に使用することができる。この用語は、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体、及び／又は非天然骨格などを含む）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）などのあらゆる組成の核酸を指し、これらはすべて、一本鎖の形態であってもよく又は二本鎖の形態であってもよく、別様の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で機能することができる天然ヌクレオチドの既知類似体を包含することができる。核酸は、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ又は宿主細胞、細胞、細胞核、ミトコンドリア、若しくは細胞の細胞質にて複製し得るか又は複製され得る他の核酸であってもよく又はそれらに由来してもよい。特に限定のない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸を包含する。別様に示されていない限り、特定の核酸配列は、明示的に示されている配列だけでなく、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び相補配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することにより達成することができる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと同義的に使用することができる。この用語は、ヌクレオチド類似体、一本鎖ポリヌクレオチド（「センス」又は「アンチセンス」、「プラス」鎖又は「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレーム又は「リバース」リーディングフレーム、「フォワード」鎖又は「リバース」鎖）及び二本鎖ポリヌクレオチドから合成されるＲＮＡ又はＤＮＡの等価物、誘導体、バリアント、及び類似体も含むことができる。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、一般に、遺伝子産物の転写／翻訳及び転写／翻訳の調節に関与するコード領域（リーダー及びトレーラー）の前後の領域、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。ヌクレオチド又は塩基は、一般に、核酸のプリン分子単位及びピリミジン分子単位を指す（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、及びシトシン（Ｃ））。ＲＮＡの場合、塩基チミンはウラシルに置き換えられる。核酸の長さ又はサイズは、塩基の数として表すことができる。
本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、１種又は複数種の核酸標的が増幅される。標的核酸は、標的配列、標的ポリヌクレオチド、及び／又は標的ポリヌクレオチド配列と呼ばれる場合があり、二本鎖核酸分子及び一本鎖核酸分子を含むことができる。標的核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。標的核酸がＲＮＡ分子である場合、分子は、例えば、二本鎖、一本鎖であってもよく、又はＲＮＡ分子は、一本鎖である標的配列を含んでもよい。標的核酸が二本鎖である場合、標的核酸は、一般に、第１の鎖及び第２の鎖を含む。第１の鎖及び第２の鎖は、フォワード鎖及びリバース鎖と呼ばれる場合があり、一般に、互いに相補的である。標的核酸が一本鎖である場合、例えば、重合及び／又は逆転写により相補鎖を生成して、標的核酸を二本鎖にして、第１の／フォワード鎖及び第２の／リバース鎖を有することができる。
標的配列は、核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを指してもよく、標的核酸に存在する配列、元の標的配列の増幅コピー又は増幅産物を指すこともできる。標的配列は、より大きなポリヌクレオチド内の部分配列であってもよい。例えば、標的配列は、増幅の標的とされる核酸断片、染色体、プラスミド内の短い配列（例えば、２０～５０塩基）であってもよい。一部の実施形態では、標的配列は、核酸を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）に相補的である標的核酸内の配列を指すことができる。したがって、標的配列は、増幅の標的とされる配列全体を指してもよく、又はオリゴヌクレオチドが結合する標的核酸内の部分配列を指してもよい。増幅産物は、標的配列、並びに少なくとも１つの他の配列、又は他のヌクレオチドを含むより大きな分子であってもよい。増幅産物は、標的配列とほぼ同じ長さ、例えば、標的配列と正確に同じ長さであってもよい。増幅産物は、標的配列を含むか又はからなってもよい。
標的配列長及び／又はグアノシンシトシン（ＧＣ）濃度（パーセント）は、部分的には、増幅反応が実行される温度に依存する可能性があり、この温度は、部分的には、反応に使用されるポリメラーゼの安定性に依存する可能性がある。１セットの反応条件について適切な標的配列長及びＧＣ濃度を決定するために、試行アッセイを実施してもよい。例えば、ポリメラーゼが６０℃～６５℃まで安定である場合、標的配列は、例えば、１９～５０ヌクレオチド長、又は例えば約４０～５０、２０～４５、２０～４０、又は２０～３０ヌクレオチド長であってもよい。こうした条件下でのＧＣ濃度は、例えば、６０％未満、５５％未満、５０％未満、又は４５％未満であってもよい。
標的核酸は、例えば、ゲノム核酸、プラスミド核酸、ミトコンドリア核酸、細胞核酸、細胞外核酸、細菌核酸、及びウイルス核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、遺伝子、あらゆるタイプの細胞ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は合成オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。ゲノム核酸は、あらゆるゲノム、例えば、動物ゲノム、植物ゲノム、昆虫ゲノム、ウイルスゲノム、及び細菌ゲノム（例えば、胞子に存在するゲノム）に由来するあらゆる核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ゲノム標的核酸は、特定のゲノム遺伝子座又は複数のゲノム遺伝子座内に存在する。ゲノム遺伝子座は、オープンリーディングフレームＤＮＡ、非転写ＤＮＡ、イントロン配列、エクソン（ｅｘｔｒｏｎｉｃ）配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、フランキング配列、又は所与のゲノム遺伝子座に関連すると考えられるあらゆる配列のいずれか又は組合せを含んでいてもよい。
標的配列は、１種又は複数種の反復エレメント（例えば、多重反復配列、逆位反復配列、回文配列、タンデムリピート、マイクロサテライト、及びミニサテライトなど）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的配列は、反復エレメント（例えば、多重反復配列、逆位反復配列、回文配列、タンデムリピート、マイクロサテライトリピート、及びミニサテライトリピートなど）として試料核酸内（例えば、核酸断片内、染色体内、ゲノム内、プラスミド内）に存在する。例えば、標的配列は、反復エレメントとして複数回出現してもよく、反復エレメント内の標的配列の１つ、一部、又はすべての出現を、本明細書に記載の方法を使用して（例えば、単一対のプライマーを使用して）増幅することができる。一部の実施形態では、標的配列は、複製物及び／又はパラログとして試料核酸内（例えば、核酸断片内、染色体内、ゲノム内、プラスミド内）に存在する。
標的核酸は、マイクロＲＮＡを含んでいてもよい。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）は短く（例えば、約２１～２３ヌクレオチド長）、遺伝子調節に関与する一本鎖ＲＮＡ配列である。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳を妨げる可能性があり、メッセンジャーＲＮＡと部分的に相補的である。標的核酸は、一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及びさらにプロセシングされてｍｉＲＮＡになるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループ構造ＲＮＡなどのマイクロＲＮＡ前駆体を含んでいてもよい。標的核酸は、短く（例えば、約２０～２５ヌクレオチド長）、ＲＮＡ干渉（例えば、ウイルス複製又は遺伝子発現の下方制御）に関与する少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子である小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含んでいてもよい。
本明細書に記載の方法で使用される核酸は、あらゆる好適な生物学的検体又は試料から得ることができ、例えば、対象から得られた試料から単離することができる。対象は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、ウイルス、又は原生生物を含むがこれらに限定されない、あらゆる生体又は非生体生物であってもよい。哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科動物（例えば、ウシ）、ウマ科動物（例えばウマ）、ヤギ様及びヒツジ様動物（例えば、ヒツジ、ヤギ）、イノシシ科動物（例えばブタ）、ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科動物（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラ、及びサメを含むがそれらに限定されない、あらゆるヒト又は非ヒト動物を選択することができる。対象は、雄であってもよく又は雌であってもよく、対象は、あらゆる年齢（例えば、胎芽、胎仔、幼仔、仔供、成体）であってもよい。
試料又は試験試料は、対象又はその一部から単離されるか又は得られるあらゆる検体であってもよい。検体の非限定的な例としては、限定ではないが、以下のものを含む、対象に由来する流体又は組織が挙げられる：血液又は血液産物（例えば、血清又は血漿など）、臍帯血、骨髄、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡（ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ））、血清、血漿、尿、吸引液、生検試料、腸穿刺試料、細胞（例えば、血液細胞）又はその一部（例えば、ミトコンドリア、核、又は抽出物など）、雌生殖管の洗浄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄物、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳房液、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、又は卵巣）など、又はそれらの組合せ。血液という用語は、従来定義されているように、全血、血液産物、又は血清、血漿、若しくは軟膜などの血液のあらゆる画分を包含する。血漿とは、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離から得られる全血の画分を指す。血清とは、血液試料が凝固した後に残る流体の水様部分を指す。流体試料又は組織試料は、病院又は診療所が一般に従う標準的プロトコールに準じて収集されることが多い。血液の場合、適切な量の末梢血（例えば、３～４０ミリリットル）が収集されることが多く、調製前又は調製後に標準的手順に従って保管することができる。
試料は、胞子、ウイルス、細胞、原核生物若しくは真核生物に由来する核酸、及び／又はあらゆる遊離核酸を含む試料を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の方法は、胞子の外側にある核酸を検出するために使用することができる（例えば、溶解を必要とせずに）。試料は、上記に記載の対象に由来するものなど、標的配列を含むと疑われるあらゆる物質から単離することができる。一部の実施形態では、標的配列は、空気、植物、土壌、又は生物有機体を含むと疑われる他の物質に存在する。
核酸は、当技術分野で公知の方法により、１種又は複数種の供給源から導出（例えば、単離、抽出、精製）することができる。当技術分野におけるＤＮＡ調製方法、並びにＱｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡミニキット若しくはＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）血液ＤＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）、及びＧＦＸ（商標）ゲノム血液ＤＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）など又はそれらの組合せなどの種々の市販試薬又はキットを含む、生物学的試料から核酸を単離、抽出、及び／又は精製するためのあらゆる好適な方法を使用することができる。米国特許第７，８８８，００６号には、ＤＮＡ精製方法が提供されているが、本明細書で提供される組成物（例えば、溶解緩衝液、保護剤）及び方法は開示されていない。
一部の実施形態では、細胞溶解手順が実施される。細胞溶解は、本明細書に記載の増幅反応を開始する前に実施してもよい（例えば、増幅のために細胞からＤＮＡ及び／又はＲＮＡを放出させるために）。細胞溶解手順及び試薬は当技術分野で公知であり、化学的方法（例えば、デタージェント、低張溶液、及び酵素的手順など、又はそれらの組合せ）、物理的方法（例えば、フレンチプレス及び超音波処理など）、又は電解溶解法により実施することができる。例えば、化学的方法では、一般に、溶解剤を使用して細胞を破壊し、核酸を細胞から抽出し、続いてカオトロピック塩で処理する。一部の実施形態では、細胞溶解は、デタージェント（例えば、イオン性、非イオン性、アニオン性、双性イオン性）の使用を含む。一部の実施形態では、細胞溶解は、イオン性デタージェント（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、デオキシコレート、コレート、サルコシル）の使用を含む。凍結／解凍後の粉砕及びセルプレスの使用などの物理的方法も有用であり得る。高塩溶解手順も使用することができる。例えば、アルカリ溶解手順を使用することができる。後者の手順には、伝統的にフェノール－クロロホルム溶液の使用が組み込まれており、３種の溶液を含む代替的な無フェノール－クロロホルム手順を使用することもできる。後者の手順では、例えば、１つの溶液は、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１００μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡを含んでいてもよく、第２の溶液は、０．２Ｎ ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを含んでいてもよく、第３の溶液は、３Ｍ ＫＯＡｃ、ｐＨ５．５を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞溶解緩衝液が、本明細書に記載の方法及び成分と併せて使用される。
核酸を含む試料を処理することなく本明細書に記載の方法を実施するための核酸を提供することができる。例えば、事前の核酸精製を行わずに本明細書に記載の増幅方法を実施するための核酸を提供することができる。一部の実施形態では、標的配列は試料から直接増幅される（例えば、核酸抽出、単離、精製、及び／又は部分精製ステップを一切実施せずに）。一部の実施形態では、核酸を含む試料を処理した後で本明細書に記載の方法を実施するための核酸が提供される。例えば、核酸は、試料から抽出、単離、精製、又は部分的に精製することができる。「単離された」という用語は、一般に、その元の環境（例えば、天然に存在する場合は自然環境、又は外因的に発現された場合は宿主細胞）から取り出された核酸を指し、したがって、人間の介入により（例えば、「人の手により」）その元の環境から変更されている。「単離された核酸」という用語は、対象（例えば、ヒト対象）から取り出された核酸を指すことができる。供給源試料に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を有する単離された核酸を提供することができる。単離された核酸を含む組成物には、非核酸成分の約５０％～９９％よりも多くが含まれていなくともよい。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％よりも多くが含まれていなくてもよい。「精製された」という用語は、一般に、核酸を精製手順に供する前に存在する非核酸成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を含む場合の核酸を指す。精製された核酸を含む組成物は、他の非核酸成分の約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％よりも多くを含んでいなくてもよい。
核酸を修飾することなく本明細書に記載の方法を実施するための核酸を提供することができる。修飾としては、例えば、変性、消化、ニッキング、解巻、異種性配列の組込み及び／若しくはライゲーション、エピジェネティック修飾の付加、標識の追加（例えば、32Ｐ、33Ｐ、125Ｉ、又は35Ｓなどの放射性標識；アルカリホスファターゼなどの酵素標識；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識；又はビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、及び蛍光色素などの他の標識）などを挙げることができる。したがって、一部の実施形態では、未修飾核酸が増幅される。
試料中の標的核酸配列（一本鎖又はｄｓＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を検出するための本明細書に開示の方法は、標的核酸配列（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を高感度で検出することができる。一部の実施形態では、この方法は、複数のＲＮＡ／ＤＮＡ（標的ＲＮＡ／ＤＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡ／ＤＮＡを含む）を含む試料に存在する標的ＤＮＡ／ＲＮＡを検出するために使用することができ、標的ＲＮＡ／ＤＮＡは、１０、２０、２５、５０、１００、５００、１０3、５×１０3、１０4、５×１０4、１０5、５×１０5、１０6、又は１０7個の非標的ＤＮＡ／ＲＮＡ当たり１つ又は複数のコピーで存在する。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ／ＤＮＡ」及び「ＲＮＡ（複数）／ＤＮＡ（複数）」という用語にはそれらの通常の意味が与えられるものとし、また、ＤＮＡ、又はＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡの組合せを指すものとする。
試料中の標的ＲＮＡ／ＤＮＡを検出するための方法の検出閾値は、例えば１０ｎＭ又はそれよりも低い濃度であり得る。「検出閾値」という用語にはその通常の意味が与えられるものとし、また、検出が生じるために試料に存在しなければならない標的ＲＮＡ／ＤＮＡの最小量を記述するものとする。説明のための例として、検出閾値が１０ｎＭである場合、標的ＲＮＡ／ＤＮＡが試料中に１０ｎＭ又はそれよりも高い濃度で存在するとシグナルを検出することができる。一部の実施形態では、本開示の方法は、５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．０５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．０１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．００５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．００１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．０００５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．０００１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．００００５ｎＭ若しくはそれよりも低いか、０．００００１ｎＭ若しくはそれよりも低いか、１０ｐＭ若しくはそれよりも低いか、１ｐＭ若しくはそれよりも低いか、５００ｆＭ若しくはそれよりも低いか、２５０ｆＭ若しくはそれよりも低いか、１００ｆＭ若しくはそれよりも低いか、５０ｆＭ若しくはそれよりも低いか、５００ａＭ（アトモル濃度）若しくはそれよりも低いか、２５０ａＭ若しくはそれよりも低いか、１００ａＭ若しくはそれよりも低いか、５０ａＭ若しくはそれよりも低いか、１０ａＭ若しくはそれよりも低いか、又は１ａＭ若しくはそれよりも低い検出閾値を有する。一部の実施形態では、本開示の組成物又は方法は、アトモル濃度（ａＭ）、フェムトモル濃度（ｆＭ）、ピコモル濃度（ｐＭ）、及び／又はナノモル濃度（ｎＭ）の検出感度を呈する。
試料は、試料核酸（例えば、複数種の試料核酸）を含んでいてもよい。「複数種」という用語は、本明細書では２種又はそれよりも多くを意味するために使用される。したがって、一部の実施形態では、試料は、２種若しくはそれよりも多くの（例えば、３種若しくはそれよりも多くの、５種若しくはそれよりも多くの、１０種若しくはそれよりも多くの、２０種若しくはそれよりも多くの、５０種若しくはそれよりも多くの、１００種若しくはそれよりも多くの、５００種若しくはそれよりも多くの、１，０００種若しくはそれよりも多くの、又は５，０００種若しくはそれよりも多くの）試料核酸（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ）を含む。本開示の方法は、試料に（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの核酸の複雑な混合物に）存在する標的核酸を検出するための非常に高感度な方法として使用することができる。一部の実施形態では、試料は、５種、１０種、２０種、２５種、５０種、１００種、５００種、１０3種、５×１０3種、１０4種、５×１０4種、１０5種、５×１０5種、１０6種、又は１０7種、５０種、又はそれよりも多くの、配列が互いに異なるＤＮＡ／ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、細胞（例えば、真核細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞）又は細胞ライセート（例えば、真核細胞ライセート、哺乳類細胞ライセート、ヒト細胞ライセート、原核細胞ライセート、又は植物細胞ライセートなど）に由来するＤＮＡ／ＲＮＡを含む。
ここで使用される「試料」という用語には、その通常の意味が与えられるものとし、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含むあらゆる試料を含むものとする（例えば、標的ＤＮＡ及び／又は標的ＲＮＡがＲＮＡ及び／又はＤＮＡ集団中に存在するか否かを決定するための）。試料は、いかなる供給源に由来してもよく、例えば、試料は、精製されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡの合成的組合せであってもよい。試料は、細胞ライセート、ＤＮＡ／ＲＮＡ富化細胞ライセート、又は細胞ライセートから単離及び／若しくは精製されたＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。試料は患者に由来してもよい（例えば、診断目的の場合）。試料は、透過化細胞、架橋細胞、組織切片、又はそれらの組合せに由来してもよい。試料は、架橋し続いて脱脂し、屈折率が均一になるように調整することにより調製された組織に由来してもよい。試料は、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ／ＲＮＡ）及び複数種の非標的ＤＮＡ／ＲＮＡを含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ／ＲＮＡは、１０、２０、２５、５０、１００、５００、１０3、５×１０3、１０4、５×１０4、１０5、５×１０5、１０6、又は１０7個の非標的ＤＮＡ／ＲＮＡ当たり１コピーで試料中に存在する。
患者に関連する試料は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、生検検体又は組織培養物又はそれらに由来する細胞及びそれらの子孫などの固体組織試料、並びに調達後に何らかの方法（試薬による処理など）で操作されているか；洗浄されているか；又はある特定の細胞集団（例えば、がん細胞）若しくは特定タイプの分子（例えば、ＲＮＡ）が富化された試料を包含する。試料は、血液、血漿、血清、吸引液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料を含むがそれらに限定されない生物学的試料を含んでいてもよく、また、であってもよく、外科的切除により得られる組織、生検により得られる組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞ライセート、組織試料、器官、及び骨髄なども含む。生物学的試料は、それら（例えば、がん性細胞、感染細胞など）に由来する生物学的流体、例えば、そのような細胞から得られるＲＮＡを含む試料（例えば、ＲＮＡを含む細胞ライセート又は他の細胞抽出物）を含んでいてもよい。
試料の供給源は、罹患した（又は罹患が疑われる）細胞、流体、組織、若しくは器官であってもよく、又は正常な（非罹患の）細胞、流体、組織、若しくは器官であってもよい。一部の実施形態では、試料の供給源は、病原体に感染した（又は感染が疑われる）細胞、組織、又は器官である。例えば、試料の供給源は、感染していてもよく又はしていなくてもよい個体であってもよく、試料は、その個体から収集されるいかなる生物学的試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、喀痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引物、スワブ試料（例えば、頬側スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻汁、涙、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞擦過物）など）であってもよい。試料は、無細胞液体試料であってもよく、又は細胞を含む液体試料であってもよい。病原体は、ウイルス、真菌、蠕虫、原生動物、マラリア寄生虫、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）寄生虫、及びシストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）寄生虫などであってもよい。「蠕虫」としては、回虫、糸状虫、及び植物食性線虫（線虫類）、吸虫（吸虫類（Ｔｅｍａｔｏｄａ））、鉤頭虫類、及び条虫（条虫類）が挙げられる。原生動物感染症としては、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、トリコモナス種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）による感染症、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム症、シャーガス病、コクシジウム症、マラリア、及びトキソプラズマ症が挙げられる。寄生虫／原生動物病原体などの病原体の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。真菌病原体としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティティディス、クラミジア・トラコマティス、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスとしては、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱、ウエストナイルウイルス、ヘルペスウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びパピローマウイルスなどが挙げられる。病原性ウイルスとしては、パポバウイルス（例えば、ＨＰＶ、ポリオーマウイルス）；ヘパドナウイルス；ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ（例えば、ＨＳＶ Ｉ、ＨＳＶ ＩＩ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスリンパ向性ウイルス、バラ色粃糖疹（Ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ Ｒｏｓｅａ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス（ｉｃｈｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス（ｂｕｆａｖｉｒｕｓ）、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）；ジェミニウイルス科；ナノウイルス科；及びフィコドナウイルス科などのＤＮＡウイルスを挙げることができる。病原体の非限定的な例としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス、ヒト血清バルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、マウス白血病ウイルス、おたふくかぜウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳がんウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、トキソプラズマ・ゴンディ、ランゲルトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルージ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ）、アイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、メソセストイド・コルティ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ハイオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。
