KR101437383B1 - 대게 원산지 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법 - Google Patents

대게 원산지 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대게 원산지 판별 방법에 관한 것으로, 효과적으로 대게 원산지를 구분하기 위하여, 프라이머 세트 1 내지 9를 포함하는 대게 원산지 판별용 유전자 마커 키트를 제공한다.

Description

대게 원산지 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법{Method for origin verification of snow crab}
본 발명은 원산지 판별 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 국내산과 수입산(러시아산) 대게 판별용 키트 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.
세계적인 기후 변화 및 어업활동, 석유자원 추출 등과 같은 인간 활동의 증가에 따라 북극 지역의 생태계가 많은 영향을 받게 될 것으로 예상되었다. 북서쪽 대서양 및 북쪽 태평양에서 주로 발견되는 대게(Chionoecetes opilio)는 캐나다, 그린란드(Greenland) 및 알라스카 지역에서 상업적으로 가장 우수한 가치를 갖는 어종 중 하나로 알려져 있다(NPFMC 2010). 그러나 최근 수확량 감소 및 집단 크기의 변동은 대게 종에 대한 지속 가능한 관리가 필요하다는 것을 제시한다(Woody D, et al ., special Publication 74: 5-9, 2005; Zheng J, et al ., Prog Oceanogr 68: 184-204, 2006). 비록 대게 가운데 수컷만 제한적으로 수확하며, 껍질 두께에 따른 크기 제한 및 TAC(total allowable catch) 하의 관리에 의하여 대게 수확을 지속 가능하게 하려는 노력이 이루어지고 있으나, 대게를 보다 철저하게 관리하기 위한 방법이 요구되고 있다.
베링 해에 서식하는 대게의 유전적 다양성에 대해서는 알로자임(allozyme) 분석 결과가 발표된 바 있으며(Merkorus SE, et al ., Fishery Bulletin 96: 525-537, 1998). 이와 유사하게, 그린란드 서부 해안 및 아틀란틱 캐타다(Atlantic Canada) 지역 내에 서식하는 대게에 대하여 MS(microsatellite) 마커 분석 결과, 유전적 구조가 거의 유사하다는 것이 보고된 바 있다(Puebla O, et al., Can. J. of Fish Aqua . Sci., 65: 425-436, 2008).
이 외에도 알로자임(allozymes), 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA), RFLP(restriction fragment length polymorphisms), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism), MS(microsatellites), SNP(single nucleotide polymorphism), 및 EST(expressed sequence tag) 마커와 같은 다양한 종류의 마커를 이용하여 해양 종에 대한 유전적 구조에 대한 연구 결과가 보고된 바 있다(Liu ZJ, et al ., Aquaculture 238: 1-37, 2004). SSR(single sequence repeat)이라고 알려진 MS(microsatellite)는 다수의 임의 배열된 반복체(tandemly arranged repeats, TAR)으로 구성되며, 1 내지 6 베이스 쌍의 크기 범위를 갖는다.
MS 마커(microsatellite marker)는 이의 풍부도(abundance), 짧은 길이의 균일한 분포, 및 높은 다형성 수준과 같은 특성으로 인하여, 계통 판별, 유전적 구조 및 유전자 흐름(gene flow) 패턴 분석, 및 도입된 종의 유래 분석에 유용하다는 장점이 존재하여, 이에 대한 연구가 지속되고 있으나(Jarne P, et al., Trends in Ecology and Evolution 11: 424-429, 1996; Chistiakov DA, et al., Aquaculture, 255:1-29, 2006), 유용한 MS 마커를 발굴에 소요되는 시간, 비용 및 노동으로 인하여 이의 효율적인 활용이 어려운 실정이다(Hamilton, M., et al., Biotechniques 27: 500-507, 1999). 또한, 현재까지 대게(C. opilio)에 대한 MS 마커에 대한 연구 수준은 거의 미미하다(Urbani N, et al ., Molecular Ecology , 7: 357-358, 1998; Puebla O, et al ., Molecular Ecology Notes , 3: 644-646, 2003). 우리나라에 수입되는 대게의 90%가 러시아산이나, 형태적 구별이 어려울 뿐만 아니라 국내산으로 둔갑되어 유통되는 경우가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 효과적으로 대게의 원산지를 판별할 수 있는 키트 및 이를 이용한 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 프라이머 세트 1 내지 9로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머 세트를 포함하는, 한국산 및 러시아산 대게(C. opilio) 판별용 유전자 마커 키트가 제공된다:
서열번호 1로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 1:
서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 2:
서열번호 5로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 3:
서열번호 7로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 4:
서열번호 9로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 31개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 5:
서열번호 11로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 12로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 6;
서열번호 13으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 14로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 47개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 7;
서열번호 15로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 16으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 8; 및
서열번호 17로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 9.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 1은 서열번호 19로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 20으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 2는 서열번호 21로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 22로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 3은 서열번호 23으로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 24로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 4는 서열번호 25로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 26로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 5는 서열번호 27로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 28로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 6은 서열번호 29로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 30으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 7은 서열번호 31로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 32로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 8은 서열번호 33으로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 34로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 프라이머 세트 9는 서열번호 35로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 36으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 키트로 대게의 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 통계적으로 분석하는 단계를 포함하는, 대게(C. opilio) 원산지 판별 방법이 제공된다.
