KR20150102468A - 폐암관련 돌연변이 증폭용 프라이머 세트, 및 상기 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트; 및 상기 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트 및 이를 이용하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폐암 진단용 키트를 이용하는 경우, 종래 사용하는 서열분석법보다 매우 높은 감도로, 113의 DNA 돌연변이를 동시에 확인 할 수 있는 바, 임상 시료 사용량이 현저히 감소되며, 비용, 인력 및 소요 시간 감소 효과가 예상된다.
Description
본 발명은 폐암 관련 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트; 및
상기 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 키트를 이용하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.
이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 [0003] 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.
특히 폐암은 19세기까지만해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여 우리나라에서도 폐암의 발생이 가파르게 상승하고 있는 추세이다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 잘 되지 않아, 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암 환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다.
암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해, 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해이다. 이러한 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가된다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하여 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.
현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.
또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.
따라서, 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기발견에 사용될 수 있는 것이어야 한다.
이에, 본 발명자들은 폐암 진단을 위하여, 폐암과 관련된 돌연변이를 높은 감도 및 정확도로 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA을 증폭할 수 있는 프라이머, 및 상기 유전자의 돌연변이와 상보적인 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트가 폐암 관련 돌연변이 검출에 매우 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 폐암 관련 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트; 및
상기 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 키트를 이용하여 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트; 및
상기 EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 돌연변이란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 상기 돌연변이는 바람직하게는 유전자 단위의 돌연변이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된 점돌연변이 (point mutation) 또는 다중 돌연변이 (multiple mutation)일 수 있다. 또한 상기 돌연변이는 침묵 돌연변이, 중성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프래임 시프트 돌연변이 등 일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명에서 용어, 프라이머 세트는 "포워드 프라이머 (forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer)"로 구성될 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다. 이러한 프라이머 세트 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 및 상기 돌연변이를 포함하는 유전자에 따라서 용이하게 결정할 수 있는 사항이다. 상기 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머의 길이는 연속하는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp 부위와 상보적인 염기서열을 갖는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp로서 설계될 수 있다.
상기 프라이머 또는 시발체는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로, 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태 일 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 시발체는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브 (probe, 탐침)"는 특정물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질를 의미하며, 본 발명에서는 EGFR, KRAS, BRAF 또는 PIK3CA 유전자의 돌연변이에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합일 수 있다. 본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 프로브는 5개 내지 1000 bp의 길이일 수 있으며, 돌연변이의 규모 및 위치에 따라서 달라질 수 있으며, 그 길이를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자는 Gene bank ID 1956에 해당하며, EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자에 대한 돌연변이는 바람직하게는 액손 18 내지 21 (액손 18, 19, 20, 21)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발생하는 돌연변이다. 상기 돌연변이는 75개의 돌연변이에서 선택된 1개 이상일 수 있다. 구체적으로 해당 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, KRAS (Kirsten ras) 유전자는 Gene bank ID 3845에 해당하며, KRAS 유전자에 대한 돌연변이는 바람직하게는 코돈 12, 13 및 61으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발생하는 돌연변이다. 상기 돌연변이는 19개의 돌연변이에서 선택된 1개 이상일 수 있다. 구체적으로 해당 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, BRAF (B type Raf kinase) 유전자는 Gene bank ID 673에 해당하며, BRAF 유전자에 대한 돌연변이는 바람직하게는 V600E 위치에서 발생하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 4개의 돌연변이에서 선택된 1개 이상 일 수 있다. 구체적으로 해당 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서 PIK3CA (phosphoinositide-3-kinase catalytic-alpha polypeptide) 유전자는 Gene bank ID 5290에 해당하며, PIK3CA 유전자에 대한 돌연변이는 바람직하게는 액손 1, 10 또는 21 위치에서 발생하는 돌연변이 일 수 있으며, 15개의 돌연변이에서 선택된 1개 이상일 수 있다. 구체적으로 해당 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이에 상보적인 프로브의 서열정보는 하기와 같다.
