ES2622401T3 - Método de predicción de la eficacia de un inhibidor de la angiogénesis - Google Patents

Método de predicción de la eficacia de un inhibidor de la angiogénesis Download PDF

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Tadashi Kadowaki
Kentaro Takahashi
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Abstract

Un método de predicción de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogénesis, que comprende (a) detectar la presencia o ausencia de una mutación o pérdida de expresión de B-Raf y la presencia o ausencia de una mutación o pérdida de expresión de PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto, en el que en la etapa de detección, un caso donde (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante, o (a2) B-Raf tiene al menos una mutación seleccionada de la Tabla 1 o pérdida de expresión y PTEN tiene al menos una mutación seleccionada de la Tabla 2 o pérdida de expresión es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogénesis, en el que el inhibidor de la angiogénesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacológicamente aceptable de la misma, y en el que el tumor es melanoma.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de prediccion de la eficacia de un inhibidor de la angiogenesis Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un novedoso metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un cancer a un inhibidor de la angiogenesis.
Tecnica anterior
Se han desarrollado muchos inhibidores de cinasas como agentes antineoplasicos. Particularmente, un grupo de sustancias que tienen una actividad inhibitoria contra una tirosina cinasa de receptor tal como el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (en lo sucesivo tambien denominado "VEGF") tienen caracteffsticas de inhibicion de la angiogenesis asociada al crecimiento del cancer y llaman la atencion como una nueva generacion de agentes antineoplasicos.
Sin embargo, todavfa no se ha autorizado un agente antineoplasico eficaz para todos los tipos de cancer. Particularmente, el melanoma maligno avanzado es altamente metastasico y su pronostico es extremadamente malo. Debido a esto, es diffcil desarrollar un agente antineoplasico para melanoma maligno.
Mientras tanto, la terapia con un agente antineoplasico generalmente conlleva efectos secundarios tales como nauseas graves y malestar general. Asf, debe evitarse la administracion de un agente antineoplasico a un sujeto, en el que no se espera que el agente ejerza un efecto terapeutico. Por tanto, se ha deseado desarrollar un biomarcador por el que pueda predecirse un efecto terapeutico en un sujeto antes de administrar un agente antineoplasico con el fin de evitar la administracion de un farmaco medicinal ineficaz y reducir los efectos secundarios.
Por casualidad, se ha usado la 4-(3-cloro-4-(ciclopropilamidocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida como inhibidor multi-cinasas que tiene una actividad inhibitoria contra las tirosina cinasas de receptor tales como el receptor de VEGF, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (en lo sucesivo tambien denominado "FGF"), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (en lo sucesivo tambien denominado "PDGF"), RET cinasa y KIT cinasa, y presenta un excelente efecto de inhibicion de la angiogenesis y un efecto anti-crecimiento (Bibliograffa de patente 1; Bibliograffa de patente 2; Bibliograffa no de patente 1).
Ademas, se sabe que B-Raf, un tipo de serina/treonina cinasa, sirve de senal de proliferacion de celulas, si se activa, para activar la via de MAP cinasa importante como via de senalizacion de la proliferacion celular. Ademas, se ha informado que B-Raf activa diversos tipos de cancer debido a su mutacion (Bibliograffa no de patente 2).
Ademas, un gen represor del cancer, PTEN (homologo de fosfatasa y de tensina delecionado en el cromosoma 10), codifica una fosfatasa de lfpido que utiliza principalmente PIP3 como sustrato y controla negativamente la senal. PTEN tiene una funcion de inhibir la activacion de Akt cinasa, induciendo asf la apoptosis para suprimir la proliferacion celular; sin embargo, se sabe que una mutacion y perdida de expresion de PTEN inducen la excesiva activacion de Akt cinasa, causando el crecimiento de cancer (Bibliograffa no de patente 3).
Sin embargo, no se han hecho informes sobre la asociacion de la presencia o ausencia de una mutacion de B-Raf y la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de PTEN con el efecto antitumoral de un inhibidor de la angiogenesis.
Lista de referencias
Bibliograffa de patente
Bibliograffa de patente 1: WO02/032872 Bibliograffa de patente 2: WO2007/136103 Bibliograffa no de patente
Bibliograffa no de patente 1: Matsui et al., Clinical Cancer Research, 2008,14 (17), p. 5459-5465.
Bibliograffa no de patente 2: Davies et al., Nature, 2002, 417, p. 949-954.
Bibliograffa no de patente 3: Besson et al., European Journal of Biochemistry, 1999, 263, p. 605-611.
Sumario de la invencion Problema tecnico
La presente invencion se hizo en las circunstancias anteriormente mencionadas. Un problema a resolver por la invencion es el hallazgo de un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un cancer a un
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inhibidor de la angiogenesis, particularmente a un inhibidor del receptor de VEGF, un inhibidor del receptor de FGF, un inhibidor de RET cinasas o un inhibidor de KIT cinasas.
Otro problema a resolver por la invencion es seleccionar un sujeto que padece un cancer por el metodo de prediccion anterior y tratar el sujeto administrando un inhibidor de la angiogenesis.
Solucion al problema
Los presentes inventores hicieron un gran esfuerzo por resolver los problemas anteriormente mencionados y sorprendentemente encontraron que la aparicion simultanea de una mutacion de B-Raf y una mutacion o perdida de expresion de PTEN se correlaciona con la sensibilidad de celulas cancerosas a un inhibidor de la angiogenesis.
Mas espedficamente, los presentes inventores investigaron la sensibilidad de celulas de melanoma a un inhibidor de la angiogenesis. Como resultado, los presentes inventores elucidaron que el caso donde (a1) B-Raf y PTEN son no mutantes o (a2) B-Raf y PTEN tienen una mutacion o perdida de expresion presenta alta sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis.
Adicionalmente, los presentes inventores encontraron que la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN en celulas de melanoma se correlaciona con los niveles de expresion de angiopoyetina- 1 (ANG1) y angiopoyetina-2 (ANG2). Para describirlo mas espedficamente, se esclarecio que, en un caso donde (b1) los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en una muestra son bajos en comparacion con un valor de control, (b2) el nivel de expresion de ANG2 en una muestra es alto en comparacion con un valor de control o (b3) la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control, la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis es alta.
Por consiguiente, por el uso de la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN, los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 o la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en una muestra derivada de un sujeto, como indicador, puede predecirse la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis sin administracion de un inhibidor de la angiogenesis al sujeto.
Ademas, los presentes inventores encontraron que el patron de efecto antitumoral de un inhibidor de la angiogenesis, que fluctua con la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN en celulas de melanoma, tambien se correlaciona con los niveles de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1. Para describirlo mas espedficamente, esclarecieron que la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis es alta en un caso donde (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control, (c2) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control, (c3) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control, (c4) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control, (c5) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control, (c6) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control, (c7) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control, (c8) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control, (c9) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control, (c10) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control, (c11) el nivel de expresion o FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control, (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control, (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control, (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control.
Espedficamente, la presente invencion se refiere a lo siguiente.
(1) Un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis, que comprende
(a) detectar la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto, en el que en la etapa de deteccion, un caso donde
(a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante, o
(a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7- metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable del mismo, y en el que el tumor es melanoma.
(2) El metodo segun (1), en el que, en la etapa de deteccion (a), un caso donde B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
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(3) El metodo segun (1), en el que, en la etapa de deteccion (a), un caso donde B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis
(4) El metodo segun (1) o (3), en el que la mutacion de B-Raf es una mutacion V600E en una secuencia de aminoacidos o una mutacion en una secuencia de nucleotidos correspondiente a la mutacion.
(5) El metodo segun (1) o (3), en el que la mutacion de PTEN es al menos una mutacion en una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en A499G, T202C y T335A o al menos una mutacion en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en T167A, Y68H y L112Q.
(6) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (5), en el que el inhibidor de la angiogenesis es una sal de mesilato de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
(7) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (6), en el que el tumor es un tumor que tiene una mutacion V600E en B-Raf.
(8) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (7), en el que, en la etapa (a), se predice la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis; y el metodo comprende ademas una etapa (b) de cuantificar los niveles de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ANG1 y ANG2 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
(b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control
(b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control, o
(b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control
es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
(9) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (7), en el que, en la etapa (a), se predice la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis; y el metodo comprende ademas una etapa (c) de cuantificar un nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, lL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
(c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control,
(c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control,
(c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control,
(c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control,
(c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control,
(c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control,
(c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control,
(c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control,
(c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control,
(c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o
(c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control
es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
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(10) Un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis, que comprende
(b) cuantificar niveles de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ANG1 y ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
(b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control
(b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control, o
(b3) la relacion del nivel de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control
es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable del mismo, y en el que el tumor es melanoma.
(11) El metodo segun (10), en el que, en la etapa (b), se predice la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, y el metodo comprende ademas una etapa (c) de cuantificar un nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, nRp2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
(c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control,
(c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control,
(c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control,
(c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control,
(c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control,
(c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control,
(c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control,
(c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control,
(c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control,
(c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control,
(c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o
(c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control
es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis
(12) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (11), en el que la etapa (a) a (c) comprende una etapa de poner la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto en contacto con sondas de B-Raf y PTEN. Particularmente, las sondas son preferentemente una sonda de acido nucleico, un anticuerpo espedfico o una combinacion de los mismos.
(13) Una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de la angiogenesis para tratar un sujeto que padece melanoma, en la que se ha predicho que el sujeto es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo segun uno cualquiera de (1) a (12), en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminoplmoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma, en la que se ha predicho que el sujeto es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo segun uno cualquiera de (1) a (14) por un doctor u otro profesional medico que administra la terapia.
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Como inhibidor de la angiogenesis es particularmente preferible una sal de mesilato de 4-(3-cloro-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
(22) Uso de un kit que comprende sondas de B-Raf y PTEN o sondas de ANG1 y ANG2 de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece melanoma a un inhibidor de la angiogenesis, en el que la sensibilidad del sujeto que padece melanoma al inhibidor de la angiogenesis se predice por el metodo segun uno cualquiera de (1) a (ll) y en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6- quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma y es particularmente preferible una sal de mesilato de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
Efectos ventajosos de la invencion
La presente invencion permite predecir la sensibilidad de un sujeto que padece un cancer a un inhibidor de la angiogenesis, y en particular, predecir la sensibilidad a un inhibidor de receptor de VEGF, un inhibidor de receptor de FGF, un inhibidor de RET cinasas o un inhibidor de KIT cinasas.
Como resultado, se determina si la administracion de un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto que padece un cancer es eficaz o no, y a partir de aqu el inhibidor de la angiogenesis puede administrarse al sujeto Por tanto, se seleccionan pacientes con cancer, para los que la administracion del inhibidor de la angiogenesis es eficaz, y entonces puede administrarse el inhibidor de la angiogenesis. De este modo, puede tratarse el cancer mientras que se reduce el riesgo de un efecto secundario
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico que muestra el efecto antitumoral de E7080 sobre cada una de las celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN. En BRAF, "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion. En PTEN, "+" indica la presencia de una mutacion o una perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion.
La Figura 2 es un grafico que muestra la relacion de vasos sangumeos cubiertos de pericitos en cada uno de los tumores de celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN. En BRAF, "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion. En PTEN, "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion.
La Figura 3 es un grafico que muestra la correlacion entre el efecto antitumoral de E7080 sobre celulas de melanoma y la relacion de vasos sangumeos cubiertos de pericitos, en el tumor.
La Figura 4 es un grafico que muestra (a) el nivel de expresion de protema ANG1 y (b) el nivel de expresion de ARNm de ANG1 en celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion V600E en BRAF. El sfmbolo "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion.
La Figura 5 es un grafico que muestra (a) el nivel de expresion de protema ANG2 y (b) el nivel de expresion de ARNm de ANG2, en celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en PTEN. El sfmbolo "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion.
La Figura 6 es un grafico que muestra la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN. En BRAF, "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion. En PTEN. "+" indica la presencia de una mutacion o perdida de expresion; mientras que "-" indica la ausencia de una mutacion o perdida de expresion.
La Figura 7 es un grafico que muestra la relacion de niveles de expresion de FGFR2 y FGFR3 en celulas de melanoma, que se clasifican en grupos basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN. El termino "BRAF wt/PTEN wt" indica un caso donde BRAF y PTEn son no mutantes; "BRAF mu/PTEN mu" indica un caso donde BRAF y PTEN tienen una mutacion o perdida de expresion; y "BRAF mu/PTEN wt" indica un caso donde BRAF tiene una mutacion o perdida de expresion y PTEN es no mutante.
Descripcion de realizaciones
Realizaciones de la presente invencion se describiran a continuacion.
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Observese que las bibliograffas y publicaciones de solicitud de patente abiertas a consulta por el publico, gacetas de patente y otras bibliograffas de patente se incorporan en la memoria descriptiva como referencias.
La presente invencion se refiere a un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de la angiogenesis.
El metodo de la presente invencion comprende una etapa de detectar la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y la presencia o ausencia o una mutacion o perdida de expresion de PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto. En la etapa de deteccion, el siguiente caso de (a1) o (a2) sirve de indicador de que la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta.
(a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante.
(a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o mutacion de perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o mutacion de perdida de expresion.
Ademas, el metodo de la presente invencion comprende una etapa de cuantificar los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto. En la etapa de cuantificacion, estos resultados de cuantificacion en los siguientes (b1), (b2) o (b3) sirven de indicador de que la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta.
(b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control.
(b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control.
(b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control.
Ademas, la presente invencion comprende una etapa de cuantificar el nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFr2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto. En la etapa de cuantificacion, si un caso se corresponde con los siguientes (c1) a (c15), estos resultados de cuantificacion sirven de indicador de que la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta.
(c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control.
(c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control.
(c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control.
(c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control.
(c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control.
(c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control.
(c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control.
(c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control.
(c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control.
(c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control.
(c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control.
(c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control.
(c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control.
(c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control.
(c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control.
Ademas, la presente invencion comprende una etapa de detectar la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN y los niveles de expresion de FGFR3 o FGFR2 en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto. En la etapa de deteccion, el siguiente caso de (d1) o (d2) sirve de indicador de que la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta.
(d1) B-Raf y PTEN son cada uno no mutantes y se expresa FGFR3 o FGFR2.
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(d2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion, y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion, y se expresa FGFR3 o FGFR2.
Ademas, el metodo de la presente invencion se refiere a un metodo de prediccion de la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis por el uso de los indicadores anteriores.