유전적 구조를 명확하게 규명하는 것은 어류 자원의 효율적인 관리에 요구된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 결과는 한국 및 러시아 대게 군을 효과적이며 정확하게 구분할 수 있게 하며, 이에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 마커를 포함하는 키트는 대게의 원산지를 확인할 수 있어 수입된 대게의 부정확한 판별을 방지할 수 있으며, 결과적으로 타국과의 TAC(total allowable catch)에 있어서 분쟁을 피할 수 있을 것으로 예상된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 효과적으로 대게의 원산지를 판별하는 방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 MS(microsatellite) 마커를 이용하여 한국산 대게와 러시아산 대게의 UPGMA 계통도(dendrogram)를 개략적으로 도시하는 다이어그램이다:
R: 러시아산, YD: 경북 영덕, DJH: 경북 대진항, WJ: 경북 울진, GS: 강원도 고성, SC: 강원도 속초.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다.
SNP: 단일핵산다형(single-nucleotide polymorphism)의 약자로서 집단 내에서 또는 개체 내의 대립유전자 사이에 특정 좌위의 염기의 변화가 나타는 것을 의미한다.
MS: 미세위성(microsatellite)의 약자로서, 단순 서열 반복(simple sequence repeat, SSR) 또는 간단 순차 반복(short tandem repeat, STR)이라고도 불리우며, 게놈(genome) 내의 특정 좌위에서 2 내지 6 염기쌍이 반복되는 게놈 구조를 의미하며 반복횟수가 개체 사이 또는 대립유전자 사이에 차이가 나는 경우가 많아, 개체 식별이나 집단유전학 분석에 활용된다.
일배체형(haplotype): 하나의 염색체 상의 인접한 좌위에서 대립유전자(또는 DNA 서열)의 특정 조합(combination)을 의미하며, 개체 사이 또는 대립유전자 사이에 일배체형이 상이한 경우가 많아, 집단유전학 분석에 활용된다.
FST: 고정지수(fixation index)로서 유전학적 구조에 기인하는 집단의 차이의 측정값으로서, 단일핵산다형(single-nucleotide polymorphism, SNP)나 미세위성(microsatellite, MS)와 같은 유전학적 다형 데이터로부터 예측되며, 통상적으로 집단유2전학에서 통계적으로 이용되는 지표이다.
Na: 좌위당 대립유전자의 수(number of alleles per locus)
AR: 대립유전자 풍부도(allelic richness)로서 집단 내에서 유전자 좌위당 대립유전자의 수의 평균값을 나타낸다.
He: 예측 이형접합도(expected heterozygosity)로서 집단 내에서 표적 자위에서 예측되는 이형접합 정도를 나타내며, 이배체 개체의 집단의 경우 하기 식으로 계산된다:
Figure 112013075891323-pat00001
.
상기 식에서 m은 표적 자위에서의 대립유전자의 수이고, fi는 i번째 대립유전자의 대립유전자 빈도이다.
Ho는 관측 이형접합도(observed heterozygosity)로서 관측된 대립유전자를 전체 유전자형으로 나눈 값을 나타내며, 이배체 개체의 집단의 경우 하기 식으로 계산된다:
Figure 112013075891323-pat00002
.
상기 식에서 n은 집단 내에서 개체의 수이고, ai1 및 ai2는 표적 자위에서 개체 I의 대립유전자들이다.
