KR20130056543A - 병원체 검출용 마이크로디바이스 - Google Patents

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KR20130056543A
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Abstract

병원체(pathogen), 제 1 프로브(probe), 및 제 2 프로브를 믹싱하기 위한 수동식 마이크로믹서(passive micromixer); 상기 수동식 마이크로믹서에 연결된 자기적 분리(magnetic separation) 챔버; 및, 상기 자기적 분리 챔버에 연결된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스에 관한 것이다.

Description

병원체 검출용 마이크로디바이스{MICRODEVICE FOR PATHOGEN DETECTION}
본원은, 수동식 마이크로믹서(passive micromixer), 자기적 분리(magnetic separation) 챔버 및, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스에 관한 것이다.
LOC(랩 온 어 칩; Laboratory-on-a-chip) 기술은 단일한 웨이퍼에 몇몇의 화학적 및 생물학적인 기능적 유닛(unit)들을 도입함으로써 계속적으로 발전하고 있다. 마이크로 유체학에 기초한 소형화 및 집적화(integration)는, LOC 기술에 빠른 분석 시간, 샘플 소모 절감, 높은 검출 감응성, 자동화, 및 이동성 등의 많은 이점을 제공해주었다. 이와 관련하여, "모세관 밸브가 장착된 랩온어칩 및 랩온어칩용 모세관 밸브의 제조 방법" (대한민국 특허출원 공개특허 제10-2010-0071217호) 등의 연구가 있었다.
LOC 기술과 관련하여, 현재의 연구들은 샘플 준비 단계까지 칩 상에서 이루어지도록 함으로써 완전히 통합된 LOC 기술을 완성하여 POC(point-of-care) 테스팅을 하는 것에 목표를 두고 있다. LOC 기술이 생물학적 진단 및 고효율의 바이오/화학적 스크리닝에 적용될 수 있다는 것은 이미 입증된 바 있으며, 그 중에서도 칩 상에서의 병원체 분석은 특히 이목을 끌고 있는데, 이는 공중 감염성 질병의 위험성이 급증하고 있기 때문이다. 즉, 현장에서의 신속하고 정확한 병원체 진단을 할 필요가 있으며, 이를 위하여 PCR, 마이크로어레이, 또는 ELISA을 비롯한 다양한 분자적 검정들이 연구되고 있다.
그러나, 현재로서는 샘플 전처리 유닛의 통합과 검정 시간의 단축 등의 개선이 여전히 필요하며, E. coli O157과 같은 병원체들의 감염 도즈를 감안할 때 검출 감응성 또한 단일세포 수준으로 향상될 필요가 있다. 또한, POC 병원체 검출 시스템의 디자인 단순화, 바이오 검정 반응의 속도 향상, 감응성 향상 등도 요구된다.
본 발명자들은, 본원의 통합된 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용할 경우, 병원체 검출 시스템의 디자인 단순화, 바이오 검정 반응의 속도 향상, 및 감응성 향상 등 현행 LOC 기술에서 요구되는 여러 사항들을 동시에 만족시킬 수 있음을 발견하여 본원을 완성하였다.
이에, 본원은, 병원체(pathogen), 제 1 프로브(probe), 및 제 2 프로브를 믹싱하기 위한 수동식 마이크로믹서(passive micromixer); 상기 수동식 마이크로믹서에 연결된 자기적 분리(magnetic separation) 챔버; 및, 상기 자기적 분리 챔버에 연결된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스를 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 병원체(pathogen), 제 1 프로브(probe), 및 제 2 프로브를 믹싱하기 위한 수동식 마이크로믹서(passive micromixer); 상기 수동식 마이크로믹서에 연결된 자기적 분리(magnetic separation) 챔버; 및, 상기 자기적 분리 챔버에 연결된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스를 제공한다.
본원은 효율적인 수동식 마이크로믹서, 자기적 분리 챔버, 및 모세관 전기영동 마이크로채널을 포함하는, 단순하면서도 통합된 형태의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 제공하며, 상기 마이크로디바이스를 이용함으로써 임상 및 환경 샘플로부터 병원체를 샘플-인-앤서-아웃 능력(sample-in-answer-out)으로 현장 검출할 수 있어 이를 생물안정성 테스트, 환경 스크리닝, 및 임상 실험 등 다방면에 응용할 수 있다.
본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스는 1 종류의 병원체를 대상으로 하는 모노플렉스(monoplex) 병원체 검출, 또는 2 종류 이상의 병원체를 대상으로 하는 멀티플렉스(multiplex) 병원체 검출을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용함으로써 3 종류의 표적 병원체들(Staphylococcus aureus, Escherichia coli O0157:H7, 및 Salmonella typhimurium)에 대한 멀티플렉스 병원체 검출을 성공적으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 완전히 통합된 형태의 마이크로디바이스는, 샘플-인-앤서-아웃(sample-in-answer-out) 능력을 가지고 신속하면서도 높은 감응성으로 멀티플렉스 병원체 검출을 할 수 있도록 해주며, 이에 따라 상기 마이크로디바이스를 질병 진단 POC(point-of-care) 테스팅 등에 적용할 수 있다.
또한, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용할 경우, 종래의 분석 방법들을 이용하는 것에 비하여 훨씬 신속한 분석이 가능하다는 이점이 있다. 예를 들어, 상기 마이크로디바이스의 수동적 마이크로믹서를 이용하여 면역 복합체를 형성하는데 약 20 분이 소요되고, 상기 마이크로디바이스의 자기적 분리 챔버에서 자기적 분리 및 바코드 DNA 탈혼성화를 수행하는데 약 5 분 미만이 소요되며, 상기 마이크로디바이스의 모세관 전기영동 채널에서 전기영동법을 이용하여 바코드 DNA 가닥을 분리 및 검출하는데 약 5 분 미만이 소요됨으로써, 총 소요 시간은 약 30분 이하가 될 수 있으며, 이는 종래 분석 방법들에 비해 획기적으로 분석 시간이 단축된 것이다.
