KR101537165B1 - 바코드 dna를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법 - Google Patents

바코드 dna를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법 Download PDF

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Abstract

표적 분석물질(target analyte)에 특이적으로 결합하는 제1리간드가 결합된 자성 미세입자; 및 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제2리간드 및 하나 이상의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 이용한, 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 다수의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자 및 일반적으로 사용되는 겔 전기영동을 이용하여 PCR 등의 증폭과정이나, 민감한 신호검출을 위한 특별한 장비 없이도 미량의 생물물질을 검출 및 분석할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 검출방법은 분해되기 쉬워 검출이 어려운 miRNA도 아토 몰농도(aM; 10-18 M) 수준 또는 1 젭토몰 수준의 미량까지 검출할 수 있고 단일-염기-불일치 서열까지도 식별할 수 있으며, 다양한 크기의 바코드 DNA를 이용함으로써 다중복합적 시료로부터 복수의 성분을 한번에 정성 및/또는 정량분석할 수 있는 방법이므로, 임상시료로부터의 암진단 및 돌연변이의 검출 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

바코드 DNA를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법{A method for analysis of biological materials based on gel electrophoresis using barcode DNA}
표적 분석물질(target analyte)에 특이적으로 결합하는 제1리간드가 결합된 자성 미세입자; 및 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제2리간드 및 하나 이상의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 이용한, 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법에 관한 것이다.
다양한 마이크로RNA(microRNA; miRNA) 즉, 19-22 뉴클레오티드 길이의 소형 비코딩(non-coding) RNA는 표적 메신저 RNA와의 혼성화를 통해 유전자 발현, 발암, 세포 증식 및 사멸을 포함하는 생물학적 과정 전반에 있어서 조절자로서 역할을 한다. miRNA는 종양유전자 또는 종양억제제로서의 기능을 통해 비정상적 복합적 유전질환인 암에 관여하므로, 암을 이해하고 진단하기 위해 신뢰할만한 방식으로 매우 낮은 농도 수준에서 복수의 miRNA 서열을 검출하는 것은 매우 유용하다. 이러한 맥락에서 많은 새로운 형태의 miRNA 검출방법이 개발되었음에도 불구하고, 초미량(ultra-low amount)의 miRNA 검출에는 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 PCR-기반의 분석방법이 주로 사용되고 있다. 또한, 새롭게 개발된 방법들은 일반적으로 고도로 복잡하고, 검증되지 않았으며, 초고감도의 검출기 등을 포함하는 비관습적 기기를 기반으로 한다는 점에서 널리 사용되지 못하고 있다. 이러한 검출방법의 예로는 초고감도로 미량의 단백질 및 DNA를 검출하는 나노입자를 기반으로 하는 생물-바코드 에세이를 포함한다. 상기 검출방법은 고도로 민감하며 변하기 쉬운(versatile) 것임에도 불구하고 비-관습적 광-산란 에세이 플랫폼을 이용하므로 부분적으로 그 사용이 증가하고 있다. 특히, miRNA는 RNase에 의해 쉽게 분해되므로 19-22 뉴클레오티드 길이의 표적 miRNA를 신뢰성있고 민감하게 검출하는 것은 매우 어렵다.
이에 본 발명자들은, 분해가 쉬워 검출이 어려운 miRNA 등의 미량의 생물시료를 증폭과정이나 특별한 장비 없이 높은 신뢰도로 검출할 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분석물질과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한 자성 미세입자와 복수의 바코드 DNA를 추가로 포함하는 금속 나노입자를 이용하여 상대적으로 안정한 바코드 DNA를 검출하는 간접적인 분석 방법으로, PCR 등에 의한 증폭과정 없이도 실험실에서 일반적으로 사용되는 유전자 검출방법인 겔 전기영동법을 이용하여 약 1 젭토몰(zeptomole) 수준까지 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바코드 DNA를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 1) 표적 분석물질(target analyte)에 특이적으로 결합하는 제1리간드가 결합된 자성 미세입자; 및 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제2리간드 및 하나 이상의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 시료와 혼합하여 자성 미세입자(magnetic microparticle; MMP)-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 나노입자 복합체를 형성하는 단계; 2) 자기장을 적용하여 상기 복합체를 분리하는 단계; 3) 탈혼성화에 의해 분리된 복합체를 분해하는 단계; 4) 상기 제3단계의 생성물에 자기장을 적용하여 자성 미세입자를 제거하고 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자를 회수하는 단계; 5) 상기 회수한 나노입자로부터 바코드 DNA를 분리시키는 단계; 6) 상기 바코드 DNA를 이와 상보적인 서열을 갖는 DNA와 혼성화시키는 단계; 및 7) 겔 전기영동을 수행하여 분석하는 단계를 포함하는 바코드 DNA를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분석방법은 바코드 DNA를 이용하여 다양한 생물물질을 간접적으로 분석하는 방법에 관한 것으로, 증폭과정이나 특별한 검출장비를 요구하지 않으면서 일반적인 겔 전기영동법을 사용하여 미량의 생물물질을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이 특징이다.
상기 단계 1은, 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제1리간드가 결합된 자성 미세입자 및 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제2리간드 및 하나 이상의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 시료와 혼합하여 상기 자성 미세입자(magnetic microparticle; MMP)와 바코드 DNA를 포함하는 나노입자가 시료 중의 표적 분석물질을 매개로 복합체를 형성하는 단계로서, 시료 중 표적 분석물질의 여부 및 존재량에 따라 형성되는 복합체의 양이 결정된다. 예컨대, 시료 중 표적 분석물질이 부재하는 경우 복합체가 형성되지 않도록 제1리간드와 제2리간드는 서로 상호작용하지 않는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 한편, 단계 1의 반응 조건은 제1리간드, 제2리간드와 표적 분석물질의 종류 및 이들 간의 결합의 종류에 따라 적절히 변화시킬 수 있다.
이때, 제1리간드에 결합된 모든 표적 분석물질에 제2리간드를 통해 바코드 DNA를 포함하는 나노입자가 충분히 결합될 수 있도록 자성 미세입자에 대한 나노입자의 농도비는 충분히 높은 것이 바람직하다. 예컨대, 자성 미세입자와 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 최종 농도비가 1:10 내지 1:100이 되도록 사용할 수 있다.