FIS: 근친교배계수(inbreeding coefficient)로서 개체 내에 포함된 아집단(subpopulation)에서의 변이의 비율을 의미하며, FIS가 높을수록 상당한 근친교배의 정도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명:
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 대게의 채취
245 마리의 대게(C. opilio)를 한국 동해안의 5개 지점으로부터 채취하였으며, 러시아에서 수입된 48마리의 대게를 부산 지역 수산시장에서 구매하였다(표 1 참조).
근육 조직 샘플을 채취한 지역에서 바로 100% 에탄올 용액에 보존하였으며, 실험실로 이동하여 상기 조직 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 전체 DNA는 각 샘플로부터 MagExtractor MFX-6100 automated DNA extraction system을 이용하여 추출하였으며, 상기 추출된 게놈 DNA는 Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA) Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA)를 이용하여 정량화 하고, 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.
유래 채취장소 위치 채취시기 개체 수
한국 GS (강원도 고성) 128°30'E,37°23'N 2012.04 41
SC (강원도 속초) 128°38'E,38°11'N 2012.04 55
DJH (경북 대진) 128°48'E,37°23'N 2012.03 60
WJ (경북 울진) 129°33'E,36°44'N 2012.04 40
YD (경북 영덕) 129°39'E,36°29'N 2012.04 48
러시아 R (러시아산) Bering sea 2012.10 48
실시예 2: 대게 종 판별 마커의 제조
본 발명자는 최근 대게(C. opilio)에 대한 미세위성 마커를 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기법을 이용하여 선별한 바 있다(Kang JH, et al., Journal of Biological Sciences (in preparation)). 이 가운데, 하기 표 2에 기재된 9개의 프라이머 세트를 본 발명에 이용하였다. 상기 프라이머 세트는 58℃에서 어닐링되며, 증폭에 있어서 최적화된 온도이다.
PCR 반응용액은 3개의 프라이머 세트를 포함하고 있으며, 이는 각각 정방향 프라이머의 5'말단에 6-FAM, NED, 또는 HEX 염료(PE Applied Biosystems)로 표지되었다. PCR 증폭은 0.25 U Ex TaqTM DNA 중합효소(TaKaRa Biomedical Inc., Shiga, Japan), 1× PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP mix(각각 10 pmol), 및 100 ng 주형 DNA, 을 포함하는 10 μL 반응 용액 혼합물에 대하여 PTC 200 DNA Engine(MJ Research, Waltham, MA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 95℃ 11분, 35 사이클(94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분) 및 72℃ 5분의 최종 연장 단계를 통하여 수행하였다. 유전자 다형증(mcrosatellite polymorphism)은 ABI PRISM 3130 XL automated DNA sequencer (Applied Biosystems)를 이용하여 스크리닝 하였으며, 대립유전자는 분자사이즈 마커(GENESCAN 400 HD [ROX]; PE Applied Biosystems)에 대한 PCR 산물의 상대적인 크기에 따라서 선별하였다.
유전자 좌위 증폭용 프라이머 정보
유전자좌 프라이머 서열 서열번호 AT Motif 대립
유전자수		 사이즈 범위
Co03-nfrdi HEX TGTGCCAGACATGAGAAATAAG 19 58 (TG)8 3 181-187
ACATACAATTTTCCCCTTCCTT 20
Co27-nfrdi 6-FAM TACTCATGACTGGTGCTCTGAT 21 58 (CA)9 9 127-145
CTTACTCCAGGGATTTGGTTT 22
Co34-nfrdi 6-FAM GTGTAGCTATGGAACGTGATGA 23 58 (CA)13 23 140-206
CAAAAATTTGCAAGAGGAAAAG 24
Co36-nfrdi NED GTATTCCTCTTCGTAAACACGC 25 58 (CA)8 24 213-281
TGCGAATATTCTGTTGCATTAC 26
Co37-nfrdi HEX AAGTTGGGGAAAAAGTAGAAAAA 27 58 (CA)15 13 187-215
GATGCTCTAGTGTTGGCGATA 28
Co39-nfrdi 6-FAM AGCTTCTTCGTGACTCTTCTTG 29 58 (TG)8 5 145-155
AACAAGTGAAGGCAGACACAG 30
Co42-nfrdi 6-FAM ATTTCGCAATTTTGTATCCTTC 31 58 (TG)9 5 156-180
ATATGACTCTGCTCGGAAGAAA 32
Co60-nfrdi NED CTTCCCATCGTCATAGAGAAAT 33 58 (AT)10 16 234-270
TCAATCAAACAATCAGTCAATCA 34