| SNP_ID | UEP_SEQ |
| del_747-753_ins_S | TTCCTTGTTGGCTTTCG |
| del_745-750 | TTGGCTTTCGGAGATGT |
| del_E746-F | gTTCCCGTCGCTATCAAG |
| BRAF_V600E_1 | CCCACTCCATCGAGATTTC |
| PIK3CA-P539R | CTCAGTGATTTCAGAGAGA |
| V769L | AAGCCTACGTGATGGCCAGC |
| PIK3CA-Q546K | CTCCATAGAAAATCTTTCTCCT |
| BRAF_V600E | GGTGATTTTGGTCTAGCTACAG |
| V786M | TCTGCCTCACCTCCACC |
| PIK3CA-P18L | CATCCACTTGATGCCCC |
| PIK3CA-K111R | AGGCAACCGTGAAGAAA |
| PIK3CA-E542Q_K | TCTCCTGCTCAGTGATTT |
| del_A750-R-1 | GTTGGCTTTCGGAGATGTT |
| del_K754-R3 | ACGATTTCCTTGTTGGCTT |
| KRAS_G12C | GGCACTCTTGCCTACGCCAC |
| PIK3CA-T1025A | AGTTTTATCTAAGGCTAGGG |
| del_746-F3 | cATTCCCGTCGCTATCAAGGA |
| del_P753-F | GAATTAAGAGAAGCAACATCT |
| dup739-744 | ATTCCCGTCGCTATCAA |
| del_A755-R2 | CGAGGATTTCCTTGTTG |
| KRAS_G12A | TGTGGTAGTTGGAGCTG |
| PIK3CA-M1043V | CATGATGTGCATCATTCA |
| PIK3CA-E545K | TCCTCTCTCTGAAATCACT |
| del_S752-F | GGAATTAAGAGAAGCAACA |
| KRAS_G12A_1 | AGGCACTCTTGCCTACGCCA |
| G719C | TCAAAAAGATCAAAGTGCTG |
| PIK3CA-E545A | CCATAGAAAATCTTTCTCCTGC |
| L861Q | TCTCTTCCGCACCCAGC |
| del_747-753 | CGTCGCTATCAAGGAAT |
| KRAS_G13D_1 | GGTAGTTGGAGCTGGTG |
| T790M | CCACCGTGCAGCTCATCA |
| dup_773H | AGCAGGCGGCACACGTGG |
| L858R | AAGATCACAGATTTTGGGC |
| KRAS_G13D | TCAAGGCACTCTTGCCTACG |
| del_747-750_ins_P | gtgGGCTTTCGGAGATGTTG |
| KRAS_Q61K | GATATTCTCGACACAGCAGGT |
| del_S751-R1 | TTGTTGGCTTTCGGAGA |
| R776H | ACAACCCCCACGTGTGCC |
| L858_1 | GCACCCAGCAGTTTGGCC |
| del_L747-F | TCCCGTCGCTATCAAGGAA |
| A859T | AGATCACAGATTTTGGGCTG |
| PIK3CA-K111E | CAATTTCTCGATTGAGGATCT |
| KRAS_Q61H | CCCTCATTGCACTGTACTCCTC |
| PIK3CA-D1029E | GCCTCTTGCTCAGTTTT |
| I759K | GAAAGCCAACAAGGAAA |
| D761Y | CAAAGCAGAAACTCACAT |
| K860I | CTCTTCCGCACCCAGCAGT |
| del_S752-R2 | TTCCTTGTTGGCTTTCGGA |
| dup739-744-1 | cAATTCCCGTCGCTATCAA |
| T790M_1 | AGCCGAAGGGCATGAGCTGC |
| L747S | TTCGGAGATGTTGCTTCTCTT |
| E709A | GCTCTCTTGAGGATCTTGAAGG |
| V717G | ACGCACCGGAGCCCAGC |
| del_A750-R | TGGCTTTCGGAGATGTT |
| del_I759-R2 | CAGAAACTCACATCGAGG |
| S768I_N_T | GAAGCCTACGTGAAGGCCA |
| KRAS_Q61L | gggTCTCGACACAGCAGGTC |
| PIK3CA-D1029Y | atcCGAAAGACCCTAGCCTTA |
| del_A750-F3 | TATCAAGGAATTAAGAGAAGC |
| E709K | TTGATCTTTTTGAATTCAGTTT |
| PIK3CA-H1047L_R | TTGTCCAGCCACCATGA |
| del_T751-R3 | GTTGGCTTTCGGAGATG |
| KRAS_G13R | cGGCACTCTTGCCTACGC |
| G719A | CGTGCCGAACGCACCGGAG |
| del_E746-F2 | cATTCCCGTCGCTATCAAGG |
| del_709-710_ins_D | CTCTTGAGGATCTTGAAGGA |
| KRAS_G12C_1 | TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT |
종합적으로, EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA의 유전자 정보, 113개의 돌연변이의 SNP ID, 상기 돌연변이를 증폭할 수 있는 67개의 프라이머 세트 및 프로브의 서열정보 및 서열번호는 하기 표에 나타난 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 이는 원발성 폐암과 전이성 폐암을 포함한다. 폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 비소세포폐암과 소세포폐암으로 구분된다. 폐암 중 약 80~85%인 비소세포폐암은 바람직하게는 편평상피세포암, 선암, 대세포암 등일 수 있다. 폐암 환자의 약 15~25%인 소세포암은 전반적으로 악성도가 강하여 발견 당시 림프관이나 혈액 순환을 통하여 다른 장기나 반대편 폐, 종격동으로 전이되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많다. 본 발명의 상기 키트는 특히 한국인 특이적 폐암 돌연변이를 효과적으로 검출 할 수 있다.