상기 단계 2는, 자기장을 적용하여 상기 단계 1에서 형성한 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 나노입자 복합체를 분리하는 단계로서, 단계 1의 반응 혼합액이 담긴 용기에 자석을 가까이하여 자기장을 적용하면 미반응 자성 미세입자 및 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 나노입자 복합체는 자석이 위치한 쪽의 용기 벽면에 위치한다. 따라서, 자기장을 가한 채로 용액을 제거하면 용기 내에 미반응 자성 미세입자 및 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 나노입자 복합체만을 남기고 표적 분석물질을 제외한 시료 중의 물질 및 미반응 나노입자를 제거할 수 있다. 이후, 미반응 자성 미세입자 및 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 나노입자 복합체만이 남은 반응용기에 용매를 가하고 상기 과정을 반복하는 세척단계를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 단계 3은, 탈혼성화에 의해 상기 단계 2에 의해 분리된 복합체를 분해하는 단계로서, 제1리간드 및 제2리간드와 표적 분석물질 간의 결합을 저해하는 분위기를 제공함으로써 달성될 수 있다. 단계 3은 결과로서, 각각 독립적으로 분리된 자성 미세입자, 표적 분석물질 및 바코드 DNA를 포함하는 나노입자를 제공한다. 예컨대, 단계 3은 가열하거나, 염의 농도를 낮추거나, pH를 변화시키거나, 경쟁적으로 결합하는 물질을 도입하는 등에 의해 달성할 수 있다.
상기 단계 4는, 상기 단계 3의 생성물 즉, 각각 독립적으로 분리된 자성 미세입자, 표적 분석물질 및 바코드 DNA를 포함하는 나노입자의 혼합물에 자기장을 적용하여 자성 미세입자를 제거하고 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자를 회수하는 단계이다. 상기 단계 2와 동일하게 반응 혼합액에 자기장을 적용하면 자성 미세입자는 용기의 벽면에 위치하며 표적 분석물질 및 나노입자는 용액 중에 존재한다. 따라서, 자기장을 적용한 채로 용액을 분리해내면, 반응 혼합물 중 자성 나노입자를 제거할 수 있다.
본 발명에서 "표적 분석물질"은 생체시료 중 존재여부 또는 존재량을 확인하고자 하는 표적이 되는 물질을 지칭한다. 전술한 바와 같이 표적 분석물질은 단백질, DNA 또는 RNA 등일 수 있다. 상기 RNA는 메신저 RNA(messenger RNA; mRNA), 마이크로 RNA(microRNA; miRNA) 등을 포함한다. 상기 RNA는 자체로는 단일가닥으로 존재하나 상보적인 서열의 DNA와 혼성화할 수 있다.
본 발명에 따른 분석방법을 적용할 수 있는 상기 표적 분석물질은 단백질, DNA 및 RNA 등 서로 특이적인 결합능을 갖는 물질일 수 있다. 예컨대, 자성 미세입자 상의 제1리간드 및 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자 상의 제2리간드와 특이적으로 결합하여 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자 복합체를 형성할 수 있는 한, 본 발명의 분석방법을 제한없이 적용할 수 있다.
상기 표적 분석물질과 제1 및/또는 제2리간드 간의 특이적인 결합은 상보적인 서열 간의 혼성화, 항원-항체 간의 결합 또는 리간드-수용체 간의 결합일 수 있다. 예컨대, 표적 분석물질이 DNA 및 RNA와 같은 핵산인 경우 상기 표적 분석물질의 일부와 상보적인 서열을 갖는 DNA를 제1리간드 및 제2리간드로 선택하여 이들 간의 혼성화에 의해 복합체를 형성하도록 할 수 있다. 또는 표적 분석물질이 항원이나 특정 리간드에 대한 수용체 등과 같은 단백질인 경우에는 각각에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 제1리간드 및 제2리간드로 선택하여 이들 간의 특이적인 결합에 의해 복합체를 형성하도록 할 수 있다.
상기 제1리간드는 직접 또는 링커를 통해 자성 미세입자에 결합될 수 있으며, 제2리간드는 직접 또는 링커를 통해 바코드 DNA를 포함하는 나노입자에 결합될 수 있다. 상기 제1 및/또는 제2리간드가 DNA인 경우, 말단을 반응성있는 작용기로 수식하여 각각 자성 미세입자 또는 금속 나노입자에 결합하도록 할 수 있다. 예컨대, 말단을 티올기로 개질한 DNA는 금속 나노입자에 대한 결합능력을 가지며, 상기 결합은 금속 표면에서 이보다 강한 결합을 형성할 수 있는 치환제를 첨가함으로써 단절시킬 수 있다. 또는 말단을 아민기로 기능화한 DNA는 카르복시산으로 코팅된 입자에 결합할 수 있다. 한편, 제1 및/또는 제2리간드가 단백질인 경우는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및/또는 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 공유결합을 형성함으로써 자성 미세입자 또는 금속 나노입자의 표면에 리간드를 도입할 수 있다. 이를 위하여 자성 미세입자, 금속 나노입자의 표면 및 단백질을 적절히 개질시킬 수 있다. 그러나, 제1리간드 및 제2리간드의 도입방법은 상기 예시에 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
한편, 표적 분석물질이 DNA 또는 RNA와 같이 상보적인 서열의 DNA와 결합할 수 있는 핵산인 경우, 바코드 DNA는 말단에 제2리간드에 해당하는 서열이 연결된 형태일 수 있다. 이러한 경우, 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자에 표적 분석물질과 복합체 형성을 위한 별도의 제2리간드를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 정상 세포와 비교하여 암세포주에서 발현량이 변화하는 3종의 miRNA(miR-205, miR-21 및 miR-155)를 선택하였으며, 각 miRNA에 대해 특이적으로 결합하며, 크기가 다른 바코드 DNA를 이용하여 이들 miRNA를 정성 및 정량 분석하였다. 검출하고자 하는 각 miRNA의 일말단으로부터 중심방향으로 약 10 bp와 상보적인 서열을 포함하도록 제1리간드를 구성하였다. 또한 다른 말단으로부터 중심방향으로 약 10 bp와 상보적인 서열을 포함하도록 제2리간드를 구성하여 miRNA의 절반은 제1리간드와, 다른 절반은 제2리간드와 혼성화함으로써 자성 미세입자-표적 miRNA-금속 나노입자 복합체를 형성할 수 있도록 하였다 이때, 바코드 DNA는 제2리간드의 표적 miRNA와 혼성화하는 서열의 다른 말단 방향으로 추가 서열을 갖도록 구성하였다. 특히, 복수의 miRNA의 동시검출이 가능하도록 각기 다른 갯수의 추가서열 예컨대, 4, 9 및 14개 염기를 더 포함하도록 구성하여 크기 차이에 의해 구별될 수 있도록 하였다.