Co63-nfrdi NED CATGGCAGATGTAGTTCAAATG 35 58 (AT)9 15 227-259
CAAAAGGAAGAATGAACAGGTC 36
실험예 1: 종판별 및 CO1 유전자 다형성 분석
종을 판별하기 위하여, 한국 및 러시아 대게 군으로부터 16마리의 개체를 선별하여 분석하였다. COI(cytochrome oxydase subunit I) 유전자의 일부 서열을 LCO 프라이머(5'-GCTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3', 서열번호 37) 및 HCO 프라이머 (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3', 서열번호 38)를 이용하여 증폭하였다(Folmer O, et al., Mol . Mar . Biol . Biotechnol, 3: 294-299, 1994). PCR은 유전자 증폭기(PTC-220, Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였으며, 25 ng DNA, 0.2 units DNA 폴리머라아제(Ampli-Taq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA), 250 μM dNTP, 및 1.5 mM MgCl2와 10 pmol 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 250 μM 1X PCR 버퍼를 포함하는 25 μL 최종 부피 내에서 PCR을 수행하였다. PCR 증폭은 93℃, 10분(변성), 35 사이클(93℃, 1분(변성), 55℃, 1.5 분(어닐링), 72℃, 1분(연장)), 및 72℃, 10분(최종 연장) 단계를 통하여 수행되었다. 상기 단계를 통하여 수득된 PCR 단편은 AMPure™ magnetic 비드(Agencourt Bioscience, Beverly, MA)를 이용하여 분리되었으며, 약 8~20 ng의 분리된 산물을 주형으로 삼았으며, 이를 ABI Big Dyeㄾ Terminator v. 3.1, Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석을 수행하였다.
그 결과, 6개 군의 모든 개체로부터 예상되는 사이즈의 PCR 밴드(약 630 bp)가 증폭되었다. 모든 산물의 서열을 분석한 결과, 대게(Chionecetes opilio, GenBank Accession number AB211151)의 COI 유전자 서열과 약 99%의 상동성을 나타냈으며, 이러한 결과는 시료가 대게라는 것을 의미하는 것이다. 상기 증폭된 COI 유전자 단편의 서열 분석 결과는 8개 부분에서 다형성을 나타냈으며, 9개의 일배체형(haplotype)을 나타냈다. 그러나 그 중 하나의 일배체형(Hap 1 type)은 상기 동정된 일배체형의 75%를 차지하였다(표 3 참조).
한국산 및 러시아산의 COI 유전자의 9개 일배체형에 대한 다양성 분석
다형 부위 빈도
일배체 57 108 131 216 276 324 495 498 한국산 러시아산 전체
Hap 1 T T C C C T A T 0.700 0.796 0.745
Hap 2 . C . . . . . . 0.033 　 0.017
Hap 3 . . . A T . . . 0.168 0.105 0.136
Hap 4 . . . A T . . C 0.033 　 0.017
Hap 5 . . T . . . . . 0.033 　 0.017
Hap 6 . . . . . C . . 0.033 　 0.017
Hap 7 . . . . . . G . 　 0.033 0.017
Hap 8 C . . . . . . . 　 0.033 0.017
Hap 9 . . . . T . . . 　 0.033 0.017
합계 1.0 1.0 1.0
핵산 다양성 (%) 0.16±0.12 0.09±0.09 　
일배체의 수 6 5 　
일배체 다양성 0.49±0.10 0.37±0.11 　
다형 부위의 수 6 3 　
실험예 2: 대게( C. opilio ) 유전적 다양성 분석
유전자 좌위 당 대립유전자의 수, 대립유전자의 빈도 및 이형접합성(heterozygosity)은 Arlequin 3.0을 이용하여 계산하였다. 유전자 좌위 쌍 사이 및 HWE로부터 편차 간의 군 전체 연결(population-wide linkage)에 대한 분석은 GENEPOP(ver.4.0; http://kimura.univ-montp2.fr/~rousset/Genepop.htm)을 이용하여 측정하였으며, 상기 분석의 p 값은 다중비교(multiple comparison)를 위한 연속된 본페로니(Bonferroni) 검증으로 수득하였다. MICRO-CHECKER 2.2.3은 널(null) 대립유전자의 존재 여부를 확인하기 위하여 이용하였다. 대립형질 풍부도(Allelic richness, AR)는 샘플 사이즈에 독립적으로, 유전자 좌위 당 대립 유전자의 표준적인 수로서, FSTAT version 2.9.3을 이용하여 계산하였다. 유전적 다향성의 분포에 있어서 나타날 수 있는 지리적 분포는 FSTestimates 및 각 군간의 유전적 거리를 이용하여 분석하였다(Piry S, et al., J. Hered, 95: 536-539, 2004). The GeneClass version 2.0 프로그램(Piry S, et al., J. Hered., 95: 536-539, 2004)을 샘플을 채취한 군의 유전자형을 다양한 유전자 좌위의 유전자 형간의 관련성을 측정하는데 이용하였다.