본 발명에서 진단이란 질병유무, 질병의 상태 및 질병의 예후를 확인하는 것을 포함하며, 질병상태 및 결정을 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 말한다. 본 발명에 있어서 EGFR, KRAS, BRAF 또는 PIK3CA의 돌연변이는 폐암의 발병과 밀접한 관련성을 나타내는 유전자 돌연변이로서 상기 유전자 돌연변이 여부의 확인은 폐암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
상기와 같은 키트는 유전자를 증폭하기 위한 다양한 방법에 적용될 수 있다.
본 발명에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제 (self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트 (hotstart) PCR, 네스티드 (nested) PCR 및 부스터 (booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간 (real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR (differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNAends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응 (inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트 (vectorette) PCR, TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. 또한, 상기 증폭은 돌연변이를 증폭시키기 위한 방법으로서 iPLEX 방법을 이용할 수 있다.
상기 본 발명의 키트는 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은
(1) EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여, 시료의 DNA를 증폭하는 단계; 및
(2) 상기 증폭산물에 대하여, 상기 EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 이용하여, 단일 염기 확장 (SBE, single base extension)를 수행하는 단계를 포함하는, 폐암의 진단 방법을 제공한다.
상기 방법은 전자 증폭 산물에 대하여 잔존 dNTP를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "시료"는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 말한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류 (예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다. 특히, 폐암의 경우, 상기 시료는 폐암 환자의 세포로부터 추출된 것일 수 있고, 폐암 치료 후 잔존 종양 검사를 위한 경우, 상기 유전자 시료는 종양 치료를 받은 환자의 암세포로부터 추출된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 폐암 진단용 키트를 이용하는 경우, 종래 사용하는 서열분석법보다 매우 높은 감도로, 113의 DNA 돌연변이를 동시에 확인할 수 있는 바, 임상 시료 사용량이 현저히 감소되며, 비용, 인력 및 소요 시간 감소 효과가 예상된다.
도 1는 본 발명의 진단 키트를 이용하여 확인할 수 있는 돌연변이의 개수를 간략하게 나타낸 도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, EGFR 유전자 돌연변이 75종, KRAS 유전자 돌연변이 19종, BRAF 유전자 돌연변이 4종, PIK3CA 유전자 돌연변이 15종을 진단할 수 있으며, 총 67개의 probe (assays)로 이루어진 8개의 pools로 구성되어 있다.
도 2는 본 발명의 진단 키트를 이용한 EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA 돌연변이 진단과정을 설명한 도이다. 순차적으로 8개의 다른 pools로 이루어진 primer mix를 이용한 multiplex PCR → SAP 반응 → 해당 UEP probe pool을 이용한 Single Base Extension 반응 → Resin 이용한 desalting → Chip에 spotting → MALDI-ToF를 이용한 flying → mutation prediction table을 이용한 돌연변이 분석의 과정을 거친다.
도 3은 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_L858R 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 5 %에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_T790M 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 5%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 5는 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_L858R 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 15%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_T790M 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 15%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 진단 키트에서 검출할 수 있는 indel 돌연변이를 도표화한 것이다.
