CN109439762A - 鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法 - Google Patents

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Abstract

鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法，涉及一种三块鱼属群体鉴定领域。本发明第一种鉴定分子标记引物对为A8。本发明第二种鉴定分子标记引物对为A11。鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法：一、样本DNA的提取；二、PCR检测；三、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；四、PCR结果判定。本发明方法简化了珠星三块鱼与三块鱼种质分子鉴定的步骤，根据琼脂糖凝胶电泳结果可视化的区别珠星三块鱼和三块鱼，具有步骤简单、可操作性更强、设备要求更低，鉴定过程更快、鉴定结果更准确的优点。本发明方法可避免人工繁殖造成的种质混杂，保护种质资源。

Description

鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法
技术领域
本发明涉及一种三块鱼属群体鉴定领域。
背景技术
三块鱼属(Tribolodon)主要分布于太平洋西北部的日本海及一些内陆淡水河流，包括俄罗斯的滨海省、哈巴罗夫斯克和萨哈林、日本和朝鲜半岛，在中国仅分布于绥芬河和图们江流域。绥芬河是日本海的主要河流之一，三块鱼属鱼类性腺发育成熟后，分批溯河而上进入河口，在急滩哨口处水中产卵，故名“滩头鱼”，产卵后立即返回近海区。按照分批洄游的时间和婚姻色的差异，当地渔民把其分为“金滩头”，“银滩头”和“黑滩头”。受精卵在淡水河流中孵化，鱼苗顺流至近海水域进行生长和肥育。滩头鱼已经成为绥芬河和图们江的地标性产品，市场价格连年上升。
由于三块鱼属的鱼类在形态方面非常相近，而且洄游至绥芬河产卵的三块鱼属鱼类不同生殖群体在洄游时间和场所存在交集，极易发生形态识别和物种鉴定的错误。成鱼形态鉴定尚存在一定的困难，幼鱼分类鉴定更是困难重重。早期，日本学者Miura Masao和Okata Ahihiro对珠星三块鱼(金滩头)和三块鱼(黑滩头)这两个物种早期发育进行了系统的形态学研究，利用载黑素细胞在体节不同位置区分这两个物种鱼苗(Masao and Ahihiro1995.A study on morphological disrimation between Triobolodon brandtii andT.hakonensis at the early developmental stages.45:103-109.)。此形态学观察的缺点比较明显，在实践操作中不易掌握，需要对相同发育时间上的不同种幼鱼进行细致观察比较。目前已有鉴定三块鱼属的微卫星标记，可以区分珠星三块鱼、三块鱼或者二者的杂交种(常玉梅等2017，CN 107365872 A.鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法)。实施过程中很重要的环节就是采用微卫星引物SSR-1和SSR-2分别对黑滩头、金滩头和疑似杂交种进行扩增。将标记两种不同荧光集团的扩增产物混合后再在ABI自动测序仪上进行毛细管电泳，片段大小由Genemapper软件和GeneScan 500 LIZ Size Standard共同决定；数据采集后还需要进行手动校准。实施过程较为复杂和耗时，毛细管电泳分析过程费用比较昂贵，对扩增后的等位基因进行有效分析和鉴定也比较繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种简化的珠星雅罗鱼和三块鱼鉴定方法及使用的分子标记引物。
本发明第一种鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记引物对为A8，A8正向引物核苷酸序列为5'-GGCTACAGCAAGGCAAGAAC-3'；A8反向引物核苷酸序列为5'-ATGCATTTCCCTTCGTATGC-3'。
本发明第二种鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记引物对为A11，A11正向引物核苷酸序列为5'-GGACTGGGGAGGTGTGAGTA-3'；A11反向引物核苷酸序列为5'-TGCAGAAAGAGCAGCAGAAA-3'。
鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法：
一、样本DNA的提取；
二、PCR检测：
PCR反应体系为25μl，由18μl自制PCR buffer、1.0μl浓度为10μmol/L的正向检测引物、1.0μl浓度为10μmol/L的反向检测引物、2μl样本DNA、0.2μl酶活为5U的Taq DNA聚合酶和余量的去离子无菌水组成；18μl自制PCR buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种d NTP混合液；其中检测引物为分子标记引物对A8或分子标记引物对A11；
PCR的扩增条件为：95℃预变性3min，变性95℃ 15s，退火57.7℃ 30s，延伸72℃30s，共35个循环，延伸72℃ 7min；
三、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
四、PCR结果判定：
4.a、采用分子标记引物对A8扩增出一条带的为纯种珠星三块鱼(即金滩头)，分子标记引物对A8扩增出2条带的为纯种三块鱼(即黑滩头)。
4.b、采用分子标记引物对A 11扩增出三条条带的为纯种珠星三块鱼(即金滩头)，分子标记引物对A 11扩增出2条带的为纯种三块鱼(即黑滩头)。
本发明方法简化了珠星三块鱼与三块鱼种质分子鉴定的步骤，根据琼脂糖凝胶电泳结果可视化的区别珠星三块鱼(金滩头)和三块鱼(黑滩头)，具有步骤简单、可操作性更强、设备要求更低，鉴定过程更快、鉴定结果更准确的优点。本发明方法可避免人工繁殖造成的种质混杂，保护种质资源。
附图说明
图1是实施例1采用分子标记引物对A8对野生原种珠星三块鱼(即金滩头)、三块鱼(即黑滩头)和银滩头样品扩增凝胶电泳图。
图2是实施例1采用分子标记引物对A11对野生原种珠星三块鱼(即金滩头)、三块鱼(即黑滩头)和银滩头样品扩增凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式第一种鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记引物对为A8，A8正向引物核苷酸序列为5'-GGCTACAGCAAGGCAAGAAC-3'；A8反向引物核苷酸序列为5'-ATGCATTTCCCTTCGTATGC-3'。