하기 표 4에는 6개의 대게(C. opilio) 군의 유전적 특징을 요약하였다. 모든 유전자 좌위는 다형성을 나타냈으나, 각 유전자 좌위마다 다형성의 수준에는 차이가 나타났다. 유전자 좌위당 대립유전자 수는 4 내지 18 범위 사이에 있었으며, 평균 10.6을 나타냈으며, 유전자 좌위당 대립유전자의 풍부도는 전체 군에서 4.0 내지 17.1 범위 사이에 있었으며, 평균 9.7을 나타냈다.
5개의 한국 대게 군에 있어서 평균 대립 유전자 수는 10.6이었으며, 이는 러시아 대게 샘플로부터 수득된 수치와 유사하였다(10.8). 이와 비슷하게, 5개의 한국 대게 군에 있어서, 대립유전자의 풍부도는 9.7이었으며, 이 또한 러시아 대게 샘플로부터 수득된 결과와 유사하였다(9.9).
즉, 상기 결과에서 나타난 바와 같이, 한국과 러시아 대게 군 사이에서 대립 유전자 수 및 대립유전자의 풍부도는 차이를 보이지 않았다. 모든 유전자 좌위 사이에서 연결 불균형(disequilibrium)이 관찰되지 않았으며(p > 0.05), 이러한 결과는 마커가 서로 독립적이라는 것을 의미한다.
예측되는 이형접합성의 편차를 나타내는 HWE(Hardy-Weinberg equilibrium) 분석 결과는 본페로니(Bonferroni) 보정 이후, 34, 37, 및 60 유전자 좌위에서 유의한 편차가 존재하는 것이 관찰되었다. 모든 유전자 좌위는 예측 이형접합도(He, expected heterozygosity)가 관측 이형접합도(Ho, observed heterozygosity)에 비하여 높게 나타났으며, 이러한 결과는 이러한 유전자 좌위에서 과도한 동형접합성이 존재한다는 것을 의미한다. 널(null) 대립 유전자는 하기 4개의 유전자 좌위에 존재하는 것으로 보였으며(Co34-nfrdi, Co37-nfrdi, Co39-nfrdi, 및 Co60-nfrdi), 이에 따라 상기 유전자 좌위에 과도한 동형접합성이 존재하는 것으로 사료되었다.
하기 표 4에서 N은 시료의 수를 의미하며, Na는 유전자 좌위 당 대립유전자의 수(number of alleles per locus)를, AR은 대립유전자 풍부도(Allelic richness)를, R은 대립유전자 크기 범위(allelic size range)를 He는 예측 이형접합도(expected heterozygosity)을, Ho는 관측 이형접합도(observed heterozygosity)을, FIS는 근친교배계수(inbreeding coefficient)를 의미한다. 하기 표에 있어서 *은 Hardy-Weinberg식과 일치하지 않음을 나타낸다(p<0.005, 본페로니-보정 수치).
Figure 112013075891323-pat00003
실험예 3: 유전적 연관성 분석
하기 표 5는 페어와이즈(pairwise) 다좌위 FST(사선 하단부) 및 유전학적 거리(사선 상단부) 사이의 매트릭스를 정리하였다. 5개의 한국 대게 군 가운데 페어와이즈 FST 수치 간의 차이는 나타나지 않았다. 그러나 한국 대게 군과 러시아 대게 군 사이의 페어와이즈 FST 수치는 모든 페어와이즈 비교시 현저한 차이를 나타냈다(P<0.05). 한국 대게 군에 있어서 유전학적 거리는 0.015 내지 0.032 사이였으며, 평균은 0.023이었다. 또한, DJH(Daejin-Port) 및 WJ(WoolJin-Port)으로부터 채취된 군은 0.015로 매우 가까운 유전적 거리를 가지고 있었다. 5개의 한국 대게 군 및 러시아 대게 군 사이의 유전학적 거리는 0.202 내지 0.226 사이였으며, 평균은 0.216이었다. 9개의 MS 마커를 이용한 상기 군에 대한 분석으로부터 도출된 UPGMA 계통도(dendrogram)는 러시아 대게군과 한국 대게 군이 완전하게 분리된 결과를 나타냈다(도 1 참조).
