JP4471803B2 - 全身性エリテマトーデス患者血液細胞で発現亢進している遺伝子群、およびその利用 - Google Patents
全身性エリテマトーデス患者血液細胞で発現亢進している遺伝子群、およびその利用 Download PDFInfo
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Description
SLEの原因としては、遺伝的要因等により、リンパ球等の免疫機能に関わる細胞機能に異常を生じ、不適切な免疫応答が起こることが示唆されているが、正確な原因は不明である。そのため、SLEを正確に診断する方法や、これを完治する治療法は確立されておらず、SLEの疾患原因遺伝子を特定し、SLEのより確実な診断方法や治療方法の早期開発が強く望まれている。
ところで、発現レベル情報が疾患の診断にあるいは治療に有益な情報を提供する遺伝子(マーカー遺伝子)は、これまで種々の疾患に対し同定されてきた。さらには、複数のマーカー遺伝子を組み合わせて遺伝子群として情報を処理することにより、診断および/または治療における効果の精度を飛躍的に高められることが、明らかになっている。例えば、Golubらは、約6000種に及ぶ遺伝子について、リンパ球の内での発現状態をDNAアレイを用いて測定し、ALLとAMLの判別に必要な約200種の遺伝子群を同定した(非特許文献1参照)。また、L.J.van't Veerらは約30000種に及ぶ遺伝子について、乳癌組織の内での発現状態をDNAアレイを用いて測定し、予後の転移の有無の判別に必要な約70種の遺伝子群を同定し、次いで、これらの遺伝子群の発現状態を総合的に処理することにより、単一の遺伝子の発現状態で予測された診断結果に対し、その精度を飛躍的に高めることに成功している(非特許文献2参照)。しかし、これらの遺伝子群を同定するためには、莫大な数の遺伝子の発現状態を解析せねばならず、またその解析手段も複雑なため、多大な労力を必要としていた。
これまでに特異的発現をしている遺伝子群のクローニング法として、サブトラクション法が知られていたが、従来のサブトラクション法では、実際に特異的に発現している遺伝子群を網羅的に捕捉することは不可能に近く、発現量の差異が大きい幾つかの遺伝子のみがクローニングされる場合がほとんどであった。一方、本発明者らが開発した段階的サブトラクション法は、サブトラクション後のライブラリーから、更にサブトラクションを繰り返すことにより、2つのライブラリー間で特異的に発現している遺伝子をほぼ網羅的に捕捉することが可能である(非特許文献3、特許文献1参照)。
しかしながら、SLEについて、その診断、あるいは治療に、その発現レベルの情報が有益な手段を提供するであろう遺伝子群の網羅的な同定はいまだになされていない。
(1)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する核酸分子を含む、核酸分子の群。
(2)上記(1)記載の核酸分子の群が固定化された、核酸アレイ。
(3)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体を含む、抗体の群。
(4)上記(3)記載の抗体の群が固定化された、抗体アレイ。
(5)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定することを含む、全身性エリテマトーデスの検査方法。
(6)前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(5)記載の方法。
(7)前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(5)記載の方法。
(8)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の変異及び/又は多型を検出することを含む、全身性エリテマトーデスの検査方法。
(9)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する核酸分子を含有する、全身性エリテマトーデスの検査用試薬。
(10)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体を含有する、全身性エリテマトーデスの検査用試薬。
(11)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量、並びに/又は当該遺伝子の変異及び/若しくは多型について、全身性エリテマトーデスの有無及び/又は進行度との相関を見出し、当該相関を全身性エリテマトーデスの有無及び/又は進行度の検査基準用データとして取得する、全身性エリテマトーデスの検査基準用データの作成方法。
(12)前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(11)記載の方法。
(13)前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(11)記載の方法。
(14)上記(11)記載の方法により得られうる、全身性エリテマトーデスの検査基準用データ。
(15)細胞に被験物質を接触させ、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定し、測定された発現量に基づき、被験物質が全身性エリテマトーデスを治療し得るか否かを評価することを含む、全身性エリテマトーデスを治療し得る物質を同定する方法。
(16)前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(15)記載の方法。
