KR101981401B1 - LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 이용한 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome, EMS)의 급성간췌장 괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법 및 키트 - Google Patents

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 이용한 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome, EMS)의 급성간췌장 괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 조성물과 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법을 제공함으로써 새우 EMS/AHPND의 독성 plasmid Pir A, Pir B를 LAMP PCR법으로 진단할 수 있는 방법으로 조기에 개체군의 감염여부를 고감도로 확인함으로서 질병에 대한 대책을 마련할 수 있는 효과가 있다.

Description

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 이용한 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome, EMS)의 급성간췌장 괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법 및 키트 {Primer set for detection of acute hepatopancreatic necrosis disease using the LAMP method, detection method and detection kit using the same}
본 발명은 양식수조에 새우종자를 입식한 초기에 심각한 폐사를 일으키는 급성간체장괴사증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)을 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR법을 이용하여 조기에 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세계 새우양식장에서 심각한 피해를 입히고 있는 AHPND는 ‘조기치사증후군 (Early mortality syndrome; EMS)’라는 질병의 원인으로 알려져 있다. 새우 종자를 입식하고 나서 30일 이내에 발생하는 초기 대량 폐사를 통칭하여 붙여진 명칭이었으며, 이후 질병의 원인체가 밝혀져 AHPND라는 질병명이 공식화되었다.
EMS/AHPND는 치하 입식후 30일 이내에 100% 치사하는 경우도 있으며, 주된 증상으론 비정상적인 유영 또는 호지의 바닥 근처에서 유영하고, 성장이 둔화되고 간체장이 흰색으로 변하면서 크기도 작아진다. 외골격도 부드러워지고 간체장에 흑색 반점이나 줄이 생긴다.
이 병은 해수상존 세균 중 하나인 비브리오 파라헤모라이티쿠스( Vibrio parahaemolyticus) 의 감염에 의해 발생하는데, 특히 독성물질 발현 유전자를 가지고 있는 경우에만 병원성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 감염 경로로는 주로 새우의 구강을 통해 감염이 이루어지며 위에서 증식하여 독소를 형성한 후 주요 장기인 간췌장으로 독소가 이동하여 장기 손상에 따라, 감염된 새우는 사료를 먹지도, 소화하지도 못하고 폐사하게 된다.
V. parahaemolyticus는 전 세계의 하구와 해양 환경에서 분리되기도 하며, 일부는 내열성 장독소 (enterotoxin)를 가지고 있어서 사람에게 식중독을 일으키는 병원체인 ‘장염비브리오균’으로도 불리운다.
그러나 AHPND 균주에서는 인간에 병원성을 나타내는 내열성 용혈소 관련 유전자는 발현하지 않았고, Type VI secretion system (T6SS)에 관여하는 두 가지 유전자 (Pir A/B toxin genes)가 발현하여 이 유전자가 AHPND의 병원성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 기존에 원인체로 보고된 “V. parahaemolyticus (VPAHPND) 뿐만 아니라 Pir toxin (PirA, PirB)을 생성하는 plasmid를 가지고 있는 비브리오 할베이(V. harveyi ) 균에 의한 감염”이라고 정의하고 있다.
최근 흰다리새우에서 종자를 입식한 후 대량 폐사가 발생하여 전 세계적으로 생산량과 가격의 변동을 가져오고 있다. 때문에 전세계 새우 생산량과 가격의 변동이 매우 심했는데, 주요 원인으로 새우전염병인 급성간췌장괴사증 (AHPND)이 지목되었기 때문에 이를 해결하고자 하는 연구가 필요하다. 또한 AHPND의 경우 높은 감염률과 높은 폐사율로 인해 적은양의 원인균이라도 심각한 피해를 입을수 있으므로 초기에 고강도로 신속하게 진단할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
AHPND의 분자생물학적 진단을 위하여 여러 가지 특이 primer가 개발되어 있으나, 원인균 PirA 또는 PirB 각 하나의 원인균으로만 검사를 확인하는 것이 대부분이다.
LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification)은 표적유전자에서 6개의 영역을 선택하여 조합한 4개의 프라이머를 사용하여 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 유전자 증폭법이다.
기존의 PCR법과 유사하지만, 한 가닥에서 두 가닥으로 변성반응이 필요 없어 60~65℃의 단일 온도에서 반응이 진행되고, 서멀사이클러와 같은 기기가 필요 없다. 또한, 증폭속도가 빠르고, 특이성도 높은 것이 특징이다.