상기 분석한 9개 유전자 세트를 조합하여 대립유전자의 분포를 기준으로 분석하는 GeneClass 2 소프트웨어를 이용한 배열 분석 결과, 한국산은 96%의 정확도로 판별할 수 있었고, 러시아산은 92%의 판별율를 나타내었다.
한국산 및 러시아산 대게의 유전적 연관성 분석결과
출처 집단 DJH GS SC WJ YD R
한국 DJH - 0.0275 0.0287 0.0152 0.0171 0.2262
GS 0.002 - 0.0257 0.0189 0.0250 0.2119
SC 0.004 0.0003 - 0.0312 0.0240 0.2185
WJ -0.004 -0.0038 0.0026 - 0.0179 0.2020
YD -0.002 -0.0007 0.0001 -0.0033 - 0.2219
러시아 R 0.078* 0.070* 0.070* 0.068* 0.073* -
표 5의 FST(fixation index) 및 도 1의 UPGMA 계통도는 한국 대게 및 러시아 대게가 명백하게 구분되는 것으로 나타났다. 비록 5개의 한국 대게 군은 UPGMA 계통도에서 지리학적 거리에 따라 2개 군으로 분리되었으나, 상기 5개 군 FST 수치는 매우 낮았으며, 평균적 유전적 거리는 0.023으로 나타났다. 반면, 한국 대게와 러시아 대게 사이의 FST 수치는 0.068 내지 0.078 사이였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 나타냈으며(p<0.05), 이때 러시아 대게의 FST 수치는 0.216이었다. 이러한 차이는 GeneClass 소프트웨어를 이용한 분석에서도 재확인되었는데, 상기 소프트웨어 분석 결과 한국 및 러시아 대게는 약 92%의 정확성을 나타내며 구별되었으며, 96.5%의 품질지표(quality index)를 나타냈다. 상기 표 5에서 *는 비교하는 두 집단의 유의적인 차이를 (P<0.005) 표시한 것으로 러시아산 집단은 한국산 집단 전부에서 유의적으로 차이를 나타냄을 의미한다.
쿠릴(Kurile) 해류는 쿠릴 섬과 북태평양의 동해를 구분하며, 북서부 태평양에서 남쪽으로 흐르면서 반시계 방향으로 순환하는 차가운 아북극 해류이다. 또한, 사할린(Sakhalin) 및 아시아 본섬 사이에서 남쪽 방향으로 흐르며, 시계방향으로 순환하는 리만(Liman) 해류는 오호츠크(Okhotsk) 해로부터 동해로 차가운 해류를 운반한다. 그러나 상기 리만해류는 쓰시마(Tsushima)의 난류로 인하여 북위 40도선 이상에만 머무르게 되어, 북태평양에서 시계방향으로 순환한다. 이러한 해류의 흐름으로 인하여 한국 및 러시아 대게 사이에 유전적인 차이를 유발하는 원인일 수 있을 것으로 보인다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> Method for origin verification of snow crab <130> PD13-0808 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 311 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 1 gggaagaagt gaaggagaga aggcattaca aggcattagc aaaccgtgac agatgaagac 60 acaaaatgac acagactctt cagatagccc cttctaactt tactgaaatc atggatgtaa 120 aaatgtaagt attaacgcca ccagacttct gtaaataaaa aagaaacgtt gtcctggcga 180 cttaagtgtt atctacggta atggttatga taaggattga ttgatttatg gccaaaaagg 240 gggaaatgtg ccagacatga gaaataaggc atgataagga atgtatatgc atgtaaagga 300 tatgtaggct a 311 <210> 2 <211> 650 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 2 gacagcaaaa agcttacagg tatttacatc acttctacca tcaaatctca aacaaaaatc 60 tcatacaaac atgaaaaaaa tgactactga acacgctaac aaacgagaag gggaggagaa 120 ggaggacagc cacgtattcc tgggatctca gagactgtgt attttaccga acacaaacgg 180 cggcggctca aatactgcaa cacaaaacaa aaatagaaag gaggaaataa aaagacagaa 240 aagagttata agaacaggac gctgacattc cgctccaaac aggaacaaca atagaacaca 300 gtcgtttcaa agccaaacca gcgcctgagg tgaccagcca atcactcgct cacacagttt 360 gttgacttaa ctaacacgca tttcacagat caaatcaagt aaatgtacaa acaagtgatg 420 gaaatggacg tctgtattcc gtagattgtt tttgtccctc agcgatatac tatatttaag 480 ccttctttct ttcctcttat attatatacg tctcatttcc ctagattatt ttactccctc 540 agcgacatac aattttcccc ttcctttctt tcctcttata actccaggtg tctgtttccc 600 agtatttccc gaggctgaaa catcacttcg caggacttat ttttccttat 650 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 3 cttctatcac atcattatta ctcatgactg gtgctctgat cacatgaccc ttcacctaac 60 actgcactta 70 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 4 tggcttactc cagggatttg gtttggctta acaggctggt gttttgtgtt atgcaccggc 60 ctcaag 66 <210> 5 <211> 119 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 5 gtgtgtttct tttaaatgaa tggatttgtg tagctatgga acgtgatgaa aagtataaca 60 gaaaactgag gatcgatctg acacacacgc acacacgcac acgcacacac ccacacacc 119 <210> 6 <211> 188 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 6 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctaga 60 tctcaggcca gtatttgctt ctttgcatat aaagtacacc tgaattatat attttagacc 120 gtttcaaaaa tttgcaagag gaaaagaatg tgggtggaat ttgacttctt tccgtgtgtg 180 cgtgtgcg 188 <210> 7 <211> 205 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 7 agcatctcaa agtattcctc ttcgtaaaca cgcaaacgag cacatacgca cgcatacctg 60 cacgccaata atacacacac acacatgcac acatagacgc acatctgcat gcaataacac 120 acacgcacac atgcacgcaa taacgcacaa acacacacac atacacacgc tcacctgcac 180 gcaataacac acacacacac tcact 205 <210> 8 <211> 85 