KR20110092892A - 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩 - Google Patents

담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩 Download PDF

Info

Publication number
KR20110092892A
KR20110092892A KR1020100012578A KR20100012578A KR20110092892A KR 20110092892 A KR20110092892 A KR 20110092892A KR 1020100012578 A KR1020100012578 A KR 1020100012578A KR 20100012578 A KR20100012578 A KR 20100012578A KR 20110092892 A KR20110092892 A KR 20110092892A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna sequence
species
dna
sequence
Prior art date
Application number
KR1020100012578A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101140022B1 (ko
Inventor
김원
김성민
강승현
황승용
김지훈
구혜영
최준길
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020100012578A priority Critical patent/KR101140022B1/ko
Publication of KR20110092892A publication Critical patent/KR20110092892A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101140022B1 publication Critical patent/KR101140022B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Abstract

본 발명은 한국산 담수 어류의 종간(inter species) 분류체계 결정 방법과 이에 따른 한국산 담수 어류 종(species) 판별용 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 프로브, DNA칩(DNA chip) 및 키트(kit)에 관한 것으로, 특히 한국산 담수 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 한국산 담수 어류의 분류체계 결정 방법에 의하는 경우, 하나의 슬라이드 위에서 종 동정(species identification)이 어렵거나 불가능한 알(egg), 전기 자어(pre-larva), 후기 자어(post-larva), 치어(young or juveniles), 미성어(immature), 그리고 성어(adult) 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사하여 한국산 담수 어류의 종(species)을 결정할 수 있다.