또한, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용할 경우, 병원체가 약 105 CFU(colony forming unit) 농도 이하인 경우에도 상기 병원체의 검출을 수행할 수 있다는 이점이 있다. 예를 들어, E. coli O157과 같은 병원체들을 검출하고자 하는 경우, 상기 병원체의 감염 도즈를 감안할 때 검출 감응성이 단일세포 수준으로 향상될 필요가 있는데, 본원의 마이크로디바이스를 이용하는 경우 이와 같은 검출 감응성을 만족하면서 효율적인 검출을 수행할 수 있다. 또한, 단일 세포 수준에서의 병원체 검출이 가능하다는 것 또한 본원의 마이크로디바이스가 보유하는 이점이다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 따라 제조된, 수동식 마이크로믹서, 자기적 분리 챔버, 및 모세관 전기영동 채널을 포함하는 병원체 검출용 마이크로디바이스의 모식도이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 따라 수행된 AuNP(Gold Nano Particle; 금 나노입자) 프로브들과 컨쥬게이션시키기 위한 항체의 최적량을 알기 위한 실험의 결과로서, 구체적으로, 도 2a는 단일클론 항-Staphylococcus aureus, 도 2b는 단일클론 항-E. coli O157:H7, 도 2c는 단일클론 항-Salmonella typhimurium에 관한 것이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따라 제조된 병원체 검출용 마이크로디바이스의 수동식 마이크로믹서 부분에서 효율적인 믹싱이 일어나는 것에 관한 모식도이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 따라 수행된 105 CFU의 Staphylococcus aureus를 이용한 상대적인 세포 포획 효율(relative cell capture efficiency) 실험 결과로서 얻은 보유 시간(retention time) 그래프이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 따라 수행된 모노플렉스 병원체 검출 결과를 나타내는 전기영동도로서, 구체적으로, 도 5a는 Staphylococcus aureus, 도 5b는 E. coli O157:H7, 도 5c는 Salmonella typhimurium에 관한 것이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 따라 수행된 모노플렉스 병원체 검출 실험에서 표적 병원체 농도(pathogen CFU)에 대응하는 상대적인 형광 세기(relative fluorescence unit; RFU)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은, 본원의 일 실시예에 따라 수행된 멀티플렉스 병원체 검출 실험에서 각 병원체의 농도가 105 CFU인 경우 시간에 따른 상대적인 형광 세기(relative fluorescence unit; RFU)를 측정하여 나타낸 그래프로서, 구체적인 멀티플렉스 병원체의 종류는 다음과 같다: (i) Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7, (ii) Staphylococcus aureus + Salmonella typhimurium, (iii) E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium, (iv) Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium.
도 8은, 본원의 일 실시예에 따른 마이크로디바이스를 이용한 검출 제한(Limit of detection; LOD) 테스트 결과 그래프로서, 피크들은 왼쪽부터 순서대로 병원체 Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7, 및 Salmonella typhimurium이 존재함을 의미한다.
아래에서는 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본원의 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
본원의 제 1 측면은, 병원체(pathogen), 제 1 프로브(probe), 및 제 2 프로브를 믹싱하기 위한 수동식 마이크로믹서(passive micromixer); 상기 수동식 마이크로믹서에 연결된 자기적 분리(magnetic separation) 챔버; 및, 상기 자기적 분리 챔버에 연결된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스를 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체는, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 대장균(Eschericia coli O157:H7), 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 박테리아 병원체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 병원체가 1 종류인 경우 모노플렉스(monoplex) 병원체 검출에 해당되고, 상기 병원체가 2 종류 이상인 경우 멀티플렉스(multiplex) 병원체 검출에 해당되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 병원체는 항체를 가지고 있는 모든 박테리아일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본원의 병원체 검출용 마이크로 디바이스는, 항체를 가지고 있는 모든 박테리아뿐만 아니라 항체를 가지고 있는 모든 암세포나 기타 단백질을 검출하기 위해서도 응용될 수 있는 것이며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 제 1 프로브는 MMP(Magnetic microparticle; 자기적 마이크로 입자) 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 제 1 프로브가 상기 MMP 프로브인 경우, 본원의 마이크로디바이스에 포함되어 있는 상기 자기적 분리 챔버를 이용하여 분리하는 것이 용이해질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 MMP 프로브는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 항체를 고정화된 형태로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 MMP 프로브 표면에 고정화된 상기 병원체에 특이적인 항체는 1 종류로서 복수개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체와 관련하여, 실험적으로 MMP(Magnetic microparticle; 자기적 마이크로 입자) 등의 자성 입자의 경우 이에 단일클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 반면, AuNP(Gold Nanoparticle; 금 나노 입자) 등의 금속 나노 입자의 경우 이에 다중클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 상기 MMP 프로브는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 단일클론 항체를 고정화된 형태로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 제 2 프로브는 금, 은, 백금, 팔라듐, 구리, 니켈, 아연, 산화실리콘, 또는 폴리스티렌의 나노 입자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 제 2 프로브는 AuNP(Gold Nanoparticle; 금 나노 입자) 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제 2 프로브는 AuNP 이외에도 DNA를 부착할 수 있는 모든 종류의 나노 입자를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 제 2 프로브는 AuNP 대신 폴리스티렌 나노 입자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노 입자는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 항체 및 바코드 DNA(Barcode DNA)를 고정화된 형태로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 바코드 DNA는 5'말단에 FAM(6-carboxy-fluorescine) 표지(label)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 상기 바코드 DNA 가닥의 사이즈는 표적 박테리아 병원체별로 상이할 수 있으며, 이에 따라 전기영동시 전기영동도에서 나타나는 바코드 DNA의 피크들의 분리 시간(elution time)이 표적 박테리아 병원체별로 상이할 수 있어, 이를 이용하여 본원의 마이크로디바이스를 모노플렉스 병원체 검출은 물론이고 멀티플렉스 병원체 검출에도 유용하게 적용할 수 있으나, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 나노 입자의 표면에 고정화된 상기 병원체에 특이적인 항체는 1 종류로서 복수 개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 나노 입자의 표면에 고정화된 상기 바코드 DNA 또한 1 종류로서 복수 개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체와 관련하여, 실험적으로 MMP(Magnetic microparticle; 자기적 마이크로 입자) 등의 자성 입자의 경우 이에 단일클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 반면, AuNP(Gold Nanoparticle; 금 나노 입자) 등의 금속 나노 입자의 경우 이에 다중클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 상기 나노 