増幅
本明細書では、核酸を増幅するための方法が提供される。一部の実施形態では、核酸は、好適な増幅プロセスを使用して増幅される。核酸増幅は、典型的には、増幅されているヌクレオチド配列に相補的な配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成を含む。一部の実施形態では、増幅法は、単一のベッセル、単一のチャンバー、及び／又は単一の容積（つまり、連続容積）で実施される。一部の実施形態では、増幅法及び検出法（例えば、本明細書に記載の検出法）は、単一のベッセル、単一のチャンバー、及び／又は単一の容積（つまり、連続容積）で実施される。
「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、又は「増幅すること」という用語は、標的核酸のコピーを増殖させるためのあらゆるｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスを指す。増幅は、標的核酸の「指数関数的」増加を指すこともある。「増幅すること」は、標的核酸の数の線形増加を指すこともできるが、１回限りの単一プライマー伸長ステップとは異なる。一部の実施形態では、前増幅としても知られている限定的増幅反応を実施することができる。前増幅とは、少数回のサイクル、例えば１０サイクルが実施されるため、限定的な量の増幅が生じる方法である。前増幅は、ある程度の増幅を可能にするが、指数関数期の前に増幅を停止させ、典型的には、所望のヌクレオチド配列の約５００コピーを産生させる。前増幅を使用すると、ある特定の増幅反応における反応物の枯渇に関連する不正確性を制限することでき、標的のヌクレオチド配列又は種存在量による増幅の偏りを低減させることもできる。一部の実施形態では、１回限りのプライマー伸長は、線形増幅又は指数関数的増幅の前段階として実施してもよい。
増幅プロセスの一般的説明を本明細書に提示する。例えば、プライマー（例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド）及び標的核酸を接触させると、相補的配列は互いにアニーリング又はハイブリダイズする。プライマーは、目的の配列又はその付近（例えば、隣接する、当接するなど）の標的核酸にアニーリングすることができる。標的にアニーリングしたプライマーは、プライマー－標的ハイブリッド、ハイブリダイズしたプライマー－標的、又はプライマー－標的二重鎖と呼ばれる場合がある。目的のヌクレオチド配列を参照する場合の「付近」又は「隣接」という用語は、プライマーの末端と標的の１つ又は複数のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列）との間の距離（例えば、塩基数）又は領域を指す。一般に、隣接とは、目的のヌクレオチド又はヌクレオチド配列から約１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド）である。一部の実施形態では、１セットのプライマー（例えば、１対のプライマー、フォワードプライマー及びリバースプライマー、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチド）は、目的のヌクレオチド又はヌクレオチド配列から約１～２０ヌクレオチド以内にアニーリングし、増幅産物を産生させる。一部の実施形態では、プライマーは、目的のヌクレオチド又はヌクレオチド配列内にアニーリングする。アニーリングした後、各プライマーは、ポリメラーゼにより標的（つまり、鋳型鎖）に沿って伸長され、相補鎖が生成される。例えば、検出可能な量の増幅産物が生成されるまで、プライマーアニーリング及び伸長の数回のサイクルを実施することができる。一部の実施形態では、標的核酸がＲＮＡである場合、標的ＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）は、逆転写により、増幅ステップの前又は増幅ステップ中に合成される。
増幅反応の成分（例えば、１種又は複数種の増幅試薬）としては、例えば、１種又は複数種のプライマー（例えば、個々のプライマー、プライマー対、プライマーセット、オリゴヌクレオチド、及びマルチプレックス増幅のための複数種のプライマーセットなど）、核酸標的（例えば、試料に由来する標的核酸）、１種又は複数種のポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰなど）、及び好適な緩衝液（例えば、デタージェント、還元剤、一価イオン、及び二価イオンを含む緩衝液）を挙げることができる。増幅反応は、逆転写酵素、逆転写プライマー、及び１種又は複数種の検出剤の１種又は複数種をさらに含んでいてもよい。
核酸増幅は、天然ヌクレオチド、例えば、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び／又は誘導体化ヌクレオチドの存在下で実施することができる。天然ヌクレオチドは、一般に、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、又はウリジル酸を指す。誘導体化ヌクレオチドは、一般に、天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドである。リボヌクレオシド三リン酸は、ＮＴＰ又はｒＮＴＰと呼ばれ、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕであってもよい。デオキシヌクレオシド三リン酸基質はｄＮＴＰと呼ばれ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵであってもよい。単量体ヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、ＤＮＡ又はＲＮＡに特に言及することなく、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵとして表記される場合がある。一部の実施形態では、検出可能な標識（例えば、蛍光標識又は比色標識）を含む類似体などの、天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を使用することができる。例えば、核酸増幅は、標識ｄＮＴＰ、例えば、32Ｐ、33Ｐ、125Ｉ、又は35Ｓなどの放射性標識；アルカリホスファターゼなどの酵素標識；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識；又はビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、若しくは蛍光色素などの他の標識の存在下で実施することができる。一部の実施形態では、核酸増幅は、修飾ｄＮＴＰ、例えば、熱活性化ｄＮＴＰ（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ社のＣｌｅａｎＡｍｐ（商標）ｄＮＴＰ）の存在下で実施してもよい。
１種又は複数種の増幅試薬は、非酵素成分及び酵素成分を含んでいてもよい。非酵素成分としては、例えば、プライマー、ヌクレオチド、緩衝液、塩、還元剤、デタージェント、及びイオンを挙げることができる。一部の実施形態では、非酵素成分は、タンパク質（例えば、核酸結合タンパク質）、酵素、又は酵素活性を有するタンパク質、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、及びリコンビナーゼなどを含まない。一部の実施形態では、酵素成分は、ポリメラーゼからなるか、又はポリメラーゼ及び逆転写酵素からなる。したがって、そのような酵素成分は、他のタンパク質（例えば、核酸結合タンパク質及び／又は酵素活性を有するタンパク質）、例えば、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、及びリコンビナーゼなどを除外することになる。
一部の実施形態では、増幅条件は、酵素活性（例えば、ポリメラーゼにより提供される酵素活性、又はポリメラーゼ及び逆転写酵素により提供される酵素活性）を含む。一部の実施形態では、酵素活性は、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素以外の酵素、例えば、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、及びリコンビナーゼなどにより提供される酵素活性を含まない。ポリメラーゼ活性及び逆転写酵素活性は、別々の酵素又は別々の酵素タイプ（例えば、ポリメラーゼ及び逆転写酵素）により提供してもよく、又は単一の酵素又は酵素タイプ（例えば、ポリメラーゼ）により提供してもよい。
核酸の増幅は、非熱サイクルタイプのＰＣＲを含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸の増幅は、等温増幅プロセス、例えば等温ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）を含む。等温増幅は、一般に、一定の温度で実施される増幅プロセスである。等温条件、等温的に、及び一定の温度などの用語は、一般に、増幅反応の過程において反応温度が本質的に一定に保たれる反応条件を指す。等温増幅条件は、一般に、増幅プロセスに熱サイクル（つまり、上限温度と下限温度との間のサイクル）成分を含ない。等温条件下で増幅する場合、反応は、本質的に一定の温度に保つことができ、これは、温度が正確に１つの温度に維持されなくともよいことを意味する。例えば、等温増幅プロセスでは、環境又は装置ベース変数などのため、温度の小さな変動（例えば、±１～５℃など）が生じる場合がある。多くの場合、反応容積全体は本質的に一定の温度に保たれ、本明細書での等温反応には、一般に、反応ベッセル内で生成される温度勾配及び／又は対流に基づく温度サイクルに依存する増幅条件は含まれない。
本明細書での等温増幅反応は、本質的に一定の温度で実施することができる。一部の実施形態では、本明細書での等温増幅反応は、約５５℃の温度～約７５℃の温度、例えば、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、若しくは７５℃の温度若しくはこれらの値のおよその温度、又はこうした値のいずれか２つの間の数値又は範囲の温度で実施される。一部の実施形態では、温度要素（例えば、熱源）は、本質的に一定の温度、例えば、約７５℃若しくはそれを下まわる、摂氏約７０度若しくはそれを下まわる、約６５℃若しくはそれを下まわる、又は約６０℃若しくはそれを下まわる、本質的に一定の温度に維持される。
本明細書での増幅プロセスは、例えば、検出可能な核酸増幅産物が生成されるまで、ある特定の期間にわたって実施することができる。核酸増幅産物は、あらゆる好適な検出プロセス及び／又は本明細書に記載の検出プロセスにより検出することができる。増幅プロセスは、約２０分間以内若しくはそれよりも短い時間で、又は約１０分間以内若しくはそれよりも短い時間で実施することができる。例えば、増幅プロセスは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０分間以内に、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲以内で実施することができる。
一部の実施形態では、核酸標的は、核酸を変性させる作用剤又は条件に曝露させずに増幅することができる。一部の実施形態では、核酸標的は、増幅ステップ（及び／又は他のステップ）中に鎖分離を促進する作用剤又は条件に曝露させずに増幅することができる。一部の実施形態では、増幅ステップ（及び／又は他のステップ）中に解巻を促進する作用剤又は条件に曝露させずに核酸標的を増幅することができる。核酸を変性させ、及び／又は鎖分離を促進し、及び／又は解巻を促進する作用剤又は条件としては、例えば、熱条件（例えば、高温）、ｐＨ条件（例えば、高ｐＨ又は低ｐＨ）、化学剤、及びタンパク質（例えば、酵素剤）などを挙げることができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示の方法は、熱変性（例えば、核酸を含む溶液を、例えば７５℃、８０℃、９０℃、又は９５℃、又はそれよりも高い温度などの高温に加熱すること）も、タンパク質に基づく（例えば、酵素的な）核酸の変性も含まない。タンパク質に基づく（例えば、酵素的な）変性は、核酸を、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼ、ＲＮＡレプリカーゼ、及び核酸結合タンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質）の１種又は複数種と接触させることを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼ、ＲＮＡレプリカーゼ、及び／又は核酸結合タンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質）を含まない。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法は、挿入剤、アルキル化剤、及び／又はホルムアミド、グリセロール、尿素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、若しくはＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン（ベタイン）などの化学薬品を含まない。一部の実施形態では、本開示の方法は、核酸を変性作用剤（例えば、ホルムアミド）と接触させることを含まない。一部の実施形態では、増幅ステップは、核酸を変性させる（例えば、鎖分離を促進し、及び／又は解巻を促進する）作用剤及び／又は条件を含まない。一部の実施形態では、増幅ステップ（例えば、ステップ（ｃ））は、ポリメラーゼ（例えば、超好熱菌ポリメラーゼ）以外の、核酸を変性させる（例えば、鎖分離を促進する、及び／又は解巻を促進する）作用剤及び／又は条件を含まない。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ポリメラーゼ（例えば、超好熱菌ポリメラーゼ）及び／又は低ｐＨ条件（例えば、酸との接触）以外に、核酸を変性させる（例えば、鎖分離を促進する、及び／又は解巻を促進する）作用剤及び／又は条件を含まない。
核酸標的は、鎖分離及び／又は解巻を促進する作用剤又は条件、例えば、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼ、ＲＮＡレプリカーゼ、核酸結合タンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質）、又はそれらのあらゆる組合せに曝露させずに増幅することができる。例えば、核酸標的は、ＤＮＡヘリカーゼ及びＲＮＡヘリカーゼを含むがこれらに限定されないヘリカーゼに曝露させずに増幅することができる。ヘリカーゼの使用を含まない増幅条件は、無ヘリカーゼ増幅条件である。
核酸標的は、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＲａｄＡ、Ｔ４ ｕｖｓＸを含むがこれらに限定されないリコンビナーゼに曝露させずに増幅することができる。一部の実施形態では、核酸標的は、リコンビナーゼアクセサリータンパク質、例えば、リコンビナーゼ負荷因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（例えば、Ｔ４ ｕｖｓＹ）に曝露させずに増幅される。核酸標的は、核酸結合タンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ））、例えばＴ４ ｇｐ３２に曝露させずに増幅することができる。一部の実施形態では、核酸標的は、トポイソメラーゼに曝露させずに増幅される。核酸標的は、核酸を不安定化する作用剤又は条件に曝露させて又は曝露させずに増幅することができる。本明細書で使用される場合、「不安定化」という用語には、その通常の意味が与えられるものとし、また、傾斜、回転、捻れ、スリップ、及びフリップ効果の１種又は複数種による、核酸分子の全体的な組織性及び幾何学的配向性（例えば、二重らせん構造）の破壊を指すものとする（例えば、Lenglet et al., (2010) Journal of Nucleic Acids Volume 2010, Article ID 290935, 17 pagesの記載の通り）。不安定化は、一般に、核酸鎖の融解又は分離（例えば、変性）を指すものではない。核酸不安定化は、例えば、挿入剤若しくはアルキル化剤などの作用剤、及び／又はホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、若しくはＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン（ベタイン）などの化学薬品に曝露させることにより達成することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１種又は複数種の不安定化剤の使用を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、不安定化剤の使用を除外する。一部の実施形態では、核酸標的は、リガーゼ及び／又はＲＮＡレプリカーゼに曝露させずに増幅される。
一部の実施形態では、核酸標的は、切断又は消化せずに増幅することができる。例えば、核酸標的は、１種又は複数種の切断剤に事前に曝露させずに増幅することができ、インタクト核酸が増幅される。一部の実施形態では、核酸標的は、増幅中に１種又は複数種の切断剤に曝露させずに増幅される。一部の実施形態では、核酸標的は、増幅後に１種又は複数種の切断剤に曝露させずに増幅される。切断剤の使用を含まない増幅条件は、本明細書では、無切断剤増幅条件と呼ばれる場合がある。「切断剤」という用語は、一般に、１種又は複数種の特異的又は非特異的部位で核酸を切断することができる作用剤、場合によっては化学薬品又は酵素を指す。特異的切断剤は、多くの場合、特定のヌクレオチド配列に従って特定の部位を特異的に切断する。切断剤としては、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素及びニッキング酵素など）；エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、５’－３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、及びポリ（Ａ）特異的３’－５’エキソヌクレアーゼ）；並びに化学的切断剤を挙げることができる。
核酸標的は、制限酵素及び／又はニッキング酵素を使用せずに増幅することができる。一部の実施形態では、核酸は、制限酵素及び／又はニッキング酵素に事前に曝露させずに増幅される。一部の実施形態では、核酸は、増幅中に制限酵素及び／又はニッキング酵素に曝露させずに増幅される。一部の実施形態では、核酸は、増幅後に制限酵素及び／又はニッキング酵素に曝露させずに増幅される。核酸標的は、エキソヌクレアーゼ処理をせずに増幅することができる。エキソヌクレアーゼとしては、例えば、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、５’－３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、及びポリ（Ａ）特異的３’－５’エキソヌクレアーゼが挙げられる。一部の実施形態では、核酸は、増幅前、増幅中、及び／又は増幅後にエキソヌクレアーゼ処理をせずに増幅される。エキソヌクレアーゼの使用を含まない増幅条件は、無エキソヌクレアーゼ増幅条件である。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡｓｅ処理及び／又はＲＮＡｓｅ処理をせずに増幅される。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｓｅＨ処理をせずに増幅される。
増幅された核酸は、本明細書では、核酸増幅産物又はアンプリコンと呼ばれる場合がある。一部の実施形態では、増幅産物は、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、及びヌクレオチド類似体など、並びに前述のものの組合せを含む。増幅産物は、典型的には、試料核酸の配列（例えば、標的配列）又はその相補体と同一又は実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する。増幅産物中の「実質的に同一の」ヌクレオチド配列は、一般に、増幅されているヌクレオチド配列又はその相補体に対して高度の配列同一性（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％よりも高い配列同一性）を有することになり、変動は、ポリメラーゼフィデリティー不良又は他の変数の結果であることがある。
一部の実施形態では、核酸増幅産物は、試料核酸中の標的配列と連続的に相補的であるか又は実質的に同一であるポリヌクレオチドを含む。連続的に相補的とは、一般に、例えば、各塩基が順番に（例えば、５’から３’へと読んで）第２の鎖の対応する順番の塩基と対合する第１の鎖のヌクレオチド配列を指し、連続的に相補的であるとみなされる配列内には、ギャップも、追加の配列も、非対合塩基も存在しない。別の言い方をすれば、連続的に相補的とは、一般に、第１の鎖のヌクレオチド配列のすべての連続塩基が、第２の鎖のヌクレオチド配列の対応する連続塩基と相補的であることを指す。例えば、配列５’－ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣ－３’（配列番号３）を有する第１の鎖は、配列５’－ＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ－３’（配列番号４）を有する第２の鎖と連続的に相補的であるとみなされることになり、第１の鎖のすべての連続塩基は、第２の鎖の対応するすべての連続塩基と相補的である。しかしながら、配列５’－ＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣ－３’（配列番号５）を有する第１の鎖は、配列５’－ＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ－３’（配列番号４）を有する第２の鎖と連続的に相補的であるとはみなされないだろう。なぜならば、第１の鎖の中央にある６つのアデニン（６つのＡ）の配列は、第２の鎖の塩基と対合しないことになるからである。連続的に相補的な配列は、場合によっては、約５～約２５連続塩基長、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はこうした値のいずれか２つの間の範囲の連続塩基長である。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、試料核酸中の標的配列と連続的に相補的であるか又は実質的に同一であるポリヌクレオチドからなる。したがって、一部の実施形態では、核酸増幅産物は、標的配列と連続的に相補的でないか若しくは実質的に同一ではないあらゆる追加の配列（例えば、５’末端及び／若しくは３’末端に、又は産物内に）、例えばテイルプライマー若しくはライゲーションにより増幅産物に組み込まれた追加の配列、及び／又は切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列を含まない。一般に、標的配列がタンデムリピートを含まない限り、増幅産物はタンデムリピートの形態の産物を含まない。
核酸増幅産物は、増幅反応に使用される１種又は複数種のプライマーと相補的な又は実質的に同一な配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列と連続的に相補的であるか又は同一である第１のヌクレオチド配列、及び第２のプライマー配列と連続的に相補的であるか又は同一である第２のヌクレオチド配列を含む。
核酸増幅産物はスペーサー配列を含んでいてもよい。本明細書に記載のように、増幅産物中のスペーサー配列は、試料核酸中の標的配列の一部と連続的に相補的であるか又は実質的に同一である配列（１つ又は複数の塩基）であり、増幅反応に使用された１種又は複数種のプライマーと相補的であるか又は実質的に同一である増幅産物中の配列によりフランキングされている。増幅産物中の配列によりフランキングされたスペーサー配列は、一般に、第１の配列（第１のプライマーと相補的な又は実質的に同一な）と第２の配列（第２のプライマーと相補的な又は実質的に同一な）との間に位置する。したがって、増幅産物は、典型的には、第１の配列、続いてスペーサー配列、続いて第２の配列を含む。スペーサー配列は、一般に、プライマーの配列と相補的でもなく、実質的に同一でもない。スペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０塩基を含む、約１～１０塩基であってもよく又は含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列と連続的に相補的であるか又は同一である第１のヌクレオチド配列、第２のプライマー配列と連続的に相補的であるか又は同一である第２のヌクレオチド配列、及びスペーサー配列からなるか又はから本質的になる。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列及び第２のプライマー配列と連続的に相補的でも同一でもないあらゆる追加の配列を含まず（例えば、５’末端及び／若しくは３’末端に、又は産物内に）、スペーサー配列、例えば、テイル又はループプライマー、ライゲーション、又は他の機序により増幅産物に組み込まれた追加の配列の一部ではない。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、一般に、第１のプライマー配列及び第２のプライマー配列と連続的に相補的でも同一でもない追加の配列を含まず（例えば、５’末端及び／若しくは３’末端に、又は産物内に）、スペーサー配列、例えば、テイル又はループプライマー、ライゲーション、又は他の機序により増幅産物に組み込まれた追加の配列の一部ではない。しかしながら、そのような実施形態では、核酸増幅産物は、例えば、増幅プロセスにおけるエラー又は乱雑性により産物に導入された幾つかのミスマッチ（つまり、非相補的な）塩基又はもう１つの余分な塩基を含んでいてもよい（例えば、５’末端及び／若しくは３’末端に、又は産物内に）。
核酸増幅産物は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲の塩基長を含む、最大で５０塩基長であってもよい。一部の実施形態では、所与の標的配列の核酸増幅産物は、同じ長さ又は実質的に同じ長さを有する（例えば、１～１０塩基以内）。したがって、所与の標的配列の核酸増幅産物は、単一のシグナル（例えば、電気泳動ゲルのバンド）を生成することができ、一般に、複数の長さを示す複数のシグナル（例えば、電気泳動ゲルのラダー又はスメア）を生成しない。マルチプレックス反応では、異なる標的配列の核酸増幅産物は異なる長さを有してもよい。
本明細書に記載の方法及び成分は、一般に、１種よりも多くの目的の核酸の増幅（例えば、１種よりも多くの標的配列の増幅）を指すマルチプレックス増幅のために使用することができる。例えば、マルチプレックス増幅は、同じ試料から複数種の配列を増幅すること、又は試料中の幾つかの配列の１種を増幅することを指すことができる。マルチプレックス増幅は、複数の試料に存在する１種又は複数種の配列を同時に又は段階的に増幅することを指すこともできる。例えば、マルチプレックス増幅は、増幅可能な少なくとも２種の標的配列を増幅するために使用することができる（例えば、増幅反応は、少なくとも２種の標的配列を増幅するために適切なプライマー及び酵素を含む）。一部の実施形態では、増幅反応は、少なくとも２種の標的配列を検出するように準備されるが、試験されている試料には標的配列の１種のみが存在し、そのため両方の配列が増幅可能であるが、１種の配列のみが増幅される。一部の実施形態では、２種の標的配列が存在する場合、増幅反応は、両方の標的配列の増幅をもたらす。適切なプライマー及び酵素を含むマルチプレックス増幅反応は、標的配列の１種、一部、又はすべての増幅をもたらすことができる。一部の実施形態では、増幅反応は、１対のプライマーを用いて２種の配列を検出するように準備され、一方の配列は標的配列であり、一方の配列は対照配列（例えば、標的配列と同じプライマーにより増幅可能であり、標的とは異なるスペーサー塩基又は配列を有する合成配列）である。一部の実施形態では、増幅反応は、対応するプライマー対を用いて複数セットの配列を検出するように準備されており、各セットは標的配列及び対照配列を含む。
プライマー
核酸増幅は、一般に、１種又は複数種のプライマーの存在下で実施される。プライマーは、一般に、特定の目的の領域（つまり、標的配列）で又はその付近で（例えば、隣接して）標的核酸にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであると特徴付けられる。プライマーは、例えば、標的核酸のヌクレオチド配列の特異的決定、又は標的核酸若しくはその特徴の検出（例えば、配列の存在又は非存在）を可能にすることができる。プライマーは天然に存在してもよく又は合成であってもよい。特異的又は特異性という用語は、一般に、標的ポリヌクレオチドに対するプライマーなど、１つの分子と別の分子との結合又はハイブリダイゼーションを指す。つまり、特異的又は特異性という用語は、そうした２つの分子のいずれかと他の分子との実質的により低い認識、接触、又は複合体形成と比較した、２つの分子間の安定複合体の認識、接触、及び形成を指す。アニーリング又はハイブリダイズという用語は、一般に、２つの分子間の安定複合体形成を指す。プライマー、オリゴ、又はオリゴヌクレオチドという用語は、プライマーを参照する場合、本明細書では同義的に使用することができる。