Description

담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩{Probe and DNA Chip for Identifying Freshwater Fish Species}
본 발명은 담수어류의 종 판별용 프로브 및 DNA 칩 및 키트에 관한 것이다.
본 발명은 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 특히 한국산 담수 어류의 종을 간단하고 신속, 정확하게 구별하기 위한 것이다. 더욱 상세하게는 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 COI 유전자 지역에 존재하는 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)에 근거한 폴리뉴클레오티드 프로브와 이를 포함하는 키트를 제조하는 것이다.
국내에 서식하는 어류는 총 42목 213과 1085종이며, 그 중 담수 어류는 62종의 고유종을 포함하여 17목 39과 213종이다. 천연기념물 5과 5종을 비롯하여 멸종위기 야생동식물 I급에 4과 6종, 멸종위기 야생 동식물 II급에 4과 12종, 그리고 고유종인 잉어과(15종), 미꾸리과(3종), 꺽지과(1종), 동자개과(2종), 독중개과(1종), 동사리과(1종), 매기과(1종), 그 외에 양식과 방류를 목적으로 국내에 도입된 외래종이 12종으로 보고되고 있다.
국내외에서 담수 어류의 종 분류 및 계통연구는 골격구조, 체형, 꼬리지느러미의 모양, 비늘, 계수 형질과 어류의 측정부위인 전장, 체장, 두장, 체고, 등지느러미 기점 거리, 가슴지느러미 기점거리, 배 지느러미 기점 거리, 미병장, 미병고, 안경, 양안 간격, 체폭 등이 있는 이 직선거리를 측정기로 계측한 형태 형질과 초기생활사의 특징 등을 바탕으로 하고 있으며 주로 성체를 중심으로 이루어지고 있다.
담수 어류는 수정된 알에서 부화하여 성어가 될 때까지 6단계로 구분되는데, 부화 직후부터 난황 흡수를 끝마칠 때까지의 어린 개체인 전기 자어(pre-larva)단계, 난황 흡수 직후부터 각 지느러미 기조가 정수로 될 때까지의 어린 개체인 후기 자어(post-larva)단계, 후기 자어 이후 물고기의 겉모양은 잘 나타나지만 반문과 체색 등이 성숙한 개체와는 구별되는 어린 개체인 치어 단계, 체형, 반문, 체색 등은 성어와 거의 같으나 생식소가 성숙하지 않은 개체인 미성어 단계, 생식소가 완전히 성숙하여 생식 능력을 갖춘 개체인 성어 단계, 생식소가 폐쇄되어 산란기가 되어도 산란이나 방정이 되지 않는 시기의 개체로 몸 색깔이 퇴색하거나 비늘이 탈락된 노어(senility) 단계가 있다.
그 중 성어 단계와 노어 단계를 제외하면 종간의 동정에 어려움이 많을 뿐만 아니라 성어라 할지라도 전문가가 아닌 이상 정확한 구별이 힘든 종이 있으며 계통 유연 관계 연구에도 논란의 여지가 있다. 따라서 이 같은 문제를 해결하기 위한 분자생물학적인 연구가 진행되고 있으며 유전자 염기서열 분석방법이 발전하면서 염기서열의 차이를 이용하여 담수 어류의 종을 구분하고 이들의 유연관계를 밝히는 방법이 발전하였다.
또한, 담수 어류는 일생을 순 담수에서 생활하는 1차 담수어, 정기적으로 담수와 해수를 왕래하는 회유성, 염분의 영향을 받는 강 하류 기수역에 서식하는 종으로 구분되며, 이들의 주요서식환경의 변화와 산란시기에 따라 독특한 생태 습성을 가지고 있어 유전자 마커를 이용한 어린 개체군의 정확한 종 분포조사가 요구되고 있다.
한국산 담수 어류 종을 구분하기 위해서는 종을 판별하는데 뛰어난 유전자 마커를 대상으로 염기서열 자료를 축적할 필요가 있으며, 종간의 염기서열 차이를 신속하게 구분할 수 있는 분석법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
일반적인 DNA를 이용한 종 분류 시스템은 Tautz et al. (2002, 2003)에 소개되었고, Hebert et al. (2003)은 하나의 유전자 염기서열이 대부분의 생물종을 동정하기 위한 표준화를 제시하였다. 실제 미토콘드리아의 Cytochrome c Oxidase subunit I (COI) 유전자 부위가 종 동정하기 위한 표준화된 바이오마커로서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 특히 COI 유전자 부위는 종 내 변이 (1~2%) 보다도 종간 변이가 더 커서 종을 동정하는데 유용하며 결과에 대한 높은 신뢰성도 검증받았다.
지금까지 COI은 표준화된 DNA 바이오마커로 인식되고 있으며 대표적인 생물 바코드 데이터베이스 시스템인 Barcode Of Life Data Systems (BOLD) (www.barcodinglife.com)와 Korea Barcode Of Life (KBOL) (www.koreabarcode.org) 등의 Database System에서 COI을 표준마커로 하여 DNA 정보와 함께 생태, 이미지자료를 축적하고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로써, 한국산 담수 어류의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 어느 하나의 DNA서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시킴으로써 한국산 담수 어류 유전자형을 분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
한국산 담수 어류 중 종간(inter species) 판별을 하기 위한 대상종의 선택은 천연기념물과 멸종위기 야생동식물 I, II급을 제외한 35종 중 5과 11종이며 다음과 같다; 떡납줄갱이 Rhodeus notatus (NICHOLS, 1929), 흰줄납줄개 Rhodeus ocellatus (KNER, 1867), 각시붕어 Rhodeus uyekii (MORI, 1935), 납지리 Acheilognathus rhombeus (TEMMINCK and SCHLEGEL, 1846), 줄납자루 Acheilognathus yamatsutae (MORI, 1928), 붕어Carassius auratus (LINNAEUS, 1758), 떡붕어 Carassius cuvieri (TEMMINCK and SCHLEGEL, 1846), 버들매치 Abbottina rivularis (BASILEWSKY, 1855), 쉬리 Coreoleuciscus splendidus (Mori,1935), 줄몰개 Gnathopogon strigatus (REGAN, 1908), 누치 Hemibarbus labeo (PALLAS, 1707), 돌마자 Microphysogobio yaluensis (MORI, 1928), 두우쟁이 Saurogobio dabryi (BLEEKER, 1871), 참붕어 Pseudorasbora parva (TEMMINCK and SCHLEGEL, 1846), 왜몰개 Aphyocypris chinensis (GUNTHER, 1868), 끄리 Opsariichthys uncirostris amurensis (BERG, 1940), 피라미 Zacco platypus (TEMMINCK and SCHLEGEL, 1902), 꾹저구 Chaenogobius urotaenia (HILGENDORF, 1879), 밀어 Rhinogobius brunneus (TEMMINCK and SCHLEGEL, 1845), 갈문망둑 Rhinogobius giurinus (RUTTER,1897), 민물검정망둑 Tridentiger brevispinis (KATSUYAMA ARAI and NAKAMURA, 1972), 검정망둑 Tridentiger obscurus (Temminck and Schlegel, 1845), 버들치 Phoxinus oxycephalus (LINNAEUS, 1758), 연준모치 Phoxinus phoxinus (LINNAEUS, 1758), 황어 Tribolodon hakonensis (GUNTHER, 1880), 버들개 Rhynchocypris steindachneri (DYBOWSKI, 1869) 이다.
담수 어류의 종을 구분하는데 있어서도, 염기서열의 차이가 밝혀졌다고 하더라도 이를 신속 정확하게 분석할 수 있는 표준화된 방법이 있으면 많은 시간과 인적 자원, 비용을 줄일 수 있다. 또한 한국산 담수 어류는 삼면이 바다인 지역적인 고립성으로 인해서 많은 수의 고유종을 가지고 있으며, 천연기념물과 멸종 위기 종을 포함하여 17목 39과 213종으로 국내 담수 생태계의 풍부한 생물학적 다양성을 대표하고 있다. 본 발명에서는 담수 어류의 염기서열의 차이를 정확하게 파악하고, 이를 근거로 하여 각종에 따라 차이가 나도록 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하기 위한 것이며, 이를 포함하는 DNA칩 또는 키트를 이용하여 담수 어류의 종에 따른 염기서열 차이를 신속 정확하게 검사하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같이 어류의 종간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하여 15개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 프로브와 이것으로 구성된 DNA칩 그리고 이것들을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 이러한 본 발명에 의해 하나의 슬라이드 위에서 다수의 한국산 담수 어류의 유전자형 분석을 간단하고 신속 정확하게 검사할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명자들은 다양한 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 상기 어류 각 종마다 특이적으로 결합할 수 있는 최적의 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하였다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 특이적인 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시킴으로써 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 유전자형을 분석하여, 상기 어류의 분류체계를 결정하는 방법을 제공할 수 있다.