(17)前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(15)記載の方法。
(18)前記被験物質を接触させる細胞は、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子を発現し得る、上記(15)記載の方法。
(19)前記被験物質を接触させる細胞は、全身性エリテマトーデスである哺乳動物に由来する、上記(15)記載の方法。
(20)非ヒト哺乳動物に被験物質を接触させ、該非ヒト哺乳動物由来の生体試料における、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定し、測定された発現量に基づき、被験物質が全身性エリテマトーデスを治療し得るか否かを評価することを含む、全身性エリテマトーデスを治療し得る物質を同定する方法。
(21)前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(20)記載の方法。
(22)前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、上記(20)記載の方法。
(23)前記非ヒト哺乳動物由来の生体試料は、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子を発現し得る、上記(20)記載の方法。
(24)前記非ヒト哺乳動物は全身性エリテマトーデスモデル動物である、上記(20)記載の方法。
(25)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物と被験物質を接触させ、該翻訳産物の活性を測定し、測定された活性に基づき、被験物質が全身性エリテマトーデスを治療し得るか否かを評価することを含む、全身性エリテマトーデスを治療し得る物質を同定する方法。
(26)以下のa)及びb)を含む、全身性エリテマトーデスを治療し得る物質を同定するためのキット:
a)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定するための手段;
b)被験物質を接触させるための細胞又は非ヒト哺乳動物。
(27)前記a)の手段は、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定するための手段である、上記(26)記載のキット。
(28)前記a)の手段は、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する核酸分子である、上記(27)記載のキット。
(29)前記a)の手段は、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定するための手段である、上記(26)記載のキット。
(30)前記a)の手段は、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体である、上記(29)記載のキット。
(31)以下のa)及びb)を含む、全身性エリテマトーデスを治療し得る物質を同定するためのキット:
a)被験物質を接触させるための、全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物。
b)a)記載の翻訳産物の活性を測定するための手段;
(32)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択されたいずれかの遺伝子に対する阻害性核酸分子。
(33)前記核酸分子は、アンチセンス核酸、デコイ核酸、リボザイム及びRNAi誘導性核酸からなる群から選択される、上記(32)記載の阻害性核酸分子。
(34)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択されたいずれかの遺伝子に対する阻害性核酸分子を有効成分として含有する、全身性エリテマトーデスの予防又は治療剤。
(35)前記核酸分子は、アンチセンス核酸、デコイ核酸、リボザイム及びRNAi誘導性核酸からなる群から選択される、上記(34)記載の予防又は治療剤。
(36)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、全身性エリテマトーデスの予防又は治療剤。
(37)全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001〜AILE−025から選択された1又は2以上の遺伝子が改変された非ヒト哺乳動物。
(38)前記改変は該遺伝子の発現を増強させる改変である、上記(37)記載の非ヒト哺乳動物。
(39)全身性エリテマトーデスモデル動物である、上記(38)記載の非ヒト哺乳動物。
(40)前記改変は該遺伝子の発現を減弱させる改変である、上記(37)記載の非ヒト哺乳動物。
従って、本発明は、SLEの診断・治療、当該疾患のマーカーとなる遺伝子の探索、当該疾患の治療薬の開発、当該疾患の検査基準用データの作成などに有用である。特に、SLE患者におけるリンパ球を始めとした血液細胞において示差的に発現している遺伝子群が初めて網羅的に同定されたことから、当該遺伝子群を利用することで、SLEの診断・治療の精度を飛躍的に向上させることができるため、本発明は極めて有用である。
以下、遺伝子群AILE−001〜AILE−025をAILE遺伝子群と、AILE遺伝子群から選択されたいずれか不特定の遺伝子をAILE遺伝子と呼ぶ場合がある。
以下、本発明の各局面について詳述する。