본 발명에 따른 분석방법은 또한 표적 분석물질을 증폭과정 없이도 1 젭토몰(zeptomole; 10-21 mole) 수준까지 검출할 수 있는 것이 특징이다. 종래 미량의 생체 등의 시료를 분석하기 위해서는 PCR 등을 이용한 유전자 증폭과정을 수행하였다. 또는 감도가 높은 특별한 검출장치를 사용하였다. 그러나, 본 발명에 따른 분석방법은 이를 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따른 분석방법에 사용되는 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자는 단위 입자당 약 1500개의 DNA를 포함하므로 별도의 증폭과정 없이도 1500배의 증폭효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 종래의 miRNA를 직접 검출하는 방법으로는 10 내지 100 pM의 검출한계를 나타내었다. 각 시료를 100 ㎕씩 사용함을 고려할 때, 이는 몰량으로 환산하였을 때 1 내지 10 펨토몰에 상응한다. 또한, 바코드 DNA를 이용하여 표적 miRNA를 정성 및 정량 분석함으로써 1 아토몰 수준의 검출한계를 가짐을 확인하였다(도 6). 그러나, 상기 바코드 DNA의 검출한계는 겔 전기영동으로 검출할 수 있는 바코드 DNA 자체의 최소량을 나타낸 것이며, 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 분석방법을 이용하는 경우 약 1500배의 증폭효과를 나타낼 수 있으므로, 결과적으로 상기 바코드 DNA 검출한계의 1/1500 수준 즉, 1 젭토몰(1 zmole)의 표적 분석물질(예컨대, miRNA, DNA, 단백질 등)까지 검출가능하다.
상기 단계 5는, 단계 4에서 회수한 반응액 중의 나노입자로부터 바코드 DNA를 분리시키는 단계이다. 상기 단계 5는 금속-DNA 결합을 대체할 수 있는 치환제를 첨가하여 바코드 DNA를 금속 나노입자부터 분리시키거나, 또는 시아나이드(CN-) 화합물을 첨가하여 금속 나노입자 자체를 분해시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바코드 DNA를 손상시키지 않으면서, 금속 나노입자로부터 분리시켜 용액 중에 자유롭게 부유하도록 할 수 있는 방법이면 제한없이 사용될 수 있다. 특히 시아나이드 화합물을 첨가하여 금속 나노입자를 분해시키는 경우 치환제를 처리하여 금속 표면에서 DNA의 결합자리를 대체함으로써 DNA를 유리시키는 경우보다 현저히 짧은 반응시간 동안 처리하여도 효율적으로 바코드 DNA를 방출할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 종래 금속 표면에 티올기를 통해 결합된 DNA의 분리에 일반적으로 사용되고 있는 치환제인 DTT와 금속 나노입자를 분해할 수 있는 시아나이드 이온을 제공하는 KCN을 처리하여 바코드 DNA를 분리시킨 후 이를 겔 전기영동으로 검출하여 비교 분석하였다. 그 결과, KCN을 처리한 경우 1분만 처리하여도 DTT를 밤새도록 처리한 시료와 동일한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3).
상기 단계 6은, 상기 바코드 DNA를 이와 상보적인 서열을 갖는 DNA와 혼성화시키는 단계로서, 상기 바코드 DNA를 임의의 기지의 서열로 선택하고 이에 상보적인 서열을 별도로 준비하여 상기 단계 5에서 분리시킨 바코드 DNA와 혼성화하여 이중나선 DNA를 형성하도록 함으로써 안정성을 향상시키는 동시에 이중나선 DNA에 선택적으로 삽입되는 염색제를 이용할 수 있어 염색이 용이하며 이후 분석의 재현성을 높일 수 있다.
상기 단계 7은, 겔 전기영동을 수행하여 분석하는 단계이다.
상기 "겔 전기영동(gel electrophoresis)"은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 거대분자 또는 이들의 단편을 분리 및 분석하기 위한 방법으로, 상기 분리 및 분석은 이들의 크기 및 전하에 기초하여 이루어진다. 본 발명과 관련하여 겔 전기영동은 DNA, 이의 절편 또는 이들의 혼합물을 분리 및/또는 분석하기 위하여 생화학 및 분자생물학에서 일반적으로 사용하는 방법이다. 겔 전기영동 상에서 DNA는 음전하를 띠므로 양의 방향으로 이동하며, 크기(또는 길이) 즉, 뉴클레오티드의 수에 따라 이동 정도가 다르게 나타난다. 예컨대, 짧은 DNA는 상대적으로 긴 서열의 DNA보다 빠르게 이동하므로 동일한 시간 동안 동일한 전압을 가한 경우 로딩한 웰로부터 보다 멀리까지 이동한다. 그러나 상대적으로 유연한 단일가닥의 형태로 로딩하는 경우 불안정하여 분해되거나, 임의의 3차원 구조를 형성하여 겔 상에서 이동속도가 변화할 수 있다. 또한 상기 3차원 구조는 재현성있게 형성되지 못하므로 동일 겔 상에서 이동성 차이로 인한 띠 넓어짐이 관찰되거나 또는 실험을 반복하여 수행하는 경우에서 재현성이 떨어지는 단점이 있을 수 있다. 따라서, 겔 전기영동에 의한 분석은 상기 단계 6을 통해 상보적인 서열의 DNA와 혼성화하여 이중나선을 형성하도록 한 후 수행하는 것이 바람직하다.
상기 겔 전기영동에서 겔의 종류 및 농도, 적용하는 전압의 세기 및 수행 시간은 분석하고자 하는 바코드 DNA의 크기 범위 및 동시 분석하고자 하는 바코드 DNA의 길이 차이에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 상기 겔의 비제한적인 예로는, 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 등이 있다. 농도는 폴리아크릴아미드의 경우 3 내지 30%, 아가로스의 경우 0.5 내지 3%로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 5 bp 간격의 25 내지 35 bp 크기의 이중나선 바코드 DNA를 분리 검출하기 위하여 12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였다.
상기 겔 전기영동의 분석은 형광 표지된 DNA를 사용하거나, 에디디움 브로마이드, SYBR 그린 등의 통상의 DNA 염색제를 사용하여 가시화하고 UV 또는 가시광선을 조사하고 검출기로 검출함으로써 정성 및/또는 정량분석할 수 있다.
본 발명은 다수의 바코드 DNA를 포함하는 나노입자 및 일반적으로 사용되는 겔 전기영동을 이용하여 PCR 등의 증폭과정이나, 민감한 신호검출을 위한 특별한 장비 없이도 미량의 생물물질을 검출 및 분석할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 검출방법은 분해되기 쉬워 검출이 어려운 miRNA도 젭토몰(zeptomole; 10-21 mole) 수준까지 검출할 수 있고 단일-염기-불일치 서열까지도 식별할 수 있으며, 다양한 크기의 바코드 DNA를 이용함으로써 다중복합적 시료로부터 복수의 성분을 한번에 정성 및/또는 정량분석할 수 있는 방법이므로, 임상시료로부터의 암진단 및 돌연변이의 검출 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA에 대한 생물-바코드 겔 에세이의 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 3가지 바코드 DNA로부터의 형광세기를 형광 표준곡선상에 나타낸 도이다.
