JP2004065201A - アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子の発言を検出するためのプライマーを提供すること。
【解決手段】配列番号１〜２２に示す配列から選ばれる配列を持った、一対のプライマー対が提供される。
【選択図】　　なし

Description

【０００１】
【関連出願】
この出願は、２００１年２月１２日に出願された米国出願第０９／７８１，６９３号および２００１年１月１７日に出願された米国仮出願第６０／２６２，３１２号の一部継続出願であり、これらに基づく優先権を主張するものである。これら親出願を、本明細書の一部として本願に援用する。
【０００２】
【発明の背景】
健康な細胞に比較して腫瘍細胞で過剰に発現する種々の遺伝子が同定されている。このような遺伝子の同定は、抗腫瘍薬の開発および癌診断のための薬物ターゲットを提供することが期待される。肝臓腫瘍細胞におけるステロイド受容体（例えばアンドロゲン受容体）の数は、それらに隣接した健康な肝臓細胞に比較して増大するように思える。
【０００３】
ステロイドホルモンは、一般に、それらの特異的核内受容体に結合して複合体を形成し、次いで該複合体が転写因子として作用することによって、その生理学的効果を発揮する。この複合体は、ステロイド応答性遺伝子のプロモータにおける特異的なヌクレオチド配列に結合して、これら遺伝子の転写を促進する。
【０００４】
【発明の概要】
本発明は、（隣接する正常細胞に比較して）肝細胞腫細胞で過剰発現されるヒトタンパク質の発見に基づいており、該ヒトタンパク質はアンドロゲン受容体に結合して、該受容体がアンドロゲン応答性遺伝子をトランス活性化する能力を増強する。こうして、この新たに発見されたヒトタンパク質は「アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質」または「ＡＲＣＡＰ」と称される。開始コドンおよび停止コドンに下線を付した全長のヒトＡＲＣＡＰ　ｃＤＮＡ（配列番号１に示す）を以下に示す。
【０００５】

本発明は、ストリンジェントな条件下で一本鎖プローブにハイブリダイズする鎖（その配列は配列番号１、または配列番号１に相補的である）を有する単離された核酸を特徴とする。このような核酸は、少なくとも１５（例えば、少なくとも３０、５０、１００、２００、５００または　１０００）ヌクレオチドの長さであることができる。「ストリンジェントな条件」の下でのハイブリダイゼーションとは、６５℃、０．５×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションに続いて、４５℃、０．１×ＳＳＣで洗浄することを意味する。
【０００６】
「単離された核酸」とは、その構造が天然に存在する如何なる核酸の構造とも同一ではなく、または天然に存在するゲノム核酸の三つの遺伝子よりも多くに広がる如何なる断片の構造とも同一ではない核酸である。従って、この用語は例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有し、且つそれが天然に存在している生物のゲノムにおける当該分子の一部に隣接する両方のコード配列に隣接していないＤＮＡ、（ｂ）得られる分子が天然に存在する如何なるベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一でないように、ベクターまたは原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡの中に組み込まれた核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造された断片、または制限断片のような別々の分子、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子（即ち、融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換えヌクレオチド配列をカバーする。この定義から特別に排除されるのは、異なる（ｉ）ＤＮＡ分子、（ｉｉ）トランスフェクトされた細胞または（ｉｉｉ）細胞クローン、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリーのようなＤＮＡライブラリー中に存在するものである。
【０００７】
本発明の核酸は、ＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡが組織または細胞において発現または過剰発現されるかどうかを決定することによって、肝臓癌を診断するために使用することができる。この核酸は、ＰＣＲに基づく検出法におけるプライマーとして、または核酸ブロット（例えばノーザンブロット）における標識されたプローブとして使用することができる。
【０００８】
以下は、ヒトＡＲＣＡＰ　ｃＤＮＡ配列から選択されたＰＣＲプライマーの幾つかの例である：