本発明で提供される核酸分子の群は、AILE遺伝子群から選択された2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する複数の核酸分子を含むことを特徴とする。
各遺伝子は、タンパク質をコードする構造遺伝子とその発現を調節している調節遺伝子からなり、特に限定されないが、好ましくは各遺伝子の構造遺伝子である。
上記mRNAは、未成熟mRNA又は成熟mRNAであり、特に限定されないが、好ましくは成熟mRNAである。
本発明で提供される抗体の群は、AILE遺伝子群から選択された2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体を複数含むことを特徴とする。
本発明で提供される発現量の測定によるSLEの検査方法(方法I)は、AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。
本発明は、SLEである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現しているAILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の変異及び/又は多型を検出することを含む、SLEの検査方法を提供する。
本発明で提供される検査基準用データの作成方法は、AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子を解析し、SLEの有無及び/又は進行度との相関を見出すことを特徴とする。
本発明で提供されるSLEの治療用物質の同定方法−1は、AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。本方法(方法IV)は、AILE遺伝子の転写産物(mRNA)に結合(必要に応じて、切断若しくは分解)し、又は当該遺伝子の発現調節部位に結合し、あるいは当該遺伝子の発現を制御する他の遺伝子の発現又は機能を調節することなどにより、当該遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量を増加・減少させ得る物質や、AILE遺伝子の翻訳産物の翻訳後修飾を調節することにより、当該翻訳産物の活性発現を増加・減少させる物質等の同定を可能にする。
本方法(方法IV−1)は、具体的には、i)細胞に被験物質を接触させ、ii)AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定し、iii)測定された発現量に基づき、被験物質がSLEを治療し得るか否かを評価することを含む。
あるいは、当該細胞は、初代培養細胞から誘導された細胞であり得る。そのような細胞としては、哺乳動物由来の細胞であって、且つ増殖因子等の誘導剤により形質が改変された細胞、クローニングにより当該初代培養細胞から株化された細胞、初代培養細胞に任意の遺伝子を導入した細胞などが挙げられる。これら細胞は、当該分野で周知の方法により作製することができる。また、初代培養細胞から誘導された細胞としては、細胞バンク(例えば、ATCC)から入手可能な細胞若しくは市販されている細胞を用いることもできる。
また、被験物質として用いられる抗体としては、上記「抗体の群」の項に記載された、AILE遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を用いることができる。
本方法(方法IV−2)は、具体的には、i)非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、ii)当該非ヒト哺乳動物から生体試料を採取し、iii)当該生体試料におけるAILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定し、iv)測定された発現量に基づき、被験物質がSLEを治療し得るか否かを評価することを含む。
a)AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定するための手段、
b)被験物質を接触させるための細胞又は非ヒト哺乳動物、
を含む。
本発明で提供されるSLEの治療用物質の同定方法−2は、AILE遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物と被験物質とを接触させ、該翻訳産物の活性を測定することを特徴とする。
本方法(方法V)は、AILE遺伝子の翻訳産物又はその相互作用物質に結合すること等により、当該AILE遺伝子の翻訳産物の活性を増加・減少させる物質の同定を可能にする。
a)被験物質を接触させるための、AILE遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物、
b)a)記載の翻訳産物の活性を測定するための手段、
を含む。
本発明はAILE遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子に対する阻害性核酸分子を提供する。
本発明のSLEの予防又は治療剤は、その有効成分として、以下のa)又はb)の化合物を含有することを特徴とする:
a)AILE遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子に対する阻害性核酸分子;
b)AILE遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体。
本発明は、AILE遺伝子群から選択された1又は2以上の遺伝子が改変された非ヒト哺乳動物を提供する。当該遺伝子改変は、AILE遺伝子の発現を増強させる改変又はAILE遺伝子の発現を減弱させる改変であり得る。
実験例1:細胞サンプルの調製
