KR20040010401A - 안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질 - Google Patents

안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질 Download PDF

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챵타이-제이
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타이페이-베터란스 제너랄 호스피탈
타겟젠, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 ARCAP 유전자의 발현을 검출하기 위한 프라이머와 프로브에 관한 것이다.

Description

안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질 {ANDROGEN RECEPTOR COMPLEX-ASSOCIATED PROTEIN}
본 발명은 2001년 2월 12일자 미국 특허 출원 제09/781,693호 및 2001년 1월 17일자 미국 특허 가출원 제60/262,312호를 우선권으로 주장하는 부분 계속 출원으로, 그 명세서의 내용을 모두 참조로 인용하고 있다.
건강한 세포에 비해 종양 세포에서 과다발현되는 유전자가 다수 동정되고 있다. 이러한 유전자의 동정이 항암제의 개발 및 암의 진단을 위한 약제 표적물을 제공할 것으로 기대되고 있다. 간암 세포에서 스테로이드 수용체(예를 들면, 안드로겐 수용체)의 수가 그들과 인접한 건강한 간세포에 비해 증가되어 있는 것으로 나타났다.
스테로이드 호르몬은 일반적으로 이들의 특정 핵 수용체에 결합하여 결국 전사 인자로서 작용하는 복합체를 형성함으로써, 그들의 생리학적 효능을 발휘하게 된다. 이 복합체는 스테로이드-반응성 유전자의 프로모터 내의 특정 뉴클레오타이드 서열(스테로이드 반응성 요소)에 결합하여 이들 유전자의 전사를 용이하게 한다.
본 발명은 ARCAP 유전자의 발현을 검출하기 위한 프라이머와 프로브를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 간암 세포에서 과다발현되는 인간 단백질이 안드로겐 수용체에 결합하며, 이 수용체가 안드로겐-반응성 유전자를 트렌스활성화(transactivate)할 수 있는 능력을 증대시킨다는 발견에 따른 것이다. 따라서, 이 새로이 발견된 인간 단백질을 "안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질(androgen receptor complex-associtaed protein)" 또는 "ARCAP"라고 명명한다. 인간 ARCAP cDNA(SEQ ID NO: 1라 지정)은 시작 코돈과 종결 코돈을 밑줄로 표시하여 다음에 나타내었다:
CCGGCTCAGGCAGAGCCATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCCACACCTGTTGTGGGACGTGAGGAAAAGGTCCCTCGGGCTGGAGGACCCGTCCCGGCTGCGGAGTCGCTACCTGGGAAGAAGAGAATTTATCCAAAGATTAAAACTTGAAGCAACCCTTAATGTGCATGATGGTTGTGTTAATACAATCTGTTGGAATGACACTGGAGAATATATTTTATCTGGCTCAGATGACACCAAATTAGTAATTAGTAATCCTTACAGCAGAAAGGTTTTGACAACAATTCGTTCAGGGCACCGAGCAAACATATTTAGTGCAAAGTTCTTACCTTGTACAAATGATAAACAGATTGTATCCTGCTCTGGAGATGGAGTAATATTTTATACCAACGTTGAGCAAGATGCAGAAACCAACAGACAATGCCAATTTACGTGTCATTATGGAACTACTTATGAGATTATGACTGTACCCAATGACCCTTACACTTTTCTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGTTAGGTGGTTTGATACACGCATCAAAACTAGCTGCACAAAAGAAGATTGTAAAGATGATATTTTAATTAACTGTCGACGTGCTGCCACGTCTGTTGCTATTTGCCCACCAATACCATATTACCTTGCTGTTGGTTGTTCTGACAGCTCAGTACGAATATATGATCGGCGAATGCTGGGCACAAGAGCTACAGGGAATTATGCAGGTCGAGGGACTACTGGAATGGTTGCCCGTTTTATTCCTTCCCATCTTAATAATAAGTCCTGCAGAGTGACATCTCTGTGTTACAGTGAAGATGGTCAAGAGATTCTCGTTAGTTACTCTTCAGATTACATATATCTTTTTGACCCGAAAGATGATACAGCACGAGAACTTAAAACTCCTTCTGCGGAAGAGAGAAGAGAAGAGTTGCGACAACCACCAGTTAAGCGTTTGAGACTTCGTGGTGATTGGTCAGATACTGGACCCAGAGCAAGGCCGGAGAGTGAACGAGAACGAGATGGAGAGCAGAGTCCCAATGTGTCATTGATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATCAAGATGGTTTGAAGAAGCAAGTGAGGTTGCACAAAGCAATAGAGGACGAGGAAGATCTCGACCCAGAGGTGGAACAAGTCAATCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTCCCATCAAGTCCTGATTTGGAAGTGAGTGAAACTGCAATGGAAGTAGATACTCCAGCTGAACAATTTCTTCAGCCTTCTACATCCTCTACAATGTCAGCTCAGGCTCATTCGACATCATCTCCCACAGAAAGCCCTCATTCTACTCCTTTGCTATCTTCTCCAGACAGTGAACAAAGGCAGTCTGTTGAGGCATCTGGACACCACACACATCATCAGTCTGATAACAATAATGAAAAGCTGAGCCCCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGTTTTAAGTTTGCACTACAGCACAGAAGGAACAACTACAAGCACAATAAAACTGAACTTTACAGATGAATGGAGCAGTATAGCATCAAGTTCTAGAGGAATTGGGAGCCATTGCAAATCTGAGGGTCAGGAGGAATCTTTCGTCCCACAGAGCTCAGTGCAACCACCAGAAGGAGACAGTGAAACAAAAGCTCCTGAAGAATCATCAGAGGATGTGACAAAATATCAGGAAGGAGTATCTGCAGAAAACCCAGTTGAGAACCATATCAATATAACACAATCAGATAAGTTCACAGCCAAGCCATTGGATTCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTCAATCTTGATCGCTCTTGTGGGGTTCCAGAAGAATCTGCTTCATCTGAAAAAGCCAAGGAACCAGAAACTTCAGATCAGACTAGCACTGAGAGTGCTACCAATGAAAATAACACCAATCCTGAGCCTCAGTTCCAAACAGAAGCCACTGGGCCTTCAGCTCATGAAGAAACATCCACCAGGGACTCTGCTCTTCAGGACACAGATGACAGTGATGATGACCCAGTCCTGATCCCAGGTGCAAGGTATCGAGCAGGACCTGGTGATAGACGCTCTGCTGTTGCCCGTATTCTAATAAACTCTTTTTGGCAAGCACTTAAATGTTCTGAAATTTGTATAAGACATTTATTATATTTTTTTCTTTACAGAGCTTTAGTGCAATTTTAAGGTTATGGTTTTTGGAGTTTTTCCCTTTTTTTGGGATAACCTAACATTGGTTTGGAATGATTGTGTGCATGAATTTGGGAGATTGTATAAAACAAAACTAGCAGAATGTTTTTAAAACTTTTTGCCGTGTATGAGGAGTGCTAGAAAATGCAAAGTGCAATATTTTCCCTAACCTTCAAATGTGGGAGCTTGGATCAATGTTGAAGAATAATTTTCATCATAGTGAAAATGTTGGTTCAAATAAATTTCTACACTTGCCATTTGCATGTTTGTTGCTTTCTAATTAAAGAAACTGGTTGTTTTAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC (SEQ ID NO:1)
본 발명은 단일 가닥 프로브에 가혹한 조건하에서 혼성화시키는 가닥을 가지는 분리된 핵산인, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1의 상보물인 서열을 제공하고자 한다. 이러한 핵산의 길이는 적어도 15개(예를 들면 적어도 30, 50, 100, 200, 500, 또는 1000개)의 뉴클레오타이드가 될 수 있다.
"가혹한 조건"하에서 혼성화하는 것은 65℃, 0.5×SSC에서 혼성화하고, 45℃, 0.1×SSC에서 세척한다는 것을 의미한다.
“분리 핵산"이란 임의의 3개 이상의 개별 유전자에 걸쳐 있는 천연 발생 핵산 또는 천연 발생 유전자 핵산의 임의의 단편의 구조와 동일하지 않은 구조의 핵산이다. 따라서, 이 용어는 예를 들면 (a) 천연 발생 게놈 DNA 분자의 일부의 서열을 가지나, 천연 발생한 유기체의 게놈 내의 분자의 일부의 측면에 연결된 양쪽의 코딩 서열은 측면에 연결되지 않은 DNA; (b) 결과로서 얻어지는 분자가 천연 발생 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않도록 하는 방식으로 원핵세포 또는 진핵세포의 벡터 또는 게놈 DNA 내로 혼입된 핵산; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산된 단편, 또는 제한 단편과 같은 개별적인 분자; 및 (d) 혼성 유전자(hybrid gene), 즉 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오타이드 서열을 포괄한다. 이 정의에서는 특별히 제외되는 것은 상이한 (i) DNA 분자, (ii) 트랜스펙션 세포, 또는 (iii) 세포 클론의 혼합물에 존재하는 핵산으로, 예를 들면 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리와 같은 DNA 라이브러리 내에서 발생되는 것이 있다.