입자는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 다중클론 항체를 고정화된 형태로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수동식 마이크로믹서는 1 개 이상의 코너를 포함하고 치아-형태의 프로젝션을 내부에 포함하는 창자-형태(intestine-shaped)의 구조를 가지며, 상기 코너에서 발생되는 원심력에 의하여 믹싱(mixing) 효율을 높이는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수동식 마이크로믹서는 상기 병원체, 상기 제 1 프로브, 및 상기 제 2 프로브를 믹싱함으로써 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체를 형성하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 수동식 마이크로믹서에서 형성된 상기 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체는 다음 단계인 상기 자기적 분리 챔버로 넘어가되, 상기 복합체를 형성하지 못한 상기 제 1 프로브, 상기 병원체, 및 상기 제 2 프로브는 수세 과정 등을 통하여 제거될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 자기적 분리 챔버는, 자기장을 적용하여 상기 수동식 마이크로믹서에서 형성된 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체 중 일부분을 분리하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 복합체 중 분리되는 일부분은 상기 제 2 프로브의 나노 입자의 표면에 고정화된 바코드 DNA의 탈혼성화된 가닥일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 자기적 분리 챔버가 히터에 의해 가열되고 이 과정에서 상기 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체에 포함되어 있는 바코드 DNA가 탈혼성화되며, 이후 자기장이 적용됨으로써 탈혼성화된 바코드 DNA 가닥을 제외한 상기 복합체가 자기장에 의해 붙들리고, 이후 고압 전원이 공급됨으로써 상기 탈혼성화된 바코드 DNA 가닥만이 분리되어 모세관 전기영동 채널 쪽으로 이동될 수 있으나, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 모세관 전기영동 채널은, 상기 수동식 마이크로믹서에서 형성된 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체 중 상기 자기적 분리 챔버에서 분리된 일부분을 모세관 전기영동을 이용하여 정량적으로 검출하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 자기적 분리 챔버에서 분리된 일부분은 상기 탈혼성화된 바코드 DNA 가닥일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분리된 일부분이 바코드 DNA 가닥인 경우, 이를 분석하는데 이용될 수 있는 방법은 다양한데, 그 중 마이크로 칩 상에서 이루어지는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis; CE) 방법은 DNA 혼성화(hybridization) 방법을 능가하는 것으로서, 이를 통해 보다 정밀하고 간단하며 빠른 정량 분석이 가능하다는 점에서 유용한 방법이다. 전기영동 결과 상에 나타나는 피크들의 분리 시간(elution time)은 DNA 사이즈에 영향을 받기 때문에 용이하게 표적 DNA를 인식할 수 있도록 해주며, 칩 상에서의 단일 염기 분해(single base resolution) 분리는 멀티플렉스 DNA 분자 분석을 가능하게 해준다. 이와 같은 이점들 때문에, 마이크로 모세관 전기영동 방법에 기초한 유전 분석은 STR(short tandem repeat) 지노타이핑, DNA 시퀀싱, 및 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석 등에 널리 적용될 수 있으며, 본원에서도 상기 모세관 전기영동 채널을 이용하여 분리된 바코드 DNA 가닥의 정량적인 검출을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본원의 마이크로디바이스에 포함되는 상기 모세관 전기영동 채널은 크로스-인젝터 디자인을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 상기 크로스-인젝터 디자인을 가지는 상기 모세관 전기영동 채널은 약 140 μm의 넓이와 약 40 μm의 깊이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 상기 모세관 전기영동 채널은 상기 채널의 양 말단에 애노드와 캐소드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 상기 수동식 마이크로믹서 이전에 샘플 투입구(sample inlet)를 추가 포함하며, 상기 샘플 투입구를 통하여 상기 병원체, 상기 제 1 프로브, 및 상기 제 2 프로브가 투입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는, 상기 자기적 분리 챔버와 연결된 샘플 저장고(sample reservoir) 및 폐기물 저장고(waste reservoir), 및 상기 모세관 전기영동 채널과 연결된 캐소드 저장고(cathode reservoir) 및 애노드 저장고(anode reservoir)를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 샘플 저장고 및 폐기물 저장고는, 각각 독립적으로, 상기 자기적 분리 챔버의 일 말단과 직접 연결된 것일 수도 있고, 도 1에 도시한 바와 같이 상기 자기적 분리 챔버의 일 말단과 도관 등에 의하여 간접 연결된 것일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폐기물 저장고는, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스 중 모세관 전기영동 채널로 투입되는 물질 이외의 물질을 분리 저장하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 캐소드 저장고 및 애노드 저장고는, 각각 독립적으로, 상기 모세관 전기영동 채널의 일 말단과 직접 연결된 것일 수도 있고, 또는 도관 등에 의하여 간접 연결된 것일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같이 샘플 저장고, 폐기물 저장고, 캐소드 저장고, 및 애노드 저장고를 포함하는 전기영동 마이크로디바이스를 지칭하여 '크로스 인젝터 디자인의 전기영동 마이크로 디바이스'라 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 1 종류의 병원체를 대상으로 하는 모노플렉스(monoplex) 병원체 검출, 또는 2 종류 이상의 병원체를 대상으로 하는 멀티플렉스(multiplex) 병원체 검출을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용함으로써 3 종류의 표적 병원체들(Staphylococcus aureus, Escherichia coli O0157:H7, 및 Salmonella typhimurium)에 대한 멀티플렉스 병원체 검출을 성공적으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 완전히 통합된 형태의 마이크로디바이스는, 샘플-인-앤서-아웃(sample-in-answer-out) 능력을 가지고 신속하면서도 높은 감응성으로 멀티플렉스 병원체 검출을 할 수 있도록 해주며, 이에 따라 상기 마이크로디바이스를 질병 진단 POC(point-of-care) 테스팅 등에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용하여 상기 병원체 검출을 수행하는데 필요한 총 소요 시간이 약 30 분 이하인 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 마이크로디바이스의 수동적 마이크로믹서를 이용하여 면역 복합체를 형성하는데 약 20 분이 소요되고, 상기 마이크로디바이스의 자기적 분리 챔버에서 자기적 분리 및 바코드 DNA 탈혼성화를 수행하는데 약 5 분 미만이 소요되며, 상기 마이크로디바이스의 모세관 전기영동 채널에서 전기영동법을 이용하여 바코드 DNA 가닥을 분리 및 검출하는데 약 5 분 미만이 소요됨으로써, 총 소요 시간은 약 30분 이하가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용하여 상기 병원체 검출을 수행하는데 필요한 총 소요 시간은 약 20 분 이하, 약 25 분 이하, 또는 약 30 분 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용할 경우, 종래의 분석 방법들을 이용하는 것에 비하여 훨씬 신속한 분석이 가능하다는 이점이 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 단일세포 수준에서 상기 병원체의 검출을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 상기 병원체가 약 105 CFU 이하, 약 104 CFU 이하, 약 103 CFU 이하, 약 102 CFU 이하, 약 10 CFU 이하, 또는 약 1 CFU인 경우에도 상기 병원체의 검출을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 병원체가 약 1 CFU인 경우가 상기 병원체가 단일세포 수준인 경우를 의미하는 것이며, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용할 경우 단일세포 수준에서 상기 병원체의 검출을 수행할 수 있으나, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, E. coli O157과 같은 병원체들을 검출하고자 하는 경우, 상기 병원체의 감염 도즈를 감안할 때 검출 감응성이 단일세포 수준으로 향상될 필요가 있는데, 본원의 마이크로디바이스를 이용하는 경우 이와 같은 검출 감응성을 만족하면서 효율적인 검출을 수행할 수 있다.