細胞サンプルは次のようにして集めた。すなわち、1982年にアメリカリウマチ協会が改訂したSLE診断基準により、SLEと診断されたヒト患者(130人)及び健常人(8人)の血液を各人100mlずつ採取し20mlずつ5本に分割した後、フィコプラーク 15ml (アマシャムファルマシア) の上に重層し、1000-2000xg程度の低速で遠心分離を行った。白い帯状のバンドとして観察される血液細胞(主にリンパ球を含有する部分)を注射器で抜き取り、PBS 50μlを加え遠心分離によりペレットとした。さらにPBS 20mlに懸濁、洗浄し、さらに遠心分離を繰り返した。得られた血液細胞を以下の工程に用いた。
各細胞のtotal RNAをグアニジンイソチオシアネート/セシウム・トリフルオロ酢酸法にて抽出した(岡山ら、Methods of Enzymology 154, 3-28 (1987))。各細胞を5.5M GTC溶液 1mlに溶解した。
具体的には、グアニジンイソチオシアネート 64.9g、クエン酸ナトリウム2水 0.74g、ラウリルサルコシンナトリウム 0.5gを滅菌ミリQ水 100mlに溶解して5.5M GTC溶液を調製し、使用直前に2-メルカプトエタノール 1/71を添加した。次いで、この溶液を18Gの注射針に粘性が減少するまで数回通した。遠心分離により細胞破片を除去した後、CsTFA溶液 15ml上に重層した。なお、CsTFA溶液は、CsTFA 100ml (アマシャムファルマシア)、0.5M EDTA 39.5ml、滅菌ミリQ水 58.15mlを合わせて調製した。
次に、この溶液を遠心分離(17℃、25000rpm、24時間)に供し、得られた沈殿を4M GTC溶液 600μlに溶解した。溶解後、遠心分離にて不溶物を除去し、1M 酢酸 15μl、エタノール 450μlを加え、混合後-20℃で3時間冷却した。遠心分離(4℃、15000rpm、10分)後、上清を除き沈殿をTE 330μlに溶解した。次に2M NaCl 33μl, エタノール 990μlを加え、混合後-20℃で3時間冷却した。遠心分離(4℃、15000rpm、10分)後、上清を除き、沈殿をTE 330μlに溶解した。
オリゴdTセルロースカラムを用いてmRNAの抽出を行なった。具体的には、0.2gのオリゴdTセルロース(Collaborative Research)に20mlの滅菌水を加え、室温で10分間放置した。上清を除き、再度滅菌水 10mlを加え、カラム(0.6cm径)に注ぎ、高さが約1cmになるようにした。これを約8mlのTE/NaCl(TEと1M NaClを等量混合した液)で平衡化した。
実験例2で得られたtotal RNAに2倍量の1M NaClを加え上記平衡化したカラムに通した。スルー液を再度カラムに通し約8mlのTE/NaClで洗浄した。これにTE 0.5mlを合計6回通し、各フラクションを回収した。各画分について、その一部にエチジウムブロミドを添加し、RNAの有無を調べ、RNAを含む画分を回収した。RNA画分はエタノール沈殿により精製され、最終的に、それぞれ約50μgのpolyA+ RNAを得た。
4.1.first strandの作製
上記で得られた各polyA+ RNAを4.5μg相当分チューブに取り、65℃で5分間加熱後、氷上で急冷した。ここに10X first strand buffer 2.5μl、0.1M DTT 2.5μl、first strand methyl nucleotide mix 1.5μl (いずれもZAP cDNA Synthesis Kit (ストラタジーン)) およびリンカープライマー: (GA)10ACGCGTCGACTCGAGCGGCCGCGGACCG(T)181.0μl (1.6μg/μl)、RNase Inhibitor 0.5μl (40unit/μl) (東洋紡)、滅菌水 8.5μlを加え、室温で10分放置し、プライマーをアニールさせた。次に逆転写酵素 2μl (20unit/μl) (生化学工業)を加え、37℃で40分、さらにSuperscriptII (200unit/μl) (GIBCO BRL)を加え、48℃で40分反応させた。
上記反応液に10X second strand buffer 20μl、0.1M DTT 7.5μl、second strand methyl nucleotide mix 3μl (いずれもZAP cDNA Synthesis Kit (ストラタジーン)、ミリQ滅菌水 132.5μlを加えていった。そこにRNaseH (1.5unit/μl) 1.5μl (東洋紡)、E.coli DNA pol I 6μl (9unit/μl) (東洋紡)を加え、16℃で150分反応させた。反応終了後、フェノール/クロロホルム 200μlを加え、混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをさらにクロロホルム 200μlと混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターに30μlの1/10 TEを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。
上記のcDNA溶液に10X second strand buffer 10μl、blunting nucleotide mix 5μl (いずれもZAP cDNA Synthesis Kit (ストラタジーン))、ミリQ滅菌水 51.5μlを加えていった。ここにPfu DNA pol (2.5unit/μl) 3.5μl (ストラタジーン) を加え、37℃で30分反応させた。反応終了後、フェノール/クロロホルム 200μlを加え、混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをさらにクロロホルム 200μlと混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターにTE 20μlを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。
上記反応液の内4μlをとり、10X ligation buffer 2μl、ATP 2μl、BglII-SmaIアダプター 1μl、滅菌ミリQ水 10μlを加えた。これを氷上に5分置いた後、T4 DNA ligase (4unit/μl) 1.5μl (東洋紡)を加え、8℃で24時間反応させた。終了後、70℃で30分加熱し、氷冷した。ここにNotI補充液 27μlおよびNotI 3μl (10unit/μl) (NEB) を加え37℃で90分間反応させた。なお、NotI 補充液の組成は、278mM NaCl、8mM MgCl2、1.8mM DTT、0.018% BSA、0.018% Triton X-100である。
次いで、この反応液に10X STE 5μl、tRNA (2μg/μl) 5μlを加え、10μlずつCLOMA SPIN-400(クロンテック)にアプライした。遠心分離(4℃、2100rpm、5分)後、溶出液に等量のフェノールクロロホルムを加え、混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをさらに等量のクロロホルムと混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これに5M NaCl 4μl、エタノール100μlを加え、混合後、-80℃に3時間放置した。遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上清を除き、さらに70% エタノール100μlを加え遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上清を除いた。
沈殿に10X ligation buffer 3μl、10mM ATP 3μl、ミリQ滅菌水 22μlを加え溶解し、予めNotI、BglII、BAPで処理したpAP3neo 1μl (1μg/μl) を加えた。氷上に5分間置いた後、T4 DNA ligase 1μl (4unit/μl) (東洋紡) を加え、12℃で40時間反応させた。終了後、70℃で30分加熱し、氷冷した。反応終了後、フェノールクロロホルム 200μlを加え、混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをさらにクロロホルム200μlと混合後、遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上層を取った。これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターにTE 30μlを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。
前記ライゲーション液の内、15μl (5μlX3) をエレクトロポレーション用大腸菌DH12Sに導入した。SOC培地 2mlを加え、37℃で1時間培養した後、アンピシリンを含むLB培地 500mlに移した。約6時間37℃で培養した後、200mlを取り、ヘルパーファージ (R408) を加え、さらに37℃で終夜培養した。翌日、当業者に周知の方法で、1本鎖プラスミドDNAを抽出した。一方、残りの300mlはそのままLB培地で終夜培養し、翌日当業者に周知の方法で2本鎖プラスミドDNAを抽出した。
5.1.健常人血液細胞のpolyA+RNAのビオチン化
健常人血液細胞のpolyA+ RNA 10μg相当をチューブに取り、ミリQ滅菌水で希釈して20μlとした。ここにPHOTOPROBE BIOTIN 10μl (1μg/μl)を加え混合後、約10cmの高さから水銀灯を20分照射しビオチン化を行った。Tris-HCl (pH9.5)/1mM EDTA 70μlを加え、さらに水飽和ブタノール 100μlを加えよく混合した。遠心分離後(4℃、10000rpm、10分)水層をとり、さらにクロロホルムでの抽出を行った。水層に10分の1量の 3M 酢酸アンモニウム、3倍量のエタノール、1μgのグリコーゲンを加え、-80℃で30分放置後、遠心分離し(4℃、15000rpm、10分)、上清を除いた。さらに70%エタノール 100μlを加え遠心分離(4℃、15000rpm、10分)し上清を除いた。沈殿をミリQ滅菌水 20μlで溶解し、さらにここにPHOTOPROBE BIOTIN 10μl (1μg/μl)を加え上記の操作をもう一度繰り返した。
前記ビオチン化RNA 5μg分を8μlのミリQ滅菌水に溶解し、2XHB 12.5μl、2M NaCl 2.5μl、poly(A) 1μl (1μg/μl) (アマシャムファルマシア)、およびSLE患者血液細胞ライブラリー由来のssDNA 1μl (0.5μg/μl)を加えた。65℃で10分加熱した後、42℃で48時間ハイブリダイゼーションを行った。終了後、SB溶液 400μl、ストレプトアビジン 5μl (2μg/μl) (GIBCO BRL)を加え、室温で5分間放置した。フェノールクロロホルム処理を行い、TE 100μl加えて再抽出を行った後、上清にストレプトアビジン 5μl (2μg/μl)を加えた。再度フェノールクロロホルム処理を2回、クロロホルム処理を1回行った。これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターにTE 30μlを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。これを真空乾燥し、ミリQ滅菌水で9μlに調製した。