도 3은 종래의 DNA 마커와 비교하여 본 발명에 따른 바코드 DNA 겔 에세이에 의한 표적 DNA 검출을 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 KCN 농도에 따른 AuNP 분해를 나타낸 도이다. 각기 다른 4가지 농도의 KCN으로 5분간 처리한 후 AuNP 탐침의 흡광도를 측정하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 3종의 크기가 다른 miRNA의 검출결과를 나타낸 도이다. 농도를 10 nM로부터 1 aM로 감소시키면서 신호 세기를 도시하였다. N.C.는 음성대조군을 나타낸다.
도 6은 겔 전기영동법을 이용한 miRNA 및 바코드 DNA의 직접 검출 결과를 나타낸 도이다. 농도를 변화시키면서 검출을 수행하여 겔 전기영동법에 의해 달성될 수 있는 miRNA 및 바코드 DNA에 대한 검출한계를 결정하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 DNA를 이용한 단일-염기-불일치된 miRNA 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 다중복합적 miRNA의 검출 결과를 나타낸 도이다. 다양한 조합으로 복합 miRNA 시료를 제조하여 다중검출 가능성을 확인하였다.
도 9는 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용하여 두 가지 다른 암세포주로부터 miRNA를 검출하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 암세포주로부터 추출된 miRNA의 특성 분석 결과를 나타낸 도이다. MDA-MB-231 및 A549 세포주로부터 추출된 miRNA의 (좌측) 겔 이미지와 (우측) UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 상기 겔 이미지로부터 miRNA 밴드는 약 20 내지 30 bp에 위치하였으며, UV-Vis 스펙트럼 분석 결과 약 12 μM 농도의 RNA를 함유함을 확인하였다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 DNA를 이용하여 MDA-MB-231 및 A549 세포주로부터의 다중 복합적 miRNA 검출 결과를 나타낸 도이다. 각 실험은 3회 반복하였으며 그래프의 수치는 음성대조군의 신호에 대해 정상화하였다.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 더욱 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: DNA 수식된 자성 미세입자( DNA - modified magnetic microparticle )의 제조
아민기로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 1 ㎛ 직경의 카르복시산 작용기로 코팅된 자성 미세입자(magnetic microparticle; MMP)(Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid, Invitrogen, NY, USA)를 사용하였다. 30분 동안 보텍싱(vortexing) 후, 1 ㎖ MMP를 새로운 튜브에 옮겼다. 튜브를 2분 동안 자석 내에 위치시키고 상층액을 제거하였다. 이후, MMP를 100 mM 2-[N-몰포리노]에탄 술폰산(2-[N-morpholino]ethan sulfonic acid; MES) 완충액(pH 4.8)으로 2회 세척하고, 동일한 완충액 100 ㎕에 재현탁시켰다. 5'-말단이 아민기로 기능화된 올리고뉴클레오티드(50 nmol)와 100 mM MES(pH 4.8)에 녹인 1.25 mM 농도의 N-에틸-N'-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드(N-ethyl-N'-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride; EDC) 40 ㎕를 혼합하여 상기 세척한 MMP에 첨가하였다. 4시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 1 M 트리스 완충액(Tris buffer; pH 8.0) 250 ㎖와 10% 트윈-20(tween-20) 1 ㎖을 포함하는 TT 완충액 1 ㎖로 3회 세척하고 정제수(purified water)로 1000 ㎖로 희석하였다. 최종적으로 DNA가 수식된 MMP를 1 ㎖ TE 완충액에 재현탁시켰다. TE 완충액은 100 mM EDTA(ethylenediaminietetraacetic acid disodium salt) 10 ㎖을 1 M 트리스 완충액(pH 8.0) 10 ㎖과 혼합하고 정제수를 가하여 1000 ㎖로 희석하여 제조하였다. 반응에 첨가한 DNA 양으로부터 미반응 DNA 양을 배제하여 자성 미세입자에 결합한 DNA의 양을 계산하고 이로부터 단위 자성 미세입자 당 결합한 DNA 수 를 결정하였고, 이를 표 1에 나타내었다. 상기 DNA는 암에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 3가지 다른 miRNA 서열 예컨대, miR-205, miR-21 및 miR-155와 결합할 수 있는 서열을 포함하여 구성하였다. 상기 검출하고자 하는 3종의 miRNA 서열(서열번호 1 내지 3) 및 자성 미세입자에 결합시킨 DNA 서열(magnetic DNA; 서열번호 5 내지 7)을 표 2에 나타내었다.
DNA205 DNA21 DNA155
첨가된 DNA 양 (mol) 1.0×10-8 1.0×10-8 1.0×10-8
미반응 DNA 양 (mol) 2.8×10-9 3.2×10-9 3.2×10-9
로딩된 DNA 양 (mol) 7.2×10-9 6.8×10-9 6.8×10-9
자성 탐침 당 DNA 수 4.4×105 4.1×105 4.1×105
서열(5'→3') 서열번호
miR-205 UCCUUCAUUCC ACCGGAGUCUG 1
miR-21 UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA 2
miR-155 UUAAUGCUAAU CGUGAUAGGGG 3
Single-mismatched miR-155 UUAAUGCUAAG CGUGAUAGGGG 4
Magnetic DNA205 /NH2/A10/PEG6/CAGACTCCGGT 5
Magnetic DNA21 /NH2/A10/PEG6/TCAACATCAGT 6
Magnetic DNA155 /NH2/A10/PEG6/CCCCTATCACG 7
Barcode DNA205 GGAATGAAGGAGCTC/PEG6/A10/SH/ 8
Barcode DNA21 CTGATAAGCTAGATCACTCG/PEG6/A10/SH/ 9
Barcode DNA155 ATTAGCATTAAACTCGGATCACTCG/PEG6/A10/SH/ 10
Barcode DNA205 complement GAGCTCCTTCATTCC 11
Barcode DNA21 complement CGAGTGATCTAGCTTATCAG 12
Barcode DNA155 complement CGAGTGATCCGAGTTTAATGCTAAT 13
Barcode DNA205-Cy3 Cy3-GGAATGAAGGAGCTC/PEG6/A10/SH/ 14
Barcode DNA21-Cy3 Cy3-CTGATAAGCTAGATCACTCG/PEG6/A10/SH/ 15
Barcode DNA155-Cy3 Cy3-ATTAGCATTAAACTCGGATCACTCG/PEG6/A10/SH/ 16
제조예 2: 바코드( barcode ) DNA 수식된 금 나노입자의 제조
이황화 보호기로 개질된 올리고뉴클레오티드를 100 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)로 환원시켜 자유 티올기를 갖도록 하였다. 환원 후, 여분의 DTT를 NAP-5 컬럼(GE Healthcare, UK)으로 제거하였다. 신선하게 환원시킨 티올화된 올리고뉴클레오티드를 50 nm 직경의 금 나노입자(gold nanoparticle; AuNP) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합용액을 실온에서 밤새도록 회전 교반기 상에서 방치하였다. 이후, 용액을 0.1%(wt/vol) SDS를 포함하며 최종 인산농도가 100 mM(pH 7.4)이 되도록 조절하였다. 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 반응용액에 10분액(ten aliquots)의 1 M NaCl을 첨가하여 0.3 M NaCl이 되도록하고, 실온에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 용액을 원심분리(6,000 rpm, 15분)하여, 상층액은 제거하고 침전을 0.15 M PBS 용액(pH 7.4)에 재분산시켰다.