また、各プライマーの長さが２０〜４０（例えば２０〜３５、および２０〜３０）ヌクレオチドの、第一のプライマーおよび第二のプライマーからなる一対の増幅プライマーも本発明の範囲内である。前記第一のプライマーは配列番号２を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号３を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号４を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号５を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号６を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号７を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１５もしくは１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号８を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号９を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号１７を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１８、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１９を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号２０を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１３、１４、１５、１６もしくは１９を含むか；　前記第一のプライマーは配列番号２１を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１４、１５、１６もしくは１９を含むか；または　前記第一のプライマーは配列番号２２を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１９を含む。
【０００９】
上記プライマー対の一つを用いてヒト核酸テンプレートの増幅から得られた核酸は、ヒトＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００１０】
更に、肝臓癌を診断するためのキットも本発明の範囲内である。このキットは、上記で述べた一以上のプライマーまたはプローブを含んでいる。それは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、または表面に一以上の上記プライマーまたはプローブが配置または固相化された固相支持体のような、他の成分を含むことができる。
【００１１】
本発明は、肝臓癌を検出する方法を提供する。この方法は、被験者からサンプル（例えばバッフィーコートサンプルのような血液サンプル）を準備することと、例えば、それぞれ上記プライマー対およびプローブの一つを用いた増幅およびハイブリダイゼーションによってＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルを決定することとを含む。当該サンプル中のＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルが正常な被験者から調製したサンプルにおけるよりも高ければ、それは、当該被験者が肝臓癌を有することを示す。被験者は、肝臓癌を発症するリスクが高い人物、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎もしくは肝硬変の患者、または該患者の親族、或いは肝臓癌患者の親族であることができる。思いがけず、この方法を使用して９８％の正確さで肝臓癌が診断されたが、これはαフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルに基づく通常使用されている方法の７０％の精度よりも遥かに良好である。
【００１２】
本発明はまた、肝臓癌を段階付けする方法を提供する。この方法は、肝臓癌患者からサンプル（例えばバッフィーコートサンプルのような血液サンプル）を準備することと、例えば、それぞれ上記プライマー対およびプローブの一つを用いた増幅およびハイブリダイゼーションによってＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルを決定することとを含む。患者の癌の段階は、前記サンプル中のＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルを、種々の段階の肝臓ガンを有する他の患者から調製されたサンプルにおける発現レベルと比較することによって決定される。
【００１３】
本発明の他の特徴または利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１４】
【発明の詳細な記述】
本発明は新たに同定されたＡＲＣＡＰ遺伝子に関し、これは正常細胞に比較して肝細胞性癌細胞中で過剰発現される。示差的発現に加えて、ＡＲＣＡＰはアンドロゲン受容体に結合してそのトランス活性化作用を増強することが分かった。これらの所見は、ＡＲＣＡＰがアンドロゲン受容体複合体を介して、アンドロゲン応答性の分裂促進遺伝子（即ち、そのプロモータがアンドロゲン応答性要素を含む遺伝子）を活性化すること、ＡＲＣＡＰの過剰発現は、アンドロゲン受容体に媒介されたアンドロゲン応答性分裂促進遺伝子のトランス活性化を促進することによって癌に導くこと、並びに、ＡＲＣＡＰの発現または活性化の阻害は、これらアンドロゲン応答性分裂促進遺伝子の発現を減少させて、癌細胞をより正常な発現型に復帰させることを示唆している。結局、ＡＲＣＡＰは新規な癌薬物ターゲットである。
【００１５】