プライマーは、好適なプロセスを使用して設計及び合成することができ、標的配列にハイブリダイズし、本明細書に記載の増幅プロセスを実施するのに好適なあらゆる長さのものであってもよい。プライマーは、多くの場合、標的核酸の配列に応じて設計される。一部の実施形態では、プライマーは、約５～約３０塩基長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０塩基長であってもよい。プライマーは、天然に存在するヌクレオチド及び／若しくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、修飾ヌクレオチド、標識ヌクレオチド）又はそれらの混合物で構成されていてもよい。修飾及び修飾塩基としては、例えば、リン酸化（例えば、３’リン酸化、５’リン酸化）；付着化学又はリンカー修飾（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル－ＴＥＧ、Ｉ－Ｌｉｎｋｅｒ（商標）、アミノ修飾因子（例えば、アミノ修飾因子Ｃ６、アミノ修飾因子Ｃ１２、アミノ修飾因子Ｃ６ｄＴ、Ｕｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾因子）、アルキン（例えば、５’ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ）、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチン－ＴＥＧ）、チオール修飾（例えば、チオール修飾因子Ｃ３Ｓ－Ｓ、ジチオール、チオール修飾因子Ｃ６Ｓ－Ｓ））；フルオロフォア（例えば、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）、ＡＴＴＯ（商標）色素、ローダミン色素、ＷｅｌｌＲＥＤ色素、６－ＦＡＭ（アジド）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ（ＮＨＳエステル）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０（ＮＨＳエステル）、Ｄｙ７５０（ＮＨＳエステル））；Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ダーククエンチャー修飾（例えば、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ）；ダーククエンチャー修飾（例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）－１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）－２、Ｄａｂｃｙｌ）；スペーサー（Ｃ３スペーサー、ＰＣスペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、１’，２’－ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）；修飾塩基（例えば、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、逆位ジデオキシ－Ｔ、ジデオキシ－Ｃ、５－メチルｄＣ、デオキシイノシン、ＳｕｐｅｒＴ（登録商標）、ＳｕｐｅｒＧ（登録商標）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、ＵＮＡアンロックド核酸（例えば、ＵＮＡ－Ａ、ＵＮＡ－Ｕ、ＵＮＡ－Ｃ、ＵＮＡ－Ｇ）、Ｉｓｏ－ｄＣ、Ｉｓｏ－ｄＧ、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ）；ホスホロチオエート（ＰＳ）結合修飾（例えば、ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、ホスホロチオエート化ＬＮＡ塩基）；及びクリック化学修飾を挙げることができる。一部の実施形態では、修飾及び修飾塩基としては、ウラシル塩基、リボヌクレオチド塩基、Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、ＰＳ結合、３’リン酸基、スペーサー塩基（Ｃ３スペーサー又は他のスペーサー塩基など）が挙げられる。例えば、プライマーは、１つ又は複数のＯ－メチルＲＮＡ塩基（例えば、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基）を含んでいてもよい。２’－Ｏ－メチルＲＮＡは、一般に、ｔＲＮＡ及び他の低分子ＲＮＡに見出されるＲＮＡの転写後修飾である。２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基を含むプライマーを直接合成することができる。この修飾は、例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＴｍを増加させ、一本鎖リボヌクレアーゼ及びＤＮａｓｅの存在下での安定性を提供することができる。２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基をプライマーに含めて、例えば、安定性及び標的配列との結合親和性を増加させることができる。一部の実施形態では、プライマーは、１つ又は複数のホスホロチオエート（ＰＳ）連結（例えば、ＰＳ結合修飾）を含んでいてもよい。ＰＳ結合は、プライマーのリン酸骨格の非架橋酸素を硫黄原子に置換する。この修飾は、典型的には、ヌクレオチド間結合をヌクレアーゼ分解に対して耐性にする。ＰＳ結合を、プライマーの５’末端又は３’末端の最後の約３～５ヌクレオチドの間に導入して、例えば、エキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。一部の実施形態では、プライマー全体にわたって含まれるＰＳ結合は、エンドヌクレアーゼによる攻撃の低減を支援することができる。プライマーは、例えば、３’リン酸基を含んでいてもよい。３’リン酸化は、ある特定の３’－エキソヌクレアーゼによる分解を阻害することができ、ある特定の場合では、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止するために使用することができる。一部の実施形態では、プライマーは、１つ又は複数のスペーサー塩基（例えば、１つ又は複数のＣ３スペーサー）を含む。Ｃ３スペーサーホスホラミダイトを、プライマーの内部又は５’末端に組み込むことができる。複数のＣ３スペーサーをプライマーのいずれかの末端に付加して、例えば、フルオロフォア又は他のペンダント基を付着させための長鎖親水性スペーサーアームを導入することができる。
プライマーは、ＤＮＡ塩基、ＲＮＡ塩基、又はその両方を含んでいてもよく、ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基の１つ又は複数は、修飾されているか又は修飾されていない。例えば、プライマーは、ＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基の混合物であってもよい。プライマーは、ＤＮＡ塩基（例えば、修飾ＤＮＡ塩基及び／又は未修飾ＤＮＡ塩基）からなっていてもよい。一部の実施形態では、プライマーは未修飾ＤＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＤＮＡ塩基からなる。プライマーは、ＲＮＡ塩基（例えば、修飾ＲＮＡ塩基及び／又は未修飾ＲＮＡ塩基）からなっていてもよい。一部の実施形態では、プライマーは未修飾ＲＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＲＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーはＲＮＡ塩基を含まない。一部の実施形態では、プライマーはＤＮＡ塩基を含まない。一部の実施形態では、プライマーは、切断剤認識部位を含まない（例えば、ニッキング酵素認識部位を含まない）。一部の実施形態では、プライマーはテイルを含まない（例えば、ニッキング酵素認識部位を含むテイルを含まない）。
一部の実施形態では、プライマー配列の全部又は一部は、標的核酸と相補的であってもよく又は実質的に相補的であってもよい。配列に関連して実質的に相補的であるとは、一般に、互いにハイブリダイズすることになるヌクレオチド配列を指す。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変更して、様々な量の配列ミスマッチを許容することができる。標的配列及びプライマー配列は、例えば、互いに７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的であることを含む、互いに少なくとも７５％相補的であってもよい。標的核酸配列と実質的に相補的であるプライマーは、典型的には、標的核酸配列の相補体（つまり、標的核酸のアンチセンス鎖の配列）とも実質的に同一である。プライマー及び標的核酸のアンチセンス鎖は、配列が少なくとも７５％同一であってもよく、例えば、互いに７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であってもよい。
一部の実施形態ではプライマーは、１対のプライマーを含む。１対のプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマー（例えば、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖に結合するプライマー）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プライマーは、１対のプライマー（つまり、フォワードプライマー及びリバースプライマー）からなる。したがって、一部の実施形態では、標的配列の増幅は、１対のプライマーを使用して実施され、標的配列の増幅には追加のプライマー又はオリゴヌクレオチドは含まれていない（例えば、増幅反応成分は、所与の標的配列に対する追加のプライマー対、ネステッドプライマー、バンパープライマー（ｂｕｍｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、プライマー以外のオリゴヌクレオチド、及びプローブなどを含まない）。一部の実施形態では、プライマーは、１対のプライマーからなる。一部の実施形態では、増幅反応は、マルチプレックス増幅などにおいて、異なる標的配列を増幅するための追加のプライマー対を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プライマーは１対のプライマーからなるが、一部の実施形態では、増幅反応は、増幅の一部とはみなされない検出プロセスのための追加のプライマー、オリゴヌクレオチド、又はプローブを含んでいてもよい。一部の実施形態では、プライマーはセットで使用される。増幅プライマーセットは、所与の標的配列に対する１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含んでいてもよい。マルチプレックス増幅の場合、第１の標的配列を増幅するプライマーはプライマーセットであるとみなされ、第２の標的配列を増幅するプライマーは異なるプライマーセットであるとみなされる。
増幅反応成分は、試料核酸の第１の鎖（例えば、センス鎖、フォワード鎖）の標的配列に相補的な第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）、及び試料核酸の第２の鎖（例えば、アンチセンス鎖、リバース鎖）の標的配列に相補的である第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）を含むか又はからなっていてもよい。一部の実施形態では、第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第１の鎖の標的配列と連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第２の鎖の標的配列と連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む。プライマー－標的に関して連続的に相補的であるとは、一般に、各塩基が標的配列内の対応する順番の塩基と順番に対合し、連続的に相補的であるとみなされる配列内にはギャップも、追加の配列も、非対合塩基も存在しない、プライマーのヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、プライマーは、標的配列と連続的に相補的でないあらゆる追加の配列（例えば、５’末端及び／若しくは３’末端に、又はプライマー内に）、例えば、テイルプライマー若しくはループプライマーに存在する追加の配列、及び／又は切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列を含まない。一部の実施形態では、増幅反応成分は、追加の配列（つまり、標的配列と連続的に相補的である配列以外の配列）を含むプライマー、例えば、テイルプライマー、ループプライマー、ステップループ構造（ｓｔｅｐ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、ヘアピン構造を形成することが可能なプライマー、及び／又は切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列などを含まない。
一部の実施形態では、プライマーは、１つ又は複数のイノシン、脱塩基部位、ロックド核酸、副溝結合剤、二重鎖安定剤（例えば、アクリジン、スペルミジン）、Ｔｍ修飾因子、又はプライマーの結合特性を変化させるあらゆる修飾因子などの修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プライマーは、検出可能な分子又は実体（例えば、フルオロフォア、放射性同位元素、比色試薬、粒子、及び酵素など）を含んでいてもよい。
ポリメラーゼ
増幅反応成分（例えば、１種又は複数種の増幅試薬）は、１種又は複数種のポリメラーゼを含んでいてもよい。ポリメラーゼは、核酸標的配列（例えば、プライマーがアニーリングするもの）に対するプライマー分子、例えば本明細書に記載の増幅プライマーの３’ヒドロキシル末端を伸長するヌクレオチドの特異的組込みを触媒することが可能なタンパク質である。ポリメラーゼの非限定的な例としては、高温反応温度（例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００℃を上まわる）で活性を示すことができる好熱性又は超好熱性ポリメラーゼが挙げられる。超好熱性ポリメラーゼは、超好熱菌ポリメラーゼと呼ばれる場合がある。ポリメラーゼは、鎖置換能力を有していてもよく又は有していなくてもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、単一の合成で約１～約５０ヌクレオチド、例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０ヌクレオチド、又は単一の合成でこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲のヌクレオチドを組み込むことができる。
増幅反応成分は、以下のものから選択される１種又は複数種のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい：９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ；９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（大型断片）；Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大型（クレノウ）断片；クレノウ断片（３’－５’ｅｘｏ－）；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ ＤＮＡ；ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ；ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ；ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、大型断片（ＩｓｏＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）；ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ；ＳＰ６ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｂｒ ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼベータ；及びＴｈｅｒｍｏＰｈｉ ＤＮＡポリメラーゼ。
一部の実施形態では、増幅反応成分は、１種又は複数種の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、高温で熱安定性である超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ）を含む。超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼの半減期は、９５℃では約５～１０時間であってもよく、１００℃で約１～３時間であってもよい。例えば、増幅反応成分は、古細菌由来の１種又は複数種の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）由来の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、又はサーモコッカセアエン・アルカエアン（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅｎ ａｒｃｈａｅａｎ）由来の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、増幅反応成分は、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノコッカス科（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、又はサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来の１種又は複数種の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来の１種又は複数種の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。
一部の実施形態では、増幅反応成分は、超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ又はその機能的断片を含む。機能的断片は、一般に、全長ポリメラーゼの１つ又は複数の機能、例えば、ＤＮＡを重合する能力（例えば、増幅反応における）を保持する。一部の場合では、機能的断片は、機能（例えば、増幅反応におけるＤＮＡの重合）を、全長ポリメラーゼの機能レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％のレベルで実施する。ポリメラーゼ活性のレベルは、例えば、本明細書に記載の方法など、検出可能な核酸増幅法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号１若しくは配列番号２の機能的断片を含む超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。
一部の実施形態では、増幅反応成分（例えば、１種又は複数種の増幅試薬）は、超好熱菌ポリメラーゼ又はその機能的断片と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列又はそれらの機能的断片と少なくとも約９０％、９５％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼを含む。
ポリメラーゼは、逆転写能力を有してもよい。そのような実施形態では、増幅反応は、例えば、別々の逆転写酵素を使用せず、単一ステップでＲＮＡ標的を増幅することができる。逆転写酵素能力を有するポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｂｓｔ（大型断片）、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩなどが挙げられる。増幅反応成分は、１種又は複数種の別々の逆転写酵素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１種よりも多くのポリメラーゼが増幅反応に含まれている。例えば、増幅反応は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ、及び逆転写酵素活性を有さない第２のポリメラーゼを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を有する１種又は複数種のポリメラーゼが増幅中に使用される。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を有しないか又は低い１種又は複数種のポリメラーゼが増幅中に使用される。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を有しないか又は低いポリメラーゼは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低減又は排除する１つ又は複数の修飾（例えば、アミノ酸置換）を含む。例えば、エキソヌクレアーゼ活性が低い修飾ポリメラーゼは、非修飾ポリメラーゼと比較して１０％又はそれよりも低い、例えば、非修飾ポリメラーゼと比較して約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満のエキソヌクレアーゼ活性を有してもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないか若しくは低く、及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有しないか若しくは低い。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、一本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性を有しないか若しくは低く、及び／又は二本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性を有しないか若しくは低い。ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低減又は排除することができる修飾の非限定的な例としては、配列番号１の１４１位及び／若しくは１４３位及び／若しくは４５８位における、又は配列番号１の１４１位及び／若しくは１４３位及び／若しくは４５８位に対応する位置における１つ若しくは複数のアミノ酸置換（例えば、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｅ１４３Ｄ、及びＡ４８５Ｌ）を含む。
検出及び定量化
本明細書に記載の方法は、核酸増幅産物を検出及び／又は定量化することを含んでいてもよい。増幅産物は、例えば、本明細書に記載のあらゆる好適な検出法及び／又は定量化法により検出及び／又は定量化することができる。検出法及び／又は定量化法の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：分子ビーコン（例えば、リアルタイム、エンドポイント）、側方流動、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、表面捕捉、５’－３’エキソヌクレアーゼ加水分解プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）、挿入／結合色素、吸光度法（例えば、比色分析、濁度）、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）、質量分析、核酸シーケンシング、デジタル増幅、プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（商標））、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の分子反転プローブ（ＭＩＰ）技術、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、パイロシーケンス分析、アシクロプライム分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシーケンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイｍｉｎｉｓｅｑ、アレイプライマーエクステンション（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマーエクステンション、Ｔａｇアレイ、コードマイクロスフェア、鋳型指向性組込み（ＴＤＩ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、比色オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コードＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パッドロックプローブ、インベーダーアッセイ、少なくとも１種のプローブを使用したハイブリダイゼーション、少なくとも１種の蛍光標識プローブを使用するハイブリダイゼーション、クローニング及びシーケンシング、ハイブリダイゼーションプローブ及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の使用、ナノポアシークエンシング、チップ、及びそれらの組合せ。一部の実施形態では、核酸増幅産物の検出は、リアルタイム検出法の使用を含む（つまり、産物は、増幅プロセス中に検出及び／又は継続的にモニターされる）。一部の実施形態では、核酸増幅産物の検出は、エンドポイント検出法の使用を含む（つまり、産物は、増幅プロセスの完了又は停止後に検出される）。核酸検出法は、標的配列に直接組み込まれているか、又は標的に対する相補的配列を含むプローブに組み込まれている標識ヌクレオチドの使用を採用することもできる。このような標識は、性質が放射性及び／又は蛍光性であってもよく、本明細書で考察されている様式のいずれかで解像することができる。一部の実施形態では、核酸増幅産物の定量化は、下記に記載の１つ又は複数の検出法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、検出法は、シグナル強度の測定、並びに／又は核酸増幅産物の定量化のための標準曲線及び／若しくはルックアップテーブルの作成（又は参照）と併せて使用することができる。
核酸増幅産物の検出は、分子ビーコン技術の使用を含んでいてもよい。分子ビーコンという用語は、一般に、検出可能な分子であって、その分子の検出可能な特性は、ある特定の条件下で検出可能であり、それにより分子が特定の有益なシグナルとして機能することが可能になる。検出可能な特性の非限定的な例としては、光学的特性（例えば、蛍光）、電気的特性、磁気的特性、化学的特性、及び既知サイズの開口部を通過する時間又は速度が挙げられる。核酸分子を検出するための分子ビーコンは、例えば、一方の末端にフルオロフォアを、反対側の末端にクエンチング色素を含むヘアピン形状のオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピンのループは、標的配列に相補的なプローブ配列を含んでいてもよく、ステムは、プローブ配列の両側に位置する相補的なアーム配列のアニーリングにより形成される。フルオロフォア及びクエンチング分子は、各アームの反対側の末端に共有結合で連結されていてもよい。オリゴヌクレオチドがその相補的標的にハイブリダイズすることを防止する条件下では、又は分子ビーコンが溶液中で遊離している場合は、蛍光分子及びクエンチング分子は互いに近接してＦＲＥＴを防止する。分子ビーコンが標的分子（例えば、核酸増幅産物）に遭遇すると、ハイブリダイゼーションが生じる可能性があり、ループ構造が、安定でより剛性の立体構造へと変換され、フルオロフォア分子及びクエンチャー分子の分離が引き起こされ、蛍光がもたらされる。プローブが特異的であるため、蛍光の発生は、一般に、意図されている増幅産物の合成のみによるものである。一部の場合では、分子ビーコンプローブ配列は、標的核酸中の配列と同一であるか又は相補的である、増幅産物中の配列にハイブリダイズする。一部の場合では、分子ビーコンプローブ配列は、標的核酸中の配列と同一でも相補的でもない、増幅産物中の配列にハイブリダイズする（例えば、テイル増幅プライマー又はライゲーションにより増幅産物に付加された配列にハイブリダイズする）。分子ビーコンは特異性が高く、一塩基多型を見分けることができる。分子ビーコンは、異なる色のフルオロフォア及び異なる標的配列を用いて合成することもできるため、同じ反応で（例えば、マルチプレックス反応で）幾つかの産物を同時に検出することができる。定量的増幅プロセスの場合、分子ビーコンは、増幅の各サイクル後に増幅標的と特異的に結合することができ、ハイブリダイズしていない分子ビーコンは暗色であるため、増幅産物の量を定量的に決定するためにプローブ－標的ハイブリッドを単離する必要はない。得られるシグナルは増幅産物の量に比例する。分子ビーコンを使用した検出は、リアルタイムで行ってもよく、又はエンドポイント検出法として行ってもよい。
核酸増幅産物の検出は、側方流動の使用を含んでいてもよい。側方流動の使用は、典型的には、ディップスティックアッセイ及び種々の適切なコーティングを施した薄層クロマトグラフィープレートを含むがこれらに限定されない側方流動デバイスの使用を含む。流路には、試料に対する種々の結合試薬、試料に対する結合パートナー又は結合パートナーを含むコンジュゲート、及びシグナル発生系が固定化されている。