이러한 분류체계 결정 방법에 의하는 경우, 다수의 한국산 담수 어류에 속하는 26종에 대한 유전자형 분석을 하나의 슬라이드 위에서 간단하고 신속, 정확하게 검사함으로써, 상기 어류가 속하는 종을 간단하고 용이하게 결정할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따라 한국산 담수 어류에 속하는 어류 미토콘드리아 DNA의 COI 지역을 유전자 표지로 사용하면, 종래에 한국산 담수 어류에 속하는 종을 판별하는데 존재하였던 문제점을 해결할 수 있다. 본 발명에 따라 단염기다형성이 많은 것으로 확인된 COI 지역을 분석의 척도로 이용하면, 종래기술보다 한 단계 진보된 형태의 유전자 분석법을 제공하여, 더욱 효과적으로 유전자형을 판별할 수 있고, 분해능도 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명자들은 다양한 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 한국산 담수 어류에 속하는 26종마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작할 수 있게 되었다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 단염기다형성 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 특징이다.
본 발명자들은 수많은 연구개발 노력 끝에, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자에서 서열번호 3 내지 서열번호 28에 해당하는 DNA 서열이 각 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 종을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 종을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
그리고, 본 발명에 따라 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종간 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 유전자형과 이것이 속하는 종을 신속하게 판정할 수 있는 적용성을 갖고있다. 또한, 다수의 한국산 담수 어류에 속하는 26종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 유전자형과 분류계통 결정방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고,
도 2 내지 도 6은 각각 본 발명의 바람직한 실시 예에 따라 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA중 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 660여 개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이고, 도 7은 상기 도 2내지 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이고,
도 8a 내지 도 8z는 각각 상기 도 7의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브와 다양한 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 PCR 증폭 산물을 결합시킨 후의 반응 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위해 한국산 담수 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정 방법이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 바와 같은 한국산 담수 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 3내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브와 이를 포함하는 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정용 DNA 칩일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 DNA 칩을 포함하는 키트일 수 있다. 즉, 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기서열 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브; 와 상기 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 한국산 담수 어류에 속하는 어류의 종간 분류체계 결정용 키트가 가능하다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.
본 발명에서 서로 다른 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정 방법은 먼저, 한국산 담수 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다. 한국산 담수 어류로부터 DNA를 추출하는 것은 추출된 DNA를 분석하여 상기 어류가 속하는 종을 판별하기 위한 것이기 때문에 담수 어류의 어느 부분에서 DNA를 추출하든지 또는 어떠한 방법으로 추출되는지는 특별히 제한되지 않는다. 그 중에서도 이렇게 추출된 DNA는 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 부위의 단염기다형성 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 그리고 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭 산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출 방법이나 증폭 방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
본 발명자들은 다양한 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA중 COI 유전자의 단염기다형성 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 상기 어류 각 종마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하였다.
도 1은 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 어류의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 상기 미토콘드리아 DNA의 크기는 16602bp 이고, 이 중 상기 COI 유전자는 5486bp-7036bp에 걸쳐 위치하는 것이다.
이어서, 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 것이 본 발명의 가장 중요한 특징이다. 이후에, 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하나, 이 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 모든 결합 여부 확인방법을 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 28의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타난 바와 같다.
한국산 담수 어류에 속하는 26종의 어류 판별을 위한 DNA 서열
한국산 담수 어류 종 판정을 위한 DNA 서열
프로브 이름 DNA서열 반응 어종 DNA 서열 위치
A1(서열번호3) 5'-CGTTTGGGCAGTACTCGTAACAG-3' 떡납줄갱이 506-528
A2(서열번호4) 5'-CTTCTATCTCTACCAGTCCTGGC-3' 흰줄납줄개 540-562
A3(서열번호5) 5'-GAGCAGTCCTTGTGACAGCCGTA-3' 각시붕어 511-533
A4(서열번호6) 5'-GTACTTCTACTGCTATCACTACC-3' 납지리 536-558
A5(서열번호7) 5'-CTTCTATCGCTACCCGTTCTGGC-3' 줄납자루 545-567
A6(서열번호8) 5'-TAACCGCCGTCCTCCTTCTCCTA-3' 붕어 528-550
A7(서열번호9) 5'-TAACCGCTGTCCTTCTTCTCCTA-3' 떡붕어 523-545
A8(서열번호10) 5'-CTTCTGCTTCTCTCTCTACCAGT-3' 버들매치 534-556
A9(서열번호11) 5'-CGGCAGGAGGGGGTGATCCTATT-3' 쉬리 619-641
A10(서열번호12) 5'-CGTGCTTGTGACAGCTGTACTCC-3' 줄몰개 515-536
A11(서열번호13) 5'-CCGTGCTCCTTCTTCTCTCACTA-3' 누치 529-551
A12(서열번호14) 5'-GCTGTACTCCTACTTCTATCGCT-3' 돌마자 528-550
A13(서열번호15) 5'-TAGCCGCTGGTATTACAATACTC-3' 두우쟁이 559-581
A14(서열번호16) 5'-GTCCTAGCAGCTGGCATTACAAT-3' 참붕어 555-577
A15(서열번호17) 5'-ACTCTCCCTGCCTGTTCTAGCTG-3' 왜몰개 542-564
A16(서열번호18) 5'-CTATCCCTACCCGTATTGGCTGC-3' 끄리 548-570
A17(서열번호19) 5'-CTTCTCCTGTCCTTACCCGTACT-3' 피라미 542-564
A18(서열번호20) 5'-CTTGCAGCCGGTATTACTATGCT-3' 꾹저구 558-580
A19(서열번호21) 5'-GGCTAAGGGCCGTACCTACTATT-3' 밀어 35-57
A20(서열번호22) 5'-CAGACCGCAACTTAAACACAACC-3' 갈문망둑 591-613
A21(서열번호23) 5'-CCTAATCACAGCCGTCTTACTAC-3' 민물검정망둑 518-540
A22(서열번호24) 5'-CAATCCTAAACATGAAACCTGCTGCC-3' 검정망둑 453-478
A23(서열번호25) 5'-CCTCCTGTCATTACCAGTTTTAG-3' 버들치 539-561