실험예 1: 형광측정
1.1. 바코드 DNA 의 정량
AuNP 상에 결합된 바코드 DNA의 수를 정량하기 위하여, Cy3로 기능화된 바코드 DNA를 일반적인 수식과정을 이용하여 AuNP 상에 수식하였다. 이후, 10 ㎕ KCN을 90 ㎕ AuNP 탐침과 혼합하였다. Cy3을 포함하는 방출되는 바코드 DNA의 형광세기를 셀 온도가 25℃로 고정된 형광분광기(JASCO, MD, USA)로 측정하였다. 여기파장은 480 nm이었으며, 560 nm에서 방출세기(emission intensity)를 측정하여 정확한 DNA 수 계산에 사용하였다. 기지농도의 동일한 DNA를 사용하여 표준 곡선을 얻었다.
본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 검출방법의 높은 민감도를 결정하는 하나의 요소은 단위 입자당 결합한 바코드 DNA의 수이다. 따라서, AuNP에 형광체를 표지한 바코드 DNA를 결합시키고, KCN을 첨가하여 DNA를 유리시킨 후 형광신호를 측정하여 단위 AuNP 당 수식된 바코드 DNA 가닥의 수를 정량하였다. 그 결과를 도 2 및 하기 표 3에 나타내었다.
바코드 DNA205 바코드 DNA21 바코드 DNA155
금속 나노입자 탐침 당 바코드 DNA 수 1466±9 1499±12 1658±10
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 각각의 AuNP는 약 1,500개(1499 내지 1658 개) 바코드 DNA 가닥을 포함하므로 검출에 있어서, 단일 자성 미세입자-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자 복합체로부터 약 1,500배의 증폭효과를 제공할 수 있음을 확인하였다.
1.2. SYBR 그린, 금 나노입자 및 KCN 의 향상된 측정
SYBR 그린을 DMSO(Sigma-Aldrich, CA, USA)에 용해시키고 희석하였다. 상기 희석한 SYBR 그린 45 ㎕를 AuNP 15 ㎕ 및 KCN 10 ㎕와 혼합하였다. AuNP 또는 KCN이 첨가되지 않은 모든 시료에 탈이온수를 첨가하여 시료의 총 부피를 70 ㎕로 조절하였다. 여기 및 방출파장은 각각 477 nm 및 550 nm였으며, 셀 온도는 25℃로 고정하였다.
실험예 2: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동( polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE )
5 bp 차이를 갖는 dx 바코드 DNA를 분리하기 위하여, 30% 아크릴아미드/비스 용액(30% acrylamide/bis solution; Biorad, CA, USA), 탈이온수, 5× TBE 완충액(Sigma-Aldrich, CA, USA), APS(Sigma-Aldrich, CA, USA) 및 TEMED(Sigma-Aldrich, CA, USA)로 구성된 12% 중성 폴리아크릴아미드 겔(neutral polyacrylamide gel)을 사용하였다. 로딩염료(Fermentas Inc., MD, USA)와 dx 바코드 DNA 혼합물을 1.5 mm 두께의 겔(Galileo Bioscience, MA, USA)의 각 웰에 가하였다. 겔 상에서 DNA의 분자량을 확인하기 위하여, 동일한 겔의 별도의 웰에 마커로서 5 bp DNA 래더(Fermentas Inc., MD, USA)를 로딩하였다. 탱크(Galileo Bioscience, MA, USA) 내에서 전원장치(Hoefer, MA, USA)를 이용하여 300 V로 2.5시간 동안 겔에 전기장을 적용하여 시료를 전개하였다. 전기영동 후, 겔을 SYBR 그린 I(Lonza, NJ, USA)로 30분간 염색하고 탈이온수로 1분간 탈색하였다. 마지막으로, 306 nm UV 여기광을 사용하여 겔 영상화기(Gel Imager; Corebio, Seoul, South Korea)로 겔을 영상화하였다.