본 발명의 핵산은 ARCAP mRNA가 조직 또는 세포에서 발현되거나 과다발현되는 지를 판단하여 간암을 진단하는 데 사용할 수 있다. 핵산은 PCR-계열 측정 방법에서 프라이머 또는 핵산 블롯(예를 들면 노던 블롯)에서 표지된 프로브로 사용할 수 있다.
다음은 인간 ARCAP cDNA 서열로부터 선택된 PCR 프라이머 쌍의 일부 예이다:
(1)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCCA (SEQ ID NO:2)와
ACAGTTCCATCTTCACCACAAGAGAG (SEQ ID NO:10);
(2)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT (SEQ ID NO:11);
(3)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATCTGA (SEQ ID NO:12);
(4)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(5)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA (SEQ ID NO:14);
(6)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(7)ATGTCTCGGGGTGGCTCCTACCC (SEQ ID NO:2)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(8)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT (SEQ ID NO:11);
(9)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA (SEQ ID NO:12);
(10)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(11)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA (SEQ ID NO:14);
(12)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(13)ATGACTGTACCCAATGACCCTTACAC (SEQ ID NO:3)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(14)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG (SEQ ID NO:4)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA (SEQ ID NO:12);
(15)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG (SEQ ID NO:4)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(16)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG (SEQ ID NO:4)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(17)ACAGCTCAGTACGAATATATGATCGG (SEQ ID NO:4)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(18)CTACTGGAATGGTTGCCGTT (SEQ ID NO:5)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA (SEQ ID NO:12);
(19)CTACTGGAATGGTTGCCGTT (SEQ ID NO:5)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(20)CTACTGGAATGGTTGCCGTT (SEQ ID NO:5)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(21)CTACTGGAATGGTTGCCGTT (SEQ ID NO:5)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(22)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC (SEQ ID NO:6)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATACTGA (SEQ ID NO:12);
(23)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC (SEQ ID NO:6)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(24)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC (SEQ ID NO:6)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(25)ATGCAGAGAATGTCTGATATGTTATC (SEQ ID NO:6)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(26)TCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTC (SEQ ID NO:7)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(27)TCCAACTCAGGAGAAAGAAATGACCTC (SEQ ID NO:7)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(28)GCCACTGGGCCTTCAGCTCA (SEQ ID NO:8)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(29)GTGCTAACTTTGTAATGAGTG (SEQ ID NO:9)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(30)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
CCGATCATATATTCGTACTGAGCTGT (SEQ ID NO:11);
(31)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
AACGGGCAACCATTCCAGTAG (SEQ ID NO:18);
(32)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
GACCGTAGGAAGAGTTGAAATATCTGA (SEQ ID NO:12);
(33)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(34)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA (SEQ ID NO:14);
(35)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(36)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
CACTCATTACAAAGTTAGCAC (SEQ ID NO:19);
(37)CTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTGT (SEQ ID NO:17)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(38)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC (SEQ ID NO:20)와
ACTGGTTCACCTGTCCCTGGTTTGG (SEQ ID NO:13);
(39)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC (SEQ ID NO:20)와
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA (SEQ ID NO:14);
(40)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC (SEQ ID NO:20)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(41)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC (SEQ ID NO:20)와
CACTCATTACAAAGTTAGCAC (SEQ ID NO:19);
(42)TCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTC (SEQ ID NO:20)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(43)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT (SEQ ID NO:21)와
GAGGTCATTTCTTTCTCCTGAGTTGGA (SEQ ID NO:14);
(44)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT (SEQ ID NO:21)와
TGAGCTGAAGGCCCAGTGGC (SEQ ID NO:15);
(45)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT (SEQ ID NO:21)와
CACTCATTACAAAGTTAGCAC (SEQ ID NO:19);
(46)CCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGT (SEQ ID NO:21)와
TTATTCCTCATCCTCATTTTCATTCTCTTG (SEQ ID NO:16);
(47)GCCACTGGGCCTTCAGCTCA (SEQ ID NO:22)와
CACTCATTACAAAGTTAGCAC (SEQ ID NO:19).
또한, 본 발명은 제1 프라이머와 제2 프라이머로 이루어진 한 쌍의 증폭 프라이머에 관한 것으로, 각 프라이머의 길이는 20-40(예를 들면 20-35 및 20-30)의 뉴클레오타이드인 것이다. 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:2를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:3을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:4를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:5를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:6을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:7을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:15, 또는 16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:8을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:9를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:17을 함유하고 상기 제2프라이머는 SEQ ID NO:11, 18, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 19을 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:20을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:13, 14, 15, 16 또는 19를 함유하거나; 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:21을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:14, 15, 16, 또는 19를 함유하거나; 또는 상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:22를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:19를 함유한다.