이와 관련하여, 도 1은, 본원의 수동식 마이크로믹서, 자기적 분리 챔버, 및 모세관 전기영동 채널을 포함하는 병원체 검출용 마이크로디바이스의 모식도이다. 상기 도 1의 모식도를 참조하면, 본원의 마이크로디바이스는 바이오 검정 반응의 속도 향상, 및 감응성 향상 등의 개선된 성능을 보유하면서도 구조상으로는 단순하고 통합된 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있다. 상기 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용함으로써, 임상 및 환경 샘플로부터 병원체를 샘플-인-앤서-아웃 능력(sample-in-answer-out)으로 현장 검출할 수 있어 이를 생물안정성 테스트, 환경 스크리닝, 및 임상 실험 등에 응용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스는 랩 온 어 칩(Laboratory-on-a-chip; LOC) 기술의 개선을 위해 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스는 포인트 오브 케어(Point-of-care; POC) 서비스를 위하여 사용될 수 있는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 병원체, 항체, 및 바코드 DNA 의 준비
본 실시예에서는 분석 대상 병원체로서 3 종류의 표적 박테리아 세포들(Staphylococcus aureus (KCTC 1621), E. coli 0157:H7 (KCTC 1039), Salmonella typhimurium (KCTC 2054))을 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 입수하여 사용하였다. 상기 박테리아 세포들은 소고기 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 아가 15 g, 및 증류수 1 L를 포함하는 영양 배지 안에서 37 ℃ 온도에서 호기성 배양되었다.
또한, 항체 중 Staphylococcus aureus 및 E. coli에 대한 마우스의 단일클론항체 및 다중클론항체는 Milipore(Temecula, CA, USA) 사에서 입수하였으며, Salmonella typhimurium에 대한 마우스의 단일클론항체 및 다중클론항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA) 사로부터 입수하였다. MMP(Magnetic microparticle; 자기적 마이크로 입자) 등의 자성 입자의 경우 이에 단일클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 반면, AuNP(Gold Nanoparticle; 금 나노 입자) 등의 금속 나노 입자의 경우 이에 다중클론항체를 고정하는 것이 효율 향상에 도움이 되는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 실시예에서는 상기와 같이 단일클론항체 및 다중클론항체를 모두 사용하였다.
한편, 3 쌍의 이중나선 바코드 DNA는 티올화되고 FAM(6-carboxy-fluorescine) 표지가 된 상태로 준비하였으며, AuNP 프로브 합성을 위하여 사용되었다. 상기 3 쌍의 바코드 DNA 가닥의 염기 서열들은 각각 하기와 같았다:
(1) Staphylococcus aureus의 경우,
5'-SH-C6-GGTAAGCATCGAGGTAAGCA-3' 및
5'-FAM-TGCTTACCTCGATGCTTACC-3' (20-mer)
(2) E. coli 0157:H7의 경우,
5'-SH-C6-AAAAAAAAAAAAAAATACCACATCATCCAT-3' 및
5'-FAM-ATGGATGATGTGGTATTTTTTTTTTTTTTT-3' (30-mer)
(3) Salmonella typhimurium의 경우,
5'-SH-C6-AAAAAAAAAAAAAAATACCTACTACAAAATAAAAAAAAAA-3' 및
5'-FAM-TTTTTTTTTTATTTTGTAGTAGGTATTTTTTTTTTTTTTT-3' (40-mer)
2. 제 1 프로브 및 제 2 프로브의 준비
입자 프로브들은 공지된 프로토콜에 따라 합성되었으며, 그 구체적인 과정은 하기와 같았다.
우선, 토실-활성화된 자기적 비드들(Dynabeads M280 Tosyl-activated, 지름 2.8 μm, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)은 항체의 일차 아미노기에 공유결합 형태로 연결되었다.
다음으로, MMP(자기적 마이크로 입자; magnetic microparticles) 프로브를 제조하였다. 이를 위해, 100 μL의 MMP(~2 x 108)를 1 mL의 붕산염(borate) 버퍼(0.1 M, pH 9.5)를 이용하여 3 차례 수세하였으며 이때 자기적 분리도 함께 수행하였다. 이후 상기 MMP는 60 μg의 항체(Ab, 107 MMP 당 3 μg의 항체)를 포함하는 200 μL의 붕산염 버퍼 내에서 재-분산되었다. 상기 MMP와 상기 항체의 컨쥬게이션은 볼텍싱하면서 24 시간에 걸쳐 37℃에서 수행되었다. 이후, 상기 항체와 컨쥬게이션된 MMP는 자석 위에 올려졌으며 PBS(0.01 M, pH 7.4)를 이용하여 5 분 동안 4℃에서 수세되었다. 이와 같이 제조된 MMP 프로브들은 37℃에서 4 시간 동안 250 μL의 블로킹 버퍼(0.2 M Tris, pH 8.5)를 첨가함으로써 부동태화(passivate; 화학적으로 반응 또는 용해되지 않도록 처리)되었으며, 5 분 동안 4℃에서 수세되었다. 상기 MMP 프로브들은 사용되기 전까지 4℃에서 1 mL PBS 내에 저장되었다.
상기 MMP와 상기 항체들의 커플링 효율은 반응 전과 후에 걸쳐 280 nm에서의 흡광도에 기초하여 측정되었다 [커플링 효율(%) = {(A 280, before A 280,after)/ (A 280, before)} x 100]. 구체적으로, 2 x 108 MMP 내에서 각 항체들의 로딩된 양은, 단일클론 항-Staphylococcus aureus의 경우 50.9 μg, 단일클론 항-E. coli 0157:H7의 경우 56.4 μg, 및 단일클론 항-Salmonella typhimurium의 경우 34.4 μg 였으며, 각각의 경우 커플링 효율은 84.8%, 93.9%, 및 57.1% 였다.
다음으로, AuNP(금 나노 입자; gold nanoparticles) 프로브를 제조하였다. 상기 AuNP 프로브는 항체를 0.1 mL의 AuNP 용액(2 x 1011 mL-1 = 330 fmoles mL-1, 지름 30 nm, BBInternational, UK)에 pH 9.2 하에서 첨가함으로써 제조되었다.
상기 AuNP와 컨쥬게이션시키기 위한 각 항체의 양은, 2 x 1010의 AuNP에 대하여 Staphylococcus aureus의 경우 약 100 ng, E. coli 0157:H7의 경우 약 300 ng, 및 Salmonella typhimurium의 경우 약 100 ng 였다.