실시예 1: 생물-베이글( bio - BaGel ) 에세이
본 발명의 모든 실험에서는 RNase가 제거된(RNase-free) 물질을 사용하였다. 먼저, 3가지 miRNA(miR-205, miR-21 및 miR-155)를 100 μM 농도로 RNase가 제거된 물(RNase-free H2O)에 용해시켰다. 분석을 위하여, miRNA는 PBS(phosphate saline buffer; 10 mM phosphate, 150 mM salt, pH 7.4)에 녹여 10 nM 내지 1 aM 농도 범위로 희석시켰다. 10 ㎕ MMP(15 pM)와 10 ㎕ AuNP 탐침(500 pM)을 새로운 ep-튜브에 준비하였다. 희석한 표적 miRNA 100 ㎕를 MMP와 AuNP 탐침 혼합물에 첨가하여 총 부피가 120 ㎕가 되도록 하였다. 95℃ 물에서 3분간 어닐링하고, MMP의 정착(settlement)을 방지하기 위해 1시간 동안 실온에서 반응 튜브를 흔들어주었다. 자석을 이용하여 자기장을 적용(MPC-S, DYNAL®, Invitrogen, NY, USA)하여 형성된 MMP-표적 miRNA-AuNP 복합체(complex)를 회수하고 상층액을 제거하여 결합하지 않은 자유 AuNP와 표적 miRNA를 제거하였다. 회수한 MMP-표적 miRNA-AuNP 복합체를 15 ㎕ 물에 재분산시키고 열수에 2분간 인큐베이션하여 복합체를 탈혼성화(dehybridization)함으로써 AuNP 탐침을 분리시켰다. 자성분리(magnetic separation)을 이용하여 방출된 AuNP를 회수하여 새로운 튜브에 옮겼다. 이후, 각 튜브에 KCN(350 mM; Sigma-Aldrich, CA, USA) 2.5 ㎕와 디코딩 DNA(10 μM) 5 ㎕를 첨가하여 95℃ 물에서 3분간 어닐링하였다. 상기 KCN을 이용하여 AuNP 탐침의 AuNP를 용해시킴으로써 바코드 DNA 및 이와 혼성된 디코딩 DNA를 분리시켰다. 상기 이중나선(double-helix; dx) 바코드 DNA 시료를 실온에서 30분간 인큐베이션하고 DNA 로딩 염료 3 ㎕를 혼합하였다. 다중복합적인 miRNA의 검출을 위하여, 표적 miRNA를 동일한 PBS에 30 nM 내지 3 aM 범위의 농도로 희석하였다. 이후 3가지 MMP와 3가지 AuNP 탐침을 먼저 혼합하였다. 그리고 나서, 3가지 표적 miRNA를 각각 100 ㎕씩 혼합하여 최종 부피가 360 ㎕가 되도록 하였다. 이후의 과정은 전술한 바와 동일하게 진행하였다. 상기 3개 miRNA의 동시검출 결과를 도 3(상부)에 나타내었다. 상기 다중복합적 검출을 위해서 각 바코드 DNA 서열에 추가의 염기(miR-205, miR-21 및 miR-155에 대해 각각 4, 9 및 14 염기; 표 2, 서열목록 8 내지 10)를 삽입하였다. 또한 이에 상응하는 상보적인 서열(표 2, 서열목록 11 내지 13)을 이용하여 dx 바코드 DNA를 형성하도록, 각 바코드 DNA의 길이 차이에 의한 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동 동안 이동성 차이에 의해 이들 3가지 다른 바코드 DNA 서열 중에서 분리할 수 있도록 하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 각각 5 bp 크기 차이를 갖는 바코드 DNA를 이용하여 다중복합적 miRNA 혼합시료를 동시분석한 결과 별도의 증폭과정 없이도 뚜렷이 구분되는 3개의 밴드로 분리되는 것을 확인하였다.
1.1. 바코드 DNA 분리용 시약의 종류 및 농도에 따른 효과
일반적이로 금속 나노입자로부터 티올화된 DNA를 분리시키기 위한 시약으로는 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)이 사용되고 있다. 그러나, 상기 실시예 1에서는 금속 나노입자로부터 바코드 DNA를 분리하기 위한 시약으로서 시아나이드계 화합물인 KCN을 이용하였다. 이에 본 발명자들은 AuNP로부터 DNA를 분리시키기 위한 방법으로 종래 DTT를 이용하는 방법과 본 발명에 따른 KCN을 이용하는 방법을 비교분석하였다. 이를 위하여, DNA를 분리하는 단계에서 상기 두 가지 시약을 각각 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법 및 조건으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 3(하부)에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 동일한 농도의 시약으로 처리한 경우 KCN은 1분만 처리하여도 5 pM 수준의 시료까지 검출가능한 반면, DTT를 처리한 경우에는 1시간 처리하였을 때에는 거의 검출이 불가능하였으며 밤새도록 반응시킨 후에야 상기 KCN을 처리한 군과 유사한 수준의 검출이 가능하였다.
한편, 사용한 KCN의 농도를 변화(최종농도 0, 1, 50 및 100 mM)시켜 AuNP의 흡광도 변화를 관찰하고 이를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 사용한 KCN의 농도가 증가함에 따라, AuNP에 의한 흡수 피크가 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 상기 KCN의 처리로 금 나노입자가 분해되면서 이에 결합된 바코드 DNA를 방출하는 것을 유추할 수 있었다.
상기 결과를 종합하여 보면, AuNP에 결합된 티올화된 DNA를 치환시킬 수 있는 시약인 DTT를 이용하여 DNA를 분리시키는 경우 보다, 상기 AuNP와 DNA의 결합을 분리시키는 동시에 AuNP 자체를 분해시키는 시약인 KCN을 사용한 경우 보다 짧은 시간 내에 효과적으로 DNA를 분리해낼 수 있음을 확인하였다.
1.2. miRNA 에 대한 검출 한계
본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 miRNA 검출방법의 검출 한계를 확인하기 위하여, 상기 3종의 miRNA 시료를 각각 10 nM로부터 10배씩 희석하여 1 aM 농도까지 준비하여 전술한 방법에 따라 실험을 수행하고 겔 전기영동으로 결과물을 확인하였다. 구체적으로, KCN을 이용하여 회수한 바코드 DNA 용액(17.5 ㎕)에 10 μM 농도의 바코드 DNA 보체(complement) 5 ㎕와 2M NaCl 3.97 ㎕를 첨가하여 이중나선을 형성하도록 하고 생성된 용액은 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 상기 dx 바코드 DNA를 12% 비변성 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad, CA, USA)의 각 웰에 로딩하여 dx 바코드 DNA 검출함으로써 miRNA를 간접적으로 동정 및 정량하였다. 300 V에서 2시간 동안 전기영동한 겔을 SYBR-그린 I(1:10,000 희석용액, Lonza, NJ, USA)f로 30분간 염색하고 탈이온수로 세척한 후, UV 램프를 구비한 겔 다큐먼트 시스템(Corebio, Seoul, South Korea)으로 306 nm에서 약 1,500 ms 노출시간으로 겔을 영상화하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분석방법은 3종의 miRNA 모두를 10 nM로부터 1 aM의 넓은 농도 범위에서 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한 각 농도에서 dx 바코드 DNA 밴드는 마커로서의 밴드의 위치와 일치하였다.
비교예 1: miRNA 및 바코드 DNA 의 직접 검출
상기 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 miRNA의 간접적 검출방법의 민감도 향상을 확인하기 위하여, 시료를 순차적으로 희석하여 농도를 변화시키면서 miRNA의 직접 검출방법에 의한 검출한계와 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 간접 검출방법의 검출한계를 비교하였다.