Mas espedficamente, el metodo de la presente invencion comprende una etapa de detectar la presencia o ausencia de una mutacion o mutacion de perdida de expresion de B-Raf y PTEN; niveles de expresion de ANG1 y ANG2; o la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2, y asociar estos resultados de deteccion usados como indicador con la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis. El metodo de la presente invencion tambien comprende una etapa de cuantificar el nivel de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1 y asociar estos resultados de deteccion usados como indicador con la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis.
En la presente invencion, la etapa de deteccion puede comprender una etapa de determinar el nivel de expresion o la relacion de niveles de expresion o una etapa de analizar los resultados de determinacion obtenidos; y la etapa de cuantificacion puede comprender una etapa de determinar el nivel de expresion o la relacion de niveles de expresion, o una etapa de analizar los resultados de determinacion obtenidos.
Los resultados de deteccion y los resultados de cuantificacion anteriores obtenidos por el metodo de la presente invencion se proporcionan como informacion para determinar si el sujeto es o no altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis. Estos trozos de informacion son principalmente usados por el profesional medico.
Cuando se determina que la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis es alta por el metodo de la presente invencion, puede esperarse que el inhibidor de la angiogenesis funcione eficazmente (tiene un efecto antitumoral). Asf, el metodo de la presente invencion puede usarse como indicador de una terapia del cancer.
El inhibidor de la angiogenesis, que es una diana del metodo de la presente invencion, 4-(3-cloro-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable del mismo.
En la presente invencion, la "sensibilidad" a un inhibidor de la angiogenesis se refiere a una naturaleza de las celulas cancerosas, cuyo crecimiento es suprimido por la administracion de un inhibidor de la angiogenesis, usado como indicador de la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis.
El "tumor" en el presente documento es melanoma.
La "alta sensibilidad" de un sujeto a un inhibidor de la angiogenesis puede referirse a una naturaleza de celulas tumorales, cuyo crecimiento es fuertemente suprimido por la administracion del inhibidor de la angiogenesis, y, por ejemplo, significa que el crecimiento de celulas tumorales, por ejemplo, en terminos de velocidad de crecimiento o rendimiento del crecimiento de las celulas tumorales, con respecto a un valor de control, es 1/2 o menos, preferentemente 1/5 o menos y adicionalmente preferentemente 1/10 o menos; o que la actividad formadora de colonias de las celulas tumorales con respecto a un valor de control es 1/2 o menos, preferentemente 1/5 o menos y adicionalmente preferentemente 1/10 o menos.
Alternativamente, en un escenario clmico, la "alta sensibilidad" puede significar que se suprime un aumento de lesiones, por ejemplo, dentro del 20 % en comparacion con un valor de control por la administracion de una sustancia inhibidora de la angiogenesis; y preferentemente significa que la suma o el diametro mas largo de las lesiones diana disminuye el 30 % o mas en comparacion con aquel antes de la administracion, y ademas significa preferentemente que todas las lesiones diana desaparecen, sin embargo, la "alta sensibilidad" no se limita a estos ejemplos.
En la presente invencion, "una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto" se refiere a un tejido tumoral tomado de un sujeto, celulas tumorales disociadas de un tejido tumoral tales como celulas tumorales circulantes, o ADN, ARN (por ejemplo, ARNm, miARN, ARNt, ARNr, ARNnc, ARNbc, ARNnp, ARNnop), otros acidos nucleicos o protemas derivadas de celulas tumorales, o preparaciones hechas a partir de estas en las formas adecuadas para llevar a cabo la presente invencion. El tejido tumoral o las celulas tumorales tomadas de un sujeto puede ser un lfquido corporal o sangre. Observese que una persona que toma muestras y hace preparaciones puede ser la misma o diferente de un profesional medico que realiza las etapas de la presente invencion.
En la presente invencion, el "profesional medico" se refiere a medicos, dentistas, tecnicos de laboratorio (incluyendo expertos para realizar las pruebas en los proveedores de servicios de prueba), enfermeras y trabajadores de otras instituciones medicas.
En la presente invencion, el tipo de tumor, la sensibilidad del cual a un inhibidor de la angiogenesis es una diana a predecir o el tipo de tumor que un sujeto tiene, es melanoma, y preferentemente incluye melanoma que tiene una mutacion V600E en B-Raf. Si un tumor es uno que tiene una mutacion V600E en B-Raf puede comprobarse por un metodo de deteccion (descrito despues) para una mutacion o una perdida de expresion en B-Raf.
El sujeto en la presente invencion incluye un sujeto que padece melanoma. En tanto que un sujeto este padeciendo al menos melanoma, el sujeto puede estar padeciendo otras enfermedades.
En la presente invencion, "B-Raf' (homologo B1 del oncogen viral del sarcoma murino v-raf) (tambien denominado "BRAF"), que es una protema serina/treonina cinasa que pertenece a una familia de raf/mil, se refiere al gen (SEQ ID 5 NO: 1) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_004333.4 que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 2) con el N° de acceso de GenBank NP_0043242, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de control de la via de senalizacion de MAP cinasa/ERK.
En la presente invencion, "PTEN" (homologo de fosfatasa y de tensina delecionado en el cromosoma 10) se refiere 10 al gen (SEQ ID NO: 3) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_000314.4 que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 4) con el N° de acceso de GenBank NP_0003053, que se traduce del gen.
En la presente invencion, una "mutacion" de B-Raf o PTEN se refiere a una variacion de un unico nucleotido o una pluralidad de nucleotidos en la secuencia de polinucleotidos y/o un unico aminoacido o una pluralidad de 15 aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de B-Raf o PTEN, producida por sustitucion, delecion, insercion y/o adicion. Por tanto, si se detecta el estado en el que una sustitucion, delecion, insercion y/o adicion de uno o una pluralidad de nucleotidos en la secuencia de polinucleotidos y/o uno o una pluralidad de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de B-Raf o PTEN, se determina que B-Raf o PTEN tiene una mutacion.
En la presente invencion, una mutacion de B-Raf es, por ejemplo, una mutacion de la secuencia de aminoacidos 20 seleccionada de las mutaciones mostradas en la siguiente Tabla 1 o una mutacion de la secuencia de nucleotidos correspondiente a la mutacion de la secuencia de aminoacidos.
[Tabla 1]
Tabla 1 Mutacion de B-Raf
Aminoacido
D587A
G596R R444Q
D587E
R444W
D594E
G615E R462I
D594V
D594G
E586K
I463S S60SF
S605N
F468C
I592M T599_V600insTT
I592V T599I
F595L
K601del V471F
F595S
K601E
K601N
G464R
L597Q V600A
G464V
L597V V600D
G464E
L597S V600E
L597R V600K
V600M
V600R
V600L
5
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20
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30
Aminoacido
G466R
N581S A145V
G466V
C469S
R443T
G469E
G469A
En la Tabla 1, el caracter numerico intercalado entre el abecedario indica la posicion en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) de B-Raf; y el abecedario antes del caracter numerico es un aminoacido de tipo no mutante y el abecedario despues del caracter numerico es un aminoacido de mutante.
Para explicar mas espedficamente, una mutacion D587A en la secuencia de aminoacidos significa que, en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) codificada por el gen B-Raf (SEQ ID NO: 1), el acido aspartico en la posicion 587 esta mutado a alanina o se refiere a una mutacion de la secuencia de polinucleotidos correspondiente a la mutacion de la secuencia de aminoacidos.
Una mutacion V600E en la secuencia de aminoacidos significa que, en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) codificada por el gen B-Raf (SEQ ID NO: 1), la valina en la posicion 600 esta mutada a acido glutamico, o se refiere a una mutacion de la secuencia de polinucleotidos correspondiente; por ejemplo, en "gtg" correspondiente a las posiciones de 1798 a 1800 de la secuencia de nucleotidos, el nucleotido en la posicion 1799 se muta de timina a adenina.
Una mutacion K601del en la secuencia de aminoacidos significa que, en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) codificada por el gen B-Raf (SEQ ID NO: 1), la lisina en la posicion 601 esta delecionada o se refiere a una mutacion de la secuencia de polinucleotidos correspondiente.
Una mutacion T599_V600insTT en la secuencia de aminoacidos significa que, en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) codificada por el gen B-Raf (SEQ ID NO: 1), dos restos de treonina estan insertados entre la treonina 599 y la valina 600 o se refiere a una mutacion de la secuencia de nucleotidos correspondiente.
En la presente invencion, la "perdida de expresion" o "mutacion de perdida de expresion" de B-Raf significa que la protema B-Raf no se expresa por delecion del gen B-Raf o una mutacion de una secuencia de polinucleotidos del gen B-Raf (incluyendo un intron). Por tanto, si el nivel de deteccion de la secuencia de polinucleotidos y/o secuencia de aminoacidos de B-Raf en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto es estadfsticamente significativamente bajo en comparacion con un valor de control o inferior a un valor de corte previamente determinado, o si B-Raf es un lfmite de deteccion o menos, se determina que se pierde la expresion de B-Raf.
En la presente invencion, el "no mutante" de B-Raf se refiere al estado donde si se comprueba la presencia o ausencia de al menos uno de los sitios de mutacion mostrados en la Tabla 1, no se detecta ni mutacion ni perdida de expresion. Ademas, siendo B-Raf "no mutante" tambien se refiere a B-Raf "bajo normal".
En la presente invencion, la mutacion de PTEN es una seleccionada de aquellas mostradas en la siguiente Tabla 2. [Tabla 2]
Tabla 2 Mutacion de PTEN
Nucleotido
Aminoacido
T170G
L57W
T202C
Y68H
T228G
Y76stop
T335A
L112Q
C367T
H123Y
T370A G371C
C124S
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Nucleotido
Aminoacido
G385C G385A
G129R
G493A
G165R
A499G
T167A
A499C
T167P
En la Tabla 2, el caracter numerico intercalado entre el abecedario indica la posicion en la secuencia de polinucleotidos (SEQ ID NO: 3) o la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 4) de PTEN; el abecedario antes del caracter numerico es la secuencia de nucleotidos o la secuencia de aminoacidos de no mutante; y el abecedario despues del caracter numerico es la secuencia de nucleotidos o la secuencia de aminoacidos de mutante. Para explicar mas espedficamente, la mutacion del nucleotido T170G significa que el nucleotido de la posicion 170 en la region codificante de protema (SEQ ID NO: 3) del gen PTEN esta mutado de timina a guanina. La mutacion de aminoacido L57W significa que la leucina 57 en la secuencia de aminoacidos correspondiente (SEQ ID NO: 4) de la protema esta mutada a triptofano. Y76stop significa que el codon de tirosina 76 de la secuencia de aminoacidos de PTEN vana a un codon de parada, por lo que se termina la traduccion.
En la presente invencion, la "perdida de expresion" o "mutacion de perdida de expresion" de PTEN significa el estado donde la protema PTEN no se expresa por delecion del gen PTEN o una mutacion de una secuencia de polinucleotidos del gen PTEN (incluyendo un intron). Por tanto, si el nivel de deteccion de la secuencia de polinucleotidos y/o secuencia de aminoacidos de PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto es estadfsticamente significativamente bajo en comparacion con un valor de control o inferior a un valor de corte previamente determinado, o si PTEN es un lfmite de deteccion o menos, se determina que se pierde la expresion de PTEN.
En la presente invencion, el "no mutante" de PTEN se refiere al estado donde si se comprueba la presencia o ausencia de al menos uno de los sitios de mutacion mostrados en la Tabla 2, no se detecta ni la mutacion ni la perdida de expresion. Ademas, siendo PTEN "no mutante" tambien se refiere a PTEN "bajo normal".
En la presente invencion, "ANG1" y "ANG2", que son angiopoyetina-1 y angiopoyetina-2, respectivamente, se refieren a los genes (ANG1; SEQ ID NO: 45, ANG2: SEQ ID NO: 47) representados por las secuencias de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_001146.3, y NM_00111888.1, que se determinan a partir de su ARNm, respectivamente, y se refieren a las protemas (ANG1: SEQ ID NO: 46, N° de acceso de GenBank NP_001137.2 y ANG2: SeQ ID NO: 48, N° de acceso de GenBank NP-001112360.1), que se traducen de los genes, respectivamente
En la presente invencion, "SHC1" (dominio de homologfa 2 de src que contiene la protema transformante 1) se refiere al gen ((SEQ ID NO: 5) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_003029.4, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 6) con el N° de acceso de GenBank NP_003020.2, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion asociada a la apoptosis.
En la presente invencion, "IL6" (interleucina 6), que es una citocina que desempena una funcion importante en la hemogenesis y reacciones de inflamacion, se refiere al gen (SEQ ID NO: 7) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_000600.3, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 8) con el N° de acceso de GenBank Np_000591.1, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de control de la via de senalizacion JAK/STAT y la via de senalizacion MAP cinasa/ERKs.
En la presente invencion, "CXCR4" (receptor 4 de quimiocina CXC, (tambien denominado fusina)), que es un receptor de a-quimiocina espedfico para el factor 1 derivado del estroma, se refiere al gen (SEQ ID NO: 9) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_001008540.1, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 10) con el N° de acceso de GenBank NP_001008540.1, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de potenciar la migracion celular.
En la presente invencion, "COL4A3" (colageno, tipo IV, alfa 3), que es un componente que constituye la matriz extracelular, se refiere al gen (SEQ ID NO: 11) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_000091.4, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 12) con el N° de acceso de GenBank NP_000082.2, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de formar citoesqueleto.
En la presente invencion, "NRP2" (neuropilina-2), que es una protema de receptor transmembranaria, se refiere al gen (SEQ ID NO: 13) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank
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NM_003872.2, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 14) con el N° de acceso de GenBank NP_003863.2, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de potenciar la angiogenesis en una etapa de desarrollo y una etapa de tumorigenesis.
En la presente invencion, "MEISI" (homeocaja 1 de Meis), que es uno de los genes HOX, se refiere al gen (SEQ ID NO: 15) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_002398.2, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 16) con el N° de acceso de GenBank NP_002389.1, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de controlar la diferenciacion inducida.
En la presente invencion, "ARHGAP22" (protema 22 activante de Rho GTPasa), que es una molecula implicada en la transmision de senales intracelulares, se refiere al gen (SEQ ID NO: 17) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_021226.2, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 18) con el N° de acceso de GenBank Np_067049.2, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de controlar la remodelacion del citoesqueleto.