도 2는 본 발명의 진단 키트를 이용한 EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA 돌연변이 진단과정을 설명한 도이다. 순차적으로 8개의 다른 pools로 이루어진 primer mix를 이용한 multiplex PCR → SAP 반응 → 해당 UEP probe pool을 이용한 Single Base Extension 반응 → Resin 이용한 desalting → Chip에 spotting → MALDI-ToF를 이용한 flying → mutation prediction table을 이용한 돌연변이 분석의 과정을 거친다.
도 3은 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_L858R 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 5 %에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_T790M 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 5%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 5는 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_L858R 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 15%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 진단 키트를 이용하여 EGFR_T790M 돌연변이를 확인한 도이다. 돌연변이 DNA가 전체 시료의 15%에서부터 돌연변이 진단이 가능함을 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 진단 키트에서 검출할 수 있는 indel 돌연변이를 도표화한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
Asan
_
Lung
_
Panel
을 이용한
EGFR
,
KRAS
유전자 돌연변이 진단
Asan_Lung_Panel을 이용한 EGFR, KRAS 유전자의 돌연변이 진단 유용성을 확인하기 위해, EGFR_L858R과 EGFR_T790M 돌연변이를 지닌 것으로 기존에 알려진 H1975 세포주 DNA를 해당 유전자에 대해 정상 염기서열을 지니는 세포주인 Beas2B에서 순수 분리한 DNA로 점차적으로 희석하여, H1975가 100%, 50%, 25%, 15%, 10%, 5%, 2.5%, 1% 그리고 0%가 되도록 준비하였다. 이 때, 각 DNA의 농도는 모두 2.5 ng/ul가 되도록 하였다.
이렇게 준비된 표준 양성 DNA 농도별 희석 시료를 얼마나 낮은 농도에서까지 돌연변이 DNA를 확인할 수 있는지를 Asan_Lung_Panel을 이용하여 확인하였다. 이 때, 센스와 안티센스 프라이머만 포함하는 일반적인 중합효소 증폭반응으로 합성된 산물을 유전자 염기서열 돌연변이 확인의 표준방법인 Sanger sequencing 방법으로도 확인하여, 두 검사법간의 돌연변이 진단 민감도를 비교하였다.
실시예
1-1.
Asan
_
Lung
_
Panel
에 포함된
primer
와
probe
제작
본 실시예에 이용된 프라이머 및 시발체의 염기 정보는 page 7에 위치한 table 참조. 해당 염기서열을 지니도록 제작된 각 primers를 table에 표시된 것처럼, 8개의 pool로 나누어 혼합하여 다중중합효소연쇄반응용 primer pool 8종 준비. 이 때, 각 pool에 포함되는 각각의 primer 농도는 0.5 ㎛가 되도록 준비한다. 또한 해당 pool로 증폭한 증폭산물에 포함된 각 유전자의 돌연변이를 확인할 수 있는 UEP probe가 포함된, 단일염기증폭반응용 UEP probe pool 8종을 준비. 이 때, 각 UEP probes의 농도를 7 ㎛ 또는 14 ㎛ 가 되도록 준비하는데, 이는 각 probe의 분자량에 의해 결정되며, 5700 dalton을 기준으로 그 이하이면 7 ㎛, 이상이면 14 ㎛가 되도록 준비한다.
실시예
1-2. 표준 양성
DNA
를 이용한
다중중합효소연쇄반응
증폭
표준 양성 DNA의 돌연변이 유무를 확인하기 위해, 실시예 1-1에서 준비한 primer pool 8종을 이용하여, 아래와 같은 조건으로 각 시약을 혼합하여, 다중중합효소연쇄반응을 수행하여 증폭산물을 합성하였다. 하나의 DNA에 대해, 8종의 primer pool 전부에 대해 다음의 실험을 수행한다.
먼저, 각각 0.5 μΜ이 되도록 혼합한 프라이머 믹스 1.2 ㎕를, 10X 중합효소연쇄반응 완충용액 (Qiagen) 0.5 ㎕, 25 mM MgC2 0.7 ㎕, 25 mM dNTP 혼합물 0.1 ㎕, HotStarTaq 중합효소 (Qiagen) 0.5 unit과 3차 증류수를 섞어서 총 3㎕로 맞춰준 후, 준비된 표준 양성 DNA 농도별 희석 시료 2 ㎕를 첨가하여 다음의 조건대로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 94℃ 에서 15분간 둔 후, 94℃ 에서 20초, 56℃ 에서 30초, 72℃에서 60초 반응시키는 조건으로 45 사이클 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 3분간 더 반응시켰다.