따라서 두 가지 발생 원인균을 각각 진단할 수 있도록 PirA와 PirB 유전자 서열을 확보하여 기존의 검출 방법보다 높은 감도와 분석시간을 줄여 빠른 현장 적용성이 가능한 LAMP법으로 EMS/AHPND 검출 가능성을 높이는 개발이 필요하다.
국내 등록특허번호 제10-1566402호에는 마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트 및 흰반점바이러스를 진단하는 방법에 관한 것으로서, 흰반점바이러스의 감염 여부 뿐 만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라 흰반점바이러스를 정확하게 진단하여 수산물 정밀 검역에 소요되는 시간 및 공정을 줄이고 비용절감이 가능한 마이크로어레이 칩을 이용한 흰번점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1392305호에는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 WSSV(white spot syndrome virus) 및 HPV(hepatopancreatic parvovirus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 및 HPV의 동시 진단용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 WSSV와 HPV를 동시에 진단하는 방법, 서열번호 1 및 2로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 진단용 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 HPV 진단용 프라이머 세트에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1503511호에는 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, SSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만 아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용되는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2010-0072898호에는 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)법을 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV(israel acute paralysis virus) 감염 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단방법 및 진단용 키트에 관한 것으로서, 소정의 염기서열을 갖는 감염 진단용 프라이머 세트를 이용하여 꿀벌이 바이러스인 IAPV에 감염되었는지의 여부를 현장에서 신속하고 고감도이면서 정확하게 육안으로 진단할 수 있는 LAMP법을 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단방법 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다. Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp 인용논문 그러나 상기 선행문헌은 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 조성물과 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 구성은 개시하지 않아 차이를 보인다.
본 발명은 AHPND의 분자생물학적 진단을 위하여 여러 가지 특이 primer가 개발되어 있으나, 원인균 PirA 또는 PirB 각 하나의 원인균으로만 검사를 확인하였던 기존의 문제점을 해결하기 위하여, LAMP법을 이용하여 두 가지 발생 원인균을 각각 진단할 수 있도록 PirA와 PirB 유전자 서열을 확보하여 기존의 검출 방법보다 높은 감도와 분석시간을 줄여 빠른 현장 적용성이 가능한 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 이용한 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS)의 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법 및 키트를 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 조성물과 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 새우 EMS/AHPND의 독성 plasmid Pir A, Pir B를 LAMP PCR법으로 진단할 수 있는 방법으로 조기에 개체군의 감염여부를 고감도로 확인함으로서 질병에 대한 대책을 마련할 수 있다.
도 1은 본 발명의 V. parahaemolyticus plasmid Pir A 및 B toxin gene서열을 나타낸다.
도 2 는V . parahaemolyticus KC 12.020의 LAMP PCR결과를 나타낸다.
도 3은 V. parahaemolyticus KC 13.14.2 LAMP PCR결과를 나타낸다.
도 4는 V. harveyi KC 13.17.5 의 LAMP PCR결과를 나타낸다.
도 5는 V. parahaemolyticus KC 12.020의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 6은 V. parahaemolyticus KC 13.14.2의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 7은 V. harveyi KC 13.17.5 의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 8은 PirA와 PirB의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 9는 V. parahaemolyticus KC 12.020의 Conventional PCR결과를 나타낸다.
도 10은 V. parahaemolyticus KC 13.14.2 Conventional PCR결과를 나타낸다.
도 11은 V. harveyi KC 13.17.5 의 Conventional PCR결과를 나타낸다.
새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS 또는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)의 발병은 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus ) 의 감염에 의해 발생하고, 특히 Type VI secretion system (T6SS)에 관여하는 Pir A 및 B toxin gene를 가지고 있는 경우에만 병원성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 LAMP PCR법으로 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS 또는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 감염에서 발현되는 병원성 유전자를 특이적으로 진단 및 확인할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법) 방법을 이용하여 표적핵산의 단일염기 변이를 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다. 특히 LAMP에 사용되는 4종류의 프라이머 중 두 개의 내측 프라이머인 FIP 및 BIP의 각 5′말단이 검출대상 대립형질 염기에 상응하는 염기를 가지며, 상기 각 5′말단으로부터 두 번째 염기는 표적핵산의 염기와 상이한 염기를 갖도록 디자인하고, 이러한 프라이머를 사용하여, 특정 대립형질의 존재를 LAMP 반응의 증폭여부로 확인할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS 또는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트를 제공한다. 이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
실시예 1. EMS/ AHPND 배양조건 탐색
본 발명에서 사용된 비브리오균주는 베트남에서 발생한 새우조기폐사증후군 원인균인 비브리오균주 3종으로, V. parahaemolyticus KC 12.020, V. parahaemolyticus KC 13.14.2, 그리고 V. harveyi KC 13.17.5 종을 사용하여 실시하였다. 멸균된 maring agar에 비브리오균주 3종을 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤, 형성된 단일 colony를 maring agar broth에 넣고 37℃에서 24시간 교반 배양하였다.