이와 관련하여, 도 2는, 본 실시예에서 수행된 AuNP 프로브들과 컨쥬게이션시키기 위한 항체의 최적량을 알기 위한 실험의 결과로서, 구체적으로, 도 2a는 단일클론 항-Staphylococcus aureus, 도 2b는 단일클론 항-E. coli O157:H7, 도 2c는 단일클론 항-Salmonella typhimurium에 관한 것이다. 구체적으로, 도 2에서의 레드-쉬프트(즉, 자색)는 NaCl(2M, 10 μL)에 의하여 유도된 AuNP의 응집을 나타낸다. 이는 티올화된 바코드 DNA와 결합하기 위하여 AuNP가 얼마나 많은 표면적을 제공할 수 있는지에 대한 대략적인 표지가 된다. 예를 들어, 도 2a를 참조하면, 항체가 없는 AuNP들은 레드-쉬프트를 보이면서 응집되는 반면 항체와 컨쥬게이션된 AuNP들은 안정하며 응집되지 않는다. 즉, 충분한 항체가 AuNP 표면에 고정화되어 있으면 입자의 응집이 방지되며, 이는 티올화된 바코드 DNA 가닥들이 결합할 표면 또한 충분하지 않다는 것을 의미한다. 도 2a 내지 도 2c의 결과를 통하여, AuNP 프로브들과 컨쥬게이션시키기 위한 항체의 최적량은 0.1 mL AuNP를 기준으로 할 때, 단일클론 항-Staphylococcus aureus의 경우 100 ng, 단일클론 항-E. coli O157:H7의 경우 300 ng, 단일클론 항-Salmonella typhimurium의 경우 100 ng을 확인할 수 있었다.
상기 AuNP를 상기 최적량의 항체로 개질시키기 위하여, 우선, 실온에서 믹서기(Dynabeads Sample Mixer)를 이용하여 천천히 볼텍싱하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 항체로 개질된 AuNP를 새롭게 절단된 티올화된 바코드 DNA 가닥들(1 nmole)과 16 분 동안 반응시켰다. 상기 티올화된 바코드 DNA는, 디티오트레이톨(DTT, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 처리하여 DNA의 보호된 다이설파이드 결합을 티올기로 환원시킴으로써 준비되었으며, illustra NAP-5 컬럼(GE Healthcare, NJ, USA)으로 정제하였다. 이후, 상기 AuNP는 0.1 M NaCl 하에서 염-안정화되었으며 1% BSA 용액 하에서 30분 동안 부동태화되었다. 상기 AuNP를 13000 rpm으로 1 시간 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 제거하였으며, 이러한 과정은 2 차례 반복되었다. 이후, 상기 AuNP는 PBS 내에서 재-분산되었고 FAM-표지된 상보적인 DNA 가닥들과 37℃에서 6 시간 동안 혼성화되었다. 상기 항체 및 AuNP가 표지된 이중 바코드 DNA는 원심분리 절차를 이용하여 다시 정제되었으며, 200 μL의 워싱 버퍼(즉, 0.1% BSA 및 0.02% Tween 20을 포함하는 PBS) 내에서 재-분산되었다. 이와 같이 제조된 AuNP 프로브들은 사용 전까지 4℃의 저온에서 저장되었다.
상기 AuNP 프로브에 있어서, 바코드 DNA가 로딩된 양은 260 nm에서의 흡광도에 기초하여 측정되었다. 구체적으로, 2 x 1010 AuNP 당 바코드 DNA 상보 가닥의 수는 각각, 0.368, 0.377, 및 0.434 nmole 이었으며, 이는 각 AuNP 당 1.11 x 104, 1.13 x 104, 및 1.31 x 104의 바코드 DNA 가닥에 상응하는 것이다.
3. 병원체 검출용 마이크로디바이스의 제조
본 실시예의 병원체 검출용 마이크로디바이스는, 도 1에 나타낸 것과 같이 3 개 파트들, 즉, 수동식 마이크로믹서, 자기적 분리 챔버, 및 모세관 전기영동 마이크로채널을 포함하고 있다.
상기 수동식 마이크로믹서는 도 3에 나타낸 바와 같이 창자-형태의 구불구불한 3D 구조를 가지고 있어서 병원체, 제 1 프로브, 및 제 2 프로브가 효율적으로 믹싱되고 면역-결합 반응을 일으켜 병원체-제 1 프로브-제 2 프로브의 복합체가 형성될 수 있도록 해주었다. 본 실시예에 있어서 상기 수동식 마이크로믹서는 17.9 cm 길이 x 250 μm 너비 x 100 μm 높이를 가져, 총 부피가 3.80 μL 였다.
한편, 상기 자기적 분리 챔버는 부피가 1.8 μL 였으며 상부의 외부 자석 및 하부의 필름 히터 사이에 샌드위치되어 있었다. 상기 자기적 분리 챔버 내에서는 병원체-제 1 프로브-제 2 프로브의 복합체 중 바코드 DNA 플러그만이 분리 발생되어, 크로스-인젝터 디자인을 가지며 6 cm의 분리 길이를 가지는 모세관 전기영동 마이크로채널 쪽으로 내려갔다.
본 실시예의 병원체 검출용 마이크로디바이스에 통합된 상기 수동식 마이크로믹서는 유리-유리 웨이퍼를 이용하여 제조되었다. 상기 유리-유리 웨이퍼의 상부 웨이퍼 상에 수동식 마이크로믹서-자기적 분리 챔버-모세관 전기영동 마이크로채널의 패턴을 형성하기 위하여, 우선 저압의 화학기상증착법(CVD)을 이용하여 100 mm의 보로플롯(borofloat) 웨이퍼(1.1 mm 두께, PG&O, Santa Ana, CA, USA)를 200 nm 무정형 실리콘으로 코팅하였다. 이후, 상기 웨이퍼 상에 포토레지스트(S1818, Rohm & Haas, Philadelphia, PA, USA)가 2 μm 두께로 스핀 코팅되었으며, 포토 마스크 상의 수동식 마이크로믹서-자기적 분리 챔버-모세관 전기영동 마이크로채널의 패턴이 상기 웨이퍼 상으로 UV 노출에 의하여 전사되었다. 현상(developing) 이후, UV에 노출된 실리콘 하드 마스크는 SF6 플라즈마(VSRIE-400A, Vacuum Science, Korea)에서 RIE(reactive ion etching) 방식을 이용하여 제거되었다. 이어서, 49%의 하이드로 플루오르산 용액을 이용하여 8 분 동안 등방성 습식 식각을 수행하여 깊이 50 μm, 너비 140 μm 형태의 웨이퍼가 되도록 하였다. 잔존 포토레지스트는 10 분 동안 아세톤으로 수세하였으며, 실리콘 희생층은 SF6 플라즈마에서 RIE 방식을 이용하여 제거하였다. 저장고(Reservoir) 구멍들은 셜린 수직 밀링 기계(Sherline vertical milling machine; Model 2010, Sherline Products, Vista, CA, USA)를 이용하여 1 mm 지름으로 뚫었다.