실시예
1-3:
iPLEX
반응을 이용한 각
probe
의 단일염기확장 반응 수행
다중중합효소연쇄 반응을 통해 증폭한 각 샘플시료의 증폭산물 5 ㎕에, SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물 (Sequenom) 2㎕ 를 추가하고 37?에서 40분 반응시켜, 증폭산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP (deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시킨 후, 85 ℃에서 10분 가열반응 시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 이 후, 실시예 1-1에서 준비한 UEP probe mix 1.2 ㎕ 를 Sequenom사에서 판매하는 iPLEX-Pro kit 혼합물 (0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 μl Thermosequenase)과 섞어서 2 ㎕ 추가한 후, 다음의 조건대로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 94℃ 에서 30초 둔 후, 94℃ 에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초 반응시키는 조건으로 40 사이클 수행한 후, 마지막으로 72 ℃에서 3분간 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 15㎕ 의 증류수와 resin을 첨가하고 20분간 반응시켜 염 제거 반응을 수행하여 반응을 완료시켰다. 이 후, SpectroChip II에 대략 10 nl 정도를 집적한 후, MALDI-ToF를 이용하여 분자량 차이를 확인하여, 8개 pools에 분산되어 있는 총 67개 probe의 genotype을 확인하여, 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과를 도 3과 4에 나타내었다. 또한, EGFR_L858R과 EGFR_T790M 돌연변이를 Sanger sequencing으로 확인한 결과를 도 5와 6에 나타내었다.
도 3과 4에 나타난 바와 같이, 전체 시료에서 EGFR 유전자 돌연변이 염기서열을 지니는 H1975 세포주의 gDNA가 5% 이상 존재하는 경우에서부터 해당 돌연변이를 확인할 수 있었다. 증폭산물 모두, Beas2B DNA 100%인 경우에는 정상유전자만 확인이 되고 있으며, 주형 DNA를 넣지 않은 water only의 경우에는 유전자의 증폭이 이루어지지 않아, 정상/돌연변이 모두 나타나지 않고 있음을 알 수 있다. 도 5와 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 동일 표준시료를 이용한 sanger sequencing 방법으로는 해당 돌연변이 진단 민감도가 15%임을 알 수 있으며, 이와 비교 시 Asan_Lung_Panel의 돌연변이 염기서열 진단민감도의 우수성을 비교확인 할 수 있다.
<110> THE ASAN FOUNDATION
<120> Lung Cancer Diagnotic kit comprising primer set and probe for
mutation related to lung cancer
<130> 1-80P
<160> 201
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-753_ins_S Sense primer
<400> 1
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-753_ins_S Anti-Sense primer
<400> 2
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_745-750 Sense primer
<400> 3
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_745-750 Anti Sense primer
<400> 4
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F Sense primer
<400> 5
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F Anti Sense primer
<400> 6
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E_1 Sense primer
<400> 7
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E_1 Anti Sense primer
<400> 8
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P539R Sense primer
<400> 9
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P539R Anti Sense primer
<400> 10
acgttggatg gctcaaagca atttctacac 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V769L Sense primer
<400> 11
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V769L Anti Sense primer
<400> 12
acgttggatg tagtccagga ggcagccgaa 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-Q546K Sense primer
<400> 13
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-Q546K Anti Sense primer
<400> 14
acgttggatg gctcaaagca atttctacac 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E Sense primer
<400> 15
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E Sense primer
<400> 16
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V786M Sense primer
<400> 17
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V786M Anti Sense primer
<400> 18
acgttggatg aagggcatga gctgcgtgat 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P18L Sense primer
<400> 19
acgttggatg atcatcaggt gaactgtggg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P18L Anti Sense primer
<400> 20
acgttggatg cggaggcatt ctaaagtcac 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-K111R Sense primer
<400> 21
acgttggatg attgaaccag taggcaaccg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-K111R Anti Sense primer
<400> 22
acgttggatg gaaagggaca acagttaagc 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E542Q_K Sense primer
<400> 23
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E542Q_K Anti Sense primer
<400> 24
acgttggatg gcaatttcta cacgagatcc 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-R-1 Sense primer
<400> 25
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-R-1 Anti Sense primer
<400> 26
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_K754-R3 Sense primer
<400> 27
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_K754-R3 Anti Sense primer
<400> 28
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12C Sense primer
<400> 29
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12C Anti Sense primer
<400> 30
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-T1025A Sense primer
<400> 31
acgttggatg tactccaaag cctcttgctc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-T1025A Anti Sense primer
<400> 32
acgttggatg ctctggaatg ccagaactac 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_746-F3 Sense primer
<400> 33
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_746-F3 Sense primer
<400> 34
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_P753-F Sense primer
<400> 35
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_P753-F Anti Sense primer
<400> 36
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup739-744 Sense primer
<400> 37
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup739-744 Anti Sense primer
<400> 38
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A755-R2 Sense primer
<400> 39
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A755-R2 Anti Sense primer
<400> 40
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12A Sense primer