具体实施方式二：本实施方式第二种鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记引物对为A11，A11正向引物核苷酸序列为5'-GGACTGGGGAGGTGTGAGTA-3'；A11反向引物核苷酸序列为5'-TGCAGAAAGAGCAGCAGAAA-3'。
具体实施方式三：本实施方式鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法：
一、样本DNA的提取；
二、PCR检测：
PCR反应体系为25μl，由18μl自制PCR buffer、1.0μl浓度为10μmol/L的正向检测引物、1.0μl浓度为10μmol/L的反向检测引物、2μl样本DNA、0.2μl酶活为5U的Taq DNA聚合酶和余量的去离子无菌水组成；18μl自制PCR buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种d NTP混合液；其中检测引物为分子标记引物对A8或分子标记引物对A11；
PCR的扩增条件为：95℃预变性3min，变性95℃ 15s，退火57.7℃ 30s，延伸72℃30s，共35个循环，延伸72℃ 7min；
三、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
四、PCR结果判定：
4.a、采用分子标记引物对A8扩增出一条带的为纯种珠星三块鱼(即金滩头)，分子标记引物对A8扩增出2条带的为纯种三块鱼(即黑滩头)。
4.b、采用分子标记引物对A 11扩增出三条条带的为纯种珠星三块鱼(即金滩头)，分子标记引物对A 11扩增出2条带的为纯种三块鱼(即黑滩头)。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤三PCR扩增产物选用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。其它步骤及参数与实施方式三相同。
使用低浓度，如1.0～1.5％的琼脂糖凝胶不容易区分分子标记引物对A 11扩增出的位于250～500bp之间的第三条条带。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四的不同点是：步骤二中2μl样本DNA中含步骤一获得的样本DNA 50ng。其它步骤及参数与实施方式三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三、四或五的不同点是：步骤一样本DNA提取：取少量鳍条组织置于2mL的离心管中，离心管中加入600μL DNA提取裂解液(成分为：1M Tris pH 8.0、5M NaCl、0.5M EDTA pH 8.0、10％SDS和200μg/mL蛋白酶K)于55℃过夜消化；次日加入等体积的酚/氯仿混合液(1:1)抽提1次，12000rpm室温离心10min，吸取上清(约550μL)加入1mL无水乙醇沉淀，12000rpm室温离心10min，70％酒精洗涤1次，室温干燥10min，加入0.1×TE溶解。其它步骤及参数与实施方式三、四或五相同。
本实施方式获得DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)测定DNA浓度后稀释至10ng/μL，4℃保存备用。
实施案例1：
2016年4-6月，根据三块鱼属不同繁殖群体在黑龙江东宁县绥芬河的洄游时间及形态学差异，将采集的三块鱼分为金滩头、黑滩头和杂交体，分别收集7个个体的鳍条保存在95％酒精中；
然后进行DNA提取：取少量鳍条组织置于2mL的离心管中，离心管中加入600μL DNA提取裂解液(成分为：1M Tris pH 8.0、5M NaCl、0.5M EDTA pH 8.0、10％SDS和200μg/mL蛋白酶K)于55℃过夜消化；次日加入等体积的酚/氯仿混合液(1:1)抽提1次，12000rpm室温离心10min，吸取上清(约550μL)加入1mL无水乙醇沉淀，12000rpm室温离心10min，70％酒精洗涤1次，室温干燥10min，加入0.1×TE溶解；
再进行PCR检测：PCR反应体系为25μl，由18μl自制PCR buffer、1.0μl浓度为10μmol/L的正向检测引物、1.0μl浓度为10μmol/L的反向检测引物、2μl样本DNA、0.2μl酶活为5U的Taq DNA聚合酶和余量的去离子无菌水组成；18μl自制PCR buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种d NTP混合液；其中检测引物为分子标记引物对A8或分子标记引物对A11；
PCR的扩增条件为：95℃预变性3min，变性95℃ 15s，退火57.7℃ 30s，延伸72℃30s，共35个循环，延伸72℃ 7min；
之后PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，选用2.5％的琼脂糖凝胶。
采用分子标记引物对A8扩增结果如图1所示，珠星三块鱼(即金滩头)为单一条带，三块鱼(即黑滩头)为2条带，部分银滩头为单一条带(银滩头样品1,3,6,7)、部分银滩头为2条带(银滩头样品2,4,5)。
采用分子标记引物对A11扩增结果如图2所示，珠星三块鱼(即金滩头)为3条带，三块鱼(即黑滩头)为2条带，部分银滩头为3条带(银滩头样品1,3,6,7)、部分银滩头为2条带(银滩头样品2,4,5)。
分子标记引物对A8扩增条带都位于2000-1000bp之间可以区分野生原种金滩头和黑滩头，但不能有效区分银滩头。
分子标记引物对A11同样可以区分野生原种金滩头和黑滩头，但不能有效区分银滩头。
虽然，本发明方法不能有效区分银滩头，但通过银滩头样品判定的一致性，说明此方法有效、可靠。
实施案例2：
在2015年6月份，根据体色特征挑选金滩头(69尾)、黑滩头(65尾)、银滩头(70尾)分别注射电子标记。分别对样本剪去鳍条采用本发明方法进行鉴定。PCR结果与表型特征(体色分类)分类结果一致。
实施案例3：
在2015年6月份，根据体色特征挑选金滩头(69尾)、黑滩头(65尾)、银滩头(70尾)分别注射电子标记。将属于同种的配子(精液和卵子)收集在一起受精和孵化用于繁殖生产。当鱼苗生长到一定阶段时(平均体长1.05cm,平均体重0.0312g)，分别取随机金滩头子代，黑滩头子代和银滩头子代的整条幼鱼各40尾采用本发明方法进行鉴定。PCR结果与实际种质一致。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120> 鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctacagca aggcaagaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcatttcc cttcgtatgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactgggga ggtgtgagta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcagaaaga gcagcagaaa 20