하부 웨이퍼 상의 수동식 마이크로믹서-자기적 분리 챔버-모세관 전기영동 마이크로채널의 패턴 또한 상기와 같은 공정을 50 μm 깊이로 수행함으로써 형성되었다. 이후 상부 및 하부 웨이퍼가 정렬되었고 668℃에서 2 시간 동안 열처리하여 결합된 유리-유리 웨이퍼를 형성하였다. 또한, 3 mm 지름으로 간간히 끼어들어 있는 3 mm 두께의 PDMS 막을 UV-오존 클리너 안에서 5 분 동안 처리하였다. 이후 샘플 저장고(reservoir), 폐기물 저장고(waste reservoir), 캐소드, 및 애노드가 조립되어 전극 연결을 형성함으로써 본 실시예의 병원체 검출용 마이크로디바이스가 완성되었다.
4. 병원체 검출용 마이크로디바이스에 포함된 수동식 마이크로믹서
본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스의 효율을 극대화하기 위해서는 마이크로믹서 및 유속을 최적화하는 것이 중요하다. 본원의 창자-형태의 구불구불한 3D 마이크로믹서는, 구불구불한 디자인이 코너들에서의 원심력에서 기인하는 높고 신속한 믹싱 효율 때문에 유용하다. 구불구불한 디자인에 추가적으로, 본원의 마이크로믹서에서는 규칙적인 치아-형태의 프로젝션이 상기 구불구불한 마이크로채널 내부에 도입되도록 하여 믹싱 효율이 한층 더 향상되도록 하였다. 상부 및 하부 유리 웨이퍼 모두 이와 같은 치아-형태의 프로젝션을 가지고 있으며, 이는 도 3의 하단에 도시한 바와 같다.
이러한 믹서의 구조에 따라 병원체 샘플 및 입자 프로브 용액들이 수직적 및 수평적으로 이동하는 것이 가능하게 되어, 향상된 믹싱 효율로서 면역 복합체들을 형성할 수 있었다. 본원의 믹서의 믹싱 효율은 적색 및 청색 염료들을 이용하여 믹싱 테스트를 수행함으로써 확인되었다.
상기 믹싱 테스트 결과, 상기 수동식 믹서의 완전한 믹싱은 최대 유속인 5000 μL/h 하에서 4 믹싱 유닛들(대략 3.25 cm 이내의 길이로서, 총 길이의 25%)을 지나간 뒤에 달성되었으며, 이는 확대된 디지털 이미지 내에서 균일한 자색을 관찰함으로써 확인되었다. 상기 테스트 결과는, 낮은 유속이 보다 나은 믹싱을 돕는다는 점을 암시하였다. 이에 따라, 본원에서는 상기 수동식 믹서 내에서 입자 프로브들 및 표적 세포들의 보유 시간을 컨트롤함으로써 다양한 유속에서의 세포 포획 효율을 평가하였다.
구체적으로, 세포 샘플로서 105 CFU의 Staphylococcus aureus가 입자 프로브들과 함께 주입되었으며 마이크로 유체 채널을 따라 믹싱되었고, 이 때 유속은 3.8 내지 100 μL/h였다. 이후 면역 복합체들이 분리 챔버 상부 자석을 이용하여 분리되었고, 이후 바코드 DNA들이 고무 히터로 챔버를 가열함으로써 분리되었다. 회수된 바코드 DNA들의 형광 신호는 모세관 전기영동을 이용하여 정량적으로 분석되었으며, 상대적인 세포 포획 효율은 유속 3.8 μL/h에 상응하는 60 분의 보유 시간(retention time)에서의 형광 신호를 100%로 하여 상대적인 값으로 계산되었다.
이와 관련하여, 도 4는 105 CFU의 Staphylococcus aureus를 이용한 상대적인 세포 포획 효율(relative cell capture efficiency) 실험 결과로서 얻은 보유 시간(retention time) 그래프이다. 도 4를 통해 상기 세포 포획 효율이 상기 보유 시간에 비례하여 증가됨을 알 수 있으며, 특히, 세포의 75%가 20분의 보유 시간(즉, 11.5 μL/h의 유속)에 포획되었음이 확인되었다.
이러한 결과를 참조하여, 실험의 전체 과정이 신속하게 수행되는 동시에 본원의 디바이스가 병원체 검출에 대하여 높은 검출 감응성을 유지할 수 있도록 하기 위하여, 이후 실험들에서는 보유 시간을 20 분으로 고정하였다.
5. 병원체 검출용 마이크로디바이스의 작동
수동식 마이크로믹서를 이용한 믹싱 이후 본 실시예의 마이크로디바이스를 병원체를 검출하는 것은 2 단계, 즉, 자기적 분리 챔버를 이용한 표적 병원체의 포획 단계, 및 모세관 전기영동 채널을 이용한 바코드 DNA 검출 단계로 이루어졌다. 상기 2 단계가 수행되는 것은 도 1에 도식화되어 있다.
먼저, 모세관 전기영동 마이크로채널은 1 M NaOH로 10 분, 1 M HCl로 3 분 처리하여 수세되었으며 물을 이용하여 헹구어졌다. 이후, 상기 채널은 다이나믹 코팅(DEH-100, The Gel Company, San Francisco, CA, USA)용액에 50% v/v 메탄올 혼합액으로 채녈 내에서 2 분 동안 분리 중에 전기삼투 흐름(electroosmotic flow)이 최소화되도록 전처리되었다.
6 M 우레아, 및 5% LPA(Linear polyacrylamide)가 상기 채널에 충진되었으며, 이는 체거름 매트릭스의 역할을 수행하기 위한 것이었다. 폐기물(waste) 저장고, 캐소드, 및 애노드는 각각 1 x TTE (Tris TAPS EDTA) 버퍼로 채워졌다.
이후, MMP 프로브, 및 AuNP 프로브 각각 10 μL, 및 표적 병원체를 포함하는 샘플 용액 10 μL가 시린지 펌프를 이용하여 샘플 투입구(sample inlet)로부터 마이크로디바이스로 도입되었다. 상기 용액들은 흘러가면서 수동식 마이크로믹서에 의하여 잘 믹싱되었으며, MMP 프로브-병원체 박테리아-DNA 바코드를 포함하는 AuNP 프로브가 샌드위치 형태의 면역 복합체를 형성하였다. 상기 면역 복합체들은 상기 마이크로디바이스의 자기적 분리 챔버 상에서 자석을 이용하여 수집되며, 상기 복합체를 형성하지 않은 프로브들 및 표적 병원체들은 PBS(0.01 M, pH 7.4)에 의하여 수세되었다.