ＡＲＣＡＰ分子は、障害または疾患状態のマーカーとして、疾病状態前駆型のためのマーカーとして、質病状態素因のためのマーカーとして、薬物活性のマーカーとして、または被験者の薬理ゲノミクスプロファイルのマーカーとして有用である。ここで述べる方法を使用することにより、インビボにおいて、ＡＲＣＡＰ分子の存在、不存在および／または量を検出し、また一以上の生物学的状態と相関させてもよい。例えば、ＡＲＣＡＰ分子は、一以上の障害または疾病状態のためのマーカーとして、または疾病状態に導く症状のための代理マーカーとして働くことができる。ここで用いる「代理マーカー」とは、疾病もしくは障害の不存在または存在、または疾病もしくは障害の進行（例えば、肝臓腫瘍の存在または不存在）と相関する客観的な生化学的マーカーである。このようなマーカーの存在または量は、疾患とは独立である。従って、これらマーカーは、特定の治療コースが疾病状態または障害を低下させる上で有効であるかどうかを指示するように働く。代理マーカーは、疾病状態または障害の存在または範囲を標準の方法で評価するのが困難なとき（例えば初期段階の腫瘍）、または潜在的に危険な臨床的末期に到達する前に疾病の進行を評価するのが望ましいときに特に有用である（例えば、心筋梗塞または完全なＡＩＤＳ発症のような望ましくない臨床的結果よりも充分前に、代理マーカーとしてコレステロールレベルを使用して心臓血管系疾患の評価を行ってもよく、またＨＩＶ・ＲＮＡレベルを代理マーカーとして用いてＨＩＶ感染の分析を行ってもよい）。当該技術における代理マーカーの使用例には、Ｋｏｏｍｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｊ．　Ｍａｓｓ．　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　３５：　２５８−２６４；　およびＪａｍｅｓ　（１９９４）　ＡＩＤＳ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｎｅｗｓ　Ａｒｃｈｉｖｅ　２０９に記載されたものが含まれる。
【００１６】
ＡＲＣＡＰ分子はまた、薬力学的マーカーとしても有用である。ここで使用する「薬力学的マーカー」とは、薬物効果と特別に相関する客観的な生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物がそのために投与される疾病状態または障害には関係しない。従って、該マーカーの存在または量は、被験者における薬物の存在または活性を示すものである。例えば、薬力学的マーカーは、生物学的組織内において当該薬物のレベルに関連して該マーカーが発現もしくは転写され、または発現もしくは転写されない点において、生物学的組織における当該薬物の濃度を示すことができる。このようにして、薬の分布または取り込みは、薬力学的マーカーによってモニターされ得る。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は薬物の代謝産物の存在または量に比例するので、マーカーの存在または量は、インビボにおける当該薬物の相対的な分解率を示すことができる。薬力学的マーカーは、特に薬の投与量が少ないときに、薬効検出の感度を上げるために特に有用である。少量の薬物でも、マーカー（たとえば、ＡＲＣＡＰマーカー）の転写または発現を複数回活性化するのに十分であり得るから、増幅されたマーカーは、薬物自身よりも迅速に検出される量で存在し得る。また、マーカーは、マーカー自身の性質によって更に容易に検出され得る；例えば、ここに記載された方法を使用することにより、抗ＡＲＣＡＰ抗体を、ＡＲＣＡＰタンパク質マーカーの免疫的検出系に使用してもよく、或いは、ＡＲＣＡＰ特異的に放射ラベルされたプローブを、ＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡマーカーを検出するために使用してもよい。更に、薬力学的マーカーの使用は、直接観察可能な範囲を超えた薬物処置による危険の機構的予測を提供することができる。当業者による薬力学的マーカーの使用例は、Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．　ＵＳ　６，０３３，８６２；　Ｈａｔｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｅｎｖ．　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．　９０：２２９−２３８；　Ｓｃｈｅｎｔａｇ　（１９９９），　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．　Ｐｈａｒｍ．　５６　Ｓｕｐｐｌ．　３：Ｓ２１−Ｓ２４；およびＮｉｃｏｌａｕ　（１９９９），　Ａｍ．　Ｊ．　Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．　Ｐｈａｒｍ．　５６　Ｓｕｐｐｌ．　３：Ｓ１６−Ｓ２０に記載されている
本発明のＡＲＣＡＰ分子は、薬理ゲノミクス的マーカーとしても有用である。ここで使用される「薬理ゲノミクス的マーカー」とは、患者における特殊な臨床的薬物応答性または薬物感受性に関する客観的な生化学的マーカーである（ＭｃＬｅａｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９），　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　３５：１６５０−１６５２）。薬理ゲノミクス的マーカーの存在またはその量は、薬物を投与する前の、特殊な薬物または薬物類に対する患者の予想応答に関系する。患者において、一以上の薬理ゲノミクス的マーカーの存在または量を評価することによって、患者に最も適切な治療薬、またはかなりの割合で成功が予想される治療薬が選択されるであろう。例えば、特異的腫瘍マーカーとしての患者のＲＮＡもしくはタンパク質（例えばＡＲＣＡＰタンパク質またはＲＮＡ）の存在または量に基づいて、患者に存在しそうな特異的腫瘍の治療に最適化される薬物または治療コースを選択できる。同様に、ＡＲＣＡＰ・ＤＮＡにおける特異的な配列変異の存在または不存在は、ＡＲＣＡＰ薬物応答に相関するであろう。従って、薬理ゲノミクス的マーカーの使用は、各患者に対して治療薬を予め投与することなく、最も適切な治療の適用を可能にする。