A24(서열번호26) 5'-CCCTCTTCGTATGGGCCGTACTT-3' 연준모치 499-521
A25(서열번호27) 5'-TATGGTCCGTACTCGTAACAGCC-3' 황어 508-530
A26(서열번호28) 5'-TATCACTACCAGTTCTCGCTGCC-3' 버들개 544-566
상기한 표 1에 나타난 바와 같은 본 발명에 따른 DNA 서열은 한국산 담수 어류의 분류체계를 결정하기 위한 것으로, 상기 어류가 한국산 담수 어류 중 어떤 종에 해당하는 어류인지를 결정하기 위한 것이다. 이러한 DNA 서열은 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위를 포함하는 것으로써, 상기 어류의 반응어종에 따라 구분될 수 있는 염기서열의 일부를 나타내는 것이다. 각 DNA 서열의 위치도 표시하였다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 서열번호 3 내지 서열번호 28의 DNA 서열과 결합할 수 있도록 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 어류로부터 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물을 이용함에 있어서, 상기 PCR 산물의 어느 쪽 가닥을 사용하는 것도 가능하므로, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 가지는 표적대상 PCR 산물과 반응하기 위해서, 본 발명에 따른 프로브는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28의 DNA 서열과 동일한 염기서열을 가지는 것도 가능하다. 본 발명자들은 각 서열번호에 따른 PCR 산물의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 프로브로 이용하였고, 상기 서열번호에 대응하는 각각의 프로브 명칭을 A1 내지 A26으로 명명하였다.
도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따라 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 660여개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 즉, 도 2는 다양한 한국산 담수 어류 중에서 구체적으로는 떡납줄갱이 Rhodeus notatus, 흰줄납줄개 Rhodeus ocellatus, 각시붕어 Rhodeus uyekii, 납지리 Acheilognathus rhombeus, 줄납자루 Acheilognathus yamatsutae, 붕어Carassius auratus, 떡붕어 Carassius cuvieri, 버들매치 Abbottina rivularis, 쉬리 Coreoleuciscus splendidus, 줄몰개 Gnathopogon strigatus, 누치 Hemibarbus labeo, 돌마자 Microphysogobio yaluensis, 두우쟁이 Saurogobio dabryi, 참붕어 Pseudorasbora parva , 왜몰개 Aphyocypris chinensis, 끄리 Opsariichthys uncirostris amurensis, 피라미 Zacco platypus, 꾹저구 Chaenogobius urotaenia, 밀어 Rhinogobius brunneus, 갈문망둑 Rhinogobius giurinus, 민물검정망둑 Tridentiger brevispinis, 검정망둑 Tridentiger obscurus, 버들치 Phoxinus oxycephalus, 연준모치 Phoxinus phoxinus, 황어 Tribolodon hakonensis, 버들개 Rhynchocypris steindachneri, 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 1번부터 150번까지의 DNA 서열을 나타낸 것이고, 도 3은 상기 유전자의 151번부터 300번까지의 DNA 서열, 도 4는 상기 유전자의 301번부터 450번까지의 DNA 서열, 도 5는 상기 유전자의 451번부터 600번까지의 DNA 서열, 도 6은 상기 유전자의 601번부터 660번까지의 DNA 서열을 순차적으로 나타낸 것이다.
여기서, 단염기다형성 부위는 도 2 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 염기서열과는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, ".(점)"으로 표시되는 부위는 상기 떡납줄갱이에 해당하는 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, 도 2의 흰줄납줄개 내지 도 6의 버들개에 해당하는 염기서열에 나타난 구체적인 A, C, G 또는 T가 단염기다형성을 나타내는 부위이다.
도 2 내지 도 6은 각각 본 발명의 바람직한 실시 예에 따라 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA중 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 660여개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 이렇게 연결되는 도면은 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA COI 지역의 660여개 염기서열을 분석하여 비교한 것으로서, 이 지역에 특정 어류 종에 독특한 단염기다형성 변이가 다수 존재한다는 것을 보여준다. 지면의 한계 상 50개 염기서열 단위로 분절하여 나타내었지만 도2 내지 도6은 순서대로 이어지는 도면을 의미한다. 그 중에서도 상기한 표 1에 나타난 DNA 서열의 위치 지역이 본 발명에 따라 마이크로어레이 방법에 이용될 폴리뉴클레오티드 프로브로 사용될 수 있는 종 특이적 단염기다형성이 존재하는 지역이다.
본 발명자들은 수많은 연구개발 노력 끝에, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자에서 서열번호 3 내지 서열번호 28에 해당하는 DNA 서열이 상기 각 어류의 종을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계를 결정할 수 있음을 확인하였다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 어류 각 종의 단염기다형성 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 반응 어종에 속하는 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하기로는 10%또는 20%이상의 발생 빈도를 나타내는 두 개 이상의 대립 형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상기한 염기서열 이외에 본 발명에 따른 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다. 더불어, 상기 본 발명에 따른 다형성 부위는 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립 형질이 발생하는 것을 의미하는바, 상술한 바와 같이 도 2 내지 도 6에 나타난 다형성 부위의 염기서열과 동일하거나 이에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것도 가능하다.
이와 같은 다형성 부위를 근거로 하여, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 것이면 어느 것이나 본 발명에 해당한다. 바람직하기로는, 상기 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하여 10개 이상이고 100개 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있고, 더욱 바람직하기로는 10개 이상이고 50개 이하의 것이고, 가장 바람직하기로는 15개 이상이고 30개 이하의 것일 수 있다.
이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 한국산 담수 어류에 속하는 26종으로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위에 있는 단염기다형성 부위를 특징으로 하여 결합하는데, 상기 결합은 상기 어류가 속하는 분류체계, 즉 한국산 담수 어류에 속하는 26종에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이렇게 본 발명은 프로브와 대상 산물의 결합 여부에 따라 상기 어류의 종을 판별하는데, 본 발명에 따른 프로브로 분석 가능한 어류의 종은 상기한 표 1의 반응 어종에 기재된 바와 같다.
상기한 표 1에서 반응어종이라 함은 본 발명에 따른 DNA 염기서열이 특징적으로 결합할 수 있는 한국산 담수 어류의 종류를 의미하는 것이다. 다시 말해서, 표 1에 기재된 서열정보 3 내지 28에 해당하는 DNA 염기서열은 표 1에 기재된 반응어종의 DNA 추출물과는 결합하지만, 상기한 반응 어종이 아닌 다른 어종과는 결합하지 않는 것이다. 