Claims (5)

1.鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记，其特征在于该分子标记引物对为A8，A8正向引物核苷酸序列为5'-GGCTACAGCAAGGCAAGAAC-3'；A8反向引物核苷酸序列为5'-ATGCATTTCCCTTCGTATGC-3'。
2.鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的分子标记，其特征在于该分子标记引物对为A11，A11正向引物核苷酸序列为5'-GGACTGGGGAGGTGTGAGTA-3'；A11反向引物核苷酸序列为5'-TGCAGAAAGAGCAGCAGAAA-3'。
3.鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法，其特征在于按以下步骤进行鉴定：
一、样本DNA的提取；
二、PCR检测：
PCR反应体系为25μl，由18μl自制PCR buffer、1.0μl浓度为10μmol/L的正向检测引物、1.0μl浓度为10μmol/L的反向检测引物、2μl样本DNA、0.2μl酶活为5U的Taq DNA聚合酶和余量的去离子无菌水组成；18μl自制PCR buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种d NTP混合液；其中检测引物为分子标记引物对A8或分子标记引物对A11；
PCR的扩增条件为：95℃预变性3min，变性95℃15s，退火57.7℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，延伸72℃7min；
三、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
四、PCR结果判定：
4.a、采用分子标记引物对A8扩增出一条带的为纯种珠星三块鱼，分子标记引物对A8扩增出2条带的为纯种三块鱼。
4.b、采用分子标记引物对A 11扩增出三条条带的为纯种珠星三块鱼，分子标记引物对A 11扩增出2条带的为纯种三块鱼。
4.根据权利要求3所述的鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法，其特征在于步骤三PCR扩增产物选用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
5.根据权利要求3所述的鉴定珠星雅罗鱼和三块鱼的方法，其特征在于步骤二中2μl样本DNA中含步骤一获得的样本DNA 50ng。
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