【００１７】
ＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルは、一対のプライマー、例えば配列番号２と配列番号１０，　１１，　１２，　１３，　１４，　１５　または１６；配列番号３と配列番号１１，　１２，　１３，　１４，　１５　または１６；配列番号４と配列番号１２，　１３，　１５または１６；配列番号５　と配列番号１２，１３，　１５または１６；配列番号６と配列番号１２，　１３，　１５または１６；配列番号７と配列番号１５または１６；配列番号８と配列番号１６；配列番号９と配列番号１６；配列番号１７と配列番号１１，　１８，　１２，　１３，　１４，　１５，　１６または１９；配列番号２０と配列番号１３，　１４，　１５，　１６または１９；配列番号２１と配列番号１４，　１５，　１６または１９；或いは配列番号２２と配列番号１９を用いた増幅によって決定することができる。或いは、ＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルは、核酸プローブ、例えば上記プライマー対の一つを用いてヒト核酸テンプレートの増幅から得られた核酸とのハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット）によって決定してもよい。
【００１８】
増幅テンプレートは、精製もしくは未精製のＤＮＡ（即ちｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（即ち、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）であることができる。それは、患者由来の生物学的サンプル（例えば肝臓生検のような生検、バッフィーコートサンプルのような血液サンプル）から得ることができる。
【００１９】
典型的には、プライマーの長さは１４〜４０ヌクレオチドである（ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　１９９５，　ｐａｇｅ　３７）。また、上記の例（即ち、配列番号２〜２２）より数ヌクレオチドだけ短いが、ヒトＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡを検出するために使用できるプライマーも、本発明の範囲内である。このようなプライマーは、それらがヒトＡＲＣＡＰ核酸テンプレートから、予想されるサイズのＰＣＲ産物を産生するために使用できるかどうかを決定することによって同定することができる。上記の例より長いプライマー（例えば２０〜４０、２０〜３５、または２０〜３０ヌクレオチド）もまた、ヒトＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡを検出するために使用することができる。例えば、ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子配列に従って、５’末端または３’末端に追加のヌクレオチドを追加することができる。非ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子配列を、５’末端に加えることができる。非ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子配列の一例は、増幅生成物のクローニングを容易にするために使用される制限部位を含んだ配列である。
【００２０】
増幅生成物は、これを電気泳動によりゲル（例えばアガロースまたはポリアクリルアミドゲル）上で分離し、またはプローブにハイブリダイズさせることによって可視化することができる。このプローブは、膜（ナイロン膜またはニトロセルロース膜）、ガラス、またはプラスチックポリマーのような固相支持体の表面に固定化することができる。膜へのプローブの固定化は、８０℃でのベーキングまたはＵＶ架橋によって達成することができる。また、プローブは、ガラス表面にコートされた材料（例えばポリリジン）に共有結合させることもできる。或いは、これらのプローブは固相基板上の正確な位置でデノボ合成してもよい。Ｓｃｈｅｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：　４６７；　Ｋｏｚａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２（７）：７５３；　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２４（２）：　３８０；　Ｌｉｐｓｈｕｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９（３）：　４４２；　Ｐｅａｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９１：　５０２２；　Ｆｏｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４：　５５５；　ａｎｄ　Ｆｏｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ＷＯ　９２／１００９２を参照されたい。この検出を容易にするために、ラベルされた増幅プライマーを用いて、ラベルされた増幅生成物を生じさせてもよい。或いは、ラベリングは増幅の後に化学的または酵素的に行うこともできる。ラベリング試薬の例には、蛍光分子（例えばフルオレセインおよびローダミン）、放射性アイソトープ（例えば^３２Ｐおよび^１２５Ｉ）、比色定量試薬、および化学発光試薬が含まれるが、これらに限定されない。膜またはプラスチックポリマー上での比色定量検出のために、ビオチンおよびジゴキシゲニンが屡々使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５のような蛍光ラベルが、ガラス上での検出のために広範に使用される。加えて、人工的タグテール（例えばタンパク質またはその抗体）を、プライマーの５’末端またはプローブの末端に結合してもよい。Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ　ａｎｄ　Ｇａｉｔ，　２０００，　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　６５（１６）：　４９００を参照されたい。