En la presente invencion, "SCG2" (secretogranina 2) se refiere al gen (SEQ ID NO: 49) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_003469.4, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 50) con el N° de acceso de GenBank NP_003460.2, que se traduce del gen. La protema es una protema secretora que tiene una funcion de potenciar la migracion celular.
En la presente invencion, "FGF9" (factor de crecimiento de fibroblastos 9), que es una protema secretora que desempena una funcion importante en la diferenciacion celular y el mantenimiento funcional, se refiere al gen (SEQ ID NO: 51) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_002010.2, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 52) con el N° de acceso de GenBank NP_002001.1, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de interaccionar con FGFR3 (descrita despues).
En la presente invencion, "PML" (leucemia promielocftica), que es un tipo de factor de transcripcion, se refiere al gen (SEQ ID NO: 53) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_002675.3, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 54) con el N° de acceso de GenBank Np_002666.1, que se traduce del gen. La protema tiene una funcion de controlar la proliferacion celular como un supresor tumoral.
En la presente invencion, "FGFR3" (receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos), que es una protema que tiene una funcion de potenciar la proliferacion y diferenciacion celular, se refiere al gen (SEQ ID NO: 55) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_000142.3, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 56) con el N° de acceso de GenBank nP_000133.1, que se traduce del gen. Se sabe que FGFR3 tiene dos isoformas, es decir, FGFR3b y FGFR3c.
En la presente invencion, "FGFR2" (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos), que es una protema que tiene una funcion de potenciar la proliferacion y diferenciacion celular, se refiere al gen (SEQ ID NO: 57) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_001144918.1, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 58) con el N° de acceso de GenBank NP_00113839o.1, que se traduce del gen.
En la presente invencion, "FGFR1" (receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos), que es una protema que tiene una funcion de potenciar la proliferacion y diferenciacion celular, se refiere al gen (SEQ ID NO: 59) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_001174063.1, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 60) con el N° de acceso de GenBank NP_001167534.1, que se traduce del gen.
En la presente invencion, "FGFR4" (receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos) es una protema que tiene una funcion de potenciar la proliferacion y diferenciacion celular, se refiere al gen (SEQ ID NO: 61) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_002011.3, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 62) con el N° de acceso de GenBank NP_002002.3, que se traduce del gen.
En la presente invencion, "VEGFR1" (receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular), que es una protema que tiene una funcion de potenciar la proliferacion y diferenciacion celular y angiogenesis, se refiere al gen (SEQ ID NO: 63) representado por la secuencia de polinucleotidos con el N° de acceso de GenBank NM_001159920.1, que se determina a partir de su ARNm, y se refiere a la protema (SEQ ID NO: 64) con el N° de acceso de GenBank NP_001153392.1, que se traduce del gen.
En la presente invencion, el "inhibidor" se refiere a una sustancia que tiene una actividad inhibitoria contra la funcion de una molecula diana tal como un compuesto, un anticuerpo, un oligonucleotido antisentido ("Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications (Segunda Edicion)", CRC Press, 2007), un oligonucleotido de iARN ("RNA Methodologies (Tercera Edicion)", Elsevier, 2005, Capttulo 24), un acido nucleico peptfdico (Kaihatsu et al., Chemistry & Biology, 2004,11 (6), p. 749-758) y un antagonista peptfdico (Ladner et al., Drug Discovery Today, 2004, 9, p. 525-529).
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En la presente invencion, el "inhibidor de la angiogenesis" se refiere a 4-(3-cloro-4- (cidopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma.
Si el inhibidor de la angiogenesis que va a usarse en la presente invencion es un compuesto, pueden formar sales farmacologicamente aceptables con acidos o bases. El inhibidor de la angiogenesis de la presente invencion incluye estas sales farmacologicamente aceptables. Ejemplos de las sales con acidos incluyen, pero no se limitan a, sales de acido inorganico tales como un clorhidrato, un bromhidrato, un sulfuro y un fosfato; y sales de acido organico tales como acido formico, acido acetico, acido lactico, acido sucdnico, acido fumarico, acido maleico, acido malico, acido dtrico, acido tartarico, acido tosico, acido estearico, acido benzoico, acido mesflico, acido bencenosulfonico, acido p-toluenosulfonico y acido trifluoroacetico. Ademas, ejemplos de las sales con bases incluyen, pero no se limitan a, sal de metal alcalino tal como una sal de sodio y una sal de potasio; sales de metales alcalinoterreos tales como una sal de calcio y una sal de magnesio, sales de base organica tales como trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, diciclohexilamina, N,N'-dibenciletilendiamina, arginina y lisina; y sales de amonio.
Ademas, si el inhibidor de la angiogenesis que va a usarse en la presente invencion es un compuesto, que tiene solvatos e isomeros opticos, estos solvatos e isomeros opticos estan incluidos Como solvatos pueden mencionarse, por ejemplo, hidratos y no hidratos y preferentemente hidratos, pero no se limitan a estos. Ejemplos de disolventes incluyen, pero no se limitan a, agua, alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol) y dimetilformamida.
Ademas, en la presente invencion, si el inhibidor de la angiogenesis es un compuesto, el compuesto puede ser un cristal o amorfo. Ademas, si hay polimorfismos cristalinos, puede usarse una forma cristalina de uno cualquiera de ellos y una mezcla de los mismos.
Ademas, el inhibidor de la angiogenesis de la presente invencion incluye un inhibidor de la angiogenesis, que es metabolizado en un cuerpo vivo por oxidacion, reduccion, hidrolisis y/o conjugacion, Ademas, el inhibidor de la angiogenesis de la presente invencion tambien incluye un compuesto, que es metabolizado en un cuerpo vivo por oxidacion, reduccion o hidrolisis para producir un inhibidor de la angiogenesis.
4-(3 -Cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida (Formula (IV))
imagen1
El compuesto puede producirse por el metodo descrito en el documento WO02/032872. La forma del compuesto es preferentemente un metanosulfonato, pero no se limita a esta. El compuesto en forma de un mesilato tambien se denomina "E7080". El compuesto es conocido por tener una actividad inhibitoria contra una tirosina cinasa de receptor tal como receptor de VEGF, receptor de FGF, RET cinasa y KIT cinasa (documento WO2007/136103, Matsui et al., Clinical Cancer Research, 2008,14 (17), p. 5459-5465).
Ejemplos del inhibidor de la angiogenesis de la presente invencion incluyen 4-(3-cloro-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)7-metoxi-6-quinolincarboxamida, o una sal farmacologicamente aceptable de la misma. Como sal farmacologicamente aceptable de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi- 6-quinolincarboxamida, se menciona preferentemente mesilato o 4-(3-chloxo-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
A continuacion se describira un metodo de determinacion de la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto.
Puede obtenerse un tejido tumoral extirpando de un sujeto, por ejemplo, mediante un procedimiento quirurgico (por ejemplo, biopsia). El tamano del tejido tumoral tomado de un sujeto no esta limitado, en tanto que pueda determinarse una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN en el tejido tumoral. Por ejemplo, en el caso de cancer solido, el tamano del tejido tumoral tomado por biopsia (por ejemplo, 2 a 3 mm) es aceptable, y el tamano de un trozo de tejido cortado por bisturi es aceptable. El tamano no esta limitado.
Ademas, el tejido tumoral puede ser celulas espedficas extirpadas, ademas del trozo de tejido extraido, por, por ejemplo, un metodo tal como un metodo de micro-diseccion por captura laser (Murray et al. (Ed.), "Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols", Humana Press, 2004).
Ademas, se toma sangre de un sujeto. Celulas cancerosas que circulan a traves de la sangre periferica se aislan por el metodo de, por ejemplo, Kitago et al. A partir de la celula cancerosa, puede detectarse una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN (Kitago et al., Clinical Chemistry, 2009, 55 (4), p. 757-764).
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Ademas, por el uso de un metodo de deteccion de acido nucleico de sensibilidad alta tal como un metodo de reaccion en cadena de la ligasa con huecos (GLCR), puede detectarse una mutacion o perdida de expresion de B- Raf y PTEN directamente a partir del ADN que circula a traves de la sangre (Chuang et al., Head and Neck, 2010,32, p. 229-234).
Puede detectarse una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN por un metodo convencional tal como un metodo de determinacion de una secuencia de acidos nucleicos, un metodo que usa un acido nucleico o un anticuerpo espedfico como una sonda y un metodo que usa espectrometna de masas; sin embargo, es preferible un metodo de poner una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto en contacto con una sonda. Como sonda para detectar una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN, se menciona una sonda de acido nucleico o anticuerpo espedfico para B-Raf o PTEN. "Poner en contacto con" significa que una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto y una sonda se dejan estar presentes en condiciones a las que la muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto y la sonda pueden reaccionar entre sf, por ejemplo, mezclando una muestra y una sonda y hibridando una muestra con una sonda, aunque el metodo no se limita a estos.
En la deteccion de una mutacion y perdida de expresion determinando una secuencia de nucleotidos, la mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN puede detectarse sometiendo un producto de ADN de alto peso molecular (denominado tambien un ADN de alto peso molecular extrafdo), que se extrae de una muestra o un producto obtenido amplificandolo por una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), a un metodo de determinacion directo de secuencia de nucleotidos, metodo de transferencia Southern, metodo de transferencia Northern, un metodo de polimorfismo de conformacion de hebras por PCR (PCR-SSCP), un metodo de sonda de oligonucleotidos espedficos de gen alelico (ASO), un metodo de ensayo en gel directo, metodo de sistema de mutaciones resistentes a la amplificacion (ARMS), un metodo de analisis de transferencia puntual usando un oligomero espedfico de mutacion o un metodo analogo del mismo. Ademas, la mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN puede detectarse tambien por un secuenciador de nueva generacion tal como Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems), Roche 454 Genome Sequencer FLX System (Roche), Genome Analyzer II (Illumina), Applied Biosystems SOLiD System (Applied Biosystems) y HeliScope Single Molecule Sequencer (Helicos) ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2010, Capftulo 7). Como sonda de acido nucleico que va a usarse para detectar la mutacion o perdida de expresion de B-Raf se mencionan, por ejemplo, los cebadores (SEQ ID NOs: 39 a 44) usados en el Ejemplo 1, pero no se limitan a estos. Como sonda de acido nucleico que va a usarse para detectar una mutacion o perdida de expresion de PTEN se mencionan, por ejemplo, los cebadores (SEQ ID NOs: 19 a 38) usados en el Ejemplo 1, pero no se limitan a estos.
En la deteccion de una mutacion y perdida de expresion por uso del metodo de Sanger, se extrae ADN genomico de una muestra derivada de un sujeto segun un metodo convencional y el ADN genomico obtenido se somete a PCR para amplificar regiones de exon de B-Raf y PTEN. El ADN amplificado se somete a electroforesis en 1 % de gel de agarosa. Despues de confirmarse que el ADN amplificado tiene una longitud deseada, el producto de PCR se recupera del gel y se purifica. El producto purificado se secuencia por un secuenciador. De este modo, puede obtenerse informacion tal como la mutacion genica.
El caso donde la deteccion de una mutacion y perdida de expresion se realiza por un secuenciador de nueva generacion se describira a continuacion.
Por ejemplo, cuando se usa el Genome Analyzer II fabricado por Illumina como secuenciador de nueva generacion, se extrae ARN de una muestra derivada de un sujeto segun un metodo convencional y se prepara ADNc basandose en el ARN extrafdo. El ARN extrafdo puede cuantificarse por una tecnica tal como analisis de transferencia Northern, micromatriz de ADN, RT-PCR y PCR cuantitativa. Como metodo cuantitativo preferible para ARN, se mencionan micromatriz de ADN y PCR cuantitativa; sin embargo, el metodo cuantitativo no se limita a los metodos anteriores.
El ADNc preparado se corta en fragmentos de aproximadamente 200 pb adecuados para el analisis por un secuenciador de nueva generacion y se anade una secuencia adaptadora para preparar una genoteca de ADNc. Se deja que la genoteca preparada se una sobre una celda de flujo mediante la secuencia adaptadora para formar un grupo. Al grupo se anade un cebador de secuencia y se realiza repetidamente una etapa de deteccion de fluorescencia. De este modo, se realizan la adquisicion de datos y el analisis de extension de una unica base para obtener informacion tal como mutacion genica.
Cuando se detectan una mutacion y perdida de expresion usando un anticuerpo espedfico como sonda, si un peptido parcial que tiene la secuencia de aminoacidos de un peptido no mutante y uno parcial que tiene la secuencia de aminoacidos de un mutante con respecto a cada uno de los sitios de mutacion de B-Raf y PETN se usan respectivamente como antfgenos, anticuerpos espedficos para los sitios de mutacion pueden prepararse por un metodo convencional. Cuando se detecta una perdida de expresion, si un peptido parcial que tiene una secuencia de aminoacidos no mutante y un peptido parcial que tiene la secuencia de aminoacidos que conduce a perdida de expresion con respecto a cada uno de los sitios de perdida de expresion de B-Raf y PETN se usan respectivamente como antfgenos, pueden prepararse anticuerpos espedficos para los sitios de perdida de expresion por un metodo convencional. En la preparacion de un anticuerpo espedfico para un sitio de perdida de expresion de PTEN, el sitio de perdida de expresion puede detectarse si no se hace deteccion por el anticuerpo que reconoce un no mutante.
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Cuando se detecta una mutacion o perdida de expresion, pueden usarse anticuerpos espedficos del sitio de mutacion solos o en combinacion de dos o mas tipos.
Cuando se detectan una mutacion y perdida de expresion por espectrometna de masas, la deteccion puede hacerse, por ejemplo, por el sistema MassARRAY fabricado por Sequenom segun el metodo de Gabriel et al., (Gabriel et al., "Current Protocolos in Human Genomics", John Wiley & Sons, 2009, Unidad 2.12).
Puede detectarse una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN por uno cualquiera de los metodos anteriormente mencionados o en combinacion de ellos.
En la deteccion anterior, si se obtiene el resultado de (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante, o (a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion, el resultado sirve de indicador de que la sensibilidad al inhibidor de la angiogenesis en el sujeto es alta. Las formas de B-Raf y PTEN, que sirven de indicador de que la sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se muestran en la Tabla 3.
[Tabla 3]
B-Raf PTEN Sensibilidad
a1
No mutante No mutante Alta
a2
Esta presente al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion Esta presente al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion Alta
En (a2) de la Tabla 2, las formas de B-Raf y PTEN, que sirven de indicador de que la sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis es particularmente alta, se obtienen cuando se obtiene el resultado B-Raf tiene una mutacion V600E y PTEN tiene mutaciones T167A, Y68H o L112Q.