실시예 2. Genomic DNA extraction
AHPND의 유전자 분석 (LAMP PCR)을 위하여 24시간 배양한 V. parahaemolyticus KC12.020, V. parahaemolyticus KC13.14.2, V. harveyi KC13.17.5 배양액 1ml을 12,000rpm에서 2분간 원심분리를 돌린 후 상층액을 제거하고, 5% chelex resin 100㎕를 분주한다.
미리 준비해둔 95℃ heating block에서 15분간 가열시킨 후 12,000rpm에서 5분간 원심분리 시켜 분리하였다. 분리된 genomic DNA는 NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하였다.
실시예 3. 프라이머 세트의 제작
도 1은 본 발명의 V. parahaemolyticus plasmid Pir A 및 B toxin gene서열을 나타낸다. V. parahaemolyticus plasmid pir like toxin gene 서열을 확보하고 Pir A 및 B toxin gene을 구분하기 위해 Genbank에 등록되어 있는 서열들을 참고하여 primer를 구상하였다.
표 1은 AHPND 특이 LAMP PCR용 프라이머 세트를 나타낸다. 표 1의 프라이머 세트는 높은 상동성을 갖는 조기치사증후군 (Early mortality syndrome; EMS)의 원인이 되는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)를 진단하기 위하여 감염에서 발현되는 병원성 유전자 Pir A 및 B toxin gene를 증폭하도록 설계된 프라이머이다.
EMS/AHPND pir A 와 pir B LAMP PCR용 primer
서열번호 Primer Name Sequence (5‘’ Len. 농도
( umol )
1 AHPND pirA lamp - F3 ACTGACTATTCTCACGATTGG 21 0.02
2 AHPND pirA lamp - B3 CATCACGTTGTACCACATG 19 0.02
3 AHPND pirA lamp - FIP TCTACACTACGACCGACTTCCGCGTCACAGAAGTAGACAG 40 0.05
4 AHPND pirA lamp - BIP GACGTGGGGAGCTTACCATTGATTTAGCCACTTTCCAGC 39 0.05
5 AHPND pirB lamp - F3 GAGTTAAACGGCGCTTAC 18 0.02
6 AHPND pirB lamp - B3 GGCAACTTTGTCAGAACCT 19 0.02
7 AHPND pirB lamp - FIP TTCACCAACAACAAATGTTCGATCATGTTGATGTTATTGCCAATGGAC 48 0.05
8 AHPND pirB lamp - BIP ACTCAGGCAAGCCAAGTGTGTCTTGATCCGCAAGCATG 38 0.05
또한 신속진단을 위한 LAMP PCR용 F3, B3, FIP, BIP primer들은 Primer Explorer V4 software (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)를 이용하여 melting temperature를 60∼65℃ 사이로 구성하였다.
Melting temperature, GC비율 및 hairpin 구조 등의 quality는 Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer version 3.1 software를 사용하여 검증한 후 제작하였다.
실시예 4. AHPND 특이 LAMP PCR용 primer의 진단법 조건 확립
EMS/AHPND pir A 와 pir B 검출을 위해 제작한 LAMP PCR용 primer의 최적 온도를 확인하기 위하여 동일한 양의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 표 1에서 제작한 4가지 set의 LAMP PCR용 primer에 대한 test를 수행하였으며 최종 25 ㎕ volume으로 12.5 ㎕의 Isothermal Master Mix (OptiGene, Japan)를 사용하였다. LAMP PCR은 Thermal Cycler Dice Real Time System TP850 (Takara, Japan)를 이용하여 수행하였다.
각 LAMP PCR primer 농도는 0.5 ㎕(5 pmol)의 External primer (F3, B3), 1.5 ㎕ (1.5 pmol)의 Internal primer (FIP, BIP) 를 사용하였다. PCR 반응은 65 ℃에서 30초 간 pre-denaturation 후, 65 ℃에서 60분 간 증폭시켰고, 얻어진 PCR 산물을 2% agarose gel에서 100 volt, 20분간 전기 영동하여 결과를 확인하였다.