核酸増幅産物の検出は、２種の発色団：ドナー分子及びアクセプター分子の間のエネルギー移動機序であるＦＲＥＴの使用を含んでいてもよい。手短に言えば、ドナーフルオロフォア分子が特定の励起波長で励起される。ドナー分子がその基底状態へと戻る際のその後のドナー分子の発光は、長距離双極子間相互作用により励起エネルギーをアクセプター分子へと移動させることができる。アクセプター分子の発光強度をモニターすることができ、発光強度は、ドナーとアクセプターとの間の距離、ドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルとの重複、及びドナー発光双極子モーメント及びアクセプター吸収双極子モーメントの向きの関数である。ＦＲＥＴは、分子ビーコンについて記載したように、例えば、ＤＮＡ－ＤＮＡ相互作用の分子動力学の定量化に有用であり得る。特定の産物の産生をモニターするために、プローブの一方の末端をドナー分子で標識し、他方の末端をアクセプター分子で標識することができる。プローブ－標的ハイブリダイゼーションにより、ドナーとアクセプターとの距離又は向きが変化し、ＦＲＥＴ変化が観察される。
核酸増幅産物の検出は、蛍光偏光（ＦＰ）の使用を含んでいてもよい。ＦＰ技法は、蛍光標識化合物が直線偏光で励起されると、その回転速度に反比例した偏光度を有する蛍光を発することになるという原理に基づく。したがって、例えば蛍光標識を有するトレーサー－核酸コンジュゲートなどの分子が直線偏光で励起されると、光が吸収されてから発光するまでの間はフルオロフォアの回転が拘束されるため、発光は高度に偏光したままである。遊離トレーサー化合物（つまり、核酸に結合していない）が直線偏光で励起されると、その回転は、対応するトレーサー－核酸コンジュゲートよりもはるかに速く、分子の向きはよりランダムになるため、放射光の偏光は解消される。したがって、蛍光偏光は、増幅反応で産生されたトレーサー－核酸コンジュゲートの量を測定するための定量的手段を提供する。
核酸増幅産物の検出は、例えば、特定のオリゴヌクレオチドを表面に固定化して感度及び選択性が両方とも高いバイオセンサーを製作することにより達成される表面捕捉の使用を含んでいてもよい。プローブを付着させるために使用することができる表面の例としては、金及び炭素が挙げられる。核酸増幅産物の検出は、５’－３’エキソヌクレアーゼ加水分解プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）の使用を含んでいてもよい。例えば、ＴＡＱＭＡＮプローブは、定量的増幅法（例えば、定量的ＰＣＲ）の特異性を増加させることができる加水分解プローブである。ＴＡＱＭＡＮプローブの原理は、１）相補的標的配列へのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断するＴａｑポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、及び２）フルオロフォアに基づく検出に依存する。得られる蛍光シグナルは、増幅の指数関数的段階中の増幅産物の蓄積の定量的測定を可能にし、ＴＡＱＭＡＮプローブは、検出の特異性を著しく増加させることができる。
核酸増幅産物の検出は、核酸を特異的に染色する色素を含む、挿入色素及び／又は結合色素の使用を含んでいてもよい（例えば、挿入色素は、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合すると蛍光の増強を呈する）。色素としては、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｉ（非対称性シアニン色素）、ＳＹＢＲ（登録商標）ＩＩ、ＴＯＴＯ（チアゾールオレンジ二量体）、及びＹＯＹＯ（オキサゾールイエロー二量体）を含むがそれらに限定されない、ＤＮＡ又はＲＮＡ挿入フルオロフォアを挙げることができる。核酸増幅産物の検出は、吸光度法（例えば、比色分析、濁度）の使用を含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸の検出及び／又は定量化は、吸光度（例えば、２６０ｎｍのＵＶ吸光度測定）を濃度へと直接変換することにより達成することができる。核酸の直接測定は、測定の経路長及び吸光係数を使用して吸光度を濃度に関係付けるランベルトベールの法則を使用して濃度へと変換することができる。核酸増幅産物の検出は、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）の使用及び／又は質量分析の使用を含んでいてもよい。質量分析は、核酸の構造及び量を決定するために使用することができる分析技法であり、複雑な混合物の迅速な分析を提供するために使用することができる。増幅後、試料をイオン化し、得られたイオンを、電場及び／又は磁場において質量対電荷比に従って分離することができ、イオンの質量対電荷比は検出器により測定される。質量分析法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、及びエレクトロスプレーが挙げられる。こうした方法は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）と組み合わせることができる。質量分析法（例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ ＭＳ））は、固体表面からの高速シグナル取得及び自動分析により、ハイスループットを実現することができる。
核酸増幅産物の検出は、核酸シーケンシングの使用を含んでいてもよい。増幅産物の配列全体又は部分配列を決定することができ、決定されたヌクレオチド配列はリードと呼ばれる場合がある。例えば、線形増幅産物は、さらなる増幅を行わずに（例えば、単一分子シーケンシング法を使用することにより）直接分析することができる。一部の実施形態では、線形増幅産物をさらなる増幅に供し、次いで分析する（例えば、ライゲーション又はパイロシーケンシング法によるシーケンシングを使用して）。配列決定法の非限定的な例としては、シングルエンドシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、可逆的ターミネーターに基づく配列決定、ライゲーションによる配列決定、パイロシーケンシング、合成による配列決定、単一分子配列決定、マルチプレックス配列決定、固相単一ヌクレオチド配列決定、及びナノポア配列決定が挙げられる。核酸増幅産物の検出は、デジタル増幅（例えば、デジタルＰＣＲ）の使用を含んでいてもよい。核酸のデジタル増幅及び分析用のシステムが利用可能である（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
溶解緩衝液
溶解剤
本明細書に開示のように、溶解剤は、デタージェントを含んでいてもよい。デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。アニオン性界面活性剤は、対イオンとしてＮＨ4 +、Ｋ+、Ｎａ+、又はＬｉ+を含んでいてもよい。カチオン性界面活性剤は、対イオンとしてＩ-、Ｂｒ-、又はＣｌ-を含んでいてもよい。
アニオン性界面活性剤は、ラウリン酸カリウム、ステアリン酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキル硫酸ナトリウム（Ｃ８－１６）、ドデシル硫酸ナトリウム、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルギン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸及びその塩、グリセリルエステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、胆汁酸及びその塩、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルスルホン酸塩、ステアリン酸及びその塩、ステアリン酸カルシウム、ホスフェート、カルボキシメチルセルロースナトリウム、スルホコハク酸ジオクチル、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル、リン脂質、及びカルボキシメチルセルロースカルシウムから選択することができる。
カチオン性界面活性剤は、以下のものから選択することができる：第四級アンモニウム化合物、塩化ベンザルコニウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、キトン酸、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アシルカルニチン塩酸塩、アルキルピリジニウムハライド、塩化セチルピリジニウム、カチオン性脂質、ポリメチルメタクリレートトリメチルアンモニウムブロミド、スルホニウム化合物、ポリビニルピロリドン－２－ジメチルアミノエチルメタクリレートジメチルスルフェート、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ホスホニウム化合物、第四級アンモニウム化合物、ベンジル－ジ（２－クロロエチル）エチルアンモニウムブロミド、ココナッツトリメチルアンモニウムクロリド、ココナッツトリメチルアンモニウムブロミド、ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、デシルトリエチルアンモニウムクロリド、デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドブロミド、Ｃ12-15－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、Ｃ12-15－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドブロミド、ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムブロミド、ラウリルジメチル（エテノキシ）4アンモニウムクロリド、ラウリルジメチル（エテノキシ）4アンモニウムブロミド、Ｎ－アルキル（Ｃ12-18）ジメチルベンジルアンモニウムクロリド、Ｎ－アルキル（Ｃ14-18）ジメチル－ベンジルアンモニウムクロリド、Ｎ－テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド一水和物、ジメチルジデシルアンモニウムクロリド、Ｎ－アルキル（Ｃ12-14）ジメチル１－ナフチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアンモニウムハライドアルキル－トリメチルアンモニウム塩、ジアルキル－ジメチルアンモニウム塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、エトキシル化アルキアミドアルキルジアルキルアンモニウム塩、エトキシル化トリアルキルアンモニウム塩、ジアルキルベンゼンジアルキルアンモニウムクロリド、Ｎ－ジデシルジメチルアンモニウムクロリド、Ｎ－テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド一水和物、Ｎ－アルキル（Ｃ12-14）ジメチル１－ナフチルメチルアンモニウムクロリド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ジアルキルベンゼンアルキルアンモニウムクロリド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムブロミド、Ｃ8-16トリメチルアンモニウムブロミド、Ｃ8-16トリメチルアンモニウムクロリド、Ｃ15トリメチルアンモニウムブロミド、Ｃ17トリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルベンジルトリエチルアンモニウムクロリド、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ジメチルアンモニウムクロリド、アルキルジメチルアンモニウムハロゲン化物、トリセチルメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリエチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、ＰＯＬＹＱＵＡＴ１０、テトラブチルアンモニウムブロミド、ベンジルトリメチルアンモニウムブロミド、コリンエステル、塩化ベンザルコニウム、ステアラルコニウムクロリド、臭化セチルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、第四級化ポリオキシエチルアルキルアミンのハロゲン化物塩、ＭＩＲＡＰＯＬ Ａｌｋａｑｕａｔ、アルキルピリジニウム塩、アミン、アミン塩、イミドアゾリニウム塩、プロトン化第四級アクリルアミド、メチル化第四級ポリマー、カチオン性グアーガム、塩化ベンザルコニウム、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、トリエタノールアミン、及びポロキサミン。
非イオン性界面活性剤は、以下のものから選択することができる：ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ソルビタンエステル、グリセリルエステル、モノステアリン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコールエステル、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、アリールアルキルポリエーテルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポロキサマー、ポロキサミン、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非結晶性セルロース、ポリサッカリド、デンプン、デンプン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、ステアリン酸トリエタノールアミン、アミンオキシド、デキストラン、グリセロール、アカシアゴム、コレステロール、トラガント、及びポリビニルピロリドン。非イオン性界面活性剤は、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、脂肪酸石鹸、ヒドロキシ脂肪酸、ヒドロペルオキシ脂肪酸、ポリヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸の塩、モノカルボン酸及びポリカルボン酸の塩、プロスタン酸及びプロスタグランジン、ロイコトリエン及びリポキシン、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、ｎ－アルキルエトキシル化硫酸塩、胆汁酸塩のコール酸塩及びデオキシコール酸塩、ペルフルオロカルボン酸、フルオロ脂肪族ホスホン酸塩（ｆｌｕｏｒｏａｃｌｉｐｈａｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、又はフルオロ脂肪族硫酸塩。
本明細書で提供される溶解剤は、変性作用剤として作用することが可能であってもよい。本明細書で使用される場合、「変性作用剤」又は「変性剤」には、その通常の意味が与えられるものとし、タンパク質の可逆的アンフォールディングを引き起こすことになるあらゆる化合物又は物質を含む。変性作用剤又は変性剤の強度は、特定の変性作用剤又は変性剤の特性及び濃度の両方により決定されることになる。好適な変性作用剤又は変性剤としては、カオトロープ、デタージェント、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、又は２種若しくはそれよりも多くのそのような作用剤の組合せが挙げられる。好適なカオトロープとしては、尿素、グアニジン、及びチオシアン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。有用なデタージェントとしては、ドデシル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎデタージェント）、サルコシルなどの強力なデタージェント、穏やかな非イオン性デタージェント（例えば、ジギトニン）、穏やかなカチオン性デタージェント（例えば、Ｎ－＞２，３－（ジオレイオキシ）－プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム）、穏やかなイオン性デタージェント（例えば、コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）、又はスルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３－（３－クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ－１－プロパン硫酸塩（ＣＨＡＰＳ）、及び３－（３－クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳＯ）を含むが、これらに限定されない双性イオン性デタージェント。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノール又はイソプロパノールなどのＣ2－Ｃ4アルカノール）、又は低級アルカンジオール（特に、エチレン－グリコールなどのＣ2－Ｃ4アルカンジオール）などの有機水混和性溶媒を変性剤として使用することができる。リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールなどの天然に存在するリン脂質、又はジヘキサノイルホスファチジルコリン若しくはジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体若しくはバリアントであってもよい。
好適な界面活性剤レベルは、全組成物の約０．１質量％～約２５質量％、約０．２５質量％～約１０質量％、又は約０．５質量％～約５質量％であってもよい。一部の実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及びそれらの混合物である。一部の実施形態では、アニオン性、両性、非イオン性、及び双性イオン性界面活性剤（及びそれらの混合物）を使用することが有利であり得る。
本明細書において有用なアニオン性界面活性剤としては、アルキルラジカルに１０～１８個の炭素原子を有するアルキルスルフェート及びアルキルエーテルスルフェートの水溶性塩、及び１０～１８個の炭素原子を有する脂肪酸のスルホン化モノグリセリドの水溶性塩が挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウム及びココナッツモノグリセリドスルホン酸ナトリウムは、このタイプのアニオン性界面活性剤の例である。
好適なカチオン性界面活性剤は、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド；塩化セチルピリジニウム；塩化ベンザルコニウム；セチルトリメチルアンモニウムブロミド；ジイソブチルフェノキシエチル－ジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ココナッツアルキルトリメチル－アンモニウム亜硝酸塩；フッ化セチルピリジニウムなど、約８～１８個の炭素原子を含む１つの長いアルキル鎖を有する脂肪族第四級アンモニウム化合物の誘導体として広義に規定することができる。ある特定のカチオン性界面活性剤は、本明細書に開示の組成物では殺菌剤として作用することもできる。
本開示の組成物、方法、及びキットに使用することができる好適な非イオン性界面活性剤は、アルキレンオキシド基（性質が親水性）と、性質が脂肪族及び／又は芳香族であってもよい有機疎水性化合物との縮合により生成される化合物であると広義に規定することができる。好適な非イオン性界面活性剤の例としては、以下のものが挙げられる：ポロキサマー；ジイソステアリン酸ソルビタンなどのソルビタン誘導体；ＰＥＧ－３０硬化ヒマシ油などの硬化ヒマシ油のエチレンオキシド縮合物；脂肪族アルコール又はアルキルフェノールのエチレンオキシド縮合物；エチレンオキシドとプロピレンオキシド及びエチレンジアミンの反応産物との縮合から導出される産物；長鎖第三級アミンオキシド；長鎖第三級ホスフィンオキシド；長鎖ジアルキルスルホキシド；及びそのような物質の混合物。こうした物質は、消費者製品組成物の過剰な粘度上昇に寄与することなく気泡を安定化するのに有用である。
双性イオン性界面活性剤は、脂肪族第四級アンモニウム、ホスホニウム、及びスルホニウム化合物の誘導体であると広義に記述することができ、脂肪族ラジカルは、直鎖であってもよく又は分枝鎖であってもよく、脂肪族置換基の１つは、約８～１８個の炭素原子を含み、１つは、アニオン性水可溶化基、例えば、カルボキシ、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、又はホスホネートを含む。
アニオン性単鎖界面活性剤の例としては、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、飽和又は不飽和脂肪酸、及びそれらの塩が挙げられる。カチオン性界面活性剤中の極性頭部基を含む部分としては、例えば、第四級アンモニウム、ピリジニウム、スルホニウム、及び／又はホスホニウム基を挙げることができる。例えば、極性頭部基は、トリメチルアンモニウムを含むことができる。例示的なカチオン性単鎖界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウムハライド、アルキルトリメチルアンモニウムトシレート、及びＮ－アルキルピリジニウムハライドが挙げられる。
アルキル硫酸塩としては、オクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、及びテトラ－デシル硫酸ナトリウムを挙げることができる。アルキルスルホン酸塩としては、オクチルスルホン酸ナトリウム、デシルスルホン酸ナトリウム、及びドデシルスルホン酸ナトリウムを挙げることができる。アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを挙げることができる。脂肪酸塩としては、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ドデカン酸ナトリウム、及びオレイン酸のナトリウム塩を挙げることができる。
アルキルトリメチルアンモニウムハライドとしては、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、及びセチルトリメチルアンモニウムブロミドを挙げることができる。アルキルトリメチルアンモニウムトシレートとしては、オクチルトリメチルアンモニウムトシレート、デシルトリメチルアンモニウムトシレート、ドデシルトリメチルアンモニウムトシレート、ミリスチルトリメチルアンモニウムトシレート、及びセチルトリメチルアンモニウムトシレートを挙げることができる。例えば、Ｎ－アルキルピリジニウムハライドとしては、塩化デシルピリジニウム、塩化ドデシルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化デシルピリジニウム、臭化ドデシルピリジニウム、臭化セチルピリジニウム、ヨウ化デシルピリジニウム、ヨウ化ドデシルピリジニウム、ヨウ化セチルピリジニウムを挙げることができる。
カチオン性界面活性剤は、以下のものから選択される少なくとも１種の化合物を含んでいてもよい：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）－トリメチルアンモニウムブロミド、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）アミン、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）イミダゾリン、エトキシル化アミン、第四級化合物、第四級エステル、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）アミンオキシド、ラウラミンオキシド、塩化ジセチルジモニウム、塩化セトリモニウム、第一級ポリエトキシル化脂肪族アミン塩、第二級ポリエトキシル化脂肪族アミン塩、第三級ポリエトキシル化脂肪族アミン塩、第四級アンモニウム塩、テトラ（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）アンモニウムハライド、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）アミド－（Ｃ１－Ｃ３０－アルキル）アンモニウムハライド、トリ（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）ベンジルアンモニウムハライド、トリ（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）ヒドロキシ－（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）アンモニウムハライド、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）ピリジニウムクロリド、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）ピリジニウムブロミド、及びアミンオキシド。
アニオン性界面活性剤は、以下のものから選択される少なくとも１種の化合物を含むことができる：ドデシル硫酸ナトリウム、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）ベンゼンスルホン酸塩、Ｃ６－Ｃ３０アルファオレフィンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）エステルスルホン酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）硫酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキルアルコキシ）硫酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）スルホン酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキルアルコキシ）カルボン酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキルアルコキシル化）硫酸塩、モノ（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）（エーテル）リン酸塩、ジ（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）（エーテル）リン酸塩、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）サルコシン酸塩、スルホコハク酸塩、ビス（２－エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム、エトキシレート４－ノニルフェニルエーテルグリコール酸、（Ｃ１－Ｃ３０アルキル）イセチオン酸塩、タウリン酸塩、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸トリエチルアミン、ラウレス硫酸トリエチルアミン、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウレス硫酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸モノエタノールアミン、ラウレス硫酸モノエタノールアミン、ラウリル硫酸ジエタノールアミン、ラウレス硫酸ジエタノールアミン、ラウリン酸モノグリセリド硫酸ナトリウム（ｌａｕｒｉｃ ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウレス硫酸カリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、トリデシルリン酸ナトリウム、ベヘニルリン酸ナトリウム、ラウレス－２リン酸ナトリウム、セテス－３リン酸ナトリウム、トリデセス－４リン酸ナトリウム、ジラウリルリン酸ナトリウム、ジトリデシルリン酸ナトリウム、ジトリデセス－６リン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン、ココイルサルコシン、ココイル硫酸アンモニウム、ココイル硫酸ナトリウム、トリデセス硫酸ナトリウム、トリデシル硫酸ナトリウム、トリデセス硫酸アンモニウム、トリデシル硫酸アンモニウム、ココイルイセチオン酸ナトリウム、ラウレススルホコハク酸二ナトリウム、オレオイルメチルタウリンナトリウム、ラウレスカルボン酸ナトリウム、トリデセスカルボン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ココイル硫酸カリウム、ラウリル硫酸カリウム、ココイル硫酸モノエタノールアミン、トリデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、及びドデシル硫酸ナトリウム。
非イオン性界面活性剤は、以下のものから選択される少なくとも１種の化合物を含んでいてもよい：Ｃ６－Ｃ１８アルキルアルコール、（Ｃ６－Ｃ１８アルキル）フェノール、（Ｃ６－Ｃ１８アルキル）エトキシレート、（Ｃ６－Ｃ１８アルキル）フェノール（Ｃ１－Ｃ３アルコキシレート）、Ｃ６－Ｃ１８アルキルフェノールのブロックオキシ（Ｃ１－Ｃ３アルキレン）縮合物、アルカノールのオキシ（Ｃ１－Ｃ３アルキレン）縮合物、オキシエチレン／オキシプロピレンブロックコポリマー、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、８～５０個の炭素原子を有するアルキルアミンオキシド、モノ又はジ（Ｃ８－Ｃ３０）アルキルアルカノールアミド、（Ｃ６－Ｃ３０アルキル）ポリサッカリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン酸、ポリオキシエチレンアルコール、ココモノエタノールアミド、ココジエタノールアミド、ココジグリコシド、（Ｃ８－Ｃ３０アルキル）ポリグリコシド、コカミドプロピル、ラウラミンオキシド、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、エトキシル化直鎖Ｃ８－Ｃ３０アルコール、セテアリルアルコール、ラノリンアルコール、ステアリン酸、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ポリエチレングリコール１００、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニルポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル、エイコサエチレングリコールオクタデシルエーテル、及びＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）20（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）Ｏ）70（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）20Ｈ。