【００２１】
以下の具体的な例は単なる例示であり、如何なる意味でも本願の開示の他の部分を限定しないものとして解釈されるべきである。更なる詳細がなくても、当業者は、ここでの説明に基づいて本発明をその全範囲において利用できるものと思われる。ここで引用した全ての刊行物は、その全体が本明細書の一部をなすものとして本願に援用される。
【００２２】
＜血球からのバッフィーコートの単離＞
１．　サンプル当たり１０ｍｌの全血を抜き取る。
【００２３】
２．　２０°Ｃで１５分間の３，５００　ｒｐｍでの遠心分離（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）により、血球を分離する。
【００２４】
３．　スケール付の滴下器で白血球（ＷＢＣ）を除去し、次いで細胞を１５−ｍＬの遠心管に移す。
【００２５】
４．　三倍容量のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）を白血球の中に加え（ＷＢＣ：ＰＢＳ＝１：３）、これを均一に混合する。
【００２６】
５．　４　ｍＬの混合されたＷＢＣを、２　ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ：Ｓａｍｐｌｅ　＝　１：２）で満たした１５−ｍＬの遠心管に徐々に加える。ＷＢＣとＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅとの間の界面を乱さないで、ＷＢＣがＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に層状になるのを保証する。
【００２７】
６．　２０℃で１５分間、３，５００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。
【００２８】
７．　スケール付滴下器（２　ｍＬ）で白血球の第二の層を除去し、該細胞を１５−ｍＬの遠心管に移す。
【００２９】
８．　２　ｍＬのＰＢＳを白血球の中に加え（ＷＢＣ：ＰＢＳ＝１：１）、次いで均一に混合する。
【００３０】
９．　２０℃で１５分間、３，５００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。
【００３１】
１０．　上清を捨てる。
【００３２】
１１．　１　ｍＬのＰＢＳを用いて白色ペレットを最懸濁させる。
【００３３】
１２．　２０℃で２０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。
【００３４】
１３．　上清を捨てて、ペレット（バッフィーコートと言う）を二つの別々のエッペンドルフピペット中に保持する。このバッフィーコートは、必要であれば−２０℃で保存することができる。
【００３５】
＜全ＲＮＡの単離＞
１．　先に調製したバッフィーコートと共に、１　ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬を１．５−ｍＬ　エッペンドルフピペット中に加える。
【００３６】
２．　バッフィーコートを数回ピペッティングして、細胞を際懸濁させる。
【００３７】
３．　細胞を１８ｇの針に２０回通過させることにより、細胞を分離させる。
【００３８】
４．　２００μＬのクロロホルムを細胞混合物（ＴＲＩｚｏｌ試薬の１／５容量）に加え、これを激しく攪拌する。
【００３９】
５．　細胞混合物を氷上（４℃）で１０分間維持する。
【００４０】
６．　４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。
【００４１】
７．　該溶液の上層（略６００μＬのＲＮＡ溶液）を、１．５−ｍＬのエッペンドルフピペットに移す。
【００４２】
８．　等容量のイソプロパノール（略６００μＬ）をＲＮＡ溶液に添加し、これを均一に混合する。
【００４３】
９．　この混合物を氷上（４℃）で３０分間保持する。
【００４４】
１０．　４℃で３０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。
【００４５】
１１．　上清を除去し、ＲＮＡペレットを保存する。
【００４６】
１２．　このＲＮＡペレットに、２００μＬの７５％　Ａｌｃｌ−ＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボン酸（Ｄｉｅｔｈｙｌ　Ｐｙｒｏｃａｂｏｎａｔｅ）、Ｓｉｇｍａ）を添加する。
【００４７】
１３．　４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する（ＰＫ−１３１Ｒ，　ＡＬＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ．ｒ．ｌ．，　Ｉｔａｌｙ）。．
１４．　工程１３を繰り返して上清を除去し、ＲＮＡペレットを保存する。
【００４８】
１５．　２０μＬのｄｄＨ_２Ｏ−ＤＥＰＣを加えて、ＲＮＡを際懸濁させる。
【００４９】
１６．　このＲＮＡ溶液を４℃で一晩保持する。
７５％アルコール−ＤＥＰＣ：７５　ｍＬのアブソリュートアルコール２５　ｍＬのｄｄＨ_２Ｏ−ＤＥＰＣと混合して、７５％　Ａｌｃ−ＤＥＰＣを作製し、４　°Ｃに保持する。