상기 프라이머 쌍 중 하나에 의해 인간 핵산 주형을 중폭하여 얻어낸 핵산은 인간 ARCAP mRNA의 검출을 위한 혼성화 프로브로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 간암을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 상기에 기재된 하나 이상의 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 이것은 DNA 중합효소, PCR 버퍼, 또는 상기의 프라이머 또는 프로브의 하나 이상을 지역화하거나 고정화하는 고체 담체와 같은 기타 성분을 포함할 수 있다.
본 발명은 간암을 검사하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대상으로부터 샘플(예를 들면 버피코트 샘플과 같은 혈액 샘플)을 채취하는 단계; 및 예를 들면 상기 프라이머 쌍 및 프로브 중 하나로 각각 증폭하고 혼성화하여 ARCAP 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 샘플에서 ARCAP 유전자 발현 수준이 정상 대상에서 얻어진 샘플보다 더 높은 경우는 이 대상이 간암을 가진 것으로 판단된다. 이 대상은 예를 들면 B형 간염, C형 감염 또는 간경화 환자 또는 이의 유사 환자 또는 간암 유사 환자와 같이 간암으로 발병할 위험이 높은 사람일 수도 있다. 놀랍게도, 본 방법을 이용하면 간암은 98% 이상의 정확도로 진단되어서, 종래에 사용되어온 α-페토프로테인(AFP) 수준에 기준한 방법의 70% 정확도 보다도 훨씬 우수한 것이다.
본 발명은 또한 간암의 진행 단계를 판별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 간암 환자로부터 샘플(예를 들면 버피코트 샘플과 같은 혈액 샘플)을 채취하는 단계; 및 예를 들면 상기 프라이머 쌍 및 프로브 중 하나로 각각 증폭하고 혼성화하여 ARCAP 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 각 환자의 암의 진행단계는 다양한 단계의 간암을 가진 다른 환자로부터 얻은 샘플의 ARCAP 유전자 발현 수준과 이들의 샘플에서 얻은 ARCAP 유전자 발현 수준을 비교함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 또는 이점은 이하의 상세한 설명과 첨부한 특허청구범위에서 명확해질 것이다.
상세한 설명
본 발명은 정상적인 간세포에 비해 간세포의 종양 세포에서 과다발현되는, 새롭게 동정된 ARCAP 유전자에 관한 것이다. 이러한 차등 발현 외에, ARCAP는 안드로겐 수용체에 결합하고 안드로겐 수용체의 트렌스활성화 작용을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 이러한 관찰은 ARCAP가 안드로겐 수용체 복합체를 통해 안드로겐 반응성인 유사분열 촉진성 유전자(즉, 프로모터가 안드로겐 반응성 인자를 함유하는 유전자)를 활성화시킨다는 것을 시사한다. 또한, ARCAP의 과다발현이 안드로겐-반응성 유사분열 촉진성 유전자의 안드로겐 수용체-중재된 트렌스활성화를 용이하게 하여 암으로 발병하도록 한다는 것과, ARCAP 발현 또는 활성을 억제하는 것으로, 이들 안드로겐-반응성 유사분열 촉진성 유전자의 발현이 억제되고 암세포가 보다 정상적인 표현형으로 전환될 수 있다는 것을 시사한다.
ARCAP 분자는 이상증 또는 질병의 상태를 말해주는 마커, 질병의 전구체를 말해주는 마커, 질병에 걸리기 쉬운 소질을 말해주는 마커, 약물의 활성을 말해주는 마커 또는 대상의 약물유전학적 프로파일의 마커로서 유용한 것이다. 상기에 기재된 방법을 이용하여, ARCAP 분자의 존재 유무 및/또는 양을 검출할 수 있고,이들은 생체내에서 하나 이상의 생물학적 단계와 관련되어 있을 수 있다. 예를 들면 ARCAP 분자는 하나 이상의 이상증 또는 질병의 상태 또는 질병 상태에까지 도달하고 있는 증상을 위한 대리 마커로 작용할 수도 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, "대리 마커(surrogate marker)"는 질병 또는 이상증의 존재 유무와 관련되거나 또는 질병 또는 이상증의 경과(예를 들면 간암의 존재 유무)와 관련된 객관적인 생화학적 마커이다. 이러한 마커의 존재 또는 양은 이들 질병과 독립적인 것이다. 따라서 이들 마커는 치료의 특정 단계에서 질병의 단계 또는 이상증을 경감하는 데 효과적인 지를 판단하기 위해 활용할 수 있다. 대리 마커는 특히 질병 단계 또는 이상증의 존재나 정도가 표준 방법론을 통해 검사하기 어려운 경우(예를 들면 초기 단계의 종양), 또는 매우 위험한 임상 결과에 도달하기 전에 질병의 진행의 판단이 바람직한 경우(예를 들면, 심근쇄약 또는 완전히 발병된 AIDS의 바람직하지 않은 임상적 발현 휠씬 전에, 심장혈관계 질병의 판별은 콜레스테롤 수준을 대리 마커로 사용할 수 있고, HIV 감염의 분석을 HIV RNA 수준을 대리 마커로 사용할 수 있음)에 사용할 수 있다. 본 발명의 해당 분야에서 대리 마터를 사용하는 예는 Koomenet al.(2000)J. Mass. Spectrom. 35: 258-264; and James (1994)AIDS Treatment News Archive209에서 기재된 바를 포함한다.