この溶液に対して上記ハイブリダイゼーション以降の処理を再度行った。最終液はTE 30μlで溶出した。
上記ssDNA溶液 15μlにミリQ滅菌水 14μl、5'APプライマー 1μl (0.2μg/μl) を加え、65℃で10分間加熱した。室温に5分放置し、プライマーをアニールさせ、10X buffer 5μl (宝酒造, Bcabest sequencing kit用)、1mM dNTP 10μl、SSB 0.5μl (3μg/μl)、Bca Best DNA pol 2μl (2unit/μl)、ミリQ滅菌水 3μlを加えた。これを65℃で1時間反応させ2本鎖DNAを合成した。反応液にTE 50μlを加え、フェノール/クロロホルム処理を行った。TEを100μl加えて再抽出を行った後、これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターにTE 25μlを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。これを6.25μlずつ4本に分割しエレクトロポレーションで大腸菌に導入した。各々に対しSOC培地 1.5mlを加え、37℃で1時間培養した後、1本にまとめ、アンピシリンを含むLB培地 500mlに移した。約6時間37℃で培養した後、470mlを取り、ヘルパーファージ(R408)を加え、さらに37℃で終夜培養した。翌日、当業者に周知の方法で、1本鎖プラスミドDNAを抽出した。一方、残りの30mlはそのままLB培地で終夜培養し、翌日、周知の方法で2本鎖プラスミドDNAを抽出した。
上記で得られた1次サブトラクションライブラリーより任意の500個のクローンを選び当業者に周知のアルカリ-SDS法でプラスミドを抽出した。この内、1μgを用いヌクレオチド配列の決定を行った。すなわち、プラスミド溶液 10μlにBigDye試薬 4μl(ABI)、シーケンシングプライマー 1μl (3.2pmole/μl)を加え、サーマルサイクラーにて95℃20秒-50℃20秒-60℃4分の反応を25サイクル行った。反応液をセファデックスG100で精製し、ABIオートシークエンサーにて電気泳動し、ヌクレオチド配列を得た。
上記で得られたクローンのうち、重複の無いクローンについて、それぞれのプラスミド0.5μgをSmaI/NotIで切断し、0.8% アガロースゲル電気泳動にてインサートを切り出した。Quiaquick Gel Extraction kitにてゲルから最終液量30μlのDNAフラグメントを回収した。このうち、10μlずつを混合し、Random Primer labeling kit (宝酒造) にてプローブのラベリングをおこなった。すなわち、混合したDNA断片 50ngにランダムプライマー1μlを加え、95℃で5分間加熱後、急冷しDNAを変性させた。ここに、10X buffer 1.25μl、dNTP mix 1.25μl、(a-32P)dCTP 2μl (3000Ci/mmole) (アマシャムファルマシア)、klenow 0.5μl (2unit/μl)を加え、37℃で30分反応した。ついで65℃で10分加熱しklenowを変成させた。反応液をセファデックスG-50にかけ、未反応の(a-32P)dCTPを除いた。
SLE患者血液細胞及び健常人血液細胞由来のtotal RNAをそれぞれ3μgずつ電気泳動したホルムアミド変性アガロースゲルから、バイオダインAにRNAを転写した。80℃で2時間ベイクしRNAを膜に固定化した。
これをハイブリバッグに入れハイブリダイゼーションバッファー 2mlを加え42℃で2時間プレハイブリダイゼーションを行った。ここに95℃で5分加熱後急冷し変成した上記標識プローブを加え42℃で24時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの終了した膜を2X SSC/0.1% SDS 10ml中で3回、0.1X SSC/0.1% SDS 10ml中で3回洗浄後、オートラジオグラフィーを行った。
ここで、SLEである対象、特にSLE患者に由来する血液細胞に特異的に発現している遺伝子(AILE遺伝子)を特定した。
ノザンハイブリダイゼーションを行った個々のクローンについて、これらを1次サブトラクションライブラリーから差し引くためのビオチン化RNAを作製した。すなわちこれらのプラスミドを混合し、そのうち20μgをとり、10X buffer 4 (NEB) 10μl、BSA (NEB) 10μl、NotI 5μl (10unit/μl) (NEB)を加え、ミリQ滅菌水で全量を100μlとし、37℃で20時間反応させた。
次いで、反応液にTE 100μlを加え、フェノール/クロロホルム処理を行った。TE 100μlを加えて再抽出を行った後、これをミリポアフィルター:UFCP3TK50にのせ、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とした。さらに上室にTE 100μlを加え、遠心分離し(4℃、10000rpm、20分)溶液をすべて落とし洗浄する操作を2回繰り返した。この後、上室のフィルターにTE 30μlを加え、よく攪拌しcDNAを溶出した。これに10X buffer 10μl (T7RNAポリメラーゼに附属,東洋紡)、10mM rNTP 10μl、RNase Inhibitor 1μl (40unit/μl) (東洋紡)、T7 RNAポリメラーゼ 3μl (160unit/μl) (東洋紡)を加え、ミリQ滅菌水で全量を100μlとし、37℃で1.5時間反応した。これにDNase 1μl (70unit/μl) (宝酒造) を加え、37℃で15分間反応し鋳型DNAを分解した。反応液をフェノール/クロロホルム処理1回、クロロホルム処理1回した後、エタノール沈殿し、70% エタノールでリンス後、TE 50μlに溶解した。この操作により100μgのRNAが得られた。