ｄｄＨ_２Ｏ−ＤＥＰＣ：　１　ｍＬのＤＥＰＣを１，０００　ｍＬのｄｄ　Ｈ_２Ｏと混合してｄｄＨ_２Ｏ−ＤＥＰＣを作製し、オートクレーブした後に４°Ｃで保持する。
【００５０】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
１．　調製された１μＬのＲＮＡを９９μＬのｄｄＨ_２Ｏと混合し、ＲＮＡ／ＤＮＡ計算機（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ　Ｐｒｏ　Ｃｌａｓｓｉｃ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＲＮＡの濃度を決定する。各ＲＴ−ＰＣＲについて、１０μｇの全ＲＮＡが必要とされる。
【００５１】
２．　ＲＮＡをＨ_２Ｏ−ＤＥＰＣと混合して、１７μＬの最終容量にする。
【００５２】
３．　６５℃で１０分間、ＲＮＡを編成させる。
【００５３】
４．　逆転写混合物を調製する。
【００５４】
５×Ｆｉｒｓｔ緩衝液　　　　　　　　　　　　　６．
ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．
０．１　Ｍ　ＤＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　２．
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　（１　ｍｇ／ｍＬ）　　　　　　　　　　１．
ＲＮａｓｅ阻害剤　（２７．５　ｕ／ｍＬ）　　　　　　　　１．
Ｍ−ＭＬＶ　逆転写酵素　（２００　ｕ／ｍＬ）　　　　　　　１．
変性された全ＲＮＡ　（１０　ｍｇ）　　　　　　　　１７．
８．　３７℃で６０分間インキュベートし、続いて６５℃で１０分間インキュベートして、ｃＤＮＡを得る（−２０℃で保存できる）。
【００５５】
９．　ＰＣＲ混合物を調製する。
【００５６】
ｃＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
順方向プライマー　　　　　　　　　　　０．１．
逆方向プライマー　　　　　　　　　　　０．１．
ｄＮＴＰｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２．
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ　（５　ｕ／ｍＬ）　　　　　０．５．
１０×ＰＣＲ緩衝液　　　　　　　　　　　　　２．５．
ｄｄＨ_２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．６．
１０．１．０％アガロースゲル中において、１１０Ｖで２０分間の電気泳動によってＰＣＲ生成物を検出する。
【００５７】
＜他の実施例＞
この明細書に開示した全ての特徴は、如何なる組み合わせで組み合わせてもよい。この明細書に開示した夫々の特徴は、同一、均等、または類似の目的に資する別の特徴で置き換えてもよい。従って、特に述べない限り、開示された各特徴は均等または類似の特徴の一例に過ぎない。
【００５８】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、またその精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途および条件に適合させるために本発明の種々の変更、改変を行うことができる。従って、他の実施例もまた冒頭の特許請求の範囲内にあるものである。

Claims (25)

1. 第一のプライマーおよび第二のプライマーからなる増幅プライマー対であって：
   前記第一のプライマーは配列番号２を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号３を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号４を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号５を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号６を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号７を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１５もしくは１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号８を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号９を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号１７を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１８、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１９を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号２０を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１３、１４、１５、１６もしくは１９を含むか；
   前記第一のプライマーは配列番号２１を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１４、１５、１６もしくは１９を含むか；または
   前記第一のプライマーは配列番号２２を含み、且つ前記第二のプライマーは配列番号１９を含み；
   夫々のプライマーは２０〜４０ヌクレオチドの長さである増幅プライマー対。