還元剤
溶解緩衝液及び／又は試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、１種又は複数種の還元剤を含んでいてもよい。「還元剤」は、化合物であってもよく又は化合物の群であってもよい。本明細書で使用される場合、「還元剤」は、「還元体（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）」、「リデューサー（ｒｅｄｕｃｅｒ）」、又は「還元等価物（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」としても知られ、別の種に電子を供与する元素又は化合物を指すことができる。特に、還元剤は、一般に、還元によりジスルフィド結合を切断し、それによりジスルフィド結合で安定化されている三次タンパク質フォールディング構造及び四次タンパク質構造（オリゴマーサブユニット）を克服する化合物である。好適な還元剤の例としては、２－メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ＤＴＥ、還元型グルタチオン、システアミン、ＴＢＰ、ジチオエリトリオール、ＴＨＰＰ、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ＤＴＢＡ、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びＨＥＤが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で提供される方法、組成物、及びキットの一部の実施形態では、溶解緩衝液及び／又は試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、１種又は複数種の還元剤を含まない。
試薬組成物
本明細書に記載の試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、「乾燥形態」で、又は液体媒体に懸濁していない形態で提供することができる。組成物の「乾燥形態」としては、乾燥粉末、凍結乾燥組成物、噴霧乾燥組成物、又は沈殿組成物を挙げることができる。「乾燥形態」組成物としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどの糖及びそれらの対応する糖アルコール；アルギニン及びヒスチジンなどのアミノ酸；硫酸マグネシウムなどのリオトロピック塩；プロピレングリコール、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、又はポリプロピレングリコールなどのポリオール；及びそれらの組合せなどの１種又は複数種の凍結乾燥保護剤を挙げることができる。追加の例示的な凍結乾燥保護剤としては、ゼラチン、デキストリン、加工デンプン、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。本明細書で使用される場合、「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、及び「フリーズドライ」という用語は、乾燥しようとする物質をまず凍結させ、次いで氷又は凍結溶媒を真空環境での昇華により除去するプロセスを指す。「凍結乾燥物」は、凍結乾燥された物質を指す。
試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、凍結、凍結乾燥、又は噴霧乾燥されていてもよい。試薬組成物は加熱乾燥されていてもよい。試薬組成物は、１種又は複数種の添加剤（例えば、アミノ酸、ポリマー、糖、又は糖アルコール）を含んでいてもよい。糖又は糖アルコールは、スクロース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、フィコール、アルブミン、ポリペプチド、コラーゲンペプチド、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。凍結乾燥試薬としては、ポリｒＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ８０、及び／又はＴｗｅｅｎ２０を挙げることができる。
凍結若しくは凍結乾燥若しくは噴霧乾燥若しくは加熱乾燥された組成物、又は凍結若しくは凍結乾燥若しくは噴霧乾燥された組成物を調製するための水性組成物は、以下のものの１種又は複数種を含んでもよい：（ｉ）エチレングリコール、グリセロール、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドなどの非水性溶媒。（ｉｉ）Ｔｗｅｅｎ８０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ３０、Ｌｕｂｒｏｌ－ｐｘ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０；ポロキサマーとしても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー）、ポロキサミン、及びドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤。（ｉｉｉ）トレハロース、スクロース、ラクトース、及びマルトースなどのジサッカリド。（ｉｖ）ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、フィコール、及びアルブミンなどのポリマー（異なるＭＷを有してもよい）。（ｖ）グリシン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、グルタミン酸、アラニン、リジン、サルコシン、ガンマ－アミノ酪酸などのアミノ酸。
本明細書に開示のように、試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、１種若しくは複数種の保護剤及び１種若しくは複数種の増幅試薬を含んでいてもよい。
保護剤
本明細書では、１種若しくは複数種の保護剤及び／又は１種若しくは複数種の添加剤を含む方法及び組成物が提供される。１種又は複数種の添加剤は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント（例えば、非イオン性界面活性剤）、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。１種又は複数種の保護剤は、シクロデキストリン化合物（例えば、式Ｉの化合物）を含んでいてもよい。シクロデキストリン（ＣＤ）は、溶解剤（例えば、ＳＤＳ）との複合体形成のために使用することができる。シクロデキストリン（ＣＤ）は、疎水性内部空洞及び親水性外部表面を有する円錐台に似た環状オリゴサッカリドであり得る。最も一般的に使用される天然シクロデキストリンとしては、α、β、及びγ－ＣＤと称される、６、７、及び８個のグルコース単位が挙げられる。天然ＣＤは溶解性を有することができる。ヒドロキシプロピル誘導体などの化学修飾ＣＤは、水性媒体への溶解度を最大で５０％向上させる。ＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）は、ＷＡＣＫＥＲ社のシクロデキストリン誘導体の商品名であり、様々なα、β、γ－ＣＤ誘導体が網羅されている。β－ＣＤは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と主に１：１の化学量論で強力な包接複合体（α－ＣＤ及びβ－ＣＤよりも強力である）を形成することができる。β－ＣＤとＳＤＳとの結合定数は、２１００Ｍ-1～２５００Ｍ-1の範囲であり得る。
本明細書に記載の保護剤（例えば、シクロデキストリン化合物）は、クラミジア・トラコマティス及び／又はナイセリア・ゴノレア検出用の溶解緩衝液など、複合体形成のための溶解剤（例えば、ＳＤＳ）を含む溶解緩衝液と共に使用することができる。ＳＤＳは、クラミジア細胞溶解のために最も一般的に使用される試薬の１つである。ＳＤＳは、細胞膜のリン脂質及びタンパク質成分を可溶化し、細胞溶解及び細胞内容物の放出をもたらすことができる。ＳＤＳは、かなり特異的にタンパク質に結合することもでき、それにより高濃度範囲ではタンパク質を変性させる。ＳＤＳは、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲの場合、０．０１％（質量／容積）よりも高い濃度では阻害効果を示す可能性がある。本明細書に提供されるものには、クラミジア・トラコマティス及び／又はナイセリア・ゴノレア検出のためのリアルタイムアッセイでＣＤ－ＳＤＳ複合体形成が生じる方法における組成物が含まれる。ＳＤＳは、細胞溶解／試料調製用の溶解緩衝液に使用することができる。ＣＤは、酵素及び他のアッセイ成分を含む乾燥（例えば、凍結乾燥、加熱乾燥）ペレットに組み込むことができる。溶解ステップの後、試料溶液を、シクロデキストリンを含む乾燥（例えば、凍結乾燥、加熱乾燥）ペレットと混合して、ＣＤ及びＳＤＳ包接複合体形成を促進することができる。本明細書で提供される方法及び組成物は、ＳＤＳを含むクラミジア細胞溶解緩衝液（例えば、ＲＩＰＡ緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ－４０；１％ＳＤＳ緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を含んでいてもよい。１種又は複数種の保護剤は、平均Ｍｗ約１，３８０及び０．６モル置換を含んでいてもよい（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（カタログ番号３３２５９３－５Ｇ）を含んでいてもよい。１種又は複数種の保護剤は、平均Ｍｗ約１，５４０及び１．０モル置換デキストリンを含んでいてもよい（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（カタログ番号３８９１４５－５Ｇ）を含んでいてもよい。１種又は複数種の保護剤は、４５０ｍｇ／ｍＬの水溶解度を含んでいてもよい（２－ヒドロキシプロピル）－γ－シクロデキストリン（カタログ番号Ｈ１２５－５Ｇ－Ｉ）を含んでいてもよい。１種又は複数種の保護剤は、５０ｍｇ／ｍＬの水溶解度を含んでいてもよいα－シクロデキストリン（カタログ番号Ｃ４６４２－５Ｇ）を含んでいてもよい。
増幅反応混合物中の１種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の増幅試薬（例えば、増幅反応成分）のモル比は、約１０：１～約１：１０、例えば、約２：１であってもよい。この比は、約、少なくとも、若しくは最大で、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、又はこうした値のいずれか２つの間の数値若しくは範囲であってもよい。
１種又は複数種の保護剤は、式Ｉのシクロデキストリン化合物などのシクロデキストリン化合物、又はその塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物を含んでいてもよい。
Figure 2024510270000003
 （式中、
各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり；
各Ｒ1は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、－ＣＮ、－ＣＦ3、－Ｎ3、－ＮＯ2、－ＯＲB、－ＳＲB、－ＳＯＲB、－ＳＯ2ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）－ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）ＮＲAＲB、－ＮＲAＲB、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲB、又は－Ｎ（ＲB）Ｃ（Ｏ）ＲBであり；これらの各々は置換されていてもよく；
各ＲAは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
各ＲBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり；
各ｍは、独立して、０、１、２、３、４、又は５である。）
一部の実施形態では、各Ｒは、独立して、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBである。一部の実施形態では、ｎは、１、２、又は３である。各Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、又はオクチルであってもよく；各々は直鎖であってもよく又は分枝鎖であってもよい。
シクロデキストリン化合物は、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２ＨＰβＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、若しくはγ－シクロデキストリン、又はそれらの塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物であってもよい。
ヒドロカルビル置換基の炭素原子の数は、接頭辞「Ｃx－Ｃy」により示すことができ、この場合、ｘは、置換基中の炭素原子の最小数であり、ｙは最大数である。同様に、Ｃx鎖は、ｘ個の炭素原子を含むヒドロカルビル鎖を意味する。
接頭辞「ハロ」は、接頭辞が付けられている置換基が、１種又は複数種の独立して選択されるハロゲンラジカルで置換されていることを示す。例えば、「Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル」は、少なくとも１つの水素ラジカルがハロゲンラジカルで置き換えられているＣ1－Ｃ6アルキル置換基を意味する。
図示されている構造の連結要素が「存在しない」又は「結合」である場合、図示されている構造の左側の要素は、図示されている構造の右側の要素と直接連結されている。例えば、化学構造が、Ｘ－（Ｌ）n－Ｙであり、式中、Ｌは存在しないか又はｎは０である場合、その化学構造はＸ－Ｙである。
「アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。例えば、「Ｃ1－Ｃ8アルキル」は、１～８個の炭素原子を含む。アルキルラジカルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉｅｒｉ－ブチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ヘプチル、及びオクチルラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の二重結合を含む直鎖又は分枝鎖炭化水素ラジカルを表す。例えば、「Ｃ2－Ｃ8アルケニル」は、２～８個の炭素原子を含む。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１－メチル－２－ブテン－１－イル、ヘプテニル、及びオクテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の三重結合を含む直鎖又は分枝鎖炭化水素ラジカルを表す。例えば、「Ｃ2－Ｃ8アルキニル」は、２～８個の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、例えば、エチニル、１－プロピニル、１－ブチニル、ヘプチニル、及びオクチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「シクロアルキル」という用語は、単環式又は多環式飽和炭素環式環状化合物に由来する一価の基を表す。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、及びビシクロ［２．２．２］オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「炭素環」又は「炭素環式」又は「カルボシクリル」という用語は、０個のヘテロ原子環原子を含む、飽和（例えば、「シクロアルキル」）環系、部分飽和（例えば、「シクロアルケニル」又は「シクロアルキニル」）環系、又は完全不飽和（例えば、「アリール」）環系を指す。カルボシクリルは、限定ではないが、単環、又は２つ若しくはそれよりも多くの縮合環、又は架橋環若しくはスピロ環であってもよい。カルボシクリルは、例えば、３～１０個の環員（つまり、Ｃ3－Ｃ10シクロアルキルなどのＣ3－Ｃ10カルボシクリル）を含んでいてもよい。置換カルボシクリルは、シス又はトランスのいずれかの幾何学的形状を有することができる。カルボシクリル基の代表的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、アダマンチル、デカヒドロ－ナフタレニル、オクタヒドロ－インデニル、シクロヘキセニル、フェニル、ナフチル、フルオレニル、インダニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－ナフチル、インデニル、イソインデニル、ビシクロデカニル、アントラセニル、フェナントレン、ベンゾナフテニル（「フェナレニル」としても知られている）、デカリニル、及びノルピナニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。カルボシクリル基は、その基のあらゆる置換可能な炭素原子を介して親分子部分に付着していてもよい。
「アリール」という用語は、６～１４個の炭素環原子を含む芳香族カルボシクリルを指す。アリールの非限定的な例としては、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、及びインデニルなどが挙げられる。アリール基は、その基のあらゆる置換可能な炭素原子を介して親分子部分に接続していてもよい。
「ヘテロアリール」という用語は、典型的には、５～１８個の環原子を含み、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子である芳香族ヘテロシクリルを意味する。ヘテロアリールは、単環であってもよく、又は２つ若しくはそれよりも多くの縮合環であってもよい。５員ヘテロアリールの非限定的な例としては、イミダゾリル；フラニル；チオフェニル（又はチエニル若しくはチオフラニル）；ピラゾリル；オキサゾリル；イソオキサゾリル；チアゾリル；１，２，３－、１，２，４－、１，２，５－、及び１，３，４－オキサジアゾリル；並びにイソチアゾリルが挙げられる。６員ヘテロアリールの非限定的な例としては、ピリジニル；ピラジニル；ピリミジニル；ピリダジニル；並びに１，３，５－、１，２，４－、及び１，２，３－トリアジニルが挙げられる。６／５員縮合環ヘテロアリールの非限定的な例としては、ベンゾチオフラニル、イソベンゾチオフラニル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、プリニル、及びアントラニリルが挙げられる。６／６員縮合環ヘテロアリールの非限定的な例としては、キノリニル；イソキノリニル；及びベンゾオキサジニル（シンノリニル及びキナゾリニルを含む）が挙げられる。
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族３員、４員、５員、６員、若しくは７員環、又は二環式若しくは三環式基縮合系を指し、環原子の少なくとも１つはヘテロ原子であり、（ｉ）各５員環は０～１つの二重結合を有し、各６員環は０～２つの二重結合を有し、（ｉｉ）窒素及び硫黄ヘテロ原子は酸化されていてもよく、（ｉｉｉ）窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよく、（ｉｖ）上記環のいずれかはベンゼン環に縮合されていてもよい。代表的なヘテロシクロアルキル基としては、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、及びテトラヒドロフリルなどが挙げられるが、それらに限定されない。
「複素環式」又は「複素環」又は「ヘテロシクリル」という用語は、飽和（例えば、「ヘテロシクロアルキル」）環系、部分不飽和（例えば、「ヘテロシクロアルケニル」又は「ヘテロシクロアルキニル」）環系、又は完全不飽和（例えば、「ヘテロアリール」）環系を指し、環原子の少なくとも１つはヘテロ原子（つまり、窒素、酸素、又は硫黄）であり、残りの環原子は、独立して、炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される。ヘテロシクリル基は、安定分子が得られる限り、基内のあらゆる置換可能な炭素原子又は窒素原子を介して親分子部分に連結されていてもよい。ヘテロシクリルは、限定ではないが、単環であってもよい。単環ヘテロシクリルの非限定的な例としては、フラニル、ジヒドロフラニル、ピロリル、イソピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソイミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリニル、イソチアゾリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、チオジアゾリル、オキサチアゾリル、オキサジアゾリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、イソキサジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、オキサチアジニル、オキサジアジニル、モルホリニル、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、又はジアゼピニルが挙げられる。また、ヘテロシクリルとしては、限定ではないが、一緒に縮合した２つ又はそれよりも多くの環、例えば、ナフチリジニル、チアゾールピリミジニル、チエノピリミジニル、ピリミドピリミジニル、又はピリドピリミジニルを挙げることができる。ヘテロシクリルは、環員として１つ又は複数の硫黄原子を含んでいてもよく、一部の場合では、硫黄原子はＳＯ又はＳＯ2に酸化されている。ヘテロシクリルの窒素ヘテロ原子は、四級化されていてもよく又はされていなくてもよく、Ｎ－オキシドに酸化されていてもよく又はされていなくてもよい。加えて、窒素ヘテロ原子は、Ｎ－保護されていてもよく又はされていなくてもよい。
「置換されていてもよい」、「置換されていてもよいアルキル」、「置換されていてもよい」、「置換されていてもよいアルケニル」、「置換されていてもよいアルキニル」、「置換されていてもよい炭素環式」、「置換されていてもよいアリール」、「置換されていてもよいヘテロアリール」、「置換されていてもよい複素環式」、及び本明細書で使用されるあらゆる他の置換されていてもよい基という用語は、その水素原子の１つ、２つ、又は３つ、又はそれよりも多くを、独立して、典型的な置換基で置き換えることにより置換されているか又は置換されていない基を指し、典型的な置換基としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、－アリール、－アリールアルキル、－ヘテロアリール、－ヘテロアリールアルキル、－ヘテロシクロアルキル、－シクロアルキル、－炭素環式、－複素環式、－Ｆ、－ＣＩ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＯＨ、保護ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、チオオキソ、－ＮＯ2、－ＣＮ、ＣＦ3、Ｎ3、－ＮＨ2、保護アミノ、－ＮＨアルキル、－ＮＨアルケニル、－ＮＨアルキニル、－ＮＨシクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－複素環式、－ジアルキルアミノ、－ジアリールアミノ、－ジヘテロアリールアミノ、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルケニル、－Ｏ－アルキニル、－Ｏ－シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－複素環式、－Ｃ（Ｏ）－アルキル、－Ｃ（Ｏ）－アルケニル、－Ｃ（Ｏ）－アルキニル、－Ｃ（Ｏ）－シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）－アリール、－Ｃ（Ｏ）－ヘテロアリール、－Ｃ（Ｏ）－ヘテロシクロアルキル、－ＣＯＮＨ2、－ＣＯＮＨ－アルキル、－ＣＯＮＨ－アルケニル、－ＣＯＮＨ－アルキニル、－ＣＯＮＨ－シクロアルキル、－ＣＯＮＨ－アリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－ＯＣＯ2－アルキル、－ＯＣＯ2－アルケニル、－ＯＣＯ2－アルキニル、－ＯＣＯ2－シクロアルキル、－ＯＣＯ2－アリール、－ＯＣＯ2－ヘテロアリール、－ＯＣＯ2－ヘテロシクロアルキル、－ＯＣＯＮＨ2、－ＯＣＯＮＨ－アルキル、－ＯＣＯＮＨ－アルケニル、－ＯＣＯＮＨ－アルキニル、－ＯＣＯＮＨ－シクロアルキル、－ＯＣＯＮＨ－アリール、－ＯＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＯＣＯＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）－アルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）－アルケニル、－ＮＨＣ（Ｏ）－アルキニル、－ＮＨＣ（Ｏ）－シクロアルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）－アリール、－ＮＨＣ（Ｏ）－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（Ｏ）－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＣＯ2－アルキル、－ＮＨＣＯ2－アルケニル、－ＮＨＣＯ2－アルキニル、－ＮＨＣＯ2－シクロアルキル、－ＮＨＣＯ2－アリール、－ＮＨＣＯ2－ヘテロアリール、－ＮＨＣＯ2－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ2、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－アルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－アルケニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－アルケニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－シクロアルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－アリール、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－ヘテロシクロアルキル、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ2、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－アルキル、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－アルケニル、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－アルキニル、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－シクロアルキル、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－アリール、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－アルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－アルケニル、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－アルケニル、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－シクロアルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－アリール、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）－アルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）－アルケニル、－ＮＨＣ（ＮＨ）－アルケニル、－ＮＨＣ（ＮＨ）－シクロアルキル、－ＮＨＣ（ＮＨ）－アリール、－ＮＨＣ（ＮＨ）－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（ＮＨ）－ヘテロシクロアルキル、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－アルキル、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－アルケニル、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－アルキニル、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－シクロアルキル、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－アリール、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－ヘテロアリール、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）－アルキル、－Ｓ（Ｏ）－アルケニル、－Ｓ（Ｏ）－アルキニル、－Ｓ（Ｏ）－シクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）－アリール、－Ｓ（Ｏ）－ヘテロアリール、－Ｓ（Ｏ）－ヘテロシクロアルキル、－ＳＯ2ＮＨ2、－ＳＯ2ＮＨ－アルキル、－ＳＯ2ＮＨ－アルケニル、－ＳＯ2ＮＨ－アルキニル、－ＳＯ2ＮＨ－シクロアルキル、－ＳＯ2ＮＨ－アリール、－ＳＯ2ＮＨ－ヘテロアリール、－ＳＯ2ＮＨ－ヘテロシクロアルキル、－ＮＨＳＯ2－アルキル、－ＮＨＳＯ2－アルケニル、－ＮＨＳＯ2－アルキニル、－ＮＨＳＯ2－シクロアルキル、－ＮＨＳＯ2－アリール、－ＮＨＳＯ2－ヘテロアリール、－ＮＨＳＯ2－ヘテロシクロアルキル、－ＣＨ2ＮＨ2、－ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ3、ポリアルコキシアルキル、ポリアルコキシ、－メトキシメトキシ、－メトキシエトキシ、－ＳＨ、－Ｓ－アルキル、－Ｓ－アルケニル、－Ｓ－アルキニル、－Ｓ－シクロアルキル、－Ｓ－アリール、－Ｓ－ヘテロアリール、－Ｓ－ヘテロシクロアルキル、又はメチルチオメチル。