이에 따라, 상기한 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 경우 상기 어류가 속하는 종을 판별하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 결합이 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 상기한 표 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 프로브(이것은 서열번호 3의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 의미함, 이하 각 서열번호에서도 같음)가 떡납줄갱이(Rhodeus notatus) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 506-528번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 서열번호 4의 경우는 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus) 종의 540-562번째 DNA 서열, 서열번호 5의 경우는 각시붕어(Rhodeus uyekii) 종의 511-533번째 DNA 서열, 서열번호 6의 경우는 납지리(Acheilognathus rhombeus) 종의 536-558번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 줄납자루(Acheilognathus yamatsutae) 종의 545-567번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 붕어(Carassius auratus) 종의 528-550번째 서열, 서열번호 9의 경우는 떡붕어(Carassius cuvieri) 종의 523-545번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 버들매치(Abbottina rivularis) 종의 534-556번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 쉬리(Coreoleuciscus splendidus) 종의 619-641번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 줄몰개(Gnathopogon strigatus) 종의 515-536번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 누치(Hemibarbus labeo) 종의 529-551번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 돌마자(Microphysogobio yaluensis) 종의 528-550번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 두우쟁이(Saurogobio dabryi) 종의 559-581번째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 참붕어(Pseudorasbora parva) 종의 555-577번째 DNA 서열, 서열번호 17의 경우는 왜몰개(Aphyocypris chinensis) 종의 542-564번째 DNA 서열, 서열번호 18의 경우는 끄리(Opsariichthys uncirostris amurensis) 종의 548-570번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 피라미(Zacco platypus) 종의 542-564번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 꾹저구(Chaenogobius urotaenia) 종의 558-580번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 밀어(Rhinogobius brunneus) 종의 35-57번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 갈문망둑(Rhinogobius giurinus) 종의 591-613번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 민물검정망둑(Tridentiger brevispinis) 종의 518-540번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 검정망둑(Tridentiger obscurus) 종의 453-478번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 버들치(Phoxinus oxycephalus) 종의 539-561번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 연준모치(Phoxinus phoxinus) 종의 499-521번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 황어(Tribolodon hakonensis) 종의 508-530번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 버들개(Moroco lagowskii) 종의 544-566번째 DNA 서열, 과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 한국산 담수 어류에 속하는 종에 있어서, 단일염기다형성 부위를 가지는 서열번호 3 내지 서열번호 18 중 어느 하나의 DNA 서열을 이용한 것으로써, 상기 DNA 서열과 동일하거나 이에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 우리가 알고자 하는 어류의 DNA 추출물(정확히는 PCR 산물)과 결합시키는 것이 특징이다. 이와 같이, 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 한국산 담수 어류에 속하는 11종의 각각의 단염기다형성 부위를 근거로 제작되어, 의도한 어류 종에 해당하는 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 그것과는 결합하지 않는 것을 특징으로 하기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합 과정을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있다. 또한, 상기 결합을 확인하는 단계 이후에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행하면 다양한 프로브를 이용하여 중첩적으로 판별 결과 예측할 수 있는 효과가 있다. 따라서 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 많게는 수차례(특히 3~4회) 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시 예는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은 서열번호 1의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정 방향 프라이머로 사용하거나, 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 한국산 담수 어류에 속하는 26종에서 추출한 DNA를 증폭시키는데 있어서, 특정한 프라이머를 사용하는 것이다. 이 특정한 프라이머는 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 이를 위해 상기와 같이 혈액, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 COI 유전자의 단염기다형성 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 추출된 DNA를 PCR로 증폭시키기 위해 사용된 정 방향 프라이머와 역방향 프라이머는 하기의 표 2에 나타난 바와 같다.
한국산 담수 어류에 속하는 26종의 어류 판별을 위한 프라이머
프라이머 염기서열 위치
정방향 프라이머(서열번호1) 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 5508-5533bp　
역방향 프라이머(서열번호2) 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ 6194-6220bp
상기한 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PCR 과정에서 사용되는 프라이머 또한, 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위 DNA 서열에 최적으로 적합하도록 형성된 것이다. 여기서, 상기 정 방향 프라이머는 한국산 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중에서 5486bp-7036bp에 걸쳐 위치하는 COI 유전자의 5508-5533bp 지역에 결합하는 것이고, 상기 역방향 프라이머는 상기 COI 유전자의 6194-6220bp 지역에 결합하는 것이다. 이것은 다양한 어류 종에 상관없이 가장 공통된 염기서열을 기초로 하여 제작된 것이다. 본 발명자들 은 도 2 내지 도 6에 나타난 다양한 어류 종의 DNA 서열과 SNP를 조사, 분석한 뒤에, 상기한 서열번호 1 과 서열번호 2로 이루어진 염기서열을 사용할 때, PCR 산물을 가장 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 즉, 다양한 어류 종에 상관없이 미토콘드리아 DNA 추출물은 PCR 방법에 의해 빠짐없이 증폭될 것이고, 이에 따라 증폭된 PCR 산물의 개수도 현저히 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
이와 더불어, 본 발명은 PCR 산물과 본 발명에 따른 프로브를 결합시킨 뒤에 행해지는 교잡화 반응 확인을 위해, 상기 정 방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다민(rhodamine), cy3, cy5 또는 바이오틴이 부착되어 있고, 상기 결합 여부를 확인하는 것은 상기 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴에 의해 발현되는 형광을 감지하여 결합 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 어류의 종판별 방법도 가능하다. 구체적으로, 상기의 확인 단계는 로다민, cy3, cy5를 이용하거나 바이오틴과 결합하는 Syreptavidin-Cyanine을 이용하고, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 결과를 분석함으로서 유전자형 판정을 편리하게 진행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 한국산 담수 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 나아가, 본 발명은 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 한국산 담수 어류에 속하는 11종의 분류체계 결정용 DNA 칩일 수 있다. 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 글라스 위의 기질에 고정화되어 있는 형태가 바람직하다.