실리콘 고무 히터(SR020312, Hanil Electric Heat Engineering, Korea)로 95℃에서 3 분 동안 자기적 분리 챔버를 가열함으로써 AuNP 프로브로부터 FAM-표지된 바코드 DNA 가닥들이 탈혼성화되었다. 이후, 고압 전원이 공급되어 FAM-표지된 바코드 DNA를 선택적으로 상기 모세관 전기영동 마이크로채널로 이동시켰다. 이후의 모세관 전기영동 및 레이저-유도된 형광 검출은 기존에 알려진 방법들에 의하여 수행되었다. 간략히 설명하면, 상기 채널은 실리콘 고무 히터(SR020312, Hanil Electric Heat Engineering, Korea)를 이용하여 가열되었으며 온도 컨트롤러(TZ4ST-14S, Autonics, Korea)로 모니터링하여 70℃로 유지되었다. 1000 및 0 V 전원(PS300 series, Stanford Research Systems)이 폐기물 및 샘플 저장고에 60 초 동안 공급되어, 분리된 바코드 DNA 가닥들이 인젝션 채널 안쪽으로 로딩되도록 하였다. 인젝션 크로스에서 DNA 플러그를 분리시키기 위하여, 900 V의 전압이 샘플 및 폐기물 저장고에 10 초 동안 전기장력 300 V cm-1로 상기 채널을 따라 공급되었다. 이후, 애노드에 1800 V를 공급함으로써 모세관 전기영동 분리가 수행되었으며, 이때 샘플 및 폐기물 저장고는 부유(float) 상태로 유지되었다. 이와 같은 일련의 작동은 LabVIEW 프로그램에 의하여 자동적으로 컨트롤되었다.
분리된 FAM-표지된 바코드 DNA 가닥들의 형광 분리 신호들은 레이저-유도 공초점 형광 현미경(CIsi, Nikon, Japan)을 이용하여 검출되었다. 이때, 아르곤 레이저로부터 나온 488 nm의 여기(excitation) 파장이 이용되었고, 파워 강도는 10 x Plan Apo objective(NA 0.45)에서 측정된 바에 따르면 3.6 mW였다. 스캐닝 범위(0.016 mm2)는 애노드 쪽 분리 채널에서 확인되었으며, 데이터는 초 당 5 프레임의 스캐닝 비율로서 수득되었다. FAM의 분리 신호는 505-530 nm의 밴드 패스 필터를 통하여 검출되었다. 전기영동도 내의 피크들은 PeakFit(Version 4.12) 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다.
6. 모노플렉스 검출
병원체들의 정량적이고 감응성 높은 검출을 위한 마이크로디바이스를 달성하기 위해서는, 본원의 신규한 디바이스는 여러 크기차수(orders of magnitude)에 걸쳐 낮은 검출 제한(LOD; Limit od Detection) 값으로 높은 신호 반응성을 제공할 수 있음을 입증할 필요가 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 본원의 마이크로디바이스의 능력을 1-106 CFU 범위의 3 가지 표적 병원체들(Staphylococcus aureus, E.coli O157:H7, salmonella typhimurium)을 동정함으로써 입증하였다.
이와 관련하여, 도 5는, 본 실시예의 모노플렉스 병원체 검출 결과를 나타내는 전기영동도로서, 구체적으로, 도 5a는 Staphylococcus aureus, 도 5b는 E. coli O157:H7, 도 5c는 Salmonella typhimurium에 관한 것이다. 도 5를 참조하면, 표적 세포의 농도가 증가될수록 전기영동도 상에서 높은 피크 강도가 나타난다는 것을 확인할 수 있다. 각각의 피크들의 분리 시간은 160 초, 180 초, 및 200 초였으며, 이는 각각의 병원체들(Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7, salmonella typhimurium)이 20-mer 바코드 DNA, 30-mer 바코드 DNA, 40-mer 바코드 DNA인 것과 일치하는 결과이다. 이와 같은 DNA 바코드 가닥들의 형광 피크들은 5 분 내에 전기영동도 내에서 형성되었으며, 이는 본원의 마이크로디바이스를 이용한 병원체 검출의 신속성을 보여주는 것이다.
한편, 도 6은 본 실시예의 모노플렉스 병원체 검출 실험에서 표적 병원체 농도(CFU)에 대응하는 상대적인 형광 세기(relative fluorescence unit; RFU)를 측정하여 나타낸 그래프로서, 상기 그래프는 시그모이달(sigmoidal) 관계를 보여주고 있으며, 각각 병원체들의 역동적인 범위는 1-106 CFU로 결정되었다. 이와 관련하여, 하기 표 1은 도입된 세포 수에 따른 모노플렉스 병원체 검출에서의 RFU 값을 나타낸 것이며, 하기 표 2는 병원체들의 정량적 분석을 위한 시그모이달 방정식을 나타낸 것이다:
Figure pat00001
Figure pat00002
상기 표 1의 데이터에 따르면, 1 CFU의 각각의 병원체들(Staphylococcus aureus, E.coli O157:H7, salmonella typhimurium)의 형광 강도는 각각 31±4.8, 46±6.2, 및 11±4.8 RFU로서 배경 노이즈인 1.92±0.65 RFU로부터 명확하게 구별되었고, 이를 통해 단일 세포 검출이 성공적으로 수행되었음을 확인할 수 있었다.
한편, 총 분석에 소요된 시간은 30 분 이하로서, 구체적으로 면역 복합체 형성 반응에 소요된 약 20 분, 자기적 분리 및 바코드 DNA 탈혼성화를 위해 소요된 약 5 분 미만, 전기영동을 이용한 분리 및 검출에 소요된 약 5 분 미만이었으며, 이를 통해 본원의 마이크로디바이스를 이용할 경우 종래의 분석 방법들을 이용하는 것보다 훨씬 신속한 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
7. 멀티플렉스 병원체 검출
본 실시예의 병원체 검출용 마이크로디바이스 상에서의 병원체 검출을 위한 선택성 및 멀티플렉스 이용가능성을 평가하기 위하여, 4 가지 테스트들이 표적 병원체들의 여러 가지 조합들에 대하여 수행되었으며, 이 때 3 세트의 입자 프로브들은 모두 존재하는 상태였다.
구체적으로, 본 발명자들은, 도입되는 세포 수가 105 CFU라는 동일한 조건들 하에서, 2 종류의 표적 병원체를 각각 조합하였으며 (Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus + Salmonella typhimurium, 및 E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium), 3 종류의 표적 병원체들 모두를 조합하기도 하였다 (Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium).
이와 관련하여, 도 7은, 본 실시예의 멀티플렉스 병원체 검출 실험에서 각 병원체의 농도가 105 CFU인 경우 시간에 따른 상대적인 형광 세기(relative fluorescence unit; RFU)를 측정하여 나타낸 그래프로서, 구체적인 멀티플렉스 병원체의 종류는 다음과 같다: (i) Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7, (ii) Staphylococcus aureus + Salmonella typhimurium, (iii) E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium, (iv) Staphylococcus aureus + E. coli O157:H7 + Salmonella typhimurium.
