JP2022535187A - 核酸分析用の多価性結合組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年9月23日に出願された米国特許出願第16/579,794号の一部継続出願であり、かつ2019年9月6日に出願された米国仮出願第62/897,172号および2019年5月24日に出願された米国仮出願第62/852,876号の利益を主張し、それらの文献の各々は、その全体として本明細書に取り込まれている。
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および、特許出願は、各々の出版物、特許、または、特許出願が、特異的にかつ個別に参照することによって組み込まれると意図されるのと同じ程度まで、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書の用語と引用される文献の用語との間で矛盾が生じる場合には、本明細書の用語の方が優先される。
本明細書で使用されるように、「核酸」(「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「リボ核酸(RNA)」、または「デオキシリボ核酸(DNA)」とも呼ばれる)は、共有結合したヌクレオシド間結合によって連結された2つ以上のヌクレオチド、またはその変異体もしくは機能的断片の直鎖状ポリマーである。核酸の自然発生例では、ヌクレオシド間結合はリン酸ジエステル結合である。しかしながら、他の例は随意に、ホスホロチオレート結合などの他のヌクレオシド間結合を含み、リン酸基を含むこともあれば、含まない場合もある。核酸は、二本鎖および一本鎖のDNA、ならびに二本鎖および一本鎖のRNA、DNA/RNAハイブリッド、ペプチド-核酸(PNA)、PNAとDNAまたはRNAとのハイブリッドを含み、他のタイプの核酸修飾も含む場合もある。
本明細書に開示されるのは、多価性結合組成物または組み込み組成物、および配列決定または他の生物検定用途に含まれる核酸分子の分析におけるそれらの使用である。ヌクレオチドの酵素(例えば、ポリメラーゼ)または酵素複合体への結合または組み込みの増加は、ヌクレオチドの有効濃度を増加させることによって影響を受ける可能性がある。その増加は、遊離溶液中のヌクレオチドの濃度を増加させることによって、または関連する結合または組み込み部位に近接するヌクレオチドの量を増加させることによって達成され得る。増加はさらに、ヌクレオチド数を限られた容積に物理的に制限することによって達成され得、それは、濃度の局所的な増加をもたらし、したがって、そのような構造は、非コンジュゲート化され、繋留解除され、またはその他の制限されていない個々のヌクレオチドに観察され得るよりも高い見かけの結合力で結合部位または組み込み部位に結合または組み込むことができる。このような制限を行うための非限定的な手段は、複数のヌクレオチドがポリマー、分枝ポリマー、デンドリマー、ミセル、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、量子ドットまたは当技術分野で知られている他の適切な粒子などの粒子に結合した多価性結合組成物または組み込み組成物を提供することによって行われる。
図1A-1Hは、多価性結合組成物が標的核酸を配列決定するために使用される1つの例示された方法を示す。図1Aに示されるように、標的核酸(102)は固体支持体表面(101)に繋留され得る。標的核酸は、表面へ直接または間接的に付着し得る。図1Aに示されていないが、標的核酸(102)は、共有結合または非共有結合によって表面へ付着しているアダプターにハイブリダイズされ得る。標的核酸を表面に付着させるために1つ以上のアダプターを使用する場合、標的表面は、アダプターに相補的であり、したがってアダプターにハイブリダイズするフラグメントを含み得る。いくつかの例では、1つのアダプター配列は表面に繋留されてもよい。いくつかの例では、複数のアダプター配列は表面に繋留されてもよい。いくつかの例では、標的核酸(102)は、アダプターを使用することなく固体支持体表面に直接に付着し得る。固体支持体は低非特異的結合表面になり得る。
図4A~4Bは、多価性結合組成物または組み込み組成物が標的核酸を検出するために使用される1つの例示された方法を示す。図4Aに示されるように、ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲート(401)は、ポリメラーゼ(406)、第1の核酸分子(404)と第2の核酸分子(405)に接して置かれる。ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲート(401)は、コアから放射状に広がる複数のポリマー分枝を有し、いくつかの分枝はヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(402)に付着し、いくつかの分枝は標識(403)に付着する。ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲート(401)上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(402)が第1の核酸(404)の少なくとも一部に相補的である場合、多価性結合複合体または組み込み複合体が図Bに示されるように形成され、および強力な結合または組み込みシグナルは、ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲート上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに相補的または部分的に相補的な配列を有する標的核酸を検出するのに役立つ。いくつかの例では、ポリメラーゼ、核酸分子、およびポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの少なくとも1つは、固体支持体に付着している。
本開示は、粒子(例えば、ポリマー、分枝ポリマー、デンドリマー、または同等構造)にコンジュゲートした複数のヌクレオチドを有する多価性結合組成物または組み込み組成物に関する。多価性結合組成物または組み込み組成物をポリメラーゼおよびプライミングされた標的核酸の複数のコピーと接触させると、検出され得る三元複合体が形成され、これが、今度は標的核酸の塩基のより正確な判定を達成し得る。
粒子-ヌクレオチドコンジュゲートでは、同じヌクレオチドの複数のコピーが粒子に共有結合または非共有結合している可能性がある。粒子の例は、分枝ポリマー;デンドリマー;アガロース、ポリアクリルアミド、アクリレート、メタクリレート、シアノアクリレート、メタクリル酸メチル粒子などの架橋ポリマー粒子;ガラス粒子;セラミック粒子;金属粒子;量子ドット;リポソーム;エマルション粒子、または当技術分野において既知の他の粒子(例えば、ナノ粒子、微粒子など)を含み得る。好ましい実施形態では、粒子は分枝ポリマーである。
粒子-ヌクレオチドコンジュゲートの1つの例はポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートである。ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートのいくつかの非限定的な例は図5A-5Cで示される。例えば、図5Aは、様々な構成、例えば、蛍光標識されたストレプトアビジンコアと、1Kダルトン~10Kダルトンの範囲の分子量のビオチン化された線状PEGリンカーを介してコアに結合した4つのヌクレオチドを含む「スターバースト」構成を有するポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートを示す;図5Bは、例えば、12、24、48、または96アームのデンドリマーコア、および中心から放射状に広がる1Kダルトン~10Kダルトンの範囲の分子量の線状PEGリンカーを有するポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートを示す;および、図5Cは、ビオチンなどの結合部分または組み込み部分を含む分枝PEGリンカーによって一緒に連結された、例えば、ストレプトアビジンコアのネットワークを含むポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの例を示す。
多価性結合組成物または組み込み組成物が、ポリメラーゼおよび標的核酸の1つ以上のコピーと複合体を形成するために単一の非コンジュゲート化または繋留解除されたヌクレオチドの置き換えに使用される場合、複合体(2つ以上の標的核酸分子を含む複合体が形成される場合)の結合力と同様にヌクレオチドの局所濃度は何倍にも増加し、それによってシグナル強度、特に正しいシグナル対ミスマッチが増強する。本開示は、多価性結合組成物または組み込み組成物をポリメラーゼおよびプライミングされた標的核酸と接触させて、三元結合複合体または組み込み複合体の形成を判定することを企図する。
本明細書に開示されるのは、改善された核酸ハイブリダイゼーションおよび増幅性能を可能にする低非特異的結合表面組成物を含む固体支持体である。一般的に、開示される支持体は、基板(または支持構造体)、共有結合または非共有結合した低結合性化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、および一本鎖標的核酸を支持表面に繋留するために使用され得る1つ以上の共有結合または非共有結合したプライマー配列の1つ以上の層を含んでもよい。いくつかの例では、表面の調合、例えば、1つ以上の層の化学組成、1つ以上の層を支持体表面および/または相互に架橋するために使用されるカップリング化学、および層の総数を変化させることで、タンパク質、核酸分子、およびその他のハイブリダイゼーションならびに増幅反応成分の支持体表面への非特異的結合が、匹敵する単層に比べて最小限に抑えられるか、減らされるようになる。多くの場合、支持体表面での非特異的なハイブリダイゼーションが、匹敵する単層と比較して最小限に抑えられるか、減少するように、表面の調合を変化させてもよい。支持体表面での非特異的な増幅が、匹敵する単層と比較して最小限に抑えられるか、減少するように、表面の調合を変化させてもよい。支持体表面での特異的な増幅率および/または収率が最大になるように、表面の調合を変化させてもよい。検出に適した増幅レベルは、本明細書に開示されている例によっては、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、または30より多くの増幅サイクルで達成される。