miRNA와 이의 상보적인 DNA 간의 직접적인 혼성화를 위하여, miRNA를 10 μM 내지 10 nM 농도로 희석하였다. 상기 희석한 miRNA 5 ㎕를 상보적인 서열의 DNA(100 μM) 5 ㎕와 혼합하고, 2 M NaCl을 사용하여 염농도를 150 mM로 조절하였다. 전기영동방법은 전술한 에세이에서와 동일하게 진행하였다. 바코드 DNA와 이의 보체(complement) 간의 직접적인 혼성화를 위하여, 바코드 DNA 155를 200 nM내지 20 fM 농도로 희석하였다. 100 μM 농도의 디코딩 DNA 5 ㎕를 동일한 부피의 바코드 DNA에 첨가한 후 2 M NaCl을 사용하여 염농도를 150 mM로 조절하였다. 전술한 에세이에서와 동일하게 12% 비변성 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동방법을 수행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 겔 전기영동을 이용한 miRNA의 직접 검출방법으로는 10 내지 100 pM 수준의 검출한계를 달성할 수 있었다. 각 시료를 100 ㎕씩 사용함을 고려할 때, 이는 몰량으로 환산하였을 때 1 내지 10 펨토몰에 상응한다. 바코드 DNA를 이용하여 miRNA를 간접적으로 검출하는 경우 1 amole 수준까지 검출한계를 낮출 수 있음을 확인하였다. 그러나, 상기 바코드 DNA의 검출한계는 겔 전기영동으로 검출할 수 있는 바코드 DNA 자체의 최소량을 나타낸 것이며, 상기 실험예 1.1 및 표 3에 나타난 바 본 발명에 따른 분석방법을 이용하는 경우 약 1500배의 증폭효과를 나타낼 수 있음을 고려할 때, 상기 바코드 DNA 검출한계의 1/1500 수준 즉, 1 젭토몰(1 zmole)의 표적 분석물질(예컨대, miRNA, DNA, 단백질 등)까지 검출할 수 있음을 나타내는 바이며, 이로부터 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 간접적 검출방법은 miRNA를 직접 검출하는 방법에 비해 6 또는 7자릿수(106 내지 107배)만큼 검출 민감성을 향상시킬 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 2: 단일 염기 불일치된 miRNA 의 검출(선택성)
본 발명에 따른 검출방법의 선택성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1에 사용한 miRNA 중 하나인 miR-155와 하나의 염기서열만이 다른 단일-염기-불일치 miRNA 서열을 제작하여 동일한 방법으로 검출을 시도하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 단일-염기-불일치 miRNA의 서열은 표 2에 나타내었다(single-mismatched miR-155; 서열번호 4)
도 7에 나타난 바와 같이, miRNA-155와 이에 상응하는 단일-염기-불일치 miRNA를 각각 10nM 농도로 이용하여 검출을 시도한 경우, 겔 전기영동으로부터 miRNA-155에 대해서는 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있었으나, 이와 단 하나의 염기 서열이 일치하지 않는 단일-염기-불일치 miRNA은 검출되지 않았다. 이는, 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 검출방법은 miRNA에서의 단일 염기 불일치를 검출할 수 있을 만큼 민감한 검출방법임을 나타내는 바이다.
실시예 3: 다중복합적 miRNA 의 동시검출
상기 실시예 1에 간략히 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 서로 다른 길이의 바코드 DNA를 이용한 검출방법은 복수의 표적물질을 동시에 동정하고 정량할 수 있는 다중복합적 검출능을 가짐을 확인하였다. 이를 구체적으로 확인하기 위하여, 다양한 조합의 miRNA 서열을 각각 10 nM 농도로 혼합하여 시료를 제조한 후, 이들 혼합시료에 대해 검출을 시도하였으며, 그 결과를 도 8a에 나타내었다. 또한 혼합시료의 농도를 보다 낮은 수준으로 변화시키면서 혼합물에 대한 검출가능한 농도범위를 확인하고 그 결과를 도 8b에 나타내었다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 각 혼합시료에 대한 겔 전기영동은 각 조합을 구성하는 바코드 DNA의 해당 DNA 크기에 상응하는 위치에서 명확히 구분된 밴드로 나타남을 확인하였다.
또한, 도 8b에 나타난 바와 같이, 단일 표적물질뿐만 아니라 2개 또는 3개 표적물질이 혼합된 시료에 대해서도 fM 수준의 낮은 농도까지 동시에 검출가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 암세포주로부터 추출한 miRNA 의 검출
마지막으로 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 miRNA 검출방법의 생물학적 연구에 있어서의 유용성을 확인하기 위하여, 인간 폐암(A549) 및 유방암(MDA-MB-231) 세포주에서 과발현되는 miRNA 서열을 동정하였다. 실시간 PCR을 이용하여 확인된 바, 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포는 miR-21 및 miR-155를 과발현하고, miR-205는 낮은 수준으로 발현하였다. 한편, 인간 폐암 세포주인 A549 세포는 miR-205 및 miR-21을 과발현하고, miR-155는 낮은 수준으로 발현하였다. 이러한 사실에 기반하여 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용하여 상기 2가지 세포주로부터 추출한 miRNA에 대해 상기 3가지 miRNA의 검출을 시도하였다.
4.1. 암세포의 배양
MDA-MB-231(ATCC Num. HTB-26) 및 A549(ATCC Num. CCL-185)를 ATCC(American type culture collection)로부터 구입하였다. 인간 유방암세포, MDA-MB-231을 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen, NY, USA) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지(Gibco, Invitrogen, NY, USA)에 배양하였다. 인간 폐암세포, A549는 10% FBS 및 항생제를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco, USA)에 배양하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다.
4.2. 암세포로부터 마이크로 RNA ( microRNA ; miRNA )의 분리 및 검출
상기 두 가지 다른 암세포주(MDA-MB-231 및 A549)로부터 miRNA를 추출하기 위하여, E.Z.N.A™ miRNA 키트(OMEGA bio tek GA, USA)를 사용하였다. 구체적으로 실시예 4.1에 따라 80% 컨플루언시(confluency)까지 배양한 세포의 세포막 파열을 유도하였다. 세포 용해를 위하여, 단층으로 성장시킨 1×107 세포에 RNA-Solv® 시약 1 ㎖을 첨가하였다. 용해물을 깨끗한 2 ㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 3분간 실온에서 인큐베이션시킨 후, RNA-Solv® 시약을 포함하는 1 ㎖ 용해물에 클로로포름 0.2 ㎖을 첨가하고 15초간 격렬히 보텍스하였다. 혼합물을 얼음 위에서 10분간 인큐베이션하고 4℃에서 12,000 g로 15분간 원심분리하여 상부 수용액 층을 새로운 2 ㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 0.33배 부피의 에탄올을 첨가하여 충분히(thoroughly) 보텍스하였다. 크기가 큰 RNA를 제거하기 위하여, HiBind® RNA 미니컬럼을 이용하여 혼합용액을 10,000 g로 1분간 원심분리하고 여과된 액체를 회수하여 부피를 측정하였다. 여과된 액체(filtrate)에 0.65배 부피의 에탄올을 첨가하였다. miRNA를 분리하기 위하여, HiBind® 마이크로 RNA 컬럼을 사용하였다. 혼합용액을 10,000 g로 1분간 원심분리한 후, 10,000 g에서 1분간 원심분리를 통해 RNA 세척 완충액 II(RNA Wash Buffer II)로 HiBind® 마이크로 RNA를 세척하였다. 이후, HiBind® 마이크로 RNA를 깨끗한 2 ㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮기고, 15 ㎕ DEPC-처리된 물을 첨가한 후 실온에서 2분간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 최대 속도로 1분간 원심분리하여 miRNA를 수득하였다. UV-Vis 분광광도계와 겔 전기영동을 사용하여 특성분석하였으며, 상기 miRNA를 dx-바코드 에세이에 사용하였다. 상기 암세포주로부터 miRNA를 분리 및 동정하는 방법을 도 9에 개략적으로 나타내었다. 또한 각 세포주로부터 분리된 miRNA를 겔 전기영동 및 UV-Vis 분광법으로 확인한 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 상기 세포주로부터 추출한 miRNA는 약 20 내지 30 bp 크기를 가지며, 추출된 총 miRNA 양은 약 12 μM이었다.