Se describira a continuacion un metodo de cuantificacion de los niveles de expresion de ANG1 o ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto.
Se toma una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto por el metodo anteriormente mencionado.
Los niveles de expresion de ANG1 o ANG2 en la muestra pueden obtenerse cuantificando la cantidad de ARNm o protema por un metodo convencional.
En la cuantificacion de la cantidad de ARNm, puede usarse una tecnica convencional tal como analisis de transferencia Northern, micromatriz de ADN, RT-PCR y/o PCR cuantitativa; sin embargo, se usan preferentemente micromatriz de ADN o PCR cuantitativa.
Como sonda para su uso en cuantificar los niveles de expresion de ANG1 o ANG2, se menciona una sonda de acido nucleico o anticuerpo contra ANG1 o ANG2. La sonda de acido nucleico puede comprarse, por ejemplo, mediante ASSAYS-ON-DEmAnD de Applied Biosystems (las ID de ensayo de AnG1 y aNg2 son Hs 00181613 y Hs 00169867, respectivamente). Los niveles de expresion pueden cuantificarse segun el manual adjunto a las sondas. Alternativamente, la sonda de acido nucleico puede establecerse apropiadamente y prepararse basandose en la secuencia de nucleotidos de ANG1 o ANG2 por uso de Primer Express de Perkin-Elmer Applied Biosystems o un software equivalente a el.
Se comparan una pluralidad de sustancias de prueba corrigiendo el valor cuantitativo basandose en el nivel de ARNm de un gen de mantenimiento (la cantidad de transcripcion no ha fluctuado tanto), preferentemente p-actina de cada sujeto de prueba. Observese que cuando se usa ARNm para la RT-PCR, se usa un cebador en la deteccion con un colorante fluorescente, SYBR Green (intercalador); mientras que, en un metodo de deteccion usando una mezcla maestra, no solo se requiere un cebador, sino tambien una sonda. Uno cualquiera de ellos puede disenarse por el uso de un software. Cuando se usa una sonda, puede usarse una sonda comercialmente disponible por Applied Biosystems.
Ademas, el nivel de expresion de una protema puede determinarse por un kit de ELISA comercialmente disponible o por transferencia Western, una matriz de anticuerpos, espectrometna de masas o inmunohistotincion. Puede prepararse un anticuerpo espedfico para ANG1 o ANG2 tambien por el metodo descrito en el parrafo anterior del inhibidor de la angiogenesis. Cuando se usa el suero o el plasma como muestra, puede usarse cuantificacion usando ELISA y una tecnica multiplex de perlas.
El nivel de expresion de ANG1 o ANG2 puede cuantificarse por uno cualquiera de los metodos anteriormente mencionados o en combinacion de ellos.
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En la presente invencion, para cuantificar el nivel de expresion de ANG1 o ANG2, una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto se pone preferentemente en contacto con una sonda. El significado de "poner en contacto con" es el mismo que se ha definido anteriormente.
En la deteccion anteriormente mencionada, si se obtiene el resultado de (b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con valor de control; (b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control; o (b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control, el resultado sirve de indicador de que la sensibilidad del sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta. Las formas de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2, que sirven de indicador de que la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta, se muestran en la Tabla 4.
[Tabla 4]
Nivel de expresion de ANG1 Nivel de expresion de ANG2 Sensibilidad
b1
Inferior al valor de control - Alta
b2
- Superior al valor de control Alta
b3
La relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es inferior al valor de control Alta
En b1 anterior, en el presente documento, el "control" incluye una muestra obtenida en el pasado. La muestra va a usarse como una referencia para la comparacion futura con una muestra de prueba derivada de un sujeto que se predijo que tema sensibilidad terapeutica. Mas espedficamente, el valor de control significa un valor de corte, que se obtiene administrando un inhibidor de la angiogenesis espedfico a pacientes que estan padeciendo el mismo tipo de tumor, y analizando niveles de expresion de ANG1 en pacientes que se evalua que son resistentes y pacientes que se evalua que son sensibles. El valor de corte puede ser facilmente determinado. Por ejemplo, puede determinarse un valor de control como valor de corte, que es el nivel de expresion de ANG1 en una muestra derivada de un tejido tumoral de pacientes que se ha predicho que tienen sensibilidad terapeutica por la administracion de un inhibidor de la angiogenesis.
Alternativamente, el valor de control puede significar un valor de corte determinado basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN. En este caso, el valor de control se refiere al nivel de expresion de ANG1 en un paciente que padece un tumor que tiene B-Raf no mutante. En este caso, un valor de control preferible es el nivel de expresion de ANG1 en un paciente que padece un tumor que tiene B-Raf no mutante y PTEN no mutante.
En este caso, la forma del nivel de expresion de ANG1, que sirve de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se obtiene cuando se obtiene el resultado de ser igual o inferior al nivel de expresion de ANG1 observado en un paciente que padece un tumor que tiene B-Raf no mutante, y particularmente preferentemente, de ser igual o inferior al nivel de expresion de ANGl observado en un paciente que padece un tumor que tiene B-Raf no mutante y PTEN no mutante.
En b2 anterior, el "control" incluye una muestra obtenida en el pasado. La muestra va a usarse como una referencia para la comparacion futura con una muestra de prueba derivada de un sujeto que se predijo que tema sensibilidad terapeutica. Mas espedficamente, el valor de control significa un valor de corte, que se obtiene administrando un inhibidor de la angiogenesis espedfico a pacientes que estan padeciendo el mismo tipo de tumor y analizando los niveles de expresion de ANG2 en pacientes que se evalua que son resistentes y pacientes que se evalua que son sensibles. El valor de corte puede ser facilmente determinado. Por ejemplo, puede determinarse un valor de control como un valor de corte, que es el nivel de expresion de ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral de pacientes que se ha predicho que tienen sensibilidad terapeutica por administracion de un inhibidor de la angiogenesis.
Alternativamente, el valor de control puede significar un valor de corte determinado basandose en niveles de expresion de ANG1 y ANG2. En este caso, la expresion de que el nivel de expresion de ANG2 es superior a un valor de control significa que el nivel de expresion de ANG2 en terminos de valor absoluto es superior al nivel de expresion de ANG1. En este caso, un valor de control preferible se refiere a los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion de la Tabla 1 o perdida de expresion seleccionada y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion.
En este caso, particularmente, la forma de nivel de expresion de ANG2, que sirve de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se obtiene cuando se obtiene el resultado de ser superior al nivel de expresion de ANG1 observado en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion.
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Los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion son preferentemente los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene la mutacion V600E y PTEN tiene la mutacion T167A, Y68H o L112Q.
En b3 anterior, el "control" incluye una muestra obtenida en el pasado. La muestra va a usarse como referencia para la futura comparacion con una muestra de prueba derivada de un sujeto que se predijo que tema sensibilidad terapeutica. Mas espedficamente, el valor de control significa un valor de corte, que se obtiene administrando un inhibidor espedfico de la angiogenesis a pacientes que estan padeciendo el mismo tipo de tumor y analizando la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en pacientes que se evalua que son resistentes y pacientes que se evalua que son sensibles. El valor de corte puede ser facilmente determinado. Por ejemplo, puede determinarse un valor de control como valor de corte, que es la relacion de niveles de expresion de Ang1 y ANG2 (nivel de expresion de ANG1 / nivel de expresion de ANG2) en una muestra derivada de un tejido tumoral de pacientes que se ha predicho que tienen sensibilidad terapeutica por la administracion de un inhibidor de la angiogenesis.
Alternativamente, el valor de control puede ser un valor de corte, que se determina basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN en lugar del analisis de la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2.
En este caso, el valor de control preferible es un valor de corte, que es la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en pacientes en los que B-Raf tiene una mutacion o perdida de expresion y PTEN es un no mutante, preferentemente, la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante, y mas preferentemente, la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene, por ejemplo, mutacion V600E o mutacion A145V y PTEN es no mutante.
En este caso, particularmente la forma de la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2, que sirve de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se obtiene cuando se obtiene el resultado de 1) de ser igual a o inferior a la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante; 2) de ser igual a o inferior a la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion; o 3) ser inferior a la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante.
Un aspecto preferible de la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion es la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene la mutacion V600E y PTEN tiene la mutacion T167A, Y68H o L112Q. Un aspecto preferible de la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante es la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene la mutacion V600E o A145V y PTEN es no mutante.
A continuacion se describira un metodo de cuantificacion de los niveles de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto.
Un metodo de cuantificacion de los niveles de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGR4 y VEGFR1 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto es el mismo que el metodo anteriormente mencionado para cuantificar los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto, excepto que un objeto a ser cuantificado se cambia a ARNm o protema de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1.
Alternativamente, el nivel de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1 en una muestra derivada de un tejido tumoral de un sujeto puede cuantificarse analizando la expresion genica por una micromatriz de ADN.
En la deteccion anteriormente mencionada, como sonda para cuantificar el nivel de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1, puede usarse apropiadamente un producto comercialmente disponible (por ejemplo, si se usa una sonda de acido nucleico, puede comprarse mediante ASSAYS-ON-DEMAND de Applied Biosystems).
En la deteccion anteriormente mencionada, como el nivel de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1 se correlaciona con la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN, los niveles de expresion de estos genes se
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correlacionan con el efecto antitumoral determinado por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN. Los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML presentan cada uno el mismo comportamiento que el patron de fluctuacion del efecto antitumoral determinado por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN; mientras que los niveles de expresion de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 presentan cada uno comportamiento opuesto al patron de fluctuacion del efecto antitumoral determinado por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN.
Por tanto, en el caso en el que el resultado: (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control, (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control, (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control, (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control, (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control, (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control, (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control, (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control, (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control, (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control, (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control, (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control, (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control, (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control se obtiene, el resultado sirve de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta. La sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis puede predecirse analizando uno o una pluralidad de los casos seleccionados de (c1) a (c15) en combinacion.
En (c1) a (c15) anteriores, el valor de control se refiere al nivel de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 o VEGFR1 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante.
En (c1) a (c5) anteriores, particularmente, las formas de los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML, que sirven de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se obtienen cuando se obtiene el resultado de ser bajo en comparacion con los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante.
En este caso, un aspecto preferible de cada uno de los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante es el nivel de expresion de cada uno de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene la mutacion V600E o A145V y PTEN es no mutante.
En (c6) a (c15) anteriores, particularmente, las formas de los niveles de expresion de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FgF9, FGFR3, FGFR2, fGfRI, FGFR4 y VEGFR1, que sirven de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se obtienen cuando se obtiene el resultado de ser alta en comparacion con los niveles de expresion de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante.
En este caso, un aspecto preferible de cada uno de los niveles de expresion de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN es no mutante es el nivel de expresion de cada uno de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en un paciente que padece un tumor en el que B-Raf tiene la mutacion V600E o A145V y PTEN es no mutante.
Las formas de los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1, que sirven de indicador de que la sensibilidad de un sujeto al inhibidor de la angiogenesis es alta, se muestran en la Tabla 5.
[Tabla 5]
Diana a cuantificar Nivel de expresion Sensibilidad
c1
SHC1 Inferior al valor de control Alta
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NRP2 Inferior al valor de control Alta
c3
ARHGAP22 Inferior al valor de control Alta
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Diana a cuantificar Nivel de expresion Sensibilidad
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SCG2 Inferior al valor de control Alta
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PML Inferior al valor de control Alta
c6
IL6 Superior al valor de control Alta
c7
CXCR4 Superior al valor de control Alta
c8
COL4A3 Superior al valor de control Alta
c9
MEIS1 Superior al valor de control Alta
c10
FGF9 Superior al valor de control Alta
c11
FGFR3 Superior al valor de control Alta
c12
FGFR2 Superior al valor de control Alta
c13
FGFR1 Superior al valor de control Alta
c14
FGFR4 Superior al valor de control Alta
c15
VEGFR1 Superior al valor de control Alta
Otro aspecto de la presente invencion es el caso donde el resultado de determinacion de la siguiente diana de determinacion:
(a) B-Raf y PTEN,
(b) ANG1 y ANG2, o
(c) al menos una seleccionada del grupo que consiste en SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1
determinada en una muestra formada de un unico paciente se compara con el valor de control de cada una de las dianas para asf asociar la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis, y, ademas, las dianas de determinacion anteriormente mencionadas se cuantifican o detectan en muestras derivadas de una pluralidad de pacientes. Por consiguiente, la presencia o ausencia de mutacion o el nivel de expresion de cada una de las dianas de determinacion anteriormente mencionadas se detecta o determina en el numero predeterminado de pacientes (poblacion primaria) y el valor de deteccion o valor de medicion obtenidos, que se usa como datos basicos, puede compararse con datos de medicion en la muestra derivada de un unico sujeto o muestras derivadas de una pluralidad de poblaciones (poblacion secundaria).
Alternativamente, los datos de medicion de pacientes individuales se suman a los valores de la poblacion primaria y los datos completos se procesan otra vez. De este modo, puede aumentarse el numero de pacientes diana o casos de la poblacion secundaria. La exactitud de prediccion para la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis puede potenciarse aumentando el numero de casos.
El metodo segun la presente invencion puede usarse para predecir el nivel de eficacia de un inhibidor de la angiogenesis en un sujeto antes de que el inhibidor de la angiogenesis se administre al sujeto. De esta forma, se selecciona un sujeto en el que puede esperarse un efecto mas alto de un inhibidor de la angiogenesis para tratar una enfermedad. Como caso donde puede esperarse un efecto antitumoral mas alto, puede mencionarse un caso donde puede esperarse un efecto antitumoral mas alto que un efecto antitumoral promedio en sujetos que presentan smtomas similares; un caso donde puede esperarse un efecto antitumoral mas alto que aquellos en otros sujetos que padecen el mismo tipo de cancer; o un caso donde puede esperarse un efecto antitumoral mas alto que aquel de un sujeto que padece otro tipo de cancer. Por tanto, la presente invencion es clmicamente muy util.