標的核酸の配列を判定する開示された方法は、a)配列決定される鋳型鎖および伸長されるプライマー鎖を含む二本鎖または部分的に二本鎖の標的核酸分子を、1つ以上の開示される核酸結合組成物と接触させる工程と、b)核酸結合組成物の核酸分子への結合を検出し、それにより、前記核酸分子上の前記1つ以上の核酸結合組成物の1つの存在および相補鎖に組み込まれる次のヌクレオチド(すなわち、N+1または末端ヌクレオチド)の同一性を判定する工程とを含む。
システムモジュール:上記のように、本明細書にさらに開示されるのは、開示される核酸配列決定または核酸検出および分析方法のいずれかを実行するために構成されたシステムである。いくつかの例では、開示されるシステムは、本明細書に記載される1つ以上の多価性結合組成物、1つ以上の緩衝液、および/または固体支持体に繋留された1つ以上の核酸分子を含み得る。
1.多価性結合組成物の調製
図5Aに示されるように、多アーム基板の1つの種類は、プロパルギルアミンdNTPをビオチン-PEG-NHSと反応させることにより作られた。この水性反応を完了に導き、精製すると、純粋なビオチン-PEG-dNTP種が得られた。別の反応では、いくつかの様々なPEGの長さは、1K Daから20K Daまで変動する平均分子量に対応して使用された。ビオチン-PEG-dNTP種は、3~5:1のDye:SA比を使用して、新たに調整されたか、あるいは市販の色素標識ストレプトアビジン(SA)のいずれかと混合された。ビオチン-PEG-dNTPと色素標識ストレプトアビジンとの混合は、各ストレプトアビジン四量体上のビオチン結合部位の飽和を確かなものにするために、過剰なビオチン-PEG-dNTPの存在下で行われた。完全な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって過剰なビオチン-PEG-dNTPから精製された。各ヌクレオチド種は個別に変化し精製され、その後、配列判定のための4塩基混合物を作製するためにともに混合された。
PEGポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートを有する多価性結合組成物を使用する結合反応は三元結合複合体の可能な形成を検出するために分析され、様々な工程の蛍光画像は図7のA~7Jに図示される。図7のAでは、20nMのクレノウポリメラーゼおよび2.5mMのSr+2を含有する曝露緩衝液中の500nMの塩基の標識ヌクレオチド(A-Cy3およびG-Cy5)へのDNAローリングサークルアプリケーション(RCA)の鋳型(GおよびAの第1の塩基)の曝露後の赤色および緑色の蛍光画像が示される。多価性PEG基板組成物は、4-アームのPEGアミン(4ArmPEG-NH)、ビオチン-PEGアミン(ビオチン-PEG-NH)およびヌクレオチド(Nuc)の変動する比率を、サンプルPB1およびPB5、4ArmPEG-NH:ビオチン-PEG-NH:Nuc=0.25:1:0.5;サンプルPB2、4ArmPEG-NH:ビオチン-PEG-NH:Nuc=0.125:0.5:0.25;サンプルPB3、4ArmPEG-NH:ビオチン-PEG-NH:Nuc=0.25:1:0.5のように使用して調整された。画像は、曝露緩衝液と同じ組成物であるがヌクレオチドまたはポリメラーゼを含まない撮像緩衝液で洗浄した後、収集された。
多価性リガンドレポーターに基づいて配列決定を実証するため、4つの既知の鋳型は低い結合基板上でRCA方法を使用して増幅された。連続サイクルは、20nMのクレノウポリメラーゼおよび2.5mMのSr+2を含有する曝露緩衝液に曝露され、撮像緩衝液で洗浄され、画像化された。撮像後、基板は洗浄緩衝液(EDTAおよび高い塩)で洗浄され、ブロックされたヌクレオチドは次の塩基へ進むために添加された。サイクルは5サイクル繰り返した。スポットは標準撮像処理およびスポット検出を使用して検出され、配列はサイクルされている鋳型を同定するために赤色と緑色の二色のスキーム(G-Cy3およびA-Cy5)を使用してコールされた。図8Aおよび図8Bに示されるように、多価性リガンドは全ての5つの配列決定サイクルを通して塩基弁別を提供することができる。