본 발명에서는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 다수의 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계를 동시에 결정할 수 있다. 상기한 어류가 속하는 종을 판별할 수 있는 26개의 프로브를 화학 작용기가 처리된 하나의 글라스 슬라이드위에 다수의 구역을 설정하여 집적시켰으며, 대칭 또는 비대칭 PCR법을 이용하여 얻어진 형광물질 표지를 가지고 표적 유전자 서열의 교잡화 반응을 확인함으로써 정확한 26종의 어류를 구분할 수 있는 것이다.
이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상술한 바와 같이 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하여, 상기한 어류 각 종의 단염기다형성 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 어류의 대상산물 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 특징이다. 이에 따라, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 28과 동일하거나 이에 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 한국산 담수 어류에 속하는 26종을 판별할 수 있는 것이다.
이와 더불어, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계 결정 방법에 사용되는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계 결정용 키트일 수 있다.
즉, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브; 와 상기 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 분류체계 결정용 키트일 수 있다.
이러한 분류체계 결정용 키트는 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종간 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 분석하고자 하는 어류의 유전자형과 그 계군을 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한, 한국산 담수 어류에 속하는 다수의 어류 어종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 어류의 유전자형과 분류체계를 결정하는 방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화 시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시 예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시 예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
추출된 DNA의 증폭을 위한 프라이머 준비
다양한 한국산 담수 어류로부터 추출한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 본 발명에 따른 PCR 방법에서 사용한 프라이머는 상기한 표 1에 나타난 것과 같다. 본 발명에서 사용한 프라이머는 한국의 BIONEER사에 의뢰하여 준비하였다.
어종에 따른 프로브 준비
한국산 담수 어류의 특이 변이를 확인하기 위한 프로브를 합성하였다. 본 발명에 있어서 교잡화 반응에 사용한 프로브의 서열정보는 상기한 표 1에 나타난 것과 같다. 본 발명에서 프로브를 DNA칩으로 제작하기 위해 알데히드 작용기가 처리되어 이는 글라스 위에 본 발명에 따른 프로브를 공유결합을 시키기 위하여 선택된 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 수식하고, 교잡화 반응 시 글라스 슬라이드 위에 집적되어 있는 프로브간의 공간적인 방해를 최소화시키기 위하여 10-20개의 올리고(dT)를 부가하여 합성하였다. 본 발명에서 사용한 프로브는 한국의 BIONEER사에 의뢰하여 준비하였다.
DNA 추출과 PCR 반응
1) 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 DNA는 독일 QIAGEN사의 DNeasy tissue kit을 사용하여 추출하였다.
2) 하기의 표 3와 같은 조건의 방법으로 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.
3) PCR이 끝난 후, PCR 산물 5ul에 젤 로딩 버퍼(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 1ul를 넣고 1ug/ml ethidium bromide가 함유된 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동 한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (DNr Bio-Imaging Systems, 중국)에서 PCR 밴드를 확인하였다.
프라이머 정상 증폭 확인 조건
반응 조성 반응 조건
5X buffer 5ul 94℃, 5분 1 Cycle
dNTP 1ul
전위 프라이머 1ul 94℃, 30초 30 Cycle
역위 프라이머 1ul 49℃, 1분
Taq 0.3ul 72℃, 1분 30초
DW 14.7ul 72℃, 10분 1 Cycle
Template 2ul
종판별을 위한 칩 제작
1) 올리고뉴클레오티드 칩을 제작하기 위해 CSS-100 Silylated Slide(Cell Associate사, 미국)상에 50uM의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 상기 실시 예 2에 따라 준비된 프로브와 동일한 양의 2X spotting buffer(6X SSC, 3M Betaine)를 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.1% SDS로 5분간 1회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.
2) 소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4 375ml, PBS 125ml, 100% EtOH)에 제작된 칩을 5분간 반응시킨 후 증류수로 5분간 2회 세척한 후, 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 5분간 건조하였다.
3) 한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위하여 perfusion chamber(BioGrace, 미국)로 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
이렇게 제작된 DNA칩을 도 7에 예시적으로 나타내었다. 도 7은 상기 도 2 내지 도 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이다.
교잡화 반응
1) 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 교잡화 용액(3X SSC, 0.3% Sarcosyl)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우 Syreptavidin-Cyanine을 1ug/ml 농도로 첨가하여 반응시켰다.
2) 준비된 교잡화 용액을 chmaber에 도포하여 58도에서 1시간 동안 반응시켰다.
3) 1X SSC, 0.1% Sarcosyl에서 5분 동안 일차 세척 후 0.1X SSC에서 3분간 2회 세척하였다.
4) 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 5분간 건조하였다.
5) 실험 결과의 확인은 GenePix 4000B (Axon Instrument, 미국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 8a 내지 도 8z에 나타내었다.
도 8a 내지 도 8z는 상기 도 7의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브와 다양한 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 PCR 증폭산물을 교잡화한 후의 반응 결과를 나타내는 사진이며, 여기서 도 8a는 떡납줄갱이, 도 8b는 흰줄납줄개, 도 8c는 각시붕어, 도 8d는 납지리, 도 8e는 줄납자루, 도 8f는 붕어, 도 8g는 떡붕어, 도 8h는 버들매치, 도 8i는 쉬리, 도 8j는 줄몰개, 도 8k는 누치, 도 8l는 돌마자, 도 8m는 두우쟁이, 도 8n는 참붕어, 도 8o는 왜몰개, 도 8p는 끄리, 도 8q는 피라미, 도 8r는 꾹저구, 도 8s는 밀어, 도 8t는 갈문망둑, 도 8u는 민물검정망둑, 도 8v는 검정망둑, 도 8w는 버들치, 도 8x는 연준모치, 도 8y는 황어, 도 8z는 버들개에 대한 결과이다. 여기에 도시된 것과 같이, 본 발명에 의하는 경우 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 종류에 따라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 한국산 담수 어류에 속하는 26종을 판별할 수 있음을 확인하였다.
한편, 상기에서 본 발명을 특정의 바람직한 실시 예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구 범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화 될 수 있다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 이에게는 명백한 것이다.
단염기다형성 부위는 도 2 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 한국산 담수 어류에 속하는 26종의 염기서열과는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, ".(점)"으로 표시되는 부위는 상기 떡납줄갱이에 해당하는 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, 도 2의 흰줄납줄개 내지 도 6의 버들개에 해당하는 염기서열에 나타난 구체적인 A, C, G 또는 T가 단염기다형성을 나타내는 부위이다.