Como otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de uso de datos, en la administracion de un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto que padece un tumor o en el tratamiento del tumor; basado en
(a) la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN,
(b) los niveles de expresion de ANG1 y ANG2, o
(c) el nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, NRP2, ARHGAP22, sCg2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3 y FGFR2. Como se ha descrito anteriormente, un
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caso donde (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante; (a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion; (b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control; (b2) el nivel de expresion de ANG1 es igual a y mas alto en comparacion con un valor de control y el nivel de expresion de ANG2 es suficiente para anular la expresion de ANG1; (b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control; (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control; (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control; (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control; (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control; (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control; (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control; (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control; (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control; (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control; (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control; (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control; (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control; o (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control, sirve de indicador de que es eficaz administrar un inhibidor de la angiogenesis al sujeto o tratar un tumor. El uso del indicador permite evaluar como de bien un sujeto responde a un inhibidor de la angiogenesis y evaluar la posibilidad de que un sujeto responda a un inhibidor de la angiogenesis. Los resultados de la evaluacion son datos utiles como referencia en determinar la administracion correcta o erronea de un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto o en seleccionar, por ejemplo, una pauta terapeutica tumoral usando un inhibidor de la angiogenesis. Sin embargo, en la presente invencion, como un inhibidor de la angiogenesis tiene basicamente una accion inhibidora sobre la angiogenesis, aunque se determine que un sujeto no es altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis, no se predice que el inhibidor de la angiogenesis no tenga efecto antitumoral.
Observese que una persona que administra un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto que padece un tumor o una persona que trata un tumor y una persona que realiza la medicion de (a1) a (c15) anteriores puede ser igual o diferente.
Otro aspecto de la presente invencion proporciona un metodo de administracion de un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto que padece un tumor o tratamiento del tumor usando
(a) la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN,
(b) los niveles de expresion de ANG1 y ANG2, o
(c) el nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1, como indicador. Como se ha descrito anteriormente, el caso donde (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante; (a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion; (b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control; (b2) el nivel de expresion de ANG1 es igual a y mas alto en comparacion con un valor de control y el nivel de expresion de ANG2 es suficiente para anular la expresion de ANG1; (b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control; (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control; (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control; (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control; (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control; (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control; (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control; (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control; (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control; (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control; (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control; (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control; (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control; o (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control, es un indicador de que es eficaz administrar el inhibidor de la angiogenesis al sujeto y tratar un tumor. En la determinacion de la administracion correcta o erronea de un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto o la seleccion, por ejemplo, de una pauta terapeutica tumoral usando un inhibidor de la angiogenesis, el sujeto, para el que se predice que la administracion del inhibidor de la angiogenesis o el tratamiento del tumor va a ser eficaz, puede seleccionarse como una diana de la administracion para el inhibidor de la angiogenesis. Por tanto, la presente invencion engloba un metodo de tratamiento de un sujeto, que esta padeciendo un tumor y que se predice que es altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis por el metodo de prediccion de la presente invencion, administrando el inhibidor de la angiogenesis. Sin embargo, en la presente invencion, como un inhibidor de
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la angiogenesis basicamente tiene una accion inhibidora sobre la angiogenesis, aunque se determine que un sujeto no es altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis, no se predice que el inhibidor de la angiogenesis no tiene efecto antitumoral.
Observese que una persona que administra un inhibidor de la angiogenesis a un sujeto que padece un tumor o una persona que trata un tumor y una persona que realiza la medicion de (a1) a (c15) anteriores puede ser igual o diferente.
Como otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de seleccion de un sujeto que es altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis usando
(a) la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en B-Raf y PTEN,
(b) los niveles de expresion de ANG1 y ANG2, o
(c) el nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1, como indicador. Como se ha descrito anteriormente, el caso donde (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante; (a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion, (b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control; (b2) el nivel de expresion de ANG1 es igual a y mas alto en comparacion con un valor de control, y el nivel de expresion de ANG2 es suficiente para anular la expresion de ANG1; (b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control; (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control, (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control; (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control; (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control; (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control; (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control; (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control; (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control; (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control; (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control; (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control; (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control; (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control; o (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control, es un indicador de que el sujeto es altamente sensible a un inhibidor de la angiogenesis. Por consiguiente, un sujeto tal puede seleccionarse como el sujeto que es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis.
Observese que una persona que selecciona un sujeto que es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis y una persona que realiza la medicion de (a1) a (c15) anteriores puede ser igual o diferente.
Como otro aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de la angiogenesis. Un sujeto al que va a administrarse la composicion farmaceutica de la presente invencion es un sujeto, que esta padeciendo un tumor y que se ha predicho que es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo de la presente invencion. Ademas, la presente invencion proporciona el uso de un inhibidor de la angiogenesis para producir un farmaco medicinal que va a administrarse a un sujeto que padece un tumor. El sujeto es un sujeto que se ha predicho que es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo de la presente invencion. Ademas, la presente invencion proporciona un inhibidor de la angiogenesis para tratar un sujeto que padece un tumor y el sujeto es un sujeto que se ha predicho que es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo de la presente invencion.
En la composicion farmaceutica y el metodo de terapia tumoral de la presente invencion que se dirige a celulas tumorales que tienen una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN, pueden usarse uno o una pluralidad de otros agentes antitumorales en combinacion. El otro agente antitumoral no esta particularmente limitado, en tanto que sea una preparacion que tiene una actividad antineoplasica. Ejemplos del otro agente antitumoral incluyen clorhidrato de irinotecan (CPT-11), carboplatino, oxaliplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), docetaxel (Taxotere (marca registrada)), paclitaxel, clorhidrato de gemcitabina (Gemzar (marca registrada)), folinato de calcio (Leucovorin), bevacizumab (Avastin (marca registrada)) y everolimus (Certican (marca registrada) o Afinitor (marca registrada)). Ademas, ejemplos del otro agente antitumoral incluyen particularmente preferentemente dacarbazina o temozolomida cuando el tipo de tumor que va a tratarse por un agente terapeutico tumoral es melanoma; clorhidrato de irinotecan, oxaliplatino, 5-fluorouracilo, folinato de calcio o bevacizumab cuando es cancer del intestino grueso; clorhidrato de gemcitabina o bevacizumab cuando es cancer pancreatico, carboplatino o clorhidrato de gemcitabina cuando es cancer de ovario, bevacizumab o everolimus cuando es cancer de rinon; y carboplatino, docetaxel o paclitaxel cuando es cancer de pulmon.
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La composicion farmaceutica de la presente invencion puede usarse como agente terapeutico tumoral. En la presente invencion, el agente terapeutico tumoral incluye un agente antitumoral, un agente de mejora del pronostico del cancer, un preventivo de la reaparicion del cancer y un inhibidor de la metastasis del cancer.
Los efectos de la terapia del cancer pueden confirmarse por observacion, tal como radiograffa, CT y diagnostico histopatologico tal como biopsia o un valor de un marcador tumoral.
Cuando la composicion farmaceutica de la presente invencion se usa, puede ser administrada por via oral o por via parenteral. En el uso de la composicion farmaceutica de la presente invencion, la dosis de un inhibidor de la angiogenesis vana dependiendo de, por ejemplo, la gravedad del smtoma, la edad, sexo, peso y grado de sensibilidad de un sujeto, una via de administracion, un momento concreto de la dosificacion, un intervalo de dosificacion, propiedades, formulacion y tipo de una formulacion farmaceutica y tipo de principio activo. Aunque no esta particularmente limitado; la dosis es normalmente 0,1 mg a 10 g por adulto (peso corporal: 60 kg) por dfa, que se divide en porciones y se administra a una frecuencia de normalmente de una vez por semana a tres veces por dfa.
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede formularse en, por ejemplo, una formulacion solida oral y una inyeccion. Ejemplos de la formulacion solida oral incluyen un comprimido, un comprimido recubierto, un granulo, una formulacion de grano fino, un polvo y una formulacion encapsulada. Ejemplos de la inyeccion incluyen una inyeccion intravenosa, una inyeccion subcutanea y una inyeccion intramuscular. Si fuera necesario, pueden liofilizarse por un metodo convencional.
En la formulacion en una formulacion, pueden usarse aditivos convencionalmente usados tales como un excipiente, un aglutinante, un lubricante, un colorante y un aromatizante y, si fuera necesario, pueden usarse un estabilizador, un emulsionante, un acelerador de la absorcion, un tensioactivo y otros. Generalmente, los componentes usados como materiales de partida para una formulacion farmaceutica se combinan y se formulan en una formulacion segun un metodo convencional.
Ejemplos de estos componentes incluyen aceites animales y vegetales (por ejemplo, aceite de soja, sebo de res, glicerido sintetico), hidrocarburo (por ejemplo, parafina lfquida, escualano, parafina solida), aceites de ester (por ejemplo, miristato de octildodecilo, miristato de isopropilo), alcoholes superiores (por ejemplo, alcohol cetoesteanlico, alcohol behenico), resina de silicio, aceite de silicio, tensioactivos (por ejemplo, ester de acido graso de polioxietileno, ester de acido graso de sorbitano, ester de acido graso de glicerina, ester de acido graso de polioxietileno-sorbitano, polioxietileno-aceite de ricino hidrogenado, copolfmero de bloque de polioxietileno- polioxipropileno), polfmero soluble en agua (por ejemplo, hidroxietilcelulosa, acido poliacnlico, polfmero de carboxivinilo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, metilcelulosa), alcoholes (por ejemplo, etanol, isopropanol), alcoholes polihidroxilados (por ejemplo, glicerina, propilenglicol, dipropilenglicol, sorbitol), azucares (por ejemplo, glucosa, sacarosa), polvos inorganicos (anhfdrido silfcico, silicato de magnesio y aluminio, silicato de aluminio) y agua purificada. Para controlar el pH puede usarse, por ejemplo, un acido inorganico (por ejemplo, acido clorhfdrico, acido fosforico), una sal de metal alcalino de un acido inorganico (por ejemplo, fosfato de sodio), una base inorganica (por ejemplo, hidroxido sodico), un acido organico (por ejemplo, acido graso inferior, acido cftrico, acido lactico), una sal de metal alcalino de un acido organico (por ejemplo, citrato de sodio, lactato de sodio) y/o una base organica (por ejemplo, arginina, etanolamina). Si fuera necesario, puede anadirse un agente antiseptico y/o un antioxidante.
Como otro aspecto de la presente invencion, la presente invencion proporciona un kit de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis, caracterizado por que comprende sondas de B- Raf y PTEN o ANG1 y ANG2. La prediccion de la sensibilidad a un inhibidor de la angiogenesis puede realizarse por el metodo de la presente invencion. Como inhibidor de la angiogenesis se menciona, preferentemente, 4-(3-cloro-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma.
La composicion farmaceutica de la presente invencion y/o kit puede aplicarse a marnfferos (por ejemplo, un ser humano, una rata, un conejo, una oveja, un cerdo, una vaca, un gato, un perro, un mono).
La composicion farmaceutica de la presente invencion y/o kit puede comprender, aparte del inhibidor de la angiogenesis o sondas, por ejemplo, un recipiente de envasado, un folleto de instrucciones y un prospecto. En el recipiente de envasado, folleto de instrucciones y prospecto puede describirse, por ejemplo, la combinacion de uno o una pluralidad de otros agentes antineoplasicos concomitantemente usados. Ademas, la dosificacion y administracion con respecto a la forma de administracion de sustancias independientes en combinacion o una forma como una mezcla. La dosificacion y administracion pueden describirse con referencia a lo anterior.
Ejemplos
La presente invencion se describira mas espedficamente mediante los ejemplos; sin embargo, la presente invencion no se limita a estos ejemplos.
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[Ejemplo 1] Deteccion de mutacion o perdida de expresion de BRAF y PTEN
Se obtuvieron lmeas celulares de melanoma humano, SK-MEL-2, MeWo, CHL-1, HMV-1, HMCB, MDA-MB-435, LOX, G361, FEM, SEKI, SK-MEL-28, A375 y A2058, cada una de los fabricantes mostrados en la columna de "distribuidor" de la Tabla 6 y se analizaron por el metodo de Sanger o un metodo de secuencia de nueva generacion (metodo de PCR Bridge: Solexa/Illumina) para detectar una mutacion o perdida de expresion de BRAF y PTEN.
(1) Deteccion por el metodo de Sanger
(i) Preparacion de ADN genomico a partir de lmea celular de melanoma
Se purifico ADN genomico de celulas (aproximadamente 1 * 106) por uso del kit DNeasy Blood & Tissue (comprado de QIAGEN).
(ii) Amplificacion de la region de exon de PTEN
El ADN genomico obtenido se sometio a PCR para amplificar la region de exon de PTEN. Se realizo PCR por ADN polimerasa PrimeSTAR GXL (comprada de Takara Bio In.). Se mezclaron ADN genomico (100 ng), 5 * tampon PrimeSTAR GXL (4 jl), una mezcla de dNTP (2,5 mM) (1,6 jl), un cebador de sentido directo y un cebador de sentido contrario (5 pmoles para cada uno) y ADN polimerasa PrimeSTAR GXL (0,4 jl) para preparar una disolucion que tema un volumen total de 20 jl. La disolucion se sometio a una reaccion que se realizo repitiendo, 40 veces, un ciclo que consistfa en una reaccion a 95 °C durante 10 segundos, una reaccion a 55 °C durante 15 segundos y una reaccion a 68 °C durante 30 segundos.
Las secuencias de cebadores usadas en la PCR se muestran a continuacion.
Cebador de sentido directo del exon 1: AGTCGCCTGTCACCAITTC(SEQ ID NO: 19)
Cebador de sentido contrario del exon 1: ACTACGGACATTTTCGCATC(SEQ ID NO: 20)
Cebador de sentido directo del exon 2: GTTTGATTGCTGCATATTTCAG(SEQ ID NO: 21)
Cebador de sentido contrario del exon 2: GGCFTAGAAATCTTTTCTAAATG(SEQ ID NO: 22)
Cebador de sentido directo del exon 3: AATGACATGATTACTACTCTA(SEQ ID NO: 23)
Cebador de sentido contrario del exon 3: TTAATCGGTTTAGGAATACAA(SEQ ID NO: 24)
Cebador de sentido directo del exon 4: CATTATAAAGATTCAGGCAATG(SEQ ID NO: 25)
Cebador de sentido contrario del exon 4: GACAGTAAGATACAGTCTATC(SEQ ID NO: 26)
Cebador de sentido directo del exon 5: ACCTGTTAAGTTTGTATGCAAC(SEQ ID NO: 27)
Cebador de sentido contrario del exon 5: TCCAGGAAGAGGAAAGGAAA(SEQ ID NO: 28)
Cebador de sentido directo del exon 6: CATAGCAATTTAGTGAAATAACT(SEQ ID NO: 29)
Cebador de sentido contrario del exon 6: GATATGGTTAAGAAAACTGTTC(SEQ ID) NO: 30)
Cebador de sentido directo del exon 7: TGACAGTTTGACAGTTAAAGG(SEQ ID NO: 31)
Cebador de sentido contrario del exon 7: GGATATTTCTCCCAATGAAAG(SEQ ID NO: 32)
Cebador de sentido directo del exon 8: CTCAGATTGCCTTATAATAGT(SEQ ID NO: 33)
Cebador de sentido contrario del exon 8: TCATGTTACTGCTACGTAAAC(SEQ ID NO: 34)
Cebador de sentido directo del exon 9: AAGGCCCTCTTAAAGATCATG(SEQ ID NO: 35)
Cebador de sentido contrario del exon 9: TTTTCATGGTGTTTTATCCCT(SEQ ID NO: 36)
(iii) Recuperacion de producto de PCR
El producto de PCR, que se confirmo que tema una longitud deseada por electroforesis en 1 % de gel de agarosa, se recupero del gel y se purifico usando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up (comprado de Promega). El ADN genomico purificado se sometio a PCR por un kit comercialmente disponible para determinar la secuencia.