또한, EMS/AHPND pir A 와 pir B 검출에 있어 LAMP PCR의 효율을 비교하기 위하여 genomic DNA를 각각 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 까지 단계적으로 희석 하여 PCR을 수행하였다.
표준시료를 대상으로 개발한 LAMP PCR법의 EMS/AHPND 검출 효율을 평가하기 위하여 증폭산물의 양을 비교하였다. 또한 최저 검출한계치 확인을 위해 주형의 양을 달리하여 PCR을 수행한 후 그 산물을 확인하였다.
도 2 내지 도 4는 V. parahaemolyticus KC 12.020, V. parahaemolyticus KC 13.14.2, 그리고 V. harveyi KC 13.17.5 의 LAMP PCR결과를 나타낸다. 분리한 genomic DNA를 serial dilution하여 각각 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101을 PCR 반응의 주형으로 사용함으로 검출의 최저 한계치를 확인하였다. LAMP PCR 결과 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101까지 증폭이 되었다.
도 5 내지 도 7은 V. parahaemolyticus KC 12.020, V. parahaemolyticus KC 13.14.2, 그리고 V. harveyi KC 13.17.5 의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5 내지 도 7 결과, 증폭산물을 쉽게 육안으로 확인할수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때, EMS/AHPND 검출을 위해 LAMP PCR 법을 적용하는 것이 감도 및 소요시간 면에서 유리할 것으로 판단된다.
실시예 5. AHPND Conventional PCR용 primer의 진단법 조건 확립
EMS/AHPND pir A 와 pir B 검출을 위해 제작된 LAMP PCR과 Conventional PCR의 최저한계치를 비교하기 위해서 LAMP PCR에서 사용한 것과 동일한 양의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 표 2에서 제작한 2가지 set의 Conventional PCR용 primer에 대한 test를 수행하였으며 최종 20 ㎕ volume으로 10 ㎕의 2X TOPsimple™ DyeMIXnTaq Master Mix (Enzynomics, Korea)를 사용하였다.
EMS/AHPND pir A 와 pir B Conventional PCR용 primer
No. Primer Name Sequence (5‘’ Len. 농도
( umol )
1 AHPND pirA Con - F1 GCAAACATACACCTATCATCC 21 0.02
2 AHPND pirA Con - R1 GATAGAATGCATTATCAGGGC 21 0.02
3 AHPND pirB Con - F1 CGGCAAAAGATGATTACATTGG 22 0.02
4 AHPND pirB Con - R1 GAATCGGTGAAACCGAATT 19 0.02
Conventional PCR은 AllInOneCycler (Bioneer, Korea)를 이용하여 수행하였다. 각 Conventional PCR primer 농도는 1 ㎕(10 pmol)의 PirA pirmer F1과 R1 및 PirB pirmer F1과 R1 사용하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 15분 간 pre-denaturation 후, 94 ℃에 30초 간 denaturation, 56 ℃에 1분간 annealing, 72 ℃에 40초 간 extension 과정을 30 cycle 반복하여 수행하였으며 추가로 72 ℃에서 5분 간 반응하였다. PCR산물은 Ethidium Bromide (EtBr)을 포함한 1% agarose gel을 이용하여 100 volt에서 30분 간 전기영동하여 증폭된 산물의 크기를 확인하였다.
또한, EMS/AHPND pir A 와 pir B 검출에 있어 LAMP PCR과 Conventional PCR 효율을 비교하기 위하여 genomic DNA를 각각 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 까지 단계적으로 희석 하여 PCR을 수행하였다.
표준시료를 대상으로 Conventional PCR법의 EMS/AHPND 검출 효율을 평가하기 위하여 증폭산물의 양을 비교하였다. 또한 최저 검출한계치 확인을 위해 주형의 양을 달리하여 PCR을 수행한 후 그 산물을 확인하였다.
도 8은 PirA와 PirB의 전기영동 결과를 나타내고 도 9는 V. parahaemolyticus KC 12.020의 Conventional PCR결과를, 10은 V. parahaemolyticus KC 13.14.2 Conventional PCR결과를, 도 11은 V. harveyi KC 13.17.5 의 Conventional PCR결과를 나타낸다.
도 8 내지 도 11의 결과로부터 증폭산물을 쉽게 육안으로 확인할 수 있었고,실시예1 내지 4의 LAMP PCR결과와 비교했을 때 EMS/AHPND 검출을 위해 LAMP PCR 법을 적용하는 것이 Conventional PCR법보다 감도 및 소요시간 면에서 유리할 것으로 판단된다.