도 7의 모든 피크들은 높은 신호-노이즈 비율로 예상되었던 검출 시간에 나타났다. 이는, 표적 병원체들의 존재가 정확하게 나타났음을 의미한다. 여기에서 중요한 것은, 3 세트의 입자 프로브들이 모두 공존함에도 불구하고 입자와 병원체의 면역 복합체로부터 유래한 표적 병원체에 특이적인 바코드 DNA만이 검출되었다는 점인데, 이를 통해 특이적인 크로스-면역 결합이 입자 프로브들과 병원체들 사이에 형성되지 않았음을 확인할 수 있었다. 표적 박테리아 각각의 형광 신호 강도의 차이는, 병원체들과 상응하는 항체들 사이의 다른 결합 상수들과 연관되어 있다.
이러한 결과들을 통해, 각각의 표적 병원체에 대한 DNA 바코드의 길이 조절, 및 모세관 전기영동 채널 디자인의 최적화를 병합함으로써, 본원의 마이크로디바이스를 이용하여 더욱 정확하게 개선된 멀티플렉스 분석을 수행할 수 있을 것임을 알 수 있었다.
8. 검출 제한( Limit of detection ; LOD ) 테스트
병원체의 검출 제한은 생물안정성 검사 및 생체의학 클리닉에서의 조기 진단과 관련된 중요한 이슈이며, 적은 세포 수만으로 병원체 검출을 할 수 있는 능력은 지루하고 시간 소모적인 배양 과정을 생략할 수 있도록 해준다. 이에, 본 발명자들은 병원체 검출용 마이크로디바이스 내에서의 트리플렉스 병원체 검출을 위하여 LOD 테스트를 수행하였으며, 이때 3 개의 표적 병원체들 및 모든 입자 프로브들을 사용하였다. 이때 도입된 세포 수는 1, 2, 5, 및 10 CFU로 조절되었으며, 결과적인 전기영동도는 도 8에 도시하였다.
도 8을 참조하면, 극도로 낮은 도입 세포들의 농도에도 불구하고, 각각의 표적 병원체에 상응하는 모든 피크들은 성공적으로 관찰되었음을 확인할 수 있다. 도 8에서, 그래프 상의 피크들은 왼쪽부터 순서대로 병원체 Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7, 및 Salmonella typhimurium이 존재함을 의미한다. 여기에서, 단일 세포 수준에서의 다중 형광 피크 신호들이 배경 신호와 명백하게 구분된다는 것이 중요한 것이며, 이는 본원의 병원체 검출용 마이크로디바이스 내에서 멀티플렉스 단일 세포 병원체 검출이 가능함을 의미한다. 각각의 표적 병원체들의 노이즈 율에 대한 평균 신호는, 각각, Staphylococcus aureus에 대하여 19.7±3.05, E. coli O157:H7에 대하여 28.4±3.81, 및 Salmonella typhimurium에 대하여 4.3±1.87 이었다. 각각의 AuNP 상에서의 많은 수의 바코드 DNA 가닥들, 즉, Staphylococcus aureus에 대하여 1.11 x 104, E. coli O157:H7에 대하여 1.13 x 104, 및 Salmonella typhimurium에 대하여 1.31 x 104의 바코드 DNA 가닥들은, 레이저-유도된 형광 검출 시스템과 병용된 본원의 마이크로디바이스 상에서 충분히 검출할 수 있는 정도였다. 즉, 본 실시예에서 AuNP 당 상기 DNA 바코드 가닥(~104)의 양은 레이저-유도 공초점(confocal) 형광 검출기 내에서 관찰되기에 충분하므로, 단일 세포 수준의 분석을 할 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 병원체(pathogen), 제 1 프로브(probe), 및 제 2 프로브를 믹싱하기 위한 수동식 마이크로믹서(passive micromixer);
    상기 수동식 마이크로믹서에 연결된 자기적 분리(magnetic separation) 챔버; 및,
    상기 자기적 분리 챔버에 연결된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 채널
    을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Eschericia coli O157:H7), 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 박테리아 병원체를 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 프로브는 MMP(Magnetic microparticle; 자기적 마이크로 입자) 프로브를 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 MMP 프로브는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 항체를 고정화된 형태로 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 프로브는 금, 은, 백금, 팔라듐, 구리, 니켈, 아연, 산화실리콘, 또는 폴리스티렌의 나노 입자를 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 나노 입자는 그 표면에 상기 병원체에 특이적인 항체 및 바코드 DNA(Barcode DNA)를 고정화된 형태로 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 수동식 마이크로믹서는 1 개 이상의 코너를 포함하고 치아-형태의 프로젝션을 내부에 포함하는 창자-형태(intestine-shaped)의 구조를 가지며, 상기 코너에서 발생되는 원심력에 의하여 믹싱(mixing) 효율을 높이는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 수동식 마이크로믹서는 상기 병원체, 상기 제 1 프로브, 및 상기 제 2 프로브를 믹싱함으로써 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체를 형성하기 위한 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 자기적 분리 챔버는, 자기장을 적용하여 상기 수동식 마이크로믹서에서 형성된 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체 중 일부분을 분리하기 위한 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 모세관 전기영동 채널은, 상기 수동식 마이크로믹서에서 형성된 제 1 프로브-병원체-제 2 프로브 복합체 중 상기 자기적 분리 챔버에서 분리된 일부분을 모세관 전기영동을 이용하여 정량적으로 검출하기 위한 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 상기 수동식 마이크로믹서 이전에 샘플 투입구(sample inlet)를 추가 포함하며, 상기 샘플 투입구를 통하여 상기 병원체, 상기 제 1 프로브, 및 상기 제 2 프로브가 투입되는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는, 상기 자기적 분리 챔버와 연결된 샘플 저장고(sample reservoir) 및 폐기물 저장고(waste reservoir), 및 상기 모세관 전기영동 채널과 연결된 캐소드 저장고(cathode reservoir) 및 애노드 저장고(anode reservoir)를 추가 포함하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 1 종류의 병원체를 대상으로 하는 모노플렉스(monoplex) 병원체 검출, 또는 2 종류 이상의 병원체를 대상으로 하는 멀티플렉스(multiplex) 병원체 검출을 위한 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체 검출용 마이크로디바이스를 이용하여 상기 병원체 검출을 수행하는데 필요한 총 소요 시간이 30 분 이하인 것을 포함하는, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 병원체 검출용 마이크로디바이스는 단일세포 수준에서 상기 병원체의 검출을 수행하는 것인, 병원체 검출용 마이크로디바이스.
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