(2) Deteccion por el metodo de secuencia de nueva aeneracion
(i) Preparacion de ARN total a partir de la lmea celular de melanoma 13
Se cultivaron celulas en una condicion de 5 % de CO2 a 37 °C. Despues de un periodo de tiempo predeterminado, las celulas se lisaron con reactivo TRIZOL (comprado de GIBCO BRL) segun el manual de operaciones descrito en 5 el anexo del reactivo.
El metodo se realizo mas espedficamente del siguiente modo. Se anadio reactivo TRIZOL a una relacion de 1 ml por area de cultivo (10 cm2), se pipeteo varias veces y entonces se recupero el lfquido que contema la lisis de celulas. Se centrifugo la muestra asf recuperada y el sobrenadante resultante se dejo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos. A la muestra se anadio cloroformo (comprado de Junsei Chemical Co., Ltd.) a una relacion de 0,2 10 ml con respecto al volumen del reactivo TRIZO (1 ml). Esta disolucion se agito vigorosamente y se removio durante 15 segundos y se agito, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos y se centrifugo (12000 * g, 10 minutos, 4 °C). Despues de la centrifugacion, se transfirio una fase acuosa a un tubo nuevo. A este se anadio alcohol isopropflico (comprado de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en una relacion de 0,5 ml con respecto al reactivo tRizO (1 ml). La mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se centrifugo 15 (12000 * g, 10 minutos, 4 °C). Se obtuvo precipitacion, se lavo con 75% de etanol (comprado de Wako Pure
Chemical Industries Ltd.) y se seco al aire para obtener ARN total, que se sometio a las siguientes operaciones.
(ii) Amplificacion de secuencias que codifican protema BRAF y PTEN
Usando el ARN obtenido anteriormente como molde, se sintetizo ADNc segun el metodo descrito en el prospecto del kit de transcripcion inversa de ADNc de alta capacidad.
20 Los ADNc resultantes de lmeas celulares de melanoma 13 se sometieron a PCR para amplificar secuencias que codificaban protemas B-Raf y PTEN. Se realizo PCR con ADN polimerasa PrimeSTAR GXL (comprado de Takara Bio Inc.) o ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (comprada de Finnzymes). En el caso de uso de ADN polimerasa PrimeSTAR GxL se mezclaron ADNc (100 ng), 5 * tampon PrimeSTAR gXl (4 pl), una mezcla de dNTP (2,5 mM) (1,6 pl), un cebador de sentido directo y un cebador de sentido contrario (5 pmoles para cada uno) (con respecto a 25 B-Raf, se realizo una reaccion usando tres tipos de cebadores para cada una) y ADN polimerasa PrimeSTAR GXL
(0,4 pl) para preparar una disolucion de un volumen total de 20 pl y la disolucion se sometio a una reaccion que se realizo repitiendo, 40 veces, un ciclo que consistfa en una reaccion a 95 °C durante 10 segundos, una reaccion a 55 °C durante 15 segundos y una reaccion a 68 °C durante 2 minutos. En el caso de uso de ADN polimerasa Phusion High-Fidelity, se mezclaron ADNc (100 ng), 5 * tampon Phusion GC (4 pl), una mezcla de dNTP (2,5 mM) 30 (1,6 pl), un cebador de sentido directo y un cebador de sentido contrario (10 pmoles para cada uno) y ADN
polimerasa Phusion High-Fidelity (0,2 pl) para preparar una disolucion que tema un volumen total de 20 pl y la disolucion se sometio a una reaccion que se realizo repitiendo, 40 veces, un ciclo que consistfa en una reaccion a 8 °C durante 10 segundos, una reaccion a 55 °C durante 30 segundos y una reaccion a 72 °C durante 2 minutos.
Las secuencias de los cebadores usados en la PCR se muestran a continuacion.
35 Cebador de sentido directo de PTEN: TCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTT(SEQ ID NO: 37)
Cebador de sentido contrario de PTEN: TCTGACACAATGTCCTATTGCCAT(SEQ ID NO: 38)
Cebador de sentido directo 1 de BRAF: GCCCCGGCTCTCGQTIATAAGATG(SEQ ID NO: 39)
Cebador de sentido contrario 1 de BRAF: CCGTTCCCCAGAGATTCCAA(SEQ ID NO: 40)
Cebador de sentido directo 2 de BRAF: TGCCATTCCGGAGGAGGTGT(SEQ ID NO: 41)
40 Cebador de sentido contrario 2 de BRAF: GCCCATCAGGAATCTCCCAA(SEQ ID NO: 42)
Cebador de sentido directo 3 de BRAF: ATCTGGATCATCCCCTTCCGC(SEQ ID NO: 43)
Cebador de sentido contrario 3 de BRAF: CCCGGAACAGAAAGTAAAGCCTCTAG(SEQ ID NO: 44)
(iii) Recuperacion, purificacion, formacion de extremos romos y ligacion de producto de PCR
El producto de PCR, que se confirmo que tema una longitud deseada por electroforesis en 1 % de gel de agarosa, 45 se recupero del gel y se purifico usando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up (comprado de Promega). Se recogieron los productos purificados de PCR en un unico tubo por lmea celular y se sometio un volumen total (10 pl) a un tratamiento de formacion de extremos romos por un kit dNa Blunting (comprado de Takara Bio Inc.). A partir de aqrn, se realizaron extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con etanol para obtener sedimentos de ADN y se realizo un tratamiento de ligacion usando el kit DNA Ligation (comprado de Takara Bio Inc.) en un volumen total de 50 10 pl a 16 °C durante 6 horas. El ADN ligado se sometio a extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con etanol
para obtener sedimentos de ADN.
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(iv) Preparacion de genoteca para analisis por un secuenciador de nueva generacion
Se preparo una genoteca por uso del kit Genomic DNA Sample Prep (comprado de Illumina) segun el manual de operacion adjunto. El resumen del metodo es del siguiente modo.
Se sometio ADN a nebulizacion para obtener fragmentos. Los fragmentos de ADN se hicieron romos y se fosforilaron los extremos 5' de los mismos. Despues de anadir un adaptador, se realizo una electroforesis en 2 % de gel de agarosa. Se recupero un producto de 150 pb a 200 pb de longitud del gel y se purifico. El ADN se sometio a PCR usando el ADN purificado como molde y se purifico. Se midio la absorbancia del ADN resultante para comprobar la concentracion y pureza del mismo.
(v) Adquisicion de datos por secuenciador de nueva generacion
Usando GAII DNA Sample Cluster Generation Kit (comprado de Illumina) y 36-Cycle SBS Sequencing Kit (comprado de Illumina), se formo un grupo segun el manual de operacion adjunto y se obtuvieron los datos por Genome Analyzer II (Illumina). Se uso una muestra (3 pmoles) derivada de una unica lmea celular por carril. El numero de ciclos realizado fue 36 o 76.
(vi) Analisis de datos
Usando IPAR/GAPipeline fabricado por Illumina, se prepararon datos de secuencia en formato TXT a partir de una imagen en formato TIFF y se convirtio en el formato FASTQ. A partir de aqrn, se realizo el alineamiento usando MAQ con referencia a datos de secuencia de Refseq de un gen relacionado. A los datos de SNP extrafdos se anadieron, por ejemplo, datos de sustitucion de aminoacidos y se convirtieron en el formato GFF usando software incorporado. Se comprobaron la informacion de mutaciones y la informacion de profundidad (informacion de mutacion o perdida de expresion) usando Gbrowse. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
[Tabla 6]
Tabla 6 Presencia o ausencia de mutacion o perdida de expresion de B-Raf y PTEN en lmea celular de melanoma
humano
Lmea celular
Fabricante Medio de cultivo Mutacion o perdida de expresion
B-Raf
PTEN
SK-MEL-2
ATCC MEM Ninguna Ninguna
MeWo
ATCC MEM Ninguna Ninguna
CHL-1
ATCC DMEM Ninguna Ninguna
HMV-1
Dainippon Pharma Co., Ltd. RPMI1640 Ninguna Ninguna
HMCB
ATCC MEM Ninguna Ninguna
MDA-MB- 435
Dr. Mary J; C. Hendrix en la Universidad de Arizona RPMI1640 V600E Ninguna
LOX
Dainippon Pharma Co., Ltd. RPMI1640 V600E Ninguna
G361
Dainippon Pharma Co., Ltd. MacCoy's V600E Ninguna
FEM
Dr. Fodstad del Norw. Rad. Hosp. RPMI1640 A145V Ninguna
SEKI
Dainippon Pharma Co., Ltd. RPMI1640 V600E Ninguna
SK-MEL-28
ATCC MEM V600E T167A
A375
Dainippon Pharma Co., Ltd. RPMI1640 V600E Y68H
A2058
ATCC DMEM V600E L112Q
[Ejemplo 2] Calculo del efecto antitumoral del inhibidor de la angiogenesis sobre el modelo de raton injertado con lmea celular de melanoma.
Se cultivaron respectivamente lmeas celulares de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1 en los medios mostrados en la columna de "Medio de cultivo" (que contiene 10 % de FBS) de la Tabla 6 hasta que se obtuvo
aproximadamente el 80 % de confluencia (en una estufa de incubacion bajo 5 % de gas dioxido de carbono). Despues de cultivar, las celulas se recogieron por tratamiento con tripsina-EDTA segun un metodo convencional. Las celulas se suspendieron con un tampon fosfato o una disolucion de Matrigel (mezcla de tampon fosfato y Matrigel en una relacion comun de 1:1) para preparar disolucion de suspension de 1 * 108 celulas/ml o 5 * 10' 5 celulas/ml. La suspension de celulas (0,1 ml) se injerto por via subcutanea en el costado del cuerpo de cada raton sin pelo. De este modo, se prepararon modelos de raton injertados con lmea celular de melanoma humano.
Despues del injerto, desde el momento de tiempo cuando un volumen del tumor alcanzo aproximadamente 200 mm3, se administro por via oral un mesilato de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6- quinolincarboxamida (denominado en lo sucesivo E7080) (100 mg/kg/dfa). Se midieron el eje mayor y el eje menor 10 del tumor cada dfa por compas calibrador Digimatic (Mitsutoyo). El volumen del tumor y el volumen espedfico del tumor se calcularon segun la siguiente formula y asf se midio el efecto antitumoral (AT/C) de un inhibidor de la angiogenesis en el modelo de raton.
Volumen tumoral (VT) = diametro mas largo del tumor (mm) x diametro corto del tumor2 (mm2) / 2
Efecto anti-tumoral (AT/C) = (VT del grupo administrado con farmaco medicinal - VT antes del inicio de la 15 administracion) / (VT del grupo de control - VT antes del inicio de la administracion) x 100
El efecto antitumoral AT/C en el 7° dfa despues del inicio de la administracion se muestra en la Figura 1. En la Figura 1 se usaron las mismas lmeas celulares usadas en el Ejemplo 1.
Los efectos antitumorales (AT/C) de E7080 sobre las celulas de melanoma del caso donde ambos de BRAF y PTEN son no mutantes, el caso donde ambos de BRAF y PTEN tienen una mutacion o perdida de expresion, y el caso 20 donde BRAF tiene una mutacion y PTEN no tiene mutacion, fueron del 16, 23 y 45 %, respectivamente. El efecto antitumoral de E7080 se observo particularmente en el caso en el que ambos de BRAF y PTEn teman una mutacion o perdida de expresion y en el caso en el que BRAF y PTEN no teman una mutacion o perdida de expresion. Es evidente que el efecto antitumoral de E7080 vana entre celulas de melanoma que se clasifican basandose en la presencia o ausencia de una mutacion en BRAF y PTEN (Figura 1). Se demostro que la presencia o ausencia de 25 una mutacion en BRAF y PTEN se usa como indicador de la prediccion del efecto de E7080.
[Ejemplo 3] Correlacion con la relacion de vasos sangumeos cubiertos con celulas de peridermo (pericitos) que dependen de la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN
Como resultado de la angiogenesis imperfecta en un tejido tumoral, se observa un fenomeno donde no se forman vasos sangumeos cubiertos con celulas de peridermo. En el caso en el que las celulas tumorales se clasificaran 30 basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN, se investigo si la relacion de vasos sangumeos cubiertos con celulas de peridermo cambiaba o no.
Se prepararon modelos de raton injertados con lmea celular de melanoma humano usando las lmeas celulares de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1 segun el metodo del Ejemplo 2. Despues del injerto, en el momento de tiempo cuando un volumen del tumor alcanzo aproximadamente 100-300 mm3, el raton se sacrifico con CO2 y el 35 tejido tumoral injertado se extirpo por una operacion quirurgica.
A partir de aqrn, a partir del tejido tumoral extirpado, se prepararon secciones de tejido de tumor. Las secciones se tineron.