ARCAP 분자는 약물동력학적 마커로도 유용한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약물동력학적 마커(pharmacodynamic marker)"라는 것은 약물 효능과 특히 관련되는 객관적인 생화학적 마커이다. 이러한 약물동력학적 마커의 존재 또는 양은 약물이 투여되는 질병의 단계 또는 이상증과 관련이 없다. 따라서, 마거의 존재 또는 양은 대상에서 약물의 존재 또는 활성을 가리킬 수가 있다. 예를 들면 약물동력학적 마커는 생물의 조직에서 약물의 농도를 가리켜서, 이 마커가 약물의 수준에 따라 이 조직에서 발현하거나 전사하거나 또는 발현하지 않거나 전사하지 않거나 하는 것을 지시할 수 있다. 이러한 방식으로, 약물의 분포 또는 흡수를 약물동력학적 마커에 의해 감시할 수 있다. 유사하게, 약물동력학적 마커의 존재 또는 양은 약물의 대사산물의 존재 또는 양과 관련될 수도 있어서, 마커의 존재 또는 양이 생체내에서 약물의 상대적 감소율을 가리킬 수 있다. 약물동력학적 마커는 특히 약물을 낮은 함량으로 투여하는 경우, 약물의 효능을 검출하는 감도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 약물을 소량으로 투여하여도 마커(예를 들면 ARCAP 마커)의 전사 또는 발현의 복수 라운드를 활성화시키기에 충분하기 때문에, 증폭된 마커는 약물 자체보다 훨씬 용이하게 검출할 수 있는 함량이 될 것이다. 또한, 마커는 마커 자체의 상태에 기인하여 보다 쉽게 검출될 수 있다. 예를 들면 상기에 기재된 방법을 이용하여, 항 ARCAP 항체를 ARCAP 단백질 마커로 면역-계 검출 시스템에서 사용하거나, 또는 ARCAP-특이적 방사성 표지된 프로브를 ARCAP mRNA를 검출하기 위해 사용할 수도 있다. 또한, 약물동력학적 마커를 사용하는 것은 직접 관찰의 가능한 범주를 벗어난 약물 치료에 기인한 대사에 따른 위험을 예견할 수 있도록 한다. 본 기술 분야에서 약물동력학적 마커의 사용의 예는 Matsudaet al.US 6,033,862; Hattiset al.(1991) Env. Health Perspect. 90: 229-238; Schentag (1999)Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3: S21-S24; and Nicolau (1999)Am, J. Health-Syst. Pharm.56 Suppl. 3: S16-S20에 기재된 것이 있다.
또한, ARCAP 분자는 약물유전학적 마커로 유용한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바에 따르면, "약물유전학적 마커(pharmacogenomic marker)"는 대상에서 특정 임상적 약물 반응 또는 민감성과 관련된 객관적인 생화학적 마커이다(예를 들면, McLeodet al.(1999)Eur. J. Cancer35:1650-1652 참조). 약물유전학적 마커의 존재 또는 함량은 약물의 투여 전에 특정 약물 또는 일군의 약물에 대한 대상의 예상된 반응에 관한 것이다. 대상에서 하나 이상의 약물유전학적 마커의 존재 또는 함량을 검사하여, 대상에게 가장 적합하거나 또는 성공률이 우수하도록 예상되는 한 약물 치료를 선택할 수 있다. 예를 들면 대상에서 특정 종양 마커를 위한 RNA 또는 단백질(예를 들면 ARCAP 단백질 또는 RNA)의 존재 또는 함량에 따라 치료의 과정 또는 약물을 대상에서 존재하는 것으로 의심되는 특정 종양의 치료에 최적화되도록 선택할 수도 있다. 따라서 이러한 약물유전학적 마커를 사용하여, 치료를 집행해 보지 않고도, 각 대상의 가장 최적의 치료를 적용할 수 있게 된다.