9.1.2次サブトラクションライブラリーの作製
実験例8で得られたRNAの内、5μgを取り、実験例5記載の方法により2次サブトラクションライブラリーを作製した。このあと実験例6〜7記載の方法により、さらにSLEである対象、特にSLE患者に由来する血液細胞に特異的に発現している遺伝子を特定した。
実験例8記載の方法により、3次サブトラクション用RNAを作製し、実験例5記載の方法により3次サブトラクションライブラリーを作製した。その後、実験例6〜7に記載の方法により、さらにSLEである対象、特にSLE患者に由来する血液細胞に特異的に発現している遺伝子を特定した。3次サブトラクションライブラリーのヌクレオチド配列を確認したところ、数種類のクローンしか存在しないことが明らかとなり、ここまでの操作でSLEである対象、特にSLE患者に由来する血液細胞に特異的に発現しているAILE遺伝子25個をほぼ網羅的に取得できたと考えられた。取得したAILE遺伝子群についての概要を表1〜2に示す。
以上より、SLEである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群の網羅的な同定に成功したことが明らかとなった。
実施例1において得られたAILE遺伝子群のうち、AILE−001遺伝子のSLE患者及び健常人の血液細胞における発現量をリアルタイムPCR法にて測定した。結果を図4及び5並びに表3及び4に示す。
Claims (13)
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその15bp以上の部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する核酸分子を含む、核酸分子の群。
- 請求項1記載の核酸分子の群が固定化された、全身性エリテマトーデス検査用核酸アレイ。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体を含む、抗体の群。
- 請求項3記載の抗体の群が固定化された、全身性エリテマトーデス検査用抗体アレイ。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量を測定することを含む、全身性エリテマトーデスの検査方法。
- 前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、請求項5記載の方法。
- 前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、請求項5記載の方法。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された1又は2以上の遺伝子の変異及び/又は多型を検出することを含む、全身性エリテマトーデスの検査方法。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された1又は2以上の遺伝子の各ヌクレオチド配列若しくはその15bp以上の部分配列又はそれらの相補配列をそれぞれ有する核酸分子を含有する、全身性エリテマトーデスの検査用試薬。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された1又は2以上の遺伝子の各翻訳産物にそれぞれ特異的に結合する抗体を含有する、全身性エリテマトーデスの検査用試薬。
- 全身性エリテマトーデスである対象の末梢血液中に存在する細胞に特異的に発現している遺伝子群AILE−001、AILE−003、AILE−004、AILE−007及びAILE−011(ここで、AILE−001は配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−003は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−004は配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−007は配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子であり、AILE−011は配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である)から選択された1又は2以上の遺伝子の発現量、並びに/又は当該遺伝子の変異及び/若しくは多型について、全身性エリテマトーデスの有無及び/又は進行度との相関を見出し、当該相関を全身性エリテマトーデスの有無及び/又は進行度の検査基準用データとして取得する、全身性エリテマトーデスの検査基準用データの作成方法。
- 前記発現量の測定が、前記遺伝子の転写産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、請求項11記載の方法。
- 前記発現量の測定が、前記遺伝子の翻訳産物の発現量を測定することによって行なわれるものである、請求項11記載の方法。
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