Para describir este procedimiento mas espedficamente, la porcion a una distancia de aproximadamente 5 mm dentro de la periferia del tejido tumoral se corto por cuchillo, el tejido se incorporo en compuesto OCT. A partir de 40 aqrn, el tejido se congelo con nieve carbonica y se preparo un tejido congelado a -80 °C. A partir del tejido congelado, se prepararon secciones de 8 pm en espesor, se unieron a un vidrio de portaobjetos, se lavaron con agua corriente y se dejaron reposar en acetona fria a 4 °C durante 10 minutos para preparar muestras. A partir de aqrn, las muestras se lavaron tres veces con un tampon fosfato 0,01 M que contema 0,1 % de Tween20 (denominado en lo sucesivo PBS de lavado) y se dejo reaccionar con una disolucion de bloqueo de avidina en el kit 45 de bloqueo de biotina DAKO durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues de completarse la reaccion, la muestra se lavo tres veces con PBS de lavado, y se dejo que reaccionara con una disolucion de bloqueo de biotina en el kit a temperatura ambiente durante 10 minutos. A partir de aqrn, la muestra se lavo tres veces con PBS de lavado y se dejo que reaccionara con suero normal en el VECTOR STAIN ABC kit de peroxidasa-IgG de rata a temperatura ambiente durante 20 minutos. Despues de eliminarse la disolucion de reaccion de las muestras, se 50 anadio anticuerpo primario, es decir, un anticuerpo anti-CD31 (nombre del clon: MEC13.3, IgG de rata, PharMingen, BD Biosciences), que se diluyo 600 veces con un tampon fosfato 0,1 M que contema un 1 % de suero bovino fetal, y se dejo que reaccionara durante la noche a 4 °C. A partir de aqrn, las muestras se lavaron, y se anadio un anticuerpo secundario marcado con biotina en el kit y se dejo que reaccionara a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se lavaron y entonces se hicieron reaccionar adicionalmente con un reactivo de avidina en el kit a 55 temperatura ambiente durante 30 minutos. A partir de aqrn, las muestras se lavaron tres veces con un tampon fosfato 0,01 M y se desarrollo el color con DAB para tenir CD31.
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Posteriormente, las muestras se lavaron con agua corriente y se lavaron tres veces con tampon Tris. A partir de aqm, con las muestras, se dejo que anticuerpo anti-a-SMA marcado con fosfatasa alcalina (nombre del clon: 1A4, IgG de raton, SIGMA-ALDRICH) diluido 100 veces con tampon Tris reaccionara a temperatura ambiente durante una hora. A partir de aqm, las muestras se lavaron tres veces con tampon Tris y el color se desarrollo con una disolucion de fuchsina en el kit DAKO LSAB para tenir a-SMA.
Cada una de las muestras tenidas se puso bajo un microscopio y se contaron el numero de vasos sangumeos y el numero de vasos sangumeos cubiertos con pericitos por una camara CCD HYPER SCOPE (KEYENCE) en, por ejemplo, 5 sitios por muestra, y se promedio. Se obtuvo el numero de vasos sangumeos o pericitos por unidad de area. Ademas, se calculo la relacion de los vasos sangumeos con pericitos en el numero de los vasos sangumeos en cada lmea celular de melanoma. Los resultados se muestran en la Figura 2. En la Figura 2, se usaron las mismas lmeas celulares usadas en el Ejemplo 1.
Entre las clases de las celulas de melanoma, que se clasificaron basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN, la relacion de los vasos sangumeos cubiertos con pericitos en el tejido tumoral tendio a diferir (Figura 2). Ademas, se analizaron el efecto antitumoral de E7080 y la relacion de los vasos sangumeos cubiertos con pericitos en un tejido tumoral. Como resultado, la relacion de los vasos sangumeos cubiertos con pericitos en un tejido tumoral presento una alta correlacion con el efecto antitumoral de E7080 (Figura 3). A partir de esto, se sugirio que la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN influye en las propiedades de vasos sangumeos en un tumor y vana con la relacion de vasos sangumeos cubiertos con pericitos en el tumor. Los resultados sugieren que, en melanoma donde la relacion de vasos sangumeos cubiertos con pericitos es baja, E7080 puede posiblemente tender a tener un efecto sobre los vasos sangumeos, y que particularmente en casos en los que ambos de BRAF y PTEN son no mutantes y donde ambos de BRAF y PteN tienen una mutacion o perdida de expresion, E7080 facilmente produce un efecto.
[Ejemplo 4] Regulacion de la expresion de ANG1 y ANG2 por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN
(1) Correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y las expresiones de ANG1 y ANG2
En lmeas celulares de melanoma humano, se investigo la correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y las expresiones de ANG1 y aNG2 usando la RT-PCR cuantitativa y ELISA.
1. Investigacion por el metodo de RT-PCR cuantitativa
A partir de cada una de las lmeas celulares de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1, se preparo ARN total en el mismo metodo que en el Ejemplo 1 (2) (i) y se sometio a las siguientes mediciones.
El metodo de RT-PCR cuantitativa para diversos tipos de factores de la angiogenesis y diversos tipos de receptores de factor de la angiogenesis se realizo usando una sonda espedfica de gen (mezcla TaqMan Gene Expression, comprada mediante ASSAYS-ON-DEMAND de Applied Biosystems) y el sistema BioMark™ de analisis genico (comprado de Fluidigm) basado en el manual de operacion, del siguiente modo.
Los nombres de genes de los factores de angiogenesis y los receptores de factor de angiogenesis usados en el presente documento y los ID de ensayo de las sondas compradas se muestran en la Tabla 7.
Se realizo la operacion que consiste en tres etapas, una reaccion de transcripcion inversa, una pre-amplificacion y PCR.
En la primera etapa, es decir, reaccion de transcripcion inversa, se anadio dH2O libre de RNasa (6,5 pl) al ARN preparado. A este se anadieron ademas 5 x tampon PrimeScript (2 pl), PrimeScript RT Enzyme Mix I (0,5 pl), Oligo dT Primer (50 pM) (0,5 pl) y Random 6 mer (100 pM) (0,5 pl). Despues de dejar que reaccionara a 37 °C durante 15 minutos, la mezcla se calento a 85 °C durante 5 segundos para terminar la reaccion para obtener una disolucion de ADNc. La disolucion de ADNc obtenida se sometio a la segunda etapa, reaccion de pre-amplificacion.
En la reaccion de pre-amplificacion, se anadio un tampon de TE baja (58 pl) al cebador / sonda espedfico de gen (42 pl). De la disolucion se tomo una almuota (56,25 pl). A esta se anadieron PreAmp Master Mix (112,5 pl) y la disolucion de ADNc (56,25 pl). La mezcla se dejo reaccionar a 95 °C durante 10 minutos, y entonces se repitio 14 veces un ciclo de reaccion que consistfa en una reaccion a 95 °C durante 15 segundos y una reaccion a 60 °C durante 4 minutos. Despues de completarse la reaccion, la disolucion de reaccion se diluyo (1:5) con tampon TE, y se uso como una disolucion de pre-amplificacion. La disolucion de pre-amplificacion obtenida se sometio a la tercera etapa, PCR.
Se preparo una disolucion de muestra anadiendo tampon de carga (27,5 pl) a 2 x ABI Master Mix (275 pl) y anadiendo adicionalmente, a 5,5 pl de la disolucion, 4,5 pl de la disolucion de pre-amplificacion. Ademas, se preparo una disolucion de ensayo anadiendo 10 % de Tween a agua (4750 pl), tomando una almuota (5 pl) de la disolucion,
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y anadiendo 20 x ensayos (5 |jl) a la almuota. La disolucion de muestra y la disolucion de ensayo se anadieron por separado a la bandeja 48.48 Dynamic y se cargo una muestra por NanoFlex ICF controlado y a partir de aqu se realizo medicion por Biomark (Fluidigm Corporation).
[Tabla 7]
Tabla 7 Factor de angiogenesis y receptor de factor de angiogenesis cuantificado
N.°
Nombre del gen ID de ensayo
1
beta-actina Hs99999903_m1
2
Ang-1 Hs_00181613
3
Ang-2 Hs_00169867
Para realizar el analisis cuantitativo de cada gen a partir del producto de PCR obtenido, se establecio una curva de calibracion usando una muestra de ARNm preparada anadiendo cantidades equivalentes de todas las muestras. El nivel de expresion de un gen en cada una de las lmeas celulares de melanoma se obtuvo calculando Ct (representa un valor de ciclo umbral que es el numero de ciclos de PCR requerido para que un producto de PCR alcance una concentracion predeterminada) de la curva de calibracion. El nivel de expresion de un gen en cada lmea celular de melanoma se conecto por nivel de expresion de p-actina para obtener una relacion del nivel de expresion del gen en la lmea celular de melanoma y se uso para analisis de comparacion.
2. Validacion por ELISA
Se prepararon modelos de raton injertados en la lmea celular de melanoma humano segun el metodo del Ejemplo 2 usando las celulas de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1. Despues del injerto, en la etapa donde un volumen del tumor alcanzo 100 mm3 o mas, el raton se sacrifico y se recupero el tejido tumoral injertado. Al tejido tumoral se anadio un tampon de lisis de celulas (comprado de Cell Signaling) para preparar una savia celular y se guardo a -80 °C. Se determinaron el nivel de expresion de la protema ANG1 y el nivel de expresion de la protema ANG2 en la disolucion de preparacion y la relacion de ellos (ANG1/ANG2) por un kit de ELISA (comprado de R&D Systems) y se cuantifico basandose en una curva de calibracion.
Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. En la Figura 4, la barra indicada por BRAF "-" incluye los resultados de los efectos antitumorales de las lmeas celulares SK-MEL-2, MeWo, CHL-1, HMV-1 y HMCB mostradas en la Tabla 6; mientras que la barra de BRAF "+" incluye los resultados de los efectos antitumorales de las lmeas celulares MDA-MB-435, LOX, G361, FEM, SEKI, SK-MEL-28, A375 y A2058 mostradas en la Tabla 6. En la Figura
5, la barra indicada por PTEN "-" incluye los resultados de los efectos antitumorales de las lmeas celulares SK-MEL- 2, MeWo, CHL-1, HMV-1, HMCB, MDA-MB-435, LOX, G361, FEM y SEKI mostradas en la Tabla 6; mientras que una barra indicada por PTEN "+" incluye los resultados de los efectos antitumorales de las lmeas celulares SK-MEL- 28, A375 y A2058 mostradas en la Tabla 6.
Se demostro que el nivel de expresion de ARNm de ANG1 (N.° 11 en la Tabla 7) aumenta significativamente en una lmea celular de melanoma humano en la que BRAF tiene una mutacion (Figura 4 (b)) y el nivel de expresion de protema ANG1 aumenta en una lmea celular de melanoma humano en la que BRAF tiene una mutacion (Figura 4 (a)).
Ademas, el nivel de expresion de ARNm de ANG2 (N.° 12 en la Tabla 7) aumenta en una lmea celular de melanoma humano en la que PTEN tiene una mutacion (Figura 5 (b)), y el nivel de expresion de protema ANG2 (N.° 12 en la Tabla 7) aumenta significativamente en una lmea celular de melanoma humano en la que PTEN tiene una mutacion (Figura 5 (a)).
(2) Correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y la relacion (ANG1/ANG2) de niveles de expresion de ANG1 y ANG2
Se sabe que ANG1 se une al receptor de TIE-2 y la senal de ANG1-TIE-2 induce la maduracion de vasos sangumeos. Al receptor de TIE-2, ANG2 y ANG1 se unen competitivamente. Si ANG2 se une al receptor, ninguna senal fluye en la direccion 3'. Este estado llega a ser equivalente al estado donde ANG1 no se expresa (o la expresion es baja). En otras palabras, si BRAF es normal, se sabe que una senal de VEGF contribuye a la angiogenesis y supervivencia, y no se produce la maduracion de vasos sangumeos.
Cuando se clasifican celulas de melanoma basandose en la presencia o ausencia de una mutacion de BRAF y PTEN, si la senalizacion de ANG1-TIE-2 esta influida, se investigo basandose en la relacion (ANG1/ANG2) del nivel de expresion de protema ANG1 y el nivel de expresion de protema ANG2. Los resultados se muestran en la Figura
6. En la Figura 6, se usaron las lmeas celulares usadas en el Ejemplo 1.
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Cuando se clasifican celulas de melanoma basandose en la presencia o ausencia de una mutacion de BRAF y PTEN, la relacion (ANG1/ANG2) del nivel de expresion de protema ANG1 y el nivel de expresion de protema ANG2 tendio a ser bajo en el caso en el que ambos de BRAF y PTEN son no mutantes y en el caso en el que BRAF y PTEN tienen una mutacion o una perdida de expresion; mientras que la relacion (ANG1/ANG2) tendio a ser alta en el caso en el que BRAF tiene una mutacion o perdida de expresion y PTEN es no mutante (Figura 6). Ademas, en comparacion con el caso donde BRAF tiene una mutacion o una perdida de expresion y PTEN es no mutante, se mostro que la relacion de niveles de expresion de ANG1 y ANG2 era significativamente baja en el caso en el que ambos de BRAF y PTEN son no mutantes y en el caso donde BRAF y PTEN tienen una mutacion o perdida de expresion. Esto significa que en una mutacion o perdida de expresion de BRAF y PTEN, una combinacion de mutaciones probablemente sensibles a E7080 y ANG1/ANG2 presentan tendencias similares.
A partir de los resultados anteriores, se elucido que el efecto antitumoral de un inhibidor de la angiogenesis se define por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN. En un sujeto que no tiene mutacion de BRAF, disminuye la relacion de celulas de peridermo alrededor de un vaso sangumeo en un tejido tumoral. Se elucido que el control de expresion de ANG1 y ANG2, que participan en la formacion de vasos sangumeos cubiertos de pericitos, participa en la causa del mismo. En el caso en el que ANG1 no se exprese o el nivel de expresion de ANG1 sea bajo, en otras palabras, en el estado donde BRAF es normal, particularmente si FGFR3 se expresa, se espera que un inhibidor de cinasas de FGFR destruya directamente celulas cancerosas. Esto sugirio que E7080 tiene un potencial de no solo inhibir la angiogenesis, sino tambien potenciar un efecto antitumoral en un paciente con melanoma en el que BRAF es normal y FGFR3 se expresa.
A diferencia, se sugirio que si se expresa ANG1 altamente, en otras palabras, en el caso en el que BRAF tenga una mutacion o perdida de expresion, la maduracion de vasos sangumeos vana dependiendo de la expresion de ANG2; mientras que si ANG2 se expresa altamente, en otras palabras, en el caso en el que PTEN tenga una mutacion o perdida de expresion, no se produce maduracion debido a la inhibicion competitiva por ANG1 y ANG2; en cambio, si la expresion de ANG2 es baja, en otras palabras, en el caso en el que PTEN sea normal, se produce la maduracion de vasos sangumeos. Por tanto, se sugirio que, en el caso en el que la expresion de ANG1 y ANG2 sea alta, puede esperarse el efecto antitumoral de E7080 debido a la inhibicion de la angiogenesis; mientras que en el caso en el que la expresion de ANG1 sea alta y la expresion de ANG2 sea baja y si la expresion de ANG2 es superior a la expresion de ANG1, puede esperarse el efecto antitumoral de E7080.