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 8 atttctgaag gttttccatt gtctgctatt ttccagtttg ccatttgttg cgaatattct 60 gttgcattac aagatataga aaaac 85 <210> 9 <211> 346 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 9 tgcaaaatga ggtagtaatt aagataggta gttaaaaagt agaaaaagta agttttaaag 60 taaaaaagta tgttataaaa gtattaaaaa gtaatagtta taaaattaga ggaaaaagta 120 agaaaaagta agtgatataa gtaaaaaaac gtaaagttat aaaagtagag gaaaaaagta 180 agttatttat aaaagttggg gaaaaagtag aaaaagtaat agttgtaaaa gtaggaaaga 240 aaagtatgaa aaaaaaaccc tagattttga acacaaacta aaataataat aatgatagta 300 ataatacccg ttttaaagga gtgtccgcca tcttgtattg tgacgt 346 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 10 ctatcgccaa cactagagca tcataataga g 31 <210> 11 <211> 292 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 11 gtacaggaat gcaggggttg aggtgtcctg tagcgaaggt gtctgtctag ttcgtacgtg 60 taatgaatgc ccttgtcctg ccctgttttg ttttgtttgg tggaactgtc aggcttcgga 120 ggtgaaaatg gtgttgttct cattatatct ctcgcttccc tcgtatgttg ttctcgtctg 180 ttcagttctc agtacaaccc tcgcacatga cacagcttct tcgtgactct tcttgaatca 240 gtgcgatgaa gaaaatttga tggcagctgc gtcgtgtgtc tctgtgtctg tc 292 <210> 12 <211> 78 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 12 agagtgcagg aagggcgcgg cgagcaaaac aagtgaaggc agacacagga acaggatgcg 60 cgctcagaca ccaccgga 78 <210> 13 <211> 139 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 13 gttcaaactc accatggcca cttgggaatt tgcgaacata tttcgcaatt ttgtatcctt 60 ccgcaaatcc gcaaacgaat tcggactctc gcaagttgcg gacgttgcgg ttgttttgcg 120 gaagtggcca cctctggta 139 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 14 atacccccta tatatgactc tgctcggaag aaagagaggc gtgcgaa 47 <210> 15 <211> 146 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 15 ccttcccatc gtcatagaga aataaataca aaataaaaga aaaatgagaa ggttgttgac 60 acggcaattc ttgattagac cgacaggtat gtaggtagat agataggtat gttgatagat 120 agatatagat ggatagataa aaatac 146 <210> 16 <211> 89 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 16 tctatctatc tatatatcaa tcaaacaatc agtcaatcaa ttaatctatc tatcaatctg 60 tctatctatc tatctatatc tgtctgtct 89 <210> 17 <211> 229 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 17 gtcaacacat gcagcacatg ttccacctcc acggcaccgt ccttgtcaaa gtccatcttg 60 gccagtgtgt cgtggatcag ggccaccttg gcagtgtcgg gggcatggca gatgtagttc 120 aaatgctgcg tcaggtcctg taggctgaca agctcggccc tgaaaacaaa ggtatgatat 180 tcataaatac tatcttggta agatgtatac acatgtatat actgtatgc 229 <210> 18 <211> 167 <212> DNA <213> Chionoecetes opilio <400> 18 ctagtgtgac atacggggaa ccacagttac cttccccagg tttccctagg tacccattta 60 tcgaccaacc ccaaaaggaa gaatgaacag gtcttgccct ggccaggatt cgaaccaggc 120 ccgcagattc gtagctaggc gcgatagcca ctacaccaca gaggcgt 167 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co03-nfrdi foward primer <400> 19 tgtgccagac atgagaaata ag 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co03-nfrdi reverse primer <400> 20 acatacaatt ttccccttcc tt 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co27-nfrdi forward primer <400> 21 tactcatgac tggtgctctg at 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co27-nfrdi reverse primer <400> 22 cttactccag ggatttggtt t 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co34-nfrdi forward primer <400> 23 gtgtagctat ggaacgtgat ga 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co34-nfrdi reverse primer <400> 24 caaaaatttg caagaggaaa ag 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co36-nfrdi forward primer <400> 25 gtattcctct tcgtaaacac gc 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co36-nfrdi reverse primer <400> 26 tgcgaatatt ctgttgcatt ac 22 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co37-nfrdi forward primer <400> 27 aagttgggga aaaagtagaa aaa 23 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co37-nfrdi reverse primer <400> 28 gatgctctag tgttggcgat a 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co39-nfrdi