본 발명은 통상적인 검출방법보다 높은 감도와 분석시간을 줄여 빠른 현장적용이 가능한 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 이용한 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 방법 및 키트를 제공하여 초기 질병의 확산에 빠르게 대처할 수 있으므로 새우 양식의 위험 부담성을 줄여주는 한편, 생산성을 높일 수 있어 양식 기반확대 및 수산분야의 발전에 기여한다고 판단됨으로 산업상 이용가능성이 있다.
<110> Solforto Co. Ltd. <120> Primer set for detection of acute hepatopancreatic necrosis disease using the LAMP method, detection method and detection kit using the same <130> p17-059 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir A like toxin gene <400> 1 actgactatt ctcacgattg g 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir A like toxin gene <400> 2 catcacgttg taccacatg 19 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir A like toxin gene <400> 3 tctacactac gaccgacttc cgcgtcacag aagtagacag 40 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir A like toxin gene <400> 4 gacgtgggga gcttaccatt gatttagcca ctttccagc 39 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir B like toxin gene <400> 5 gagttaaacg gcgcttac 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir B like toxin gene <400> 6 ggcaactttg tcagaacct 19 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir B like toxin gene <400> 7 ttcaccaaca acaaatgttc gatcatgttg atgttattgc caatggac 48 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for detecting V. parahaemolyticus plasmid Pir B like toxin gene <400> 8 actcaggcaa gccaagtgtg tcttgatccg caagcatg 38

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 새우종자의 급성간췌장괴상증(AHPND) 진단을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 새우종자의 급성간췌장괴상증(AHPND) 진단용 키트
  3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 새우 종자의 급성간췌장괴상증(AHPND) 진단방법
  4. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 새우종자의 급성간췌장괴상증(AHPND) 진단을 위한 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR용 조성물
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337626A (zh) * 2021-06-02 2021-09-03 江苏省海洋水产研究所 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法
WO2022124823A1 (ko) * 2020-12-09 2022-06-16 대한민국(해양수산부 국립수산물품질관리원장) 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130127079A (ko) * 2012-05-14 2013-11-22 부경대학교 산학협력단 Ｗｓｓｖ 및 ｈｐｖ의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130127079A (ko) * 2012-05-14 2013-11-22 부경대학교 산학협력단 Ｗｓｓｖ 및 ｈｐｖ의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jetnaphang Kongrueng et al., Aquacult Int., 23, p.1179-1188, 2015. *
K Koiwai et al., Journal of Fish Diseases, 39, p.603-606, 2016.* *
Narong Arunrut et al., PLOS one, 11(3), 2016. *
Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp 인용논문
Ratchanok Sirikharin et al., PLOS one, 10(5), 2015. *
국내 공개특허공보 제10-2010-0072898호에는 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)법을 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV(israel acute paralysis virus) 감염 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단방법 및 진단용 키트에 관한 것으로서, 소정의 염기서열을 갖는 감염 진단용 프라이머 세트를 이용하여 꿀벌이 바이러스인 IAPV에 감염되었는지의 여부를 현장에서 신속하고 고감도이면서 정확하게 육안으로 진단할 수 있는 LAMP법을 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌 바이러스 IAPV 감염 진단방법 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1392305호에는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 WSSV(white spot syndrome virus) 및 HPV(hepatopancreatic parvovirus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 및 HPV의 동시 진단용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 WSSV와 HPV를 동시에 진단하는 방법, 서열번호 1 및 2로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 진단용 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 HPV 진단용 프라이머 세트에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1503511호에는 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, SSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만 아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용되는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1566402호에는 마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트 및 흰반점바이러스를 진단하는 방법에 관한 것으로서, 흰반점바이러스의 감염 여부 뿐 만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라 흰반점바이러스를 정확하게 진단하여 수산물 정밀 검역에 소요되는 시간 및 공정을 줄이고 비용절감이 가능한 마이크로어레이 칩을 이용한 흰번점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트에 관하여 개시하고 있다.
그러나 상기 선행문헌은 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 급성간췌장괴상증(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) 진단 조성물과 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 구성은 개시하지 않아 차이를 보인다.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022124823A1 (ko) * 2020-12-09 2022-06-16 대한민국(해양수산부 국립수산물품질관리원장) 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물
CN113337626A (zh) * 2021-06-02 2021-09-03 江苏省海洋水产研究所 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法
CN113337626B (zh) * 2021-06-02 2024-03-12 江苏省海洋水产研究所 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法

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