Por consiguiente, llega a ser posible que el efecto de E7080 pueda predecirse basandose en los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 o la relacion de los niveles de expresion.
[Ejemplo 5] Correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y las expresiones de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1
En lmeas celulares de melanoma humano, se investigo la correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y las expresiones de SHC1, lL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, aRhGAP22, ScG2, FGF9, PML, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 usando un metodo de micromatrices de ADN.
1. Extraccion de ARN total de muestra
Se usaron celulas de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1 para preparar modelos de raton injertados con celulas de melanoma humano del mismo modo que en el Ejemplo 2. Despues del injerto, en la etapa donde un volumen del tumor alcanzo 200 mm3 o mas, se sacrifico el raton y se extirpo el tejido tumoral injertado. Se preparo ARN total en el mismo metodo que en el Ejemplo 1 (2) (i) y se sometio a las siguientes operaciones.
2. Cuantificacion de ARN
1) Cuantificacion por micromatriz de ADN
Se realizaron smtesis de ADNc y marcado de biotina basandose en el metodo de Schena et al. (Schena et al., Science, 1995, 270, p. 467-470), el metodo de Lockhart et al. (Lockhart et al., Nature Biotechnology, 1996, 14, p. 1675-1680) o el ultimo manual de operaciones de la estacion de matriz GeneChip (marca registrada) fabricada por Affimetrix. A partir de aqrn, se realizaron hibridacion con una micromatriz de ADN (Human Genome U133 Plus 2.0 Array) fabricada por Affimetrix y medicion basada en el manual de operaciones para obtener datos.
3. Analisis de datos
Los datos se analizaron estadfsticamente por una prueba de tendencias usando el metodo de la chi al cuadrado acumulada y se extrajeron los genes que mostraron un cambio significativo en el nivel de expresion por la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN.
Como resultado, se elucido que los niveles de expresion de IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR1, FGFR4 y VEGPR1 disminuyen significativamente desde el nivel de expresion de un caso donde BRAF tiene una mutacion y PTEN es no mutante; mientras que los niveles de expresion de SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 y PML aumentan
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significativamente desde el nivel de expresion de un caso donde BRAF tiene una mutacion y PTEN es no mutante. As^ se elucido que los niveles de expresion de SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR1, FGFR4 y VEGFRl cambian significativamente cuando las celulas de melanoma se clasificaron basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN.
Mas espedficamente, si la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta, se sugirio que
el nivel de expresion de SHC1 disminuye significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de IL6 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de CXCR4 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de COL4A3 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de NRP2 disminuye significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de MEIS1 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de ARHGAP22 disminuye significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de SCG2 disminuye significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de FGF9 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de PML disminuye significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de FGFR1 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control,
el nivel de expresion de FGFR4 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control, y/o
el nivel de expresion de VEGFR1 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control.
[Ejemplo 6] Correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y expresiones de FGFR3 y FGFR2
En lmeas celulares de melanoma humano, se investigo la correlacion entre la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN y las expresiones de FGFR3 y FGFR2 por un metodo de RT-PCR cuantitativa.
Se usaron las lmeas celulares de melanoma humano usadas en el Ejemplo 1 para preparar modelos de raton injertados con celulas de melanoma humano del mismo modo que en el Ejemplo 2. Se preparo ARN total en el mismo metodo que en el Ejemplo 1 (2) (i) y se realizo una RT-PCR cuantitativa en el mismo metodo que en el Ejemplo 4, Seccion 1. El nombre de los genes de los factores de angiogenesis y los receptores de factor de angiogenesis usados en el presente documento y el ID de ensayo de la sonda comprada se muestran en la Tabla 8 y los resultados se muestran en la Figura 7.
[Tabla 8]
Tabla 8 Factor de angiogenesis y receptor de factor de angiogenesis cuantificado
N.°
Nombre del gen ID de ensayo
1
beta-actina Hs99999903_m1
2
FGFR3 Hs_00179829
3
FGFR2 Hs_00256527
Como resultado, los niveles de expresion de FGFR3 y FGFR2 disminuyen significativamente desde el nivel de
expresion de un caso donde BRAF tiene una mutacion y PTEN es no mutante. Asf se elucido que los niveles de
expresion de FGFR3 y FGFR2 cambiaban significativamente cuando las celulas de melanoma se clasificaron basandose en la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion en BRAF y PTEN (Figura 7).
Mas espedficamente, se sugirio que si la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de la angiogenesis es alta,
el nivel de expresion de FGFR2 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control, y
el nivel de expresion de FGFR3 aumenta significativamente en comparacion con un valor de control.
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Aplicabilidad industrial
La presente invencion proporciona un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor angiogenesis. Los resultados de prediccion obtenidos por el metodo de la presente invencion pueden usarse informacion para seleccionar un inhibidor de la angiogenesis para tratar un tumor.
Texto libre de listado de secuencias
SEQ ID NO: 1: Secuencia de polinucleotidos de B-Raf, N° de acceso de GenBank NM_004333.4
SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoacidos de B-Raf, N° de acceso de GenBank NP_004324.2
SEQ ID NO: 3: Secuencia de polinucleotidos de PTEN, N° de acceso de GenBank NM_000314.4
SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoacidos de PTEN, N° de acceso de GenBank NP_000305.3
SEQ ID NO: 5: Secuencia de polinucleotidos de SHC1, N° de acceso de GenBank NM_003029.4
SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoacidos de SHC1, N° de acceso de GenBank NP_003020.2
SEQ ID NO: 7: Secuencia de polinucleotidos de IL6, N° de acceso de GenBank NM_000600.3
SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoacidos de IL6, N° de acceso de GenBank NP_000591.1
SEQ ID NO: 9: Secuencia de polinucleotidos de CXCR4, N° de acceso de GenBank NM_001008540.1 SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoacidos de CXCR4, N° de acceso de GenBank NP_001008540.1
SEQ ID NO: 11: Secuencia de polinucleotidos de COL4A3, N° de acceso de GenBank NM_000091.4
SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoacidos de COL4A3, N° de acceso de GenBank NP_000082.2
SEQ ID NO: 13: Secuencia de polinucleotidos de NRP2, N° de acceso de GenBank NM_003872.2
SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoacidos de NRP2, N° de acceso de GenBank NP_003863.2 SEQ ID NO: 15: Secuencia de polinucleotidos de MEIS1, N° de acceso de GenBank NM _002398.2 SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoacidos de MEIS1, N° de acceso de GenBank NP_002389.1 SEQ ID NO: 17: Secuencia de polinucleotidos de ARHGAP22, N° de acceso de GenBank NM_021226.2 SEQ ID NO: 18: Secuencia de aminoacidos de ARHGAP22, N° de acceso de GenBank NP_067049.2 SEQ ID NO: 19-44: ADN sintetico
SEQ ID NO: 45: Secuencia de polinucleotidos de ANG1, N° de acceso de GenBank NM_001146.3 SEQ ID NO: 46: Secuencia de aminoacidos de ANG1, N° de acceso de GenBank NP_001137.2 SEQ ID NO: 47: Secuencia de polinucleotidos de ANG2, N° de acceso de GenBank NM_001118888.1 SEQ ID NO: 48: Secuencia de aminoacidos de ANG2, N° de acceso de GenBank NP_001112360.1 SEQ ID NO: 49: Secuencia de polinucleotidos de SCG2, N° de acceso de GenBank NM_003469.4 SEQ ID NO: 50: Secuencia de aminoacidos de SCG2, N° de acceso de GenBank NP_003460.2 SEQ ID NO: 51: Secuencia de polinucleotidos de FGF9, N° de acceso de GenBank NM_002010.2 SEQ ID NO: 52: Secuencia de aminoacidos de FGF9, N° de acceso de GenBank NP_002001.1 SEQ ID NO: 53: Secuencia de polinucleotidos de PML, N° de acceso de GenBank NM_002675.3 SEQ ID NO: 54: Secuencia de aminoacidos de PML, N° de acceso de GenBank NP_002666.1 SEQ ID NO: 55: Secuencia de polinucleotidos de FGFR3, N° de acceso de GenBank NM_000142.3 SEQ ID NO: 56: Secuencia de aminoacidos de FGFR3, N° de acceso de GenBank NP_000133.1 SEQ ID NO: 57: secuencia de polinucleotidos de FGFR2, N° de acceso de GenBank 7.NM_001144918.1
de la como
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SEQ ID NO: 58: Secuencia de aminoacidos de FGFR2, N° de acceso de GenBank NP_001138390.1 SEQ ID NO: 59: Secuencia de polinucleotidos de FGFR1, N° de acceso de GenBank NM_001174063.1 SEQ ID NO: 60: Secuencia de aminoacidos de FGFR1, N° de acceso de GenBank NP_001167534.1 SEQ ID NO: 61: Secuencia de polinucleotidos de FGFR4, N° de acceso de GenBank NM_002011.3 SEQ ID NO: 62: Secuencia de aminoacidos de FGFR4, N° de acceso de GenBank NP_002002.3 SEQ ID NO: 63: Secuencia de polinucleotidos de VEGFR1, N° de acceso de GenBank NM_001159920.1 SEQ ID NO: 64: Secuencia de aminoacidos de VEGFR1, N° de acceso de GenBank NP_001153392.1 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Eisai R&D Management Co., Ltd.
<120> Un metodo de prediccion de un efecto de agente antiangiogenico
<130> PCT12-0011
<150> JP 2011-110884 <151>
<160> 64
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1

Claims (14)

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    1. Un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis, que comprende
    (a) detectar la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de B-Raf y la presencia o ausencia de una mutacion o perdida de expresion de PTEN en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto, en el que en la etapa de deteccion, un caso donde
    (a1) B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante, o
    (a2) B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion
    es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma, y en el que el tumor es melanoma.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que, en la etapa de deteccion (a), un caso donde B-Raf es no mutante y PTEN es no mutante es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que, en la etapa de deteccion (a), un caso donde B-Raf tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 1 o perdida de expresion y PTEN tiene al menos una mutacion seleccionada de la Tabla 2 o perdida de expresion es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1 o al reivindicacion 3, en el que la mutacion de B-Raf es una mutacion V600E en una secuencia de aminoacidos o una mutacion en una secuencia de nucleotidos correspondiente a la mutacion.
  5. 5. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3, en el que la mutacion de PTEN es al menos una mutacion en una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en A499G, T202C y T335A o al menos una mutacion en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en T167A, Y68H y L112Q.
  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el inhibidor de la angiogenesis es una sal de mesilato de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
  7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tumor es un tumor que tiene una mutacion V600E en B-Raf.
  8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que, en la etapa (a), se predice la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis; y el metodo comprende ademas una etapa (b) de cuantificar niveles de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ANG1 y ANG2 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
    (b1) el nivel de expresion de ANG 1 es bajo en comparacion con un valor de control
    (b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control, o
    (b3) la relacion de los niveles de expresion de ANG1 y ANG2 es baja en comparacion con un valor de control es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
  9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que, en la etapa (a), se predice la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis; y el metodo comprende ademas una etapa (c) de cuantificar un nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 y VEGFR1 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
    (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control,
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    (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o
    (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
  10. 10. Un metodo de prediccion de la sensibilidad de un sujeto que padece un tumor a un inhibidor de la angiogenesis, que comprende
    (b) cuantificar niveles de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ANG1 y ANG2 en una muestra derivada de un tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
    (b1) el nivel de expresion de ANG1 es bajo en comparacion con un valor de control
    (b2) el nivel de expresion de ANG2 es alto en comparacion con un valor de control, o
    (b3) la relacion de nivel de expresion de ANG1 y ANG2 es bajo en comparacion con un valor de control
    es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma y en el que el tumor es melanoma.
  11. 11. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que, en la etapa (b), se predice alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis, y el metodo comprende ademas una etapa (c) de cuantificar un nivel de expresion de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FgFR1, FGFR4 y VEGFR1 en la muestra derivada del tejido tumoral del sujeto, en el que, en la etapa de cuantificacion, un caso donde
    (c1) el nivel de expresion de SHC1 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c2) el nivel de expresion de NRP2 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c3) el nivel de expresion de ARHGAP22 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c4) el nivel de expresion de SCG2 es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c5) el nivel de expresion de PML es bajo en comparacion con un valor de control,
    (c6) el nivel de expresion de IL6 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c7) el nivel de expresion de CXCR4 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c8) el nivel de expresion de COL4A3 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c9) el nivel de expresion de MEIS1 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c10) el nivel de expresion de FGF9 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c11) el nivel de expresion de FGFR3 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c12) el nivel de expresion de FGFR2 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c13) el nivel de expresion de FGFR1 es alto en comparacion con un valor de control,
    (c14) el nivel de expresion de FGFR4 es alto en comparacion con un valor de control, o
    (c15) el nivel de expresion de VEGFR1 es alto en comparacion con un valor de control
    es indicativo de la alta sensibilidad del sujeto al inhibidor de la angiogenesis.
  12. 12. Una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de la angiogenesis para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece melanoma, en el que se ha predicho que el sujeto es altamente sensible al inhibidor de la angiogenesis por el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y en el que el inhibidor de la
    5 angiogenesis es 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma.
  13. 13. La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 12, en la que el inhibidor de la angiogenesis es una sal de mesilato de 4-(3-cloro-4-(ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida.
  14. 14. Un uso de un kit que comprende sondas de B-Raf y PTEN o sondas de ANG1 y ANG2 para predecir la 10 sensibilidad de un sujeto que padece melanoma a un inhibidor de la angiogenesis, en el que la sensibilidad del
    sujeto que padece melanoma al inhibidor de la angiogenesis se predice por el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y en el que el inhibidor de la angiogenesis es 4-(3-cloro-4- (ciclopropilaminocarbonil)aminofenoxi)-7-metoxi-6-quinolincarboxamida o una sal farmacologicamente aceptable de la misma.
    15
    117
    U CD H ZIo m > z -tt
    Efecto anti-tumoral de E7080 (AT/G)
    63
    Q
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    118
    Relacion de vaso sanguineo cubierto por pericitos en tejido tumoral (%)
    TJ DD
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    imagen3
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    Fig .6
    imagen7
    BRAF - + +
    PTEN - - +
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