forward primer <400> 29 agcttcttcg tgactcttct tg 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co39-nfrdi reverse primer <400> 30 aacaagtgaa ggcagacaca g 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co42-nfrdi forward primer <400> 31 atttcgcaat tttgtatcct tc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co42-nfrdi reverse primer <400> 32 atatgactct gctcggaaga aa 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co60-nfrdi forward primer <400> 33 cttcccatcg tcatagagaa at 22 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co60-nfrdi reverse primer <400> 34 tcaatcaaac aatcagtcaa tca 23 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co63-nfrdi forward primer <400> 35 catggcagat gtagttcaaa tg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Co63-nfrdi reverse primer <400> 36 caaaaggaag aatgaacagg tc 22 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCO primer <400> 37 gctcaacaaa tcataaagat attgg 25 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCO primer <400> 38 taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (3)

  1. 하기 프라이머 세트 1 내지 9를 포함하는, 한국산 대게(C. opilio) 판별용 유전자 마커 키트:
    서열번호 1로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 1:
    서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 2:
    서열번호 5로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 3:
    서열번호 7로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 4:
    서열번호 9로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 31개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 5:
    서열번호 11로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 12로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 6;
    서열번호 13으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 14로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 47개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 7;
    서열번호 15로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 16으로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 8; 및
    서열번호 17로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 정방향 및 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로부터 선택되는 10개 내지 50개의 연속되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 9.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 1은 서열번호 19로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 20으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 프라이머 세트 2는 서열번호 21로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 22로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되며,
    상기 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 3은 서열번호 23으로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 24로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 프라이머 세트 4는 서열번호 25로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 26로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되며,
    상기 프라이머 세트 5는 서열번호 27로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 28로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 프라이머 세트 6은 서열번호 29로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 30으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되며,
    상기 프라이머 세트 7은 서열번호 31로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 32로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되고,
    상기 프라이머 세트 8은 서열번호 33으로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 34로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되며,
    상기 프라이머 세트 9는 서열번호 35로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 36으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성되는, 한국산 대게(C. opilio) 판별용 유전자 마커 키트.
  3. 제1항 또는 제2항의 키트로 대게의 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
    증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및
    전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 통계적으로 분석하는 단계를 포함하는, 대게(C. opilio)의 원산지 판별 방법.
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