<400> 41
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12A Anti Sense primer
<400> 42
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-M1043V Sense primer
<400> 43
acgttggatg tccatttttg ttgtccagcc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-M1043V Anti Sense primer
<400> 44
acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E545K Sense primer
<400> 45
acgttggatg tacacgagat cctctctctg 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E545K Anti Sense primer
<400> 46
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S752-F Sense primer
<400> 47
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S752-F Anti Sense primer
<400> 48
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12A_1 Sense primer
<400> 49
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12A_1 Anti Sense primer
<400> 50
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719C Sense primer
<400> 51
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719C Anti Sense primer
<400> 52
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E545A Sense primer
<400> 53
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-E545A Anti Sense primer
<400> 54
acgttggatg tacacgagat cctctctctg 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L861Q Sense primer
<400> 55
acgttggatg acgtactggt gaaaacaccg 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L861Q Anti Sense primer
<400> 56
acgttggatg attctttctc ttccgcaccc 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-753 Sense primer
<400> 57
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-753 Anti Sense primer
<400> 58
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13D_1 Sense primer
<400> 59
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13D_1 Anti Sense primer
<400> 60
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M Sense primer
<400> 61
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M Anti Sense primer
<400> 62
acgttggatg tagtccagga ggcagccgaa 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup_773H Sense primer
<400> 63
acgttggatg tagtccagga ggcagccgaa 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup_773H Anti Sense primer
<400> 64
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R Sense primer
<400> 65
acgttggatg acgtactggt gaaaacaccg 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858R Anti Sense primer
<400> 66
acgttggatg attctttctc ttccgcaccc 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13D Sense primer
<400> 67
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13D Anti Sense primer
<400> 68
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-750_ins_P Sense primer
<400> 69
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-750_ins_P Anti Sense primer
<400> 70
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61K Sense primer
<400> 71
acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61K Anti Sense primer
<400> 72
acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S751-R1 Sense primer
<400> 73
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S751-R1 Anti Sense primer
<400> 74
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R776H Sense primer
<400> 75
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R776H Anti Sense primer
<400> 76
acgttggatg aagggcatga gctgcgtgat 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858_1 Sense primer
<400> 77
acgttggatg gcagcatgtc aagatcacag 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L858_1 Anti Sense primer
<400> 78
acgttggatg cctccttctg catggtattc 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_L747-F Sense primer
<400> 79
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_L747-F Anti Sense primer
<400> 80
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A859T Sense primer
<400> 81
acgttggatg gcagcatgtc aagatcacag 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A859T Anti Sense primer
<400> 82
acgttggatg cctccttctg catggtattc 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-K111E Sense primer
<400> 83
acgttggatg gaaagggaca acagttaagc 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-K111E Anti Sense primer
<400> 84
acgttggatg attgaaccag taggcaaccg 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61H Sense primer
<400> 85
acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61H Anti Sense primer
<400> 86
acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-D1029E Sense primer
<400> 87
acgttggatg tactccaaag cctcttgctc 30
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-D1029E Anti Sense primer
<400> 88
acgttggatg ctctggaatg ccagaactac 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I759K Sense primer
<400> 89
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I759K Anti Sense primer
<400> 90
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D761Y Sense primer
<400> 91
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D761Y Anti Sense primer
<400> 92
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K860I Sense primer
<400> 93
acgttggatg attctttctc ttccgcaccc 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K860I Anti Sense primer
<400> 94
acgttggatg acgtactggt gaaaacaccg 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S752-R2 Sense primer
<400> 95
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S752-R2 Anti Sense primer
<400> 96
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup739-744-1 Sense primer
<400> 97