アリール、ヘテロアリール、炭素環、複素環、及びアルキルなどは、さらに置換されていてもよいことが理解される。
「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を指す。
「脱離基」又は「ＬＧ」という用語は、本明細書で使用される場合、その基が関与する化学反応の過程で脱離するあらゆる基を指し、例えば、ハロゲン、ブロシレート、メシレート、トシレート、トリフレート、ｐ－ニトロベンゾエート、ホスホネート基が挙げられるが、これらに限定されない。
「保護ヒドロキシ」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ベンゾイル、アセチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、メトキシメチル基を含む、上記で規定のようなヒドロキシ保護基で保護されたヒドロキシ基を指す。
「ヒドロキシ保護基」という用語は、本明細書で使用される場合、合成手順中の望ましくない反応からヒドロキシ基を保護することが当技術分野で公知である易反応性化学部分を指す。前記合成手順の後、本明細書に記載のヒドロキシ保護基を選択的に除去することができる。ヒドロキシ保護基の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ベンジルオキシカルボニル、４－ニトロベンジルオキシカルボニル、４－ブロモベンジルオキシカルボニル、４－メトキシベンジルオキシカルボニル、メトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２－フルフリルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、アセチル、ホルミル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、メチル、ｔ－ブチル、２，２，２－トリクロロエチル、２－トリメチルシリルエチル、１，１－ジメチル－２－プロペニル、３－メチル－３－ブテニル、アリル、ベンジル、パラ－メトキシベンジルジフェニルメチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロフリル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、２，２，２－トリクロロエトキシメチル（ｔｒｉｅｈｌｏｒｏｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、２－（トリメチルシリル）エトキシメチル、メタンスルホニル、パラ－トルエンスルホニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、及びトリイソプロピルシリルなど。一部の実施形態では、ヒドロキシ保護基は、アセチル（Ａｃ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ3）、ベンゾイル（Ｂｚ又は－Ｃ（Ｏ）Ｃ6Ｈ5）、及びトリメチルシリル（ＴＭＳ又は－Ｓｉ（ＣＨ3）3）である。
「アミノ保護基」という用語は、本明細書で使用される場合、合成手順中の望ましくない反応からアミノ基を保護することが当技術分野で公知である易反応性化学部分を指す。前記合成手順の後、本明細書に記載のアミノ保護基を選択的に除去することができる。アミノ保護基の例としては、ｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメトキシカルボニル、及びベンジルオキシカルボニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「保護アミノ」という用語は、本明細書で使用される場合、上記で規定のアミノ保護基で保護されたアミノ基を指す。
「アルキルアミノ」という用語は、構造－Ｎ（ＲaＲb）を有する基を指し、式中、Ｒa及びＲbは独立してＨ又はアルキルである。
許容される塩の例としては、非毒性酸付加塩、或いは塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸と、又は酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、若しくはマロン酸などの有機酸と、又はイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することにより形成されるアミノ基の塩が挙げられるが、これらに限定されない。他の許容される塩としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、及び吉草酸塩など。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、又はマグネシウム塩などが挙げられる。さらなる許容される塩としては、必要に応じて、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びハロゲン化物、水酸化物などの対イオンを使用して形成されるアミンカチオン、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、１～６個の炭素原子を有するアルキル、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩が挙げられる。
「エステル」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示のプロセスにより形成される化合物のエステルを指すことができ、ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解し、ヒト体内で容易に分解して親化合物又はその塩を残すものを含んでいてもよい。好適なエステル基としては、例えば、許容される脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、及びアルカン二酸から誘導され、各アルキル又はアルケニル部分が有利には６個以下の炭素原子を有するものが挙げられる。特定のエステルの例としては、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、及びエチルコハク酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の化合物は、１つ又は複数の不斉中心を含み、したがって、絶対立体化学の観点から、（Ｒ）－若しくは（Ｓ）－として又はアミノ酸の場合は（Ｄ）－若しくは（Ｌ）－として規定することができる、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び他の立体異性形態が生じる。本開示は、すべてのそのような考え得る異性体、並びにそれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を含むことが意図されている。光学異性体は、上記に記載の手順により、又はラセミ混合物を分離することにより、それぞれの光学活性前駆体から調製することができる。分離は、分離剤の存在下で、クロマトグラフィーにより、又は結晶化を繰り返すことにより、又は当業者に公知の技法の幾つかの組合せにより実施することができる。本明細書に記載の化合物がオレフィン性二重結合又は他の幾何学的不斉中心を含む場合、別様の指定がない限り、化合物はＥ幾何異性体及びＺ幾何異性体の両方を含むことが意図されている。同様に、すべての互変異性形態も含まれることが意図されている。本明細書に出現するあらゆる炭素－炭素二重結合の立体配置は、便宜上選択されているに過ぎず、本文にそのように記載されていない限り、特定の立体配置を指定することは意図されていない。したがって、本明細書においてトランスとして便宜的に図示されている炭素－炭素二重結合は、シス、トランス、又はこの２つのあらゆる割合の混合物であってもよい。
キット
本明細書に開示されるものには、試料中の標的核酸配列を検出するためのキットが含まれる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）１種又は複数種の溶解剤を含む溶解緩衝液であって、１種又は複数種の溶解剤は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能であり、試料核酸は標的核酸配列を含むことが疑われている、溶解緩衝液；並びに（ｂ）１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む乾燥組成物であって、１種又は複数種の増幅試薬は、等温増幅条件下で標的核酸配列を増幅するための１種又は複数種の成分を含む、乾燥組成物を含む。一部の実施形態では、前記成分は、（ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマーであって、第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である、第１のプライマー及び第２のプライマー；並びに（ｉｉ）核酸増幅産物を生成することが可能な超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液及び／又は試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤を含む。１種又は複数種の還元剤は、２－メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ＤＴＥ、還元型グルタチオン、システアミン、ＴＢＰ、ジチオエリトリオール、ＴＨＰＰ、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ＤＴＢＡ、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びＨＥＤの１種又は複数種を含んでいてもよい。
キットは、核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１種の成分を含んでいてもよい。リアルタイム検出活性は、分子ビーコンにより提供することができる。試薬組成物（例えば、乾燥組成物）は、逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の増幅試薬のモル比は、約１０：１～約１：１０（例えば、約２：１）である。一部の実施形態では、１種又は複数種の添加剤は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント（例えば、非イオン性界面活性剤）、又はそれらのあらゆる組合せを含む。一部の実施形態では、１種又は複数種の保護剤は、式（Ｉ）のシクロデキストリン化合物を含む。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解試薬は、処理試料の約０．００１％（質量／容積）～約１．０％（質量／容積）（例えば、約０．２％（質量／容積））を構成する。一部の実施形態では、１種又は複数種の溶解剤は、デタージェントを含む。デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１種又は複数の保護剤は、１種又は複数種の溶解剤を隔離し、それにより１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能であることが有利であり得る。
キットは、例えば、本明細書に記載のように、１種又は複数種のポリメラーゼ及び１種又は複数種のプライマー、並びに任意に１種又は複数種の逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーを含んでいてもよい。１種の標的を増幅する場合、１対のプライマー（フォワード及びリバース）がキットに含まれていてもよい。複数種の標的配列を増幅する場合、複数のプライマー対がキットに含まれていてもよい。キットには、対照ポリヌクレオチドが含まれていてもよく、複数種の標的配列を増幅する場合、複数種の対照ポリヌクレオチドがキットに含まれていてもよい。
超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。例えば、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
核酸増幅産物は、約２０～４０塩基長であってもよい。核酸増幅産物は、（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに（３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体及び（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列であって、１～１０塩基長であるスペーサー配列を含んでいてもよい。
生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、ウイルス粒子、エキソソーム、プロトプラスト、及び微小胞の１種又は複数種を含んでいてもよい。生物学的実体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、それらの一部、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。標的核酸配列は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物の核酸配列であってもよい。試料核酸は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物に由来してもよい。
また、キットは、あらゆる数の別々のベッセル、チャンバー、容器、パケット、チューブ、バイアル、及びマイクロタイタープレートなど中に成分の１種又は複数種を含んでいてもよく、又は成分をそのような容器中で種々の組合せで一緒にしてもよい。キットの成分は、例えば、１つ又は複数の容器に存在してもよい。一部の実施形態では、成分のすべてが１つの容器に提供されている。一部の実施形態では、酵素（例えば、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素）は、プライマーとは別々の容器に提供されていてもよい。成分は、例えば、凍結乾燥されていてもよく、加熱乾燥されていてもよく、フリーズドライされていてもよく、又は安定緩衝液中に存在してもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素は、単一の容器中に凍結乾燥形態又は加熱乾燥形態で存在し、プライマーは、異なる容器において、凍結乾燥されているか、加熱乾燥されているか、フリーズドライされているか、又は緩衝液中に存在するかのいずれかである。一部の実施形態では、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素並びにプライマーは、単一の容器中に凍結乾燥形態又は加熱乾燥形態で存在する。
キットは、例えば、反応に使用されるｄＮＴＰ、又は反応に使用される修飾ヌクレオチド、ベッセル、キュベット、若しくは他の容器、又は凍結乾燥若しくは加熱乾燥された成分を再水和するための水若しくは緩衝液のバイアルをさらに含んでいてもよい。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼ活性及びプライマーアニーリング活性の両方に適したものであってもよい。
また、キットは、本明細書に記載の１つ若しくは複数の方法を実施するための使用指示書、及び／又は本明細書に記載の１種若しくは複数種の成分の説明書を含んでいてもよい。使用指示書及び／又は説明書は印刷物の形態であってもよく、キット添付文書に含まれていてもよい。また、キットは、そのような使用指示書又は説明書を提供するインターネット上の場所の書面による記載を含んでいてもよい。
キットは、検出法に使用される試薬、例えば、ＦＲＥＴ、側方流動デバイス、ディップスティック、蛍光色素、コロイド金粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、又はポリスチレンビーズに使用される試薬をさらに含んでいてもよい。
上記で考察されている実施形態の一部の態様を、以下の実施例においてさらに詳細に開示するが、これらはいかなる点でも本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
（実施例１）
ナイセリア・ゴノレアＤＮＡ増幅に対するアニオン性デタージェントＳＤＳ及びＨＰ－βＣＤの効果
この実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物のＳＤＳ複合体形成分析を提供する。特に、この実施例は、ナイセリア・ゴノレアＤＮＡ増幅に対するアニオン性デタージェントＳＤＳ及びＨＰ－βＣＤの効果を実証する。＞０．０１％のアニオン性デタージェントＳＤＳは、ＤＮＡのＡＰＡ増幅を阻害するが、保護剤ヒドロキシプロピルβ－ＣＤ（βＣＤ）が存在すると、≦０．２％ＳＤＳにも関わらず増幅を進行させることが可能だった。したがって、ＳＤＳのヒドロキシプロピルβ－ＣＤ隔離の動力学は、モル比２：１（約１４ｍＭ：約７ｍＭ）で十分に迅速であり、ＳＤＳによる９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼ不活化が防止された。
「ホットスタート」ＣｌｅａｎＡｍｐ（商標）デオキシヌクレオチド（ＣＡｄＮＴＰ）及び配列特異的分子ビーコン検出プローブを含む４％Ｓｉｇｍａ３８９１４５ＨＰβＣＤを有する又は有しない標準ＡＰＡ反応を、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ4、及び（ＮＨ4）2ＳＯ4 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＣＡｄＮＴＰ、プライマー、及びプローブを含む、凍結乾燥（（デキストラン４０、トレハロースで補完されている）、図２Ｂ）試薬又は「湿式」（ＨＰβＣＤ無し、図２Ａ）試薬を用いて実施した。凍結乾燥反応の場合、試料を、５００コピーのＮ．ゴノレアゲノムＤＮＡを有する（図形記号）又は有しない（破線）、ＭｇＳＯ4及び（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む５０μｌ溶液で調製した。乾燥試薬を試料に溶解した後、示されているように種々の量のＳＤＳを添加し、溶液をボルテックスした。湿式反応の場合、すべての反応成分を含む４５μｌマスターミックスを、５００コピーのＮ．ゴノレアゲノムＤＮＡを有する又は有しない、１０×ＳＤＳを含む５μｌ試料に添加した（最終濃度は表記の通り）。９０℃で２分間ＣＡｄＮＴＰを活性化し、続いて６８℃で１０分間ＡＰＡを行い、１５秒毎に収集した蛍光によりＮＧ増幅産物を検出した。結果は、βＣＤの非存在下では＞０．０１％ＳＤＳで不活化されたが、βＣＤの存在下では少なくとも０．２％に対して耐容性を示した（図２Ａ～２Ｂ）。
（実施例２）
クラミジア・トラコマティスＤＮＡ増幅に対するカチオン性デタージェントＣＴＡＢの効果
この実施例は、実施例１と同様であるが、クラミジア・トラコマティスＤＮＡ増幅に対するカチオン性デタージェントＣＴＡＢの効果の実証を提供する。ＣＡｄＮＴＰ及び配列特異的分子ビーコン検出プローブを含むＡＰＡ反応を、５００コピーのＣ．トラコマティス全細胞ＤＮＡを添加せずに（「ＮＴＣ」）又は添加して、凍結乾燥反応（ＨＰ－βＣＤ有り、図３Ｂ）又は湿式反応（ＨＰ－βＣＤ無し、図３Ａ）にて、種々の量のカチオン性デタージェントＣＴＡＢを用いて上記のように実施した。９０℃で２分間加熱することによりＣＡｄＮＴＰを活性化し、続いて６８℃でＡＰＡを行い、１５秒毎に蛍光を収集した。結果は、ＨＰ－βＣＤの非存在下では＞０．０１％ＣＴＡＢにより完全に不活化されたが、ＨＰ－βＣＤの存在下では少なくとも０．２％まで完全に耐容性だったことを示した。
（実施例３）
クラミジア・トラコマティスの溶解
この実施例は、現在利用可能な核酸検出方法及び組成物に対する、本明細書で提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。例えば、現在利用可能な方法の試料タイプは、溶解させ易いヒト血液に拡張することができるものの、そのような方法は、溶解が難しい病原体の効率的な溶解も増幅も提供することができない。
この実施例では、ＡＰＡに基づくアッセイを使用して、基本小体溶解（約４０個／反応）を調べた。基本小体（Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ）を、冷却クラミジア輸送培地（スクロース、リン酸塩緩衝液、及びグルタミン酸を含むＳＰＤ）、ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ１０－１）、又は０．４％ＳＤＳを含む溶解緩衝液ｐＨ２．２のいずれかに添加した。ＴＥ又はＳＤＳ中の試料を、それぞれ９５℃で５分間（熱溶解）又は７８℃で２分間（ＳＤＳ溶解）加熱した。次いで、５μｌ（４０個の基本小体を含む）を、等温ＡＰＡ（６８℃）のために４％シクロデキストリンＨＰ－βＣＤを含む「湿式」ＡＰＡ反応ミックス（ｐＨ７．６、等温ＣＡｄＮＴＰ活性化を促進するため）に上記のように添加し、クラミジア特異的分子ビーコンからの蛍光を１５秒毎に収集した。
ＳＤＳ溶解（破線）は、標的ＤＮＡの解放が、熱溶解（実線）と同様に効果的であった。溶解試薬の非存在下では、硬い架橋タンパク質細胞壁を含むという独特な基本小体は、非鋳型対照（ＮＴＣ 点線）と同様に検出できなかった（四角）（図４）。生物を溶解するために０．４％イオン性デタージェントが存在したにも関わらず、ＡＰＡ中にデタージェントが存在し続けても、シクロデキストリンがＳＤＳを隔離したため、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ媒介性増幅に影響を及ぼさなかった。そうでなければデタージェントの存在は阻害性であると考えられる。
（実施例４）
Ｂ型インフルエンザウイルス検出に対するヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）保護の効果
この実施例は、現在利用可能な核酸検出法及び組成物に対する、本明細書で提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。例えば、保護の度合いを決定するためのアッセイの感度を開示しない従来の方法とは異なり、この実施例では、＋／－ＳＤＳでＲＮＡ標的の検出時間が同等であることが示され、アッセイ感度が決定される。ＡＰＡを、凍結乾燥試薬（β－シクロデキストリン、ｄＮＴＰ、３５単位の逆転写酵素、ＫＣｌ、ＥＧＴＡ（又はＥＤＴＡ）、Ｔｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリｒＡ、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、デキストラン４０ｋ、４％ベータＣＤ、トレハロース、プライマー、プローブ、９°Ｎｍ（商標）を含む）で実施した。
図５Ａに示されているように、５８℃に予熱した乾燥試薬を、５００ＩＵ（感染単位）相当のＢ型インフルエンザＲＮＡを有しない（ＮＴＣ、点線）又は有する、５８℃に２分間予熱した０．２％ＳＤＳ（ＲＢＳＲ）又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＲＢＴＲ）、ＭｇＳＯ4、及び（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む５０ｍｌ溶解溶液をピペッティングすることにより溶解した。５８℃で２分後（逆転写を促進するため）、ＡＰＡ及び蛍光検出のために温度を６８℃に上昇させた。
図５Ｂに示されているように、ＡＰＡは、０（ＮＴＣ）～５，０００ＩＵのＢ型インフルエンザのアッセイ検出範囲（ＳＤＳ及びウイルスを有する）を示し、図５Ａで使用した５００ＩＵは、アッセイダイナミックレンジ内に十分に入っていたこと、つまり、アッセイ感度は十分であり、そうした条件下においてＳＤＳの存在下でＨＰ－β－シクロデキストリンによりアッセイ性能が事実上完全に回復したことを示唆する。
（実施例５）
添加順序アッセイ
この実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。例えば、予想外のことだが、ヒドロキシプロピルβ－ＣＤの動力学は、ヒドロキシプロピルβ－ＣＤ及びＳＤＳのモル比２：１で十分に迅速だったことが見出された。図６には、添加順序アッセイに関するデータが図示されている。
添加順序アッセイ：検出時間は、酵素とＳＤＳとの短時間相互作用前のシクロデキストリン添加に依存する。ＳＤＳは９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼを迅速に及び不可逆的に不活化したため、その代わりに酵素をＳＤＳ及びβ－ＣＤに同時に曝露する場合、後者の２種の物質の複合体形成の動力学は、ＳＤＳと酵素との間の相互作用の速度と比較して非常に迅速なければならない。
図６には、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、ＫＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＳＹＢＲＩ、ＣＡｄＮＴＰ、９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼを含むＣｌｅａｎＡｍｐ（商標）デオキシヌクレオチド（ＣＡｄＮＴＰ）により媒介される湿式「ホットスタート」形式でのＡＰＡ反応によるＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＤＮＡ標的（５０，０００コピー）の検出に関するデータが図示されている。０．４％ＳＤＳ（Ｘ）、４％ヒドロキシプロピルβ－ＣＤ（四角）、ＳＤＳ次いで直ちにβ－ＣＤ（丸形）、又はβ－ＣＤ次いでＳＤＳ（実線）を添加し、混合した。対照（ｃｔｒｌ 点線）には添加しなかった。すべての試料にはＤＮＡ標的が含まれていた。等温ＡＰＡを６８℃で行い、挿入色素蛍光を１５秒毎に収集して、すべての指数関数的ＤＮＡ増幅をモニターした。ＳＤＳからの増幅（Ｘ、平坦）に対する障壁は、β－ＣＤ（実線）を事前に添加することにより相殺され、プラトーは低減されたが、検出時間は回復した。β－ＣＤ添加前に短時間ＳＤＳに曝露しただけでも（丸形、平坦）、９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼ酵素を不活化するのに十分であり、この２：１モル比のβ－ＣＤ：ＳＤＳで隔離の動力学が迅速だったことが示唆された。Ｓ．エンテリカＤＮＡを有しない各条件の陰性対照により、表記の増幅産物の特異性が確認された（図示せず）。
（実施例６）
ＲＮａｓｅＡ不活化アッセイ
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのイオン性デタージェントは、本明細書で提供される方法及び組成物において溶解剤として使用することができ、効率的な溶解を可能にし、変性によりリボヌクレアーゼを阻害することもでき、したがって溶解ステップ中に標的ＲＮＡを保護することができる。しかしながら、分離又は核酸精製をせずに乾燥反応ミックスを溶解試料に直接溶解することにより開始されるその後の直接的で迅速な分子試験反応では、ＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）は、反応に必要な酵素である逆転写酵素及びポリメラーゼも変性させることになるため、迅速に除去することが必要である可能性がある。しかしながら、リボヌクレアーゼの変性に使用される一部の作用剤の除去は、リボヌクレアーゼの再活性化、つまりその酵素活性の回復を可能にする可能性がある。本明細書に示されているように、乾燥反応ミックス中にシクロデキストリンを含めることにより、ＳＤＳ（及び／又はＣＴＡＢ）の迅速な除去を可能にすることができる。実際、この迅速な除去は、一部の変性タンパク質のリフォールディングも加速させる可能性がある。この実施例で実証したように、シクロデキストリンの存在下ではリボヌクレアーゼ再活性化が非常に迅速であり、標的ＲＮＡを未保護のままにしたことが実際に示された。
図７には、種々の温度におけるＣＴＡＢの存在下でのＲＮａｓｅＡ不活化の不可逆性に対するＤＴＴの効果に関するデータが図示されている。信頼できる反応条件をシミュレートするために、９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼを欠如するが４％ＨＰ－βＣＤを含む標準ＡＰＡ反応試薬を凍結乾燥形式で調製した。凍結乾燥試薬は、活性ＲＮａｓｅＡの存在下で蛍光を放射する合成クエンチＲＮＡプローブであるＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイ基質も含んでいた。試薬を２分間プレインキュベートし、１０ｍＭ ＤＴＴを有する（点線）又は有しない（図形記号）、２０ｎｇ ＲＮａｓｅＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌ溶液に表記温度で溶解した。この溶液も、温度勾配がプログラムされたＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦｘサーモサイクラーにて表記温度にてプレインキュベートされていた。すべての場合で、４％ＨＰ－βＣＤによるＣＴＡＢ隔離後の推定ＣＴＡＢ媒介性ＲＮａｓｅ活性不活化（ＤＴＴを有しない、図形記号）の即時可逆性は、ＤＴＴが含まれている場合は不可逆的だった。つまり、活性の回復は検出されなかった（平坦線）。