Claims (11)

  1. 한국산 담수 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 한국산 담수 어류의 종간 분류체계 결정 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출한 DNA는 상기 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 부위의 단기염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 포함하는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 15-30개의 연속적인 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 담수 어류 분류체계 결정 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 3 내지 28 중 어느 하나의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하는 것으로써, 상기 결합은 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 결합이 상기 담수 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 프로브(이것은 서열번호 3의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 의미함, 이하 각 서열번호에서도 같음)가 떡납줄갱이(Rhodeus notatus) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 506-528번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 서열번호 4의 경우는 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus) 종의 540-562번째 DNA 서열, 서열번호 5의 경우는 각시붕어(Rhodeus uyekii) 종의 511-533번째 DNA 서열, 서열번호 6의 경우는 납지리(Acheilognathus rhombeus) 종의 536-558번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 줄납자루(Acheilognathus yamatsutae) 종의 545-567번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 붕어(Carassius auratus) 종의 528-550번째 서열, 서열번호 9의 경우는 떡붕어(Carassius cuvieri) 종의 523-545번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 버들매치(Abbottina rivularis) 종의 534-556번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 쉬리(Coreoleuciscus splendidus) 종의 619-641번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 줄몰개(Gnathopogon strigatus) 종의 515-536번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 누치(Hemibarbus labeo) 종의 529-551번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 돌마자(Microphysogobio yaluensis) 종의 528-550번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 두우쟁이(Saurogobio dabryi) 종의 559-581번째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 참붕어(Pseudorasbora parva) 종의 555-577번째 DNA 서열, 서열번호 17의 경우는 왜몰개(Aphyocypris chinensis) 종의 542-564번째 DNA 서열, 서열번호 18의 경우는 끄리(Opsariichthys uncirostris amurensis) 종의 548-570번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 피라미(Zacco platypus) 종의 542-564번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 꾹저구(Chaenogobius urotaenia) 종의 558-580번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 밀어(Rhinogobius brunneus) 종의 35-57번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 갈문망둑(Rhinogobius giurinus) 종의 591-613번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 민물검정망둑(Tridentiger brevispinis) 종의 518-540번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 검정망둑(Tridentiger obscurus) 종의 453-478번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 버들치(Phoxinus oxycephalus) 종의 539-561번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 연준모치(Phoxinus phoxinus) 종의 499-521번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 황어(Tribolodon hakonensis) 종의 508-530번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 버들개(Moroco lagowskii) 종의 544-566번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은 서열번호 1의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하거나, 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다민(rhodamine), cy3, cy5 또는 바이오틴이 부착되어 있고, 상기 결합 여부를 확인하는 것은 상기 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴에 의해 발현되는 형광을 감지하여 결합 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 담수 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브.
  10. 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 담수 어류의 분류체계 결정용 DNA 칩.
  11. 담수 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 28 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 담수 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 담수 어류의 분류체계 결정용 키트.
KR1020100012578A 2010-02-10 2010-02-10 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩 KR101140022B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100012578A KR101140022B1 (ko) 2010-02-10 2010-02-10 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100012578A KR101140022B1 (ko) 2010-02-10 2010-02-10 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110092892A true KR20110092892A (ko) 2011-08-18
KR101140022B1 KR101140022B1 (ko) 2012-05-02