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dup739-744-1 Anti Sense primer
<400> 98
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M_1 Sense primer
<400> 99
acgttggatg tgttcccgga catagtccag 30
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M_1 Anti Sense primer
<400> 100
acgttggatg atctgcctca cctccaccgt 30
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L747S Sense primer
<400> 101
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L747S Anti Sense primer
<400> 102
acgttggatg cccagaaggt gagaaagtta 30
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709A Sense primer
<400> 103
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709A Anti Sense primer
<400> 104
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V717G Sense primer
<400> 105
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V717G Anti Sense primer
<400> 106
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-R Sense primer
<400> 107
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-R Anti Sense primer
<400> 108
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_I759-R2 Sense primer
<400> 109
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_I759-R2 Anti Sense primer
<400> 110
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 111
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S768I_N_T Sense primer
<400> 111
acgttggatg ctccaggaag cctacgtga 29
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S768I_N_T Anti Sense primer
<400> 112
acgttggatg atgagctgcg tgatgagctg 30
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61L Sense primer
<400> 113
acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61L Anti Sense primer
<400> 114
acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-D1029Y Sense primer
<400> 115
acgttggatg ctctggaatg ccagaactac 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-D1029Y Anti Sense primer
<400> 116
acgttggatg tactccaaag cctcttgctc 30
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-F3 Sense primer
<400> 117
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-F3 Anti Sense primer
<400> 118
acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709K Sense primer
<400> 119
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 120
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709K Anit Sense primer
<400> 120
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-H1047L_R Sense primer
<400> 121
acgttggatg tccatttttg ttgtccagcc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-H1047L_R Anti Sense primer
<400> 122
acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30
<210> 123
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_T751-R3 Sense primer
<400> 123
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_T751-R3 Anti Sense primer
<400> 124
acgttggatg tctggatccc agaaggtgag 30
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13R Sense primer
<400> 125
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G13R Anti Sense primer
<400> 126
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719A Sense primer
<400> 127
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719A Anti Sense primer
<400> 128
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F2 Sense primer
<400> 129
acgttggatg tctggatccc agaaggtgag 30
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F2 Anti Sense primer
<400> 130
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_709-710_ins_D Sense primer
<400> 131
acgttggatg ccaaccaagc tctcttgagg 30
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_709-710_ins_D Anti Sense primer
<400> 132
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12C_1 Sense primer
<400> 133
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12C_1 Anti Sense primer
<400> 134
acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30
<210> 135
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_747-753_ins_S UEP_SEQ
<400> 135
ttccttgttg gctttcg 17
<210> 136
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_745-750 UEP_SEQ
<400> 136
ttggctttcg gagatgt 17
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F UEP_SEQ
<400> 137
gttcccgtcg ctatcaag 18
<210> 138
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E_1 UEP_SEQ
<400> 138
cccactccat cgagatttc 19
<210> 139
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P539R UEP_SEQ
<400> 139
ctcagtgatt tcagagaga 19
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V769L UEP_SEQ
<400> 140
aagcctacgt gatggccagc 20
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-Q546K UEP_SEQ
<400> 141
ctccatagaa aatctttctc ct 22
<210> 142
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_V600E UEP_SEQ
<400> 142
ggtgattttg gtctagctac ag 22
<210> 143
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V786M UEP_SEQ
<400> 143
tctgcctcac ctccacc 17
<210> 144
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-P18L UEP_SEQ
<400> 144
catccacttg atgcccc 17
<210> 145
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-K111R UEP_SEQ
<400> 145
aggcaaccgt gaagaaa 17
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> PIK3CA-E542Q_K UEP_SEQ
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<213> Artificial Sequence
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<223> del_K754-R3 UEP_SEQ
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> A859T UEP_SEQ
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<223> I759K UEP_SEQ
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D761Y UEP_SEQ