2. 請求項１に記載のプライマー対であって、各プライマーが２０〜３５ヌクレオチドの長さであるプライマー対。
3. クレーム２に記載のプライマー対であって、各プライマーが２０〜３０ヌクレオチドの長さであるプライマー対。
4. 請求項１に記載のプライマー対であって、
   前記第一のプライマーは配列番号２であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号３であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号４であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号５であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１４、１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号６であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１２、１３、１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号７であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１５もしくは１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号８であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号９であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１６であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号１７であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１１、１８、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１９であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号２０であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１３、１４、１５、１６もしくは１９であるか；
   前記第一のプライマーは配列番号２１であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１４、１５、１６もしくは１９であるか；または
   前記第一のプライマーは配列番号２２であり、且つ前記第二のプライマーは配列番号１９である増幅プライマー対。
5. 請求項１のプライマー対を用いたヒト核酸テンプレートの増幅から得られた核酸。
6. 請求項５に記載の核酸であって、前記プライマーは２０〜３５ヌクレオチドの長さである核酸。
7. 請求項６に記載の核酸であって、前記プライマーは２０〜３０ヌクレオチドの長さである核酸。
8. 肝臓癌を検出する方法であって：
   被験者からのサンプルを準備することと；
   請求項１のプライマー対を用いた増幅により、または請求項５の核酸とのハイブリダイゼーションにより、アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質の遺伝子発現レベルを決定することとを含み、
   前記サンプルにおける前記遺伝子発現レベルにより、それが正常な被験者から調製されたサンプル中での発現レベルよりも高いときに、前記被験者が肝臓癌を有していることが示される方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。
11. 請求項８に記載の方法であって、前記被験者はＢ型肝炎患者またはその親族である方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。
14. 請求項８に記載の方法であって、前記患者はＣ型肝炎患者またはその親族である方法。
15. 請求項１４に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。
17. 請求項８に記載の方法であって、前記被験者は肝硬変患者またはその親族である方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。
20. 請求項８に記載の方法であって、前記被験者は肝臓癌患者の親族である方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
22. 請求項２１に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。
23. 肝臓癌の段階を決定する方法であって：
    肝臓癌患者からのサンプルを準備することと；
    請求項１のプライマー対を用いた増幅により、または請求項５の核酸とのハイブリダイゼーションにより、アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質の遺伝子発現レベルを決定することとを含み、
    種々の段階の肝臓癌を有する他の患者から調製されたサンプル中の発現レベルと比較したときに、前記遺伝子発現レベルによって、前記患者の癌の段階が示される方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、前記サンプルは血液サンプルである方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、前記サンプルはバッフィーコートサンプルである方法。