ARCAP 유전자의 발현 수준은 한 쌍의 프라이머, 예를 들면, SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16; SEQ ID NO:3과 SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 또는 16; SEQ ID NO:4와 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16; SEQ ID NO:5와 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16; SEQ ID NO:6와 SEQ ID NO:12, 13, 15, 또는 16; SEQ ID NO:7과 SEQ ID NO:15 또는 16; SEQ ID NO:8과 SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:9와 SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17과 SEQ ID NO:11, 18, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 19; SEQ ID NO:20과 SEQ ID NO:13, 14, 15, 16, 또는 19; SEQ ID NO:21과 SEQ ID NO:14, 15, 16, 또는 19; 또는 SEQ ID NO:22와 SEQ ID NO:19로 증폭하여 결정할수 있다. 또한, 핵산 프로브, 예를 들면 바로 전에 기재된 프라이머쌍 중 하나로 인간 핵산 주형을 증폭하여 얻어진 핵산으로 혼성화(예를 들면 노던 블롯)에의해 결정할 수 있다.
증폭 주형은 정제되거나 또는 정제되지 않은 형태의 DNA(즉, cDNA) 또는 RAN(즉, 총 RNA 또는 mRNA)가 될 수 있다. 이것은 환자로부터 생물학적 샘플(예를 들면 간생검과 같은 생검 또는 버피코트 샘플과 같은 혈액 샘플)로부터 얻을 수 있다.
통상, 프라이머의 길이는 14-40 뉴클레오타이드이다(PCR Application Manual, Boehringer Mannheim, 1995, page 37). 또한, 본 발명은 상기 예들(즉, SEQ ID NO:2-22)보다 짧은 소수의 뉴클레오타이드이나, 여전히 인간 ARCAP mRAN를 검출하는 데 사용될 수 있는 프라이머에 관한 것이다. 이러한 프라이머는 인간의 ARCAP 핵산 주형으로부터 예정된 크기의 PCR 산물을 생산하는 데 사용될 수도 있는 지를 판단하여 동정할 수 있다. 상기 예들 보다 긴 프라이머(예를 들면 길이가 20-40, 20-35, 또는 20-30의 뉴클레오타이드)는 인간 ARCAP mRNA를 측정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 추가의 뉴클레오타이드를 인간 ARCAP 유전자 서열에 따라 5'-말단 또는 3'-말단 중 하나에 추가할 수도 있다. 인간이 아닌 ARCAP 유전자 서열을 4'-말단에 추가할 수도 있다. 예를 들면 인간이 아닌 ARCAP 서열은 증폭 산물의 클로닝을 가능하게 하는 데 사용된 제한 자리를 함유한 서열이다.
증폭 산물은 전기 영동을 통해 겔(예를 들어, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔)에서 분해시키거나 또는 이것을 프로브에 혼성화시켜 가시화 할수도 있다.프로브는 막(나이론-막 또는 니트로셀룰로즈 막), 유리, 또는 플라스틱 폴리머와 같은 고체 담체의 표면에서 고정화시킬 수도 있다. 프로브를 막에 고정화하는 것은 80℃에서 소성 또는 UV 가교결합에 의해 달성할 수 있다. 프로브는 유리의 표면에 코팅된 물질(예를 들면 폴리-라이신)에 공유결합으로 연결될 수 있다. 또한, 프로브는 처음부터 고체 기판상의 정확한 위치에서 합성될 수 있다. Schena et al., 1995, Science 270: 467; Kozal et al., 1996, Nature Medicine 2(7): 753; Cheng et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(2): 380; Lipshutz et al., 1995, BioTechniques 19(3): 442; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5022; Fodor et al., 1993, Nature 364: 555; and Fodor et al., WO 92/1009 참조. 검출을 용이하게 하기 위해서, 표지된 증폭 산물을 표지된 증폭 프라이머로 생성할 수 있다. 또한, 표지화는 증폭한 다음 화학적, 효소에 의해 실시할 수도 있다. 표지화 시약의 예로는 형광성 분자(예를 들면, 플루오르세인 및 로다민), 방사활성 동위원소(예를 들면32P 및125I), 비색계 시약, 및 화학발광시약을 포함하나 이것으로 제한되는 것은 아니다. 바이오틴 및 다이옥스게닌은 막 또는 플라스틱 폴리머 상에 비색계 검출을 위해 종종 사용된다. Cy3 및 Cy5와 같은 형광성 라벨은 유리 상에서 검출을 위해 널리 사용되는 것이다. 또한, 인공 태그 테일(예를 들면 단백질 또는 이의 항체)은 프라이머의 5'-말단 또는 프로브의 임의의 말단에 접합될 수 있다. Stetsenko and Gait, 2000, J. Org. Chem. 65(16): 4900 참조.