상기 암세포주로부터 추출하여 동정한 miRNA 혼합물에 대한 바코드 DNA를 이용한 miRNA-205, miRNA-21 및 miRNA155의 정성 및 정량분석을 수행하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, MDA-MB-231 세포는 miR-21 및 miR-155를 과발현하고, 매우 miR-205는 낮은 수준으로 발현하였으며, A549 세포는 miR-205 및 miR-21을 과발현하고, miR-155는 상대적으로 낮은 수준으로 발현하였다. 상기 결과는 겔 전기영동 이미지로 상대적인 발현수준을 육안으로 확인한 후 수치화하여 상대적인 발현양의 배수비를 그래프로 나타내었다. 이들 결과는 전술한 실시간 PCR을 기반으로 상기 세포주들에 대해 밝혀진 사실과 일치하였다.
종합적으로, 본 발명에 따른 바코드 DNA를 이용한 생물물질의 분석방법은 분해되기 쉬워 검출이 어려운 miRNA도 1 젭토몰의 낮은 수준까지 검출가능할 뿐만 아니라, 단일-염기-불일치 서열을 갖는 시료도 식별가능한 민감성 및 선택성을 가진 방법임을 확인하였다. 뿐만 아니라, 5 bp 차이의 DNA까지 구분 가능하므로 각기 다른 크기의 복수의 바코드 DNA를 이용하여 다중복합적 시료의 동시분석이 가능함을 확인하였고, 임상시료에 대해서도 증폭과정 없이 간단한 겔 전기영동을 이용하여 기존의 실시간 PCR 등을 이용한 결과와 잘 일치하는 분석결과를 제공할 수 있음을 확인하였다.
1; RNA; miR-205; 5'-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-3'; 22 염기
2; RNA; miR-21; 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'; 22 염기
3; RNA; miR-155; 5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3'; 22 염기
4; RNA; Single-mismatched miR-155; 5'-UUAAUGCUAAGCGUGAUAGGGG-3'; 22 염기
5; DNA; Magnetic DNA205; 5'-/NH2/A10/PEG6/CAGACTCCGGT-3'; 21 염기
6; DNA; Magnetic DNA21; 5'-/NH2/A10/PEG6/TCAACATCAGT-3'; 21 염기
7; DNA; Magnetic DNA155; 5'-/NH2/A10/PEG6/CCCCTATCACG-3'; 21 염기
8; DNA; Barcode DNA205; 5'-GGAATGAAGGAGCTC/PEG6/A10/SH/-3'; 25 염기
9; DNA; Barcode DNA21; 5'-CTGATAAGCTAGATCACTCG/PEG6/A10/SH/-3'; 30 염기
10; DNA; Barcode DNA155; 5'-ATTAGCATTAAACTCGGATCACTCG/PEG6/A10/SH/-3'; 35 염기
11; DNA; Barcode DNA205 complement; 5'-GAGCTCCTTCATTCC-3'; 15 염기
12; DNA; Barcode DNA21 complement; 5'-CGAGTGATCTAGCTTATCAG-3'; 20 염기
13; DNA; Barcode DNA155 complement; 5'-CGAGTGATCCGAGTTTAATGCTAAT-3'; 25 염기
14; DNA; Barcode DNA205-Cy3; 5'-Cy3-GGAATGAAGGAGCTC/PEG6/A10/SH/-3'; 25 염기
15; DNA; Barcode DNA21-Cy3; 5'-Cy3-CTGATAAGCTAGATCACTCG/PEG6/A10/SH/-3'; 30 염기
16; DNA; Barcode DNA155-Cy3; 5'-Cy3-ATTAGCATTAAACTCGGATCACTCG/PEG6/A10/SH/-3'; 35 염기

Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는 바코드 DNA를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법:
    1) 표적 분석물질(target analyte)에 특이적으로 결합하는 제1리간드가 결합된 자성 미세입자; 및 표적 분석물질에 특이적으로 결합하는 제2리간드 및 하나 이상의 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자를 시료와 혼합하여 자성 미세입자(magnetic microparticle; MMP)-표적 분석물질-바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자 복합체를 형성하는 단계;
    2) 자기장을 적용하여 상기 복합체를 분리하는 단계;
    3) 탈혼성화에 의해 분리된 복합체를 분해하는 단계;
    4) 상기 제3단계의 생성물에 자기장을 적용하여 자성 미세입자를 제거하고 바코드 DNA를 포함하는 금속 나노입자를 회수하는 단계;
    5) 상기 회수한 금속 나노입자로부터 바코드 DNA를 분리시키는 단계;
    6) PCR을 통한 증폭과정 없이 이전 단계로부터 수득한 바코드 DNA를 이와 상보적인 서열을 갖는 DNA와 혼성화시키는 단계; 및
    7) 겔 전기영동을 수행하여 분석하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물질은 단백질, DNA 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분석방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물질과 리간드 간의 특이적인 결합은 상보적인 서열 간의 혼성화, 항원-항체 간의 결합 및 리간드-수용체 간의 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분석방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1리간드는 직접 또는 링커를 통해 자성 미세입자에 결합된 것인 분석방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2리간드는 직접 또는 링커를 통해 바코드 DNA를 포함하는 나노입자에 결합된 것인 분석방법.
  6. 제1항에 있어서,
    표적 분석물질을 바코드 DNA의 증폭과정 없이도 1 젭토몰(1 zeptomole; 10-21 mole) 수준까지 검출할 수 있는 것이 특징인 분석방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 5)는 치환제로써 DTT(dithiothreitol)를 첨가하여 바코드 DNA를 금속 나노입자부터 분리시킴으로써 달성되는 것인 분석방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 5)는 시아나이드(CN-) 화합물을 첨가하여 금속 나노입자 자체를 분해시킴으로써 달성되는 것인 분석방법.
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