Family

ID=44929668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100012578A KR101140022B1 (ko) 2010-02-10 2010-02-10 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101140022B1 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365872A (zh) * 2017-09-15 2017-11-21 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法
CN108739542A (zh) * 2018-06-15 2018-11-06 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 珠星三块鱼人工繁殖方法
CN109439762A (zh) * 2018-11-13 2019-03-08 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法
KR102018798B1 (ko) * 2018-09-21 2019-09-05 부경대학교 산학협력단 어류 분류용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법
CN110892874A (zh) * 2019-12-04 2020-03-20 成都市农林科学院 一种花*和唇*的人工杂交繁殖方法
KR102638817B1 (ko) 2023-08-04 2024-02-22 주식회사 다온에코 심층 신경망을 활용한 담수 어류 길이 측정 및 동정시스템 및 이의 방법

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365872A (zh) * 2017-09-15 2017-11-21 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法
CN107365872B (zh) * 2017-09-15 2020-10-09 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法
CN108739542A (zh) * 2018-06-15 2018-11-06 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 珠星三块鱼人工繁殖方法
CN108739542B (zh) * 2018-06-15 2021-06-08 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 珠星三块鱼人工繁殖方法
KR102018798B1 (ko) * 2018-09-21 2019-09-05 부경대학교 산학협력단 어류 분류용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법
CN109439762A (zh) * 2018-11-13 2019-03-08 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法
CN109439762B (zh) * 2018-11-13 2021-12-14 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 鉴定珠星三块鱼和三块鱼的分子标记和方法
CN110892874A (zh) * 2019-12-04 2020-03-20 成都市农林科学院 一种花*和唇*的人工杂交繁殖方法
KR102638817B1 (ko) 2023-08-04 2024-02-22 주식회사 다온에코 심층 신경망을 활용한 담수 어류 길이 측정 및 동정시스템 및 이의 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101140022B1 (ko) 2012-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101140022B1 (ko) 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩
KR102062452B1 (ko) 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
KR101151747B1 (ko) 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
CN102329876A (zh) 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法
KR102077917B1 (ko) 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법
CN106282394A (zh) 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒
KR100806208B1 (ko) 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
CN112513298A (zh) 用于辨别土鸡的遗传背景或品种的单核苷酸多态性标记集及其用途
KR20110105669A (ko) 대한민국 연안 규조류의 종 판별 방법과 이에 따른 규조류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR101248425B1 (ko) 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물, 이를 포함하는 ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법
KR101151757B1 (ko) 대한한국 연안 해파리류의 종 판별 방법과 이에 따른 해파리류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
CN105297141B (zh) 瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针
KR20170122599A (ko) 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법
KR101196640B1 (ko) 오징어류의 종 판별 방법과 이를 위한 오징어 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR101540852B1 (ko) 굴의 종 특이적 프로브，ｄｎａ 칩，키트 및 이를 이용한 굴의 종 감별 방법
KR101131789B1 (ko) 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법과 이에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR20100128118A (ko) 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩
KR101825497B1 (ko) 단일염기다형성을 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측용 키트 및 이를 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측 방법
JP4982746B2 (ja) Ｄｎａマーカーを用いたブタの親子判定方法
KR20130048856A (ko) 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물, ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법
CN103131788B (zh) 慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒
KR100829421B1 (ko) 연어 종 또는 계군의 판별 방법과 이에 따른 연어 종 또는계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ칩 및 키트
CN203212579U (zh) 慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用基因芯片及试剂盒
KR102530346B1 (ko) 홍해삼 식별용 유전자 마커를 이용한 친자확인방법
KR102530342B1 (ko) 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150226

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160128

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170403

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190902

Year of fee payment: 8