이하의 실시예는 단순히 예시를 위한 것이고 어떠한 의미로도 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 추가의 노력없이도, 당업자라면 본 명세서에 기재된 설명을 기초로 본 발명을 충분하게 활용할 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 인용된 모든 공보는 전문이 참고로 인용된다.
혈액 세포로부터 버피코트를 분리
1. 샘플당 10 ㎖ 전혈을 채취
2. 20℃ 3,500 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 15분간 원심분리하여 혈액 세포를 분리
3. 백혈구(WBC)를 scaled-dropper로 제거하고 세포를 15 ㎖의 원심분리관으로 이동시켰다.
4. 3 용량의 인산염 버퍼 식염수(PBS)를 백혈구에 첨가(WBC:PBS = 1:3)하고, 충분히 혼합.
5. 4 ㎖의 혼합된 WBC를 서서히 2 mL Ficoll-Paque ( Ficoll-paque:Sample = 1:2 )로 충전된 15-mL의 원심분리관에 첨가. WBC와 Ficoll-Paque 사이의 계면을 휘젓지 말고, WBC가 Ficoll-Paque의 상부의 층을 형성하도록 주의할 것.
6. 20℃, 3,500 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 15분간 원심분리.
7. 백혈구를 scaled dropper (2 mL)로 제거하고 세포를 15-mL 원심분리관에 이동.
8. 2 mL PBS를 백혈구에 첨가하고(WBC:PBS = 1:1), 완전하게 혼합.
9. 20℃, 3,500 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 15분간 원심분리.
10. 상층액을 버림.
11. 백색 펠릿을 1 mL PBS로 재부유.
12. 20℃, 12,000 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 20분간 원심 분리.
13. 상층액을 버리고 펠릿(버피코트로 칭함)을 2개의 별개의 에펜도르프에 넣음. 버피코트는 필요한 경우 -20℃에서 저장.
총 RNA의 분리
1. 1 mL TRIzol 시약을 이전에 준비한 버피코트와 함께 1.5-mL 에펜도르프에 첨가.
2. 세포를 재부유시키기 위해 버피코트를 수회 피펩시킴.
3. 세포를 18g의 바늘을 통해 20회 통과시켜 파손.
4. 200㎕의 클로로포름을 세포 혼합물(1/5 용량의 TRIzol 시약)에 첨가하고, 이들을 격력하게 와동시킴.
5. 세포 혼합물을 얼음(4℃)에서 10분간 유지.
6. 4℃, 12,000 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 10분간 원심분리.
7. 용액의 상층(RNA 용액의 대략 대략 600㎕)을 1.5-mL 에펜도르프에 이송.
8. 동량의 이소프로판올(약 600 ㎕)을 RNA 용액에 첨가하고 이들을 균일하게 혼합.
9. 혼합물을 얼음(4℃)에서 30분간 유지.
10. 4℃, 12,000 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)에서 30분간 원심분리.
11. 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 저장.
12. 200 ㎕ 75% Alcl-DEPC(디에틸 피로카보네이트, Sigma)을 RNA 펠릿에 첨가.
13. 4℃, 12,000 rpm (PK-131R, ALC International S.r.l., Italy)을 10 분간 원심분리.
14. 단계 11을 반복하여 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 저장.
15. 10 ㎕의 ddH2O-DEPC을 첨가하여 RNA를 재부유.
16. RNA 용액을 4℃에서 하룻밤 유지.
75% 알콜-DEPC: 75 mL의 순수 알콜을 25 mL의 ddH2O-DEPC와 혼합하여 75% Alc-DEPC을 제조하고, 4 ℃에서 유지.
ddH2O-DEPC: 1 mL의 DEPC을 1,000 mL의 dd H2O와 혼합하여ddH2O-DEPC을 제조하고, 건조후 4℃에서 유지.
RT-PCR
1. 1 ㎕의 제조된 RNA를 99 ㎕의 ddH2O와 혼합하여, RNA/DNA Calculator (GeneQuant Pro Classic; Amersham Biosciences)를 이용하여 RNA의 농도를 결정. 각 RT-PCR에 대해, 10 ㎍의 총 RNA가 필요함.
2. RNA를 H2O-DEPC와 혼합하여 최종 용량 17 ㎕로 만듬.
3. RNA를 65℃에서 10분간 변성.
4. 역전사 혼합물의 제조
5×1차 버퍼6λ
dNTPs 2λ
0.1 M DTT 2λ
Oligo(dT)(1 ㎍/㎕)1λ
RNase 억제제 (27.5 u/㎕) 1λ
M-MLV 역전사효소 (200 u/㎕) 1λ
변성된 총 RNA (10 ㎍) 17λ
5. 37℃에서 60분간 배양한 후 65℃에서 10분간 배양하여 cDNA (-20℃에서 저장)를 얻음.