（実施例７）
ＲＮａｓｅＡ不活化アッセイ
現在利用可能な方法では、最大２００ｎｇ／ｍｌにて不可逆的なリボヌクレアーゼ不活化を達成することができるに過ぎないが、本明細書で提供される組成物及び方法は、患者試料中の潜在的により大きな量に対応するために１０μｇ／ｍｌでの有用性を示した。図８には、ＲＮａｓｅＡ不活化に対するＤＴＴ及びＨＰ－βＣＤの効果に関するデータが図示されている。ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔアッセイを使用して、ＲＮａｓｅ不活化に対するＤＴＴ及び０．２％カチオン性デタージェントＣＴＡＢの効果を研究した。ＲＮａｓｅＡを、０．２％ＣＴＡＢを含む溶液にスパイクし、それを、すべての溶液を６８℃でプレインキュベートした後、酵素を欠如するがＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質及び保護剤（４％ＨＰ－β ＣＤ）を含む凍結乾燥ＡＰＡ試薬ペレットと混合し、続いて６８℃で蛍光データを収集した。１０ｍＭ ＤＴＴの存在下では（点線及び破線；図８）、ＲＮａｓｅＡは効果的に不可逆的に不活化され、デタージェントを隔離しても活性は回復しなかった。しかしながら、デタージェントのみを用いた場合、活性は隔離後に急速に回復した（実線１０μｇ／ｍｌ、丸形１μｇ／ｍｌ）。
（実施例８）
不可逆的ＲＮａｓｅ不活化の要件
この実施例は、一部の先行技術とは異なり、いずれも単独ではなくＤＴＴ及びＳＤＳの組合せ作用が、ＡＰＡのために凍結乾燥ＡＰＡ試薬を溶解する前に、その未希釈試料を使用してさらなる処理せずに粗試料溶出液中のＲＮａｓｅＡを不可逆的に不活化する操作を可能にしたことの実証を提供する（図９）。５００ｎｇのＲＮａｓｅＡ（つまり、１０μｇ／ｍｌ）を、２５００感染単位に相当する精製Ｂ型インフルエンザＲＮＡを有しない（点線）又は有する（図形記号）、表記の添加物（０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含む、ＭｇＳＯ4及び（ＮＨ4）2ＳＯ4を有する５０ｍｌのＡＰＡランニング緩衝液に添加し、５８℃で２分間予熱した（図９）。次いで、加熱した溶液を使用して、実施例４で使用したのと同様の、９°Ｎm（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及び４％βＣＤを含む同様に予熱した凍結乾燥ＡＰＡ試薬を溶解した。５８℃でさらに２分後（このプライマーセットによる逆転写を促進するため）、温度を６８℃に調整した後１５秒毎に蛍光を収集して、ＡＰＡをモニターした。この形式では、ＳＤＳ単独（四角）は、４％ＨＰ βＣＤによるＳＤＳ隔離後のＲＮａｓｅＡ活性の有意な回復を防止しなかった（初期２分間の５８℃インキュベーション中のＳＤＳの存在下では、ＲＮａｓｅ活性が存在しないことが他所で示されていた）。しかしながら、ＤＴＴ及びＳＤＳの組合せ作用（Ｘ）は、ＲＮａｓｅＡを有しない陽性対照と同等のその後のＡＰＡ性能を可能にした（図示せず）。ＲＮａｓｅＡ活性に影響を及ぼさないＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の場合、ＲＮＡは検出されず（菱形）、ＲＮａｓｅＡは、ＡＰＡ試薬の溶解及び逆転写の開始の前及び後で活性であることが推定された。ＤＴＴ及びＴｒｉｔｏｎは、イオン性デタージェント（三角）を含まなかったものの、ＲＮＡを保護しなかった。この場合も、この形式ではＤＴＴ前処理がＲＮＡの適切な保護に不十分であることを示している。アッセイ較正（図示せず）は、ＲＮＡ検出能の＞９９％低減と一致した（図９）。重要なことには、この実施例は、先行技術のＲＮａｓｅ不活化（イオン性デタージェントを有しないＤＴＴ）が、代表的なＲＮａｓｅとして精製ＲＮａｓｅＡを使用したこのＰＯＣアッセイ系での検出では、ＲＮＡの保護に役に立たないことを示している。さらに、イオン性デタージェント単独では効果がなかった。現在利用可能な方法では、最大２００ｎｇ／ｍｌにて不可逆的なリボヌクレアーゼ不活化を達成することができるに過ぎないが、本明細書で提供される組成物及び方法は、患者試料中の潜在的により大きな量に対応するために１０μｇ／ｍｌでの有用性を示した。したがって、ここで示されているように、こうした条件下で検出を成功させるためには、イオン性デタージェント及び還元剤による同時処理が必要である。
（実施例９）
鼻腔スワブリボヌクレアーゼからのＲＮＡの保護
この実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物が、鼻腔スワブリボヌクレアーゼからＲＮＡを保護したことの実証を提供する。図１０Ａでは、鼻腔スワブ溶出液（スワブ内容物の４％、これは患者検査中に日常的に遭遇する可能性が高い量である）を、０．２％ＳＤＳ（Ｘ）又は０．２％ＳＤＳ＋１０ｍＭ ＤＴＴ（三角）を含む５０ｍｌ溶液中で２分間５８℃にて加熱した。ＳＤＳを隔離するために４％βＣＤに調整した後、Ｂ型インフルエンザＲＮＡを添加し、５８℃でのインキュベーションを継続した。第２のインキュベーション中（ＳＤＳ隔離後）に回復したリボヌクレアーゼ活性をモニターするために、５ｍｌ（２５００感染単位相当のＲＮＡを含む）を、標準ＡＰＡ（標準ＲＮａｓｅ保護手段が組み込まれている）で試験した。つまり、凍結乾燥試薬及びＲＢＳ ＤＴＴを５８℃でプレインキュベートし、次いで逆転写ＡＰＡを実施例４と同様に進行させた。ＤＴＴ無し（×）では検出されなかったが、ＤＴＴの添加は検出を回復させた（三角）。これは、対照（鼻腔溶出液無し、四角）と比べて、ＤＴＴ無しではＲＮａｓｅ活性が回復したことを示唆する。ＮＴＣは鼻腔溶出液を含んでいたが、ＲＮＡを含んでいなかった。アッセイ較正（図１０Ｂ）は、回復したＲＮａｓｅ活性が、５８℃で２分間のインキュベーション中にＲＮＡ検出能の＞９５％を消失させるのに十分だったことを示した。したがって、ここで示されているように、こうした条件下で検出を成功させるためには、イオン性デタージェント及び還元剤による同時処理が必要である。上記のデータと一致して、本開示の組成物及び方法は、ヒト鼻腔におけるＳＤＳ＋ＤＴＴ依存性のリボヌクレアーゼ不可逆的不活化（例えば、顧客使用中に遭遇すると考えられるもの）を示すことにより、インフルエンザＲＮＡの検出可能性に対する潜在的なリスクに対処する。
（実施例１０）
ＲＮａｓｅＡ活性アッセイ
この実施例は、現在利用可能な核酸検出法及び組成物に対する、本明細書で提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。２ｎｇ ＲＮａｓｅＡを、１０ｍＭ ＤＴＴ＋０．２％ＳＤＳ（＋）、０．２％ＳＤＳ（三角）、１０ｍＭ ＤＴＴ（四角）、又はいずれも無し（実線）を含む５０ｍｌ溶液中で５８℃にて２分間インキュベートし、次いで、ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔアッセイを使用して、酵素を有しないがＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質及び保護剤（４％βＣＤ）を含む凍結乾燥ＡＰＡ試薬を溶解した後でＳＤＳを隔離した際のあらゆるＲＮａｓｅ活性の回復を研究し、５８℃でのインキュベーション及び蛍光データ収集を継続した。ＲＮａｓｅ活性の存在下では、ＲＮａｓｅ ａｌｅｒｔインジケーター基質が検出可能な蛍光を放射する。図１１Ｂに示されているように、ＤＴＴ及びＳＤＳ（＋）の組合せのみが、その後のＲＮａｓｅの回復を防止し、その不可逆的不活化と一致したが、ＤＴＴ（四角）及びＳＤＳ（三角）はいずれも単独では、対照（実線）とほぼ同等の、酵素活性の事実上完全な回復の防止には十分ではなかった。図１１Ａには、βＣＤを添加しない同一前処理後のＲＮａｓｅＡ活性の回復が図示されており、この場合、ＲＮａｓｅ ａｌｅｒｔ「湿式」反応形式に移すことにより５ｍｌの溶液にて活性をモニターした。この形式では、ＳＤＳはＲＮａｓｅ ａｌｅｒｔアッセイ中にＲＮａｓｅＡを不活化し続けることになるため、ＳＤＳを有しない試料からのみ関連する結論が導き出されるが、結果は、ＤＴＴ単独による前処理（四角）も、その後にβＣＤを添加しない場合は、ＲＮａｓｅＡ活性の回復に影響を及ぼさなかったことを示した。したがって、ここで示されているように、本明細書に記載の条件下で不可逆的不活化を成功させるためには、イオン性デタージェント及び還元剤による同時処理が必要である。さらに、この実施例で実証したように、シクロデキストリンの存在下ではリボヌクレアーゼ再活性化が非常に迅速であり、標的ＲＮＡを未保護のままにしたことが実際に示された。いかなる特定の理論にも束縛されないが、これは、リフォールディングプロセスに対するシクロデキストリン及び他のＡＰＡ添加剤の影響に関する可能性がある。また、この実施例は、独立した市販のＲＮａｓｅアッセイを用いて、先行技術及び現在利用可能な方法（例えば、還元剤を使用するが変性剤を使用しない）が、こうした条件下では不適切であることのさらなる確認を提供する。
（実施例１１）
Ｂ型インフルエンザアッセイ
この実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。図１２Ａ～１２Ｂには、ＥＬＢ（溶出／溶解緩衝液）中でＤＴＴを用いた、実施例４のアッセイと同様のＢ型インフルエンザアッセイにおけるＲＮａｓｅＡ不活化に関するデータが図示されている。この実施例（図１２Ａ）は、種々の量のＢ型インフルエンザウイルスを有さない（ＮＴＣ 点線）又は有する（実線及び破線）０．２％ＳＤＳを含むＥＬＢ中で５８℃にて２分間加熱した後のＲＮＡｓｅＡ（１０μｇ／ｍｌ）活性の阻害レベルの回復を実証する。インキュベーション後、５８℃で２分間共インキュベートした、β－ＣＤ（最終４％）を含む凍結乾燥ＡＰＡ試薬を、加熱した溶液に溶解し、１５秒毎にＦＡＭ蛍光を収集してＡＰＡをモニターした。図１２Ｂでは、０．２％ＳＤＳに１０ｍＭ ＤＴＴを添加してＲＮＡｓｅＡをプレインキュベートしたことを除き同じ条件を用いた。これは、無ＲＮＡｓｅＡ対照（図示せず）と同等の性能を可能にした。ＤＴＴを含めることにより、非常に高レベルの精製ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む模擬試料において、このＰＯＣインフルエンザ検出系の作用を妨げないことが可能になる。さらに、現在利用可能な方法では、最大２００ｎｇ／ｍｌにて不可逆的なリボヌクレアーゼ不活化を達成することができるに過ぎないが、本明細書で提供される組成物及び方法は、患者試料中の潜在的により大きな量に対応するために１０μｇ／ｍｌでの有用性を示す。
（実施例１２）
鼻腔リボヌクレアーゼ不活化の迅速な不可逆性
この実施例は、現在利用可能な核酸検出法及び組成物に対する、本明細書に提供される方法及び組成物の予期せぬ利点を実証する。図１３には、鼻腔リボヌクレアーゼ不活化の迅速な不可逆性に関するデータが図示されている。典型的な鼻腔スワブの２％に相当する量である、ＴＥ中の濃縮鼻腔スワブ溶出液５μｌを、すべて６０℃に予熱した、０．２％ＳＤＳ（ＲＢＳ、実線）を含む溶解緩衝液、４０ｍＭシステインを含むＲＢＳ（四角）、又は水（点線）のいずれかの４５μｌと混合した。５μｌを、直ちに４５μ１の４％β－シクロデキストリンで希釈して、デタージェントを隔離した。回復したＲＮａｓｅ活性を、ＲＮａｓｅ ａｌｅｒｔアッセイで測定した。アッセイの対照として、等量の鼻腔スワブ溶出液を、前処理せずに直接添加した（Ｘ）。結果は、ＳＤＳ及び還元剤としてのシステインの組合せ作用により媒介されたＲＮａｓｅ不活化は、即時不可逆的操作であるという考えと一致した（四角）。ＳＤＳのみの存在下では（実線）、ＲＮａｓｅ不活化は、シクロデキストリンによるＳＤＳ隔離後は事実上完全に可逆的であり、つまり対照（点線又はＸ）と区別できなかった。予想外なことであったが、本発明の実施中にこのようにして観察されたリボヌクレアーゼの効果的に不可逆的な不活化は、熱に基づく従来技術の方法とは異なり、事実上瞬間的であった（リボヌクレアーゼ活性を直接試験することによりモニターした）。また、この実施例では、ＲＮａｓｅＡについて記載された不活化特性が、鼻滲出液中に天然に存在するリボヌクレアーゼにも当てはまることが示されている。
（実施例１３）
臨床マトリックスの存在下及び非存在下での等温Ｂ型インフルエンザウイルス検出のための直接溶解
この実施例は、本明細書で開示の方法を使用した、鼻腔スワブ試料を有する場合及び有しない場合の検出が同等であることの実証を提供する。
生Ｂ型インフルエンザウイルスを、０．２％ＳＤＳを含む溶液５０μｌ中で６８℃にて２分間溶解し、次いでこれを使用して、逆転写酵素；９ｄＮ＋ポリｒＡ＋ＢＳＡ無し（図１４Ａ）及び有り（図１４Ｂ）を用いた上記と同様の等温逆転写及びＡＰＡのために、ＨＰ－βＣＤを含む凍結乾燥ＡＰＡ試薬を同じ温度で溶解した。推定陰性個体からの典型的な鼻腔スワブ試料（リボヌクレアーゼ活性を含む）の量の４％に相当する量の鼻腔スワブ溶出液が溶解中に含まれていた。増幅されたＢ型インフルエンザの検出には、フルオレセイン標識分子ビーコンを用いた。鼻腔「マトリックス」リボヌクレアーゼの有無に関わらず、ほとんど又は全く差異はなかった（図１４Ａ～１４Ｂ）。
前述の実施形態の少なくとも一部では、ある実施形態で使用された１種又は複数種の要素は、そのような置き換えが技術的に実行不可能でない限り、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者であれば、特許請求されている主題の範囲から逸脱することなく、上記に記載の方法及び構造に対して、種々の他の省略、追加、及び改変をなすことができることを理解するだろう。そのような改変及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲により規定される主題の範囲内に入ることが意図されている。
本明細書における実質的にあらゆる複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者であれば、状況及び／又は応用に応じて、複数から単数へと及び／又は単数から複数へと言い換えることができる。明確性のため、種々の単数／複数の入れ替えは、本明細書では明示的に記載されている場合がある。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別様に指示しない限り、複数の参照を含む。本明細書における「又は」へのあらゆる言及は、別様の記載のない限り、「及び／又は」を包含することが意図されている。
当業者であれば、一般に、本明細書及び特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用されている用語は、一般に「オープン」用語（例えば、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「含むが、それに限定されない」と解釈されるべきであり、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「含むが、それに限定されない」と解釈されるべきである、など）であることが意図されていることを理解するだろう。さらに、当業者であれば、導入された請求項記載において特定の数が意図されている場合、そのような意図は請求項に明示的に記載されることになり、そのような記載がない場合にはそのような意図は存在しないことが理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲には、請求項記載を導入するために「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という導入語句の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような語句の使用は、同じ請求項が、「１つ又は複数」又は「少なくとも１つ」という導入語句、及び「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞を含む（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」を意味すると解釈されるべきである）場合であっても、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項記載の導入が、そのような導入された請求項記載を含むあらゆる特定の請求項を、１つのみのそのような記載を含む実施形態に限定することを意味するものであると解釈されるべきではない。請求項記載を導入するために使用される定冠詞の使用にも同じことが当てはまる。加えて、導入された請求項記載において特定の数が明示的に記載されている場合であっても、当業者であれば、そのような記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを認識するであろう（例えば、「２つの記載」の基本記載は、他の修飾語がない場合、少なくとも２つの記載、又は２つ若しくはそれよりも多くの記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣなどの少なくとも１つ」と類似する慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は、当業者であればその慣例を理解するだろうという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを共に有する系などを含むが、それらに限定されないだろう）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどの少なくとも１つ」と類似する慣例が使用される場合では、一般に、そのような構成は、当業者であればその慣例を理解するだろうという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを共に有する系などを含むが、それらに限定されないだろう）。さらに、当業者であれば、明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、２つ又はそれよりも多くの代替用語を提示する事実上あらゆる選言的な単語及び／又は語句は、そうした用語、そうした用語のいずれか、又は両用語の１つを含む可能性を企図すると理解されるべきであることを理解するだろう。
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者であれば、それにより本開示が、マーカッシュ群のあらゆる個々のメンバー又はメンバーの部分群の観点でも記載されていることを認識するだろう。
当業者であれば理解することになるように、書面による説明を提供するという観点など、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示のすべての範囲は、ありとあらゆる考え得る部分範囲及びそれらの部分範囲の組合せも包含する。列挙されている範囲はいずれも、十分に説明されているように、同じ範囲を少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などに分割することができるものであると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で考察されている各範囲は、下位三分の一、中位三分の一、及び上位三分の一などに容易に分割することができる。また、当業者であれば理解することになるように、「～まで」、「少なくとも」、「よりも大きい」、及び「未満」などのすべての文言は、記載されている数値を含み、上記で考察されているように後に部分範囲へと分割することができる範囲を指す。最後に、当業者であれば理解することになるように、範囲は、各々個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３つの項目を含む群は、１、２、又は３つの項目を含む群を指す。同様に、１～５つの項目を含む群は、１、２、３、４、又は５つの項目を含む群を指す、などである。
種々の態様及び実施形態が本明細書に開示されているが、当業者であれば、他の態様及び実施形態は明らかであろう。本明細書で開示される種々の態様及び実施形態は、例示を目的とするものであり、限定を意図するものではなく、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲により示される。

Claims (60)

  1. 試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
    （ａ）生物学的実体を含む試料を溶解緩衝液と接触させて、処理試料を生成するステップ、ここで、前記溶解緩衝液は、生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能な１種又は複数種の溶解剤を含み、且つ前記試料核酸は標的核酸配列を含むことが疑われている；
    （ｂ）試薬組成物を前記処理試料と接触させて、増幅反応混合物を生成するステップ、ここで、試薬組成物は、１種又は複数種の保護剤及び１種又は複数種の増幅試薬を含む；
    （ｃ）前記増幅反応混合物中で標的核酸配列を増幅するステップであって、それにより核酸増幅産物を生成する、前記ステップ；並びに
    （ｄ）前記核酸増幅産物を検出するステップ、ここで、前記検出するステップは、前記試薬組成物が処理試料と接触した時点から約２０分未満に実施される
    を含む方法。
  2. 前記溶解緩衝液及び／又は試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤を含み、任意に、前記１種又は複数種の還元剤は、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、還元型グルタチオン、システアミン、トリ－ｎ－ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオエリトリオール、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びヒドロキシエチルジスルフィド（ＨＥＤ）の１種又は複数種を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記溶解緩衝液は、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、ＥＤＴＡ、及びＥＧＴＡの１種又は複数種を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記溶解緩衝液のｐＨは、約１．０～約１０．０であり、任意に、前記溶解緩衝液のｐＨは、約２．２である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記試料核酸は、試料リボ核酸及び／又は試料デオキシリボ核酸を含み、任意に、前記試料核酸は、細胞ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はそれらの組合せを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記１種又は複数種の増幅試薬は、逆転写酵素及び／又は超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素を含み、任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、逆転写酵素活性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記試薬組成物は、逆転写酵素、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、第１のプライマー、第２のプライマー、及び逆転写プライマーの１種又は複数種を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記増幅するステップは、等温増幅条件で実施され；及び／又は
    前記核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出法の使用を含む、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 試薬組成物は、凍結乾燥され、加熱乾燥され、及び／又は１種若しくは複数種の添加剤を含み、任意に、前記１種又は複数種の添加剤は、
    Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント、若しくはそれらの組合せ；
    アミノ酸；
    糖若しくは糖アルコール、ここで、任意に、前記糖若しくは糖アルコールは、スクロース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、若しくはそれらのあらゆる組合せを含む；及び／又は
    ポリマー、ここで、任意に、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、フィコール、アルブミン、ポリペプチド、コラーゲンペプチド、若しくはそれらのあらゆる組合せを含む
    を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. １種又は複数種の保護剤対１種又は複数種の増幅試薬のモル比は、約１０：１～約１：１０であり、任意に、前記モル比は約２：１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. １種又は複数種の保護剤は、式（Ｉ）のシクロデキストリン化合物、又はその塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
    Figure 2024510270000004
     （式中、
    各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり；
    各Ｒ1は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、－ＣＮ、－ＣＦ3、－Ｎ3、－ＮＯ2、－ＯＲB、－ＳＲB、－ＳＯＲB、－ＳＯ2ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）－ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）ＮＲAＲB、－ＮＲAＲB、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲB、又は－Ｎ（ＲB）Ｃ（Ｏ）ＲBであり；これらの各々は置換されていてもよく；
    各ＲAは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
    各ＲBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
    ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり；
    各ｍは、独立して、０、１、２、３、４、又は５である。）
  12. 各Ｒは、独立して、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり、任意に、ｎは、１、２、若しくは３であり；及び／又は
    各Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、若しくはオクチルであり、任意に、各々は、直鎖又は分枝鎖であり、さらに任意に、ｎは、１、２、又は３である、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 前記シクロデキストリン化合物は、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２ＨＰβＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、若しくはγ－シクロデキストリン、又はそれらの塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物である、請求項１１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記１種又は複数種の溶解試薬は、
    約０．００１％（質量／容積）～約１．０（質量／容積）の処理試料、任意に、約０．２％（質量／容積）の処理試料；並びに／又は
    デタージェント、ここで、任意に、前記デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種若しくは複数種を含む
    を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記試料核酸は、標的核酸配列を含む核酸を含み、任意に、前記標的核酸配列は、互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記標的核酸配列を増幅するステップは、
    互いに相補的な第１の鎖及び第２の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅することを含み、ここで、前記増幅するステップは、前記標的核酸配列を含む核酸を、下記ｉ）及びｉｉ）：
    ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマー、ここで、前記第１のプライマーは、前記標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記第２のプライマーは、前記標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である；並びに
    ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素であって、それにより核酸増幅産物を生成する、前記酵素、ここで、前記核酸増幅産物は、
    （１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、
    （２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに
    （３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列、ここで、前記スペーサー配列は、１～１０塩基長である、を含む
    と接触させることを含む、
    請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記増幅するステップは、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素を使用することを含まず、並びに／又は、前記増幅するステップは、前記核酸を熱変性及び／若しくは酵素変性することを含まず、任意に、前記方法は、ステップ（ｃ）の前又はステップ（ｃ）の間に、前記核酸を一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と接触させることを含まない、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記核酸は、二本鎖ＤＮＡである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記核酸は、逆転写反応の産物であり、任意に、前記核酸は、試料リボ核酸から生成される逆転写反応の産物であり、さらに任意に、ステップ（ｃ）は、逆転写反応により核酸を生成することを含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記試料核酸は、試料リボ核酸を含み、且つ、前記方法は、試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させてｃＤＮＡを生成することを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記標的核酸配列を増幅するステップは、
    （ｃ１）試料リボ核酸を逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーと接触させてｃＤＮＡを生成すること；
    （ｃ２）前記ｃＤＮＡを、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成すること、ここで、前記ｄｓＤＮＡは標的核酸配列を含み、前記標的核酸配列は、互いに相補的である第１の鎖及び第２の鎖を含む；
    （ｃ３）前記標的核酸配列を等温増幅条件下で増幅すること、ここで、前記増幅することは、前記ｄｓＤＮＡを、下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
    （ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマー、ここで前記第１のプライマーは、前記標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記第２のプライマーは、前記標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である；並びに
    （ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素であって、それにより核酸増幅産物を生成する、前記酵素、ここで、前記核酸増幅産物は、下記
    （１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、
    （２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに
    （３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列、ここで、前記スペーサー配列は、１～１０塩基長である、を含む
    と接触させることを含む
    を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記逆転写酵素及び／又は前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外の酵素を使用することを含まない、請求項２１に記載の方法。
  23. ステップ（ｄ）は、試料中の、標的核酸配列を含むｄｓＤＮＡ及び／又は核酸の量を決定することをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有し、任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有し、さらに任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであり、任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、エキソヌクレアーゼ活性が低いか又はエキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記標的核酸配列を増幅するステップは、約５５℃～約７５℃の一定の温度で実施され、任意に、前記標的核酸配列を増幅するステップは、約６５℃の一定の温度で実施される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、及び／若しくは前記逆転写プライマーは、約８～１７塩基長であり、任意に、前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、及び／若しくは前記逆転写プライマーは、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、若しくはそれらの組合せの１種若しくは複数種を含み；
    前記核酸増幅産物は、約２０～４０塩基長であり；並びに／又は
    前記スペーサー配列は標的核酸配列の一部を含み、任意に、前記スペーサー配列は１～１０塩基長である、
    請求項７～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記核酸増幅産物を、増幅産物にハイブリダイズすることが可能なシグナル発生オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、ここで、前記シグナル発生オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、又はその両方を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記核酸増幅産物を検出するステップは、蛍光シグナルを検出することを含み、任意に、前記蛍光シグナルは、分子ビーコンからのものである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記試料リボ核酸は、前記逆転写酵素及び前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と同時に接触し、任意に、前記試料リボ核酸は、前記逆転写酵素、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、並びに前記第１及び第２のプライマーと同時に接触し、さらに任意に、前記試料リボ核酸は、前記逆転写酵素、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素、前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、及び前記逆転写プライマーと同時に接触する、請求項１９～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記１種又は複数種の溶解剤は、前記１種又は複数種の増幅試薬を変性させることが可能であり、前記１種又は複数種の保護剤は、前記１種又は複数種の溶解剤による１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記１種又は複数種の保護剤は、前記１種又は複数種の溶解剤を隔離（sequester）することで、前記１種又は複数種の溶解剤による前記１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記１種又は複数種の溶解剤の約９０％よりも多くは、前記１種又は複数種の保護剤により隔離（sequester）される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記１種又は複数種の増幅試薬の約１０％未満は、前記１種又は複数種の溶解剤により変性される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記試料は複数種のヌクレアーゼを含み、ここで、前記ヌクレアーゼはリボヌクレアーゼ及び／若しくはデオキシリボヌクレアーゼを含み、且つ、
    前記１種若しくは複数種の溶解剤は、リボヌクレアーゼを変性させて変性リボヌクレアーゼを生成することが可能であり、前記１種若しくは複数種の還元剤は、リボヌクレアーゼを還元して還元型リボヌクレアーゼを生成することが可能であり、前記１種若しくは複数種の還元剤及び前記１種若しくは複数種の溶解剤は、還元型変性リボヌクレアーゼを生成することが可能であり、並びに／又は
    前記１種若しくは複数種の溶解剤は、デオキシリボヌクレアーゼを変性させて変性デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能であり、前記１種若しくは複数種の還元剤は、デオキシリボヌクレアーゼを還元して還元型デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能であり、前記１種若しくは複数種の還元剤及び前記１種若しくは複数種の溶解剤は、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能である、
    請求項２～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 変性リボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は前記１種若しくは複数種の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元して、復元リボヌクレアーゼを生成することが可能であり、任意に、前記１種又は複数種の溶解剤を隔離（sequester）することは、前記１種又は複数種の溶解剤と変性リボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼとの物理的相互作用を低減させ；並びに／或いは
    変性デオキシリボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性デオキシリボヌクレアーゼは、時間が経過すると及び／又は前記１種若しくは複数種の溶解剤との物理的相互作用が低減すると復元して、復元デオキシリボヌクレアーゼを生成することが可能であり、任意に、前記１種又は複数種の溶解剤を隔離（sequester）することは、前記１種又は複数種の溶解剤と変性デオキシリボヌクレアーゼ及び／又は還元型変性デオキシリボヌクレアーゼとの物理的相互作用を低減させる、
    請求項３４に記載の方法。
  36. 変性デオキシリボヌクレアーゼ、還元型デオキシリボヌクレアーゼ、還元型変性デオキシリボヌクレアーゼ、変性リボヌクレアーゼ、還元型リボヌクレアーゼ、及び／又は還元型変性リボヌクレアーゼは酵素的に不活性であり、復元リボヌクレアーゼ及び／又は復元デオキシリボヌクレアーゼは酵素的に活性である、請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 還元型変性リボヌクレアーゼは、変性リボヌクレアーゼよりも少なくとも約１．１倍ゆっくりと復元し、及び／又は
    還元型変性デオキシリボヌクレアーゼは、変性デオキシリボヌクレアーゼよりも少なくとも約１．１倍ゆっくりと復元する、
    請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、約１．１倍多くの試料リボ核酸が、ｃＤＮＡを生成するための鋳型として逆転写酵素により使用され、及び／又は
    溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、約１．１倍多くの試料デオキシリボ核酸が、核酸増幅産物を生成するための鋳型として超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素により使用される、
    請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記増幅反応混合物は、前記溶解緩衝液が１種又は複数種の還元剤を含まない同等の方法と比較して、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）の１０分後に少なくとも１．１倍低いヌクレアーゼ活性を含み、任意に、前記ヌクレアーゼ活性は、デオキシリボヌクレアーゼ活性及び／又はリボヌクレアーゼ活性を含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記生物学的実体は、
    原核細胞、真核細胞、ウイルス粒子、エキソソーム、プロトプラスト、及び微小胞の１種若しくは複数種；並びに／又は
    ウイルス、細菌、真菌、原生動物（protozoa）、それらの一部、若しくはそれらのあらゆる組合せ
    を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記標的核酸配列は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物（protozoa）の核酸配列であり、任意に、前記試料核酸は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物に由来する、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペス、ヘルペスウイルス６、ヘルペスウイルス７、エプスタインバーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザ、ロタウイルス、ヒトアデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトエンテロウイルス、生殖器ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、若しくはハンタウイルスであり；
    前記細菌は、マイコバクテリア・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、エールリッヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ・ドゥモフィ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｄｕｍｏｆｆｉｉ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、エーリキア種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の１種若しくは複数種を含み、
    前記真菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、及びトリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）の１種若しくは複数種を含み、並びに／又は
    前記原生動物は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、シクロスポラ種（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、及びエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐ．）の１種若しくは複数種を含む、
    請求項４０～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記増幅するステップは、２種又はそれよりも多くの標的核酸配列のマルチプレックス増幅を含み、前記検出ステップは、前記２種又はそれよりも多くの標的核酸配列に由来する２種又はそれよりも多くの核酸増幅産物のマルチプレックス検出を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記２種又はそれよりも多くの標的核酸配列は、２種又はそれよりも多くの異なる生物に特異的であり、任意に、前記２種又はそれよりも多くの異なる生物は、クラミジア・トラコマティス、ナイセリア・ゴノレア、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及び／又はＣ型インフルエンザの１種又は複数種を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記増幅するステップは、以下のもの：ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ラミフィケーション（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、シグナル媒介性ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノム指数関数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、及び等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）の１種又は複数種を含まず、任意に、前記増幅するステップは、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）を含まない、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. （ｉ）前記処理試料を希釈すること；（ｉｉ）前記増幅反応混合物を希釈すること；（ｉｉｉ）前記処理試料を熱変性させること；（ｉｖ）前記処理試料を超音波処理すること；（ｖ）前記増幅反応混合物を超音波処理すること；（ｖｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤及び／又はデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤を前記処理試料に添加すること；（ｖｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤及び／又はデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤を前記増幅反応混合物に添加すること；（ｖｉｉｉ）前記試料を精製すること；（ｉｘ）前記試料核酸を精製すること；（ｘ）前記核酸増幅産物を精製すること；（ｘｉ）前記処理試料又は前記増幅反応混合物から前記１種又は複数種の溶解剤を除去すること；（ｘｉｉ）増幅前及び／又は増幅中に前記試料核酸を熱変性及び／又は酵素変性させること；並びに（ｘｉｉｉ）リボヌクレアーゼＨを前記処理試料又は前記増幅反応混合物に添加することの１つ又は複数を含まない、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 試料中の標的核酸配列を検出するためのキットであって、以下の（ａ）及び（ｂ）を含むキット：
    （ａ）生物学的実体を溶解してそれらの中に含まれる試料核酸を放出させることが可能な１種又は複数種の溶解剤を含む溶解緩衝液、ここで、前記試料核酸は、標的核酸配列を含むことが疑われている；並びに
    （ｂ）１種又は複数種の保護剤、及び等温増幅条件下で標的核酸配列を増幅するための１種又は複数種の成分を含む１種又は複数種の増幅試薬を含む試薬組成物、ここで、前記増幅するための１種又は複数種の成分は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）：
    （ｉ）第１のプライマー及び第２のプライマー、ここで、前記第１のプライマーは、標的核酸配列の第１の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖の配列にハイブリダイズすることが可能である；並びに
    （ｉｉ）核酸増幅産物を生成することが可能な超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素
    を含む。
  48. 前記溶解緩衝液及び／又は前記試薬組成物は、１種又は複数種の還元剤を含み、任意に、前記１種又は複数種の還元剤は、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、還元型グルタチオン、システアミン、トリ－ｎ－ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオエリトリオール、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、ジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）、システイン、システイン－チオグリコレート、亜硫酸の塩、チオグリコール酸、及びヒドロキシエチルジスルフィド（ＨＥＤ）の１種又は複数種を含む、請求項４７に記載のキット。
  49. 核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１種の成分をさらに含み、任意に、前記リアルタイム検出活性は、分子ビーコンにより提供される、請求項４７～４８のいずれか１項に記載のキット。
  50. 前記試薬組成物は、逆転写酵素及び／又は逆転写プライマーを含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のキット。
  51. 前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有しており、任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有し、さらに任意に、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリメラーゼである、請求項４７～５０のいずれか１項に記載のキット。
  52. 前記核酸増幅産物は約２０～４０塩基長であり、且つ、前記核酸増幅産物は、
    （１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体、
    （２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体、並びに
    （３）（１）第１のプライマーの配列及びその逆相補体並びに（２）第２のプライマーの配列及びその逆相補体によりフランキングされているスペーサー配列、ここで、前記スペーサー配列は１～１０塩基長である
    を含む、請求項４７～５１のいずれか１項に記載のキット。
  53. 前記生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、ウイルス粒子、エキソソーム、プロトプラスト、及び微小胞の１種若しくは複数種を含み、任意に、前記生物学的実体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物（protozoa）、それらの一部、若しくはそれらのあらゆる組合せを含み；並びに／又は
    標的核酸配列は、ウイルス、細菌、真菌、若しくは原生動物の核酸配列であり、任意に、前記試料核酸は、ウイルス、細菌、真菌、若しくは原生動物に由来する、
    請求項４７～５２のいずれか１項に記載のキット。
  54. 前記ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペス、ヘルペスウイルス６、ヘルペスウイルス７、エプスタインバーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザ、ロタウイルス、ヒトアデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトエンテロウイルス、生殖器ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、及びハンタウイルスであり；
    前記細菌は、マイコバクテリア・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、エールリッヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ・ドゥモフィ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｄｕｍｏｆｆｉｉ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、エーリキア種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の１種若しくは複数種を含み、
    前記真菌は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、及びトリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）の１種若しくは複数種を含み、並びに／又は
    前記原生動物は、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、シクロスポラ種（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、及びエイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐ．）の１種若しくは複数種を含む、
    請求項５３に記載のキット。
  55. 前記試薬組成物は、凍結乾燥及び／又は加熱乾燥されており、且つ、１種又は複数種の添加剤を含み、ここで、前記１種又は複数種の添加剤は、
    Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ８０、非イオン性デタージェント、若しくはそれらの組合せ；
    アミノ酸；
    糖若しくは糖アルコール、ここで、任意に、前記糖若しくは糖アルコールは、スクロース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、若しくはそれらのあらゆる組合せを含む；及び／又は
    ポリマー、ここで、任意に、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、フィコール、アルブミン、ポリペプチド、コラーゲンペプチド、若しくはそれらのあらゆる組合せを含む、
    を含む、請求項４７～５４のいずれか１項に記載のキット。
  56. １種又は複数種の保護剤は、式（Ｉ）のシクロデキストリン化合物、又はその塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物を含む、請求項４７～５５のいずれか１項に記載のキット。
    Figure 2024510270000005
     （式中、
    各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり；
    各Ｒ1は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、－ＣＮ、－ＣＦ3、－Ｎ3、－ＮＯ2、－ＯＲB、－ＳＲB、－ＳＯＲB、－ＳＯ2ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）－ＲB、－Ｎ（ＲB）Ｓ（Ｏ2）ＮＲAＲB、－ＮＲAＲB、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲB、又は－Ｎ（ＲB）Ｃ（Ｏ）ＲBであり；これらの各々は置換されていてもよく；
    各ＲAは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
    各ＲBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は置換されていてもよく；
    ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり；
    各ｍは、独立して、０、１、２、３、４、又は５である。）
  57. 各Ｒは、独立して、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲB、－ＯＣ（Ｏ）ＲB、－Ｃ（Ｏ）ＲB、若しくは－Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲBであり、任意に、ｎは、１、２、若しくは３であり；及び／又は
    各Ｒは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、若しくはオクチルであり、任意に、各々は、直鎖若しくは分枝鎖であり、さらに任意に、ｎは、１、２、若しくは３である、
    請求項５６に記載のキット。
  58. シクロデキストリン化合物は、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２ＨＰβＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、若しくはγ－シクロデキストリン、又はそれらの塩、エステル、溶媒和物、若しくは水和物である、請求項５６～５７のいずれか１項に記載のキット。
  59. 前記１種又は複数種の溶解剤はデタージェントを含み、且つ、前記デタージェントは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の１種又は複数種を含む、請求項４７～５８のいずれか１項に記載のキット。
  60. 前記１種又は複数種の保護剤は、前記１種又は複数種の溶解剤を隔離（sequester）することで、それにより前記１種又は複数種の溶解剤による前記１種又は複数種の増幅試薬の変性を防止することが可能である、請求項４７～５９のいずれか１項に記載のキット。
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