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K860I UEP_SEQ
<400> 181
ctcttccgca cccagcagt 19
<210> 182
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_S752-R2 UEP_SEQ
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ttccttgttg gctttcgga 19
<210> 183
<211> 19
<212> DNA
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<223> dup739-744-1 UEP_SEQ
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caattcccgt cgctatcaa 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> T790M_1 UEP_SEQ
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<213> Artificial Sequence
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<223> L747S UEP_SEQ
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ttcggagatg ttgcttctct t 21
<210> 186
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709A UEP_SEQ
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gctctcttga ggatcttgaa gg 22
<210> 187
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V717G UEP_SEQ
<400> 187
acgcaccgga gcccagc 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-R UEP_SEQ
<400> 188
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_I759-R2 UEP_SEQ
<400> 189
cagaaactca catcgagg 18
<210> 190
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S768I_N_T UEP_SEQ
<400> 190
gaagcctacg tgaaggcca 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_Q61L UEP_SEQ
<400> 191
gggtctcgac acagcaggtc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-D1029Y UEP_SEQ
<400> 192
atccgaaaga ccctagcctt a 21
<210> 193
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_A750-F3 UEP_SEQ
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tatcaaggaa ttaagagaag c 21
<210> 194
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E709K UEP_SEQ
<400> 194
ttgatctttt tgaattcagt tt 22
<210> 195
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA-H1047L_R UEP_SEQ
<400> 195
ttgtccagcc accatga 17
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<220>
<223> del_T751-R3 UEP_SEQ
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<223> KRAS_G13R UEP_SEQ
<400> 197
cggcactctt gcctacgc 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719A UEP_SEQ
<400> 198
cgtgccgaac gcaccggag 19
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_E746-F2 UEP_SEQ
<400> 199
cattcccgtc gctatcaagg 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del_709-710_ins_D UEP_SEQ
<400> 200
ctcttgagga tcttgaagga 20
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_G12C_1 UEP_SEQ
<400> 201
tataaacttg tggtagttgg agct 24
Claims (18)
- EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), KRAS(Kirsten ras), BRAF (B type Raf kinase) 및 PIK3CA(phosphoinositide-3-kinase catalytic-alpha polypeptide) 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 EGFR 유전자의 돌연변이는 액손 18, 19, 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발생하는, 75개의 돌연변이에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 EGFR 유전자의 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 KRAS 유전자의 돌연변이는 코돈 12, 13 및 61으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발생하는, 19개의 돌연변이에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 KRAS 유전자의 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BRAF 유전자의 돌연변이는 V600 위치에서 발생하는, 4개의 돌연변이에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 BRAF 유전자의 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 액손 1, 10 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발생하는, 15개의 돌연변이에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 하기의 표에 나타난 돌연변이로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 점돌연변이 (point mutation) 또는 다중 돌연변이 (multiple mutation)인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이는 한국인 폐암환자에서 특이적으로 발생하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 135 내지 201의 염기서열로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물을 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), KRAS(Kirsten ras), BRAF (B type Raf kinase) 및 PIK3CA(phosphoinositide-3-kinase catalytic-alpha polypeptide) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 추가로 포함한는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 표에 나타난 서열번호 1 내지 134의 염기서열로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 청구항 14의 표의 프라이머 세트 및 프로브를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
- 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 폐암 진단용 키트.
- (1) EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여, 시료의 DNA를 증폭하는 단계; 및
(2) 상기 증폭산물에 대하여, 상기 EGFR, KRAS, BRAF 및 PIK3CA 유전자의 돌연변이에 상보적인 프로브를 이용하여, 단일 염기 확장 (SBE, single base extension)를 수행하는 단계를 포함하는, 폐암의 진단 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 청구항 14의 표의 프라이머 세트 및 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐암의 진단 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (2)
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| WO2017181134A3 (en) * | 2016-04-15 | 2017-12-21 | F. Hoffman-La Roche Ag | Detecting cancer driver genes and pathways |
| WO2022119423A1 (ko) * | 2020-12-04 | 2022-06-09 | 주식회사 제노픽스 | 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 |
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2014
- 2014-02-28 KR KR1020140024366A patent/KR101720050B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| WO2017181134A3 (en) * | 2016-04-15 | 2017-12-21 | F. Hoffman-La Roche Ag | Detecting cancer driver genes and pathways |
| WO2022119423A1 (ko) * | 2020-12-04 | 2022-06-09 | 주식회사 제노픽스 | 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 |
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