6. PCR 혼합물을 제조:
cDNA 1λ
전방향 프라이머 0.1λ
역방향 프라이머 0.1λ
dNTPs 0.2λ
Taq DNA 중합효소 (5 u/㎕) 0.5λ
10×PCR 버퍼 2.5λ
ddH2O 20.6λ
7. 110V에서 20분간 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 PCR 산물을 검출
기타 실시예
본 명세서 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로도 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각각의 요소는 동일하거나, 등가의 또는 유사한 목적을 위한 다른 특징으로 대체될 수도 있다. 따라서, 달리 언급하지 않는 한, 개시된 각 요소는 등가의 또는 유사한 요소를 가진 일반군의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자라면 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상과 범주에서 이탈함 없이, 다양한 변경과 수정을 하여 다양한 용도와 조건에 적용할 수 있을 것이다. 또한 다른 실시예들은 다음의 특허청구범위의 범주 내에 있는 것이다.
본 발명은 ARCAP 유전자의 발현을 검출하기 위한 프라이머와 프로브를 제공할 수 있다.

Claims (25)

  1. 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 이루어진 한 쌍의 증폭 프라이머로서,
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:2를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:3을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:4를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:5를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:6을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:7을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:15 또는 16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:8을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:9를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16을 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:17을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ IDNO:11, 18, 12, 13, 14, 15, 16 또는 19를 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:20을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:13, 14, 15, 16 또는 19를 함유하거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:21을 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:14, 15, 16 또는 19를 함유하거나; 또는
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:22를 함유하고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:19를 함유하며,
    각 프라이머의 길이는 20-40의 뉴클레오타이드인 한 쌍의 증폭 프라이머.
  2. 제1항에 있어서,
    각 프라이머의 길이가 20-35의 뉴클레오타이드인 한 쌍의 증폭 프라이머.
  3. 제2항에 있어서,
    각 프라이머의 길이가 20-30의 뉴클레오타이드인 한 쌍의 증폭 프라이머.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:2이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:3이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:4이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:5이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:6이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:12, 13, 15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:7이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:15 또는 16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:8이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:9이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:16이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:17이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:11, 18, 12, 13, 14, 15, 16 또는 19이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:20이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:13, 14, 15, 16 또는 19이거나;
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:21이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:14, 15, 16 또는 19이거나; 또는
    상기 제1 프라이머는 SEQ ID NO:22이고 상기 제2 프라이머는 SEQ ID NO:19인
    한 쌍의 증폭 프라이머.
  5. 제1항에 따르는 한 쌍의 증폭 프라이머로 인간 핵산 주형을 증폭하여 얻어지는 핵산.
  6. 제5항에 있어서,
    각 프라이머의 길이가 20-35의 뉴클레오타이드인 핵산.
  7. 제6항에 있어서,
    각 프라이머의 길이가 20-30의 뉴클레오타이드인 핵산.
  8. 대상으로부터 샘플을 채취하는 단계; 및
    제1항에 따르는 한 쌍의 프라이머로 증폭하거나 또는 제5항에 따르는 핵산으로 혼성화하여 안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 간암 검사 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 검사 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 검사 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 대상이 B형 간염 환자 또는 유사 환자인 간암 검사 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 검사 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 검사 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 대상이 C형 간염 환자 또는 유사 환자인 간암 검사 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 검사 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 검사 방법.
  17. 제8항에 있어서,
    상기 대상이 간경화 환자 또는 유사 환자인 간암 검사 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 검사 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 검사 방법.
  20. 제8항에 있어서,
    상기 대상이 간암 유사 환자인 간암 검사 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 검사 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 검사 방법.
  23. 간암 환자로부터 샘플을 채취하는 단계; 및
    제1항에 따르는 한 쌍의 프라이머로 증폭하거나 또는 제5항에 따르는 핵산으로 혼성화하여 안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 샘플에서 상기 유전자 발현 수준을 다양한 단계의 다른 간암 환자로부터 얻은 샘플의 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 이 환자의 암의 진행 단계를 지시하는
    간암 진행 단계 검사 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플인 간암 진행 단계 검사 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 샘플이 버피코트 샘플인 간암 진행 단계 검사 방법.
KR1020030051537A 2002-07-25 2003-07-25 안드로겐 수용체 복합체-결합 단백질 KR20040010401A (ko)

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