三元複合体は、実施例2におけるように調製され画像化される。複合体は、三元複合体の持続性を実証するために様々な時間、例えば60秒ほどにわたって画像化される。時間が経つと、複合体はその形成に使用された緩衝液と同一の緩衝液で洗浄され、この緩衝液は、任意の2価性カチオン、例えば、10mM Tris pH8.0、0.5mM EDTA、50mM NaCl、0.016%のTritonX100(SrOAcなし)を欠くだけであり、あるいは複合体は、その形成に使用された緩衝液と同一の緩衝液で洗浄され、この緩衝液はキレート剤を含むが任意の2価性カチオン、例えば、100nm-100mM EDTAを含み、10mM Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、50mM NaCl、0.016%TritonX100(SrOAcなし)を欠いている。複合体の蛍光は、三元複合体の解離の観察および定量化を可能にすることが経時的に観察される。この溶解の代表的な時間経過は図6に示される。
実施例4におけるように、三元複合体を調整、撮像、および解離した後、デブロッキング溶液は、ブロッキング部分を除去するには十分な、O-アジドメチル基、O-アルキルヒドロキシルアミノ基、またはO-アミノ基などの結合されたDNA分子を含有するチャンバーへと伸長するDNA鎖の3’末端から流し込まれる。これに続いてまたはこれと同時に、伸長溶液は、結合されたDNA分子を含有するチャンバーへと流し込まれる。伸長溶液は緩衝液、ポリメラーゼ活性を支持するのに十分な2価性カチオン、活性ポリメラーゼ、および全ての4つのヌクレオチドの適切な量を含有し、ヌクレオチドは、3’-O-アジドメチル基、3’-O-アルキルヒドロキシルアミノ基、または3’-O-アミノ基の組み込みなどにより、伸長するDNA鎖に単一のヌクレオチドが追加された後でさらなる伸長を支持することができなくなるようにブロックされる。伸長する鎖は、従って、1つおよび僅か1つの塩基によって伸長され、触媒的に不活性なポリメラーゼ、および多価性の結合基板の結合は、サイクルにおいて次の塩基をコールするために使用することができる。
実施例3に記載された様々なPEGアーム長さを有するポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、実施例1に記載されるように単一の配列決定サイクルに曝され画像化された。図9のA~Jで示されるように、PEG分枝の長さの増加により、シグナルは5K Daの明白な平均PEG MWに対応する長さにまで増加した(図9のA~D)。これより長いPEGアームの使用は、Cy3-AおよびCy5-Gの両方の蛍光シグナルの減少を引き起こした(図9のE~9G)。シグナル強度の定量的測度は、図10においてグラフ式に示される。
界面活性剤が存在する状態と存在しない状態で、多価性基板を調製し、結合複合体へと組み立てた。一方のセットでは10mM Tris pH 8.0、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5mM SroAc、0%のTritonX100(条件A)を、もう一方のセットでは10mMのTris pH 8.0、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5mM SroAc、0.016%TritonX100を使用した。図11は、DNAクラスターに結合されたこれらの多価性基板の正規化された蛍光を示し、トリトン-X100(0.016%)の存在下(条件B)で形成された基板複合体は増強された蛍光強度を明白に示す。
実施例2のように多価性基板を調製し、結合複合体へと組み立てた。遊離標識されたヌクレオチドを使用して、同一の緩衝液条件下で複合体も形成された。複合体は、複合体の持続時間を特徴づけるために、60分の期間にわたって画像化された。図12A~図12Bは代表的な結果を示す。多価性結合複合体は、60分より大きい時間尺度にわたり安定している(図12B)一方、標識された遊離ヌクレオチドは、1分未満で解離する(図12A)。
本開示は、DNA配列判定とバイオセンサの用途のための大幅に改善された方法および組成物を提供する。上記の特徴は例証的なものであって、限定的なものではないと意図されていることが理解されるべきである。多くの実施形態が、上記の記載の検討に際して当業者に明白であろう。例として、本発明の概念は主にポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用に関して記載されているが、他の種類の粒子-ヌクレオチドコンジュゲートを使用することができることは当業者によって容易に認識されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、量子ドット、リポソーム、またはエマルジョン粒子を含む粒子ヌクレオチドコンジュゲートを使用することが望ましいかもしれない。あるいは、コンジュゲーションは、水素結合などの非共有結合または他の相互作用によって達成され得る。したがって、本発明概念の範囲は、上記の記載に関して判定されるべきではなく、その代わりに、添付の請求項が与えられる等価物の十分な範囲とともに、このような請求項に関して判定されるべきである。
Claims (73)
- 標的核酸配列においてヌクレオチドの同一性を判定する方法であって、該方法は、
a.組成物であって、
i.前記標的核酸配列の2つ以上のコピー、
ii.前記標的核酸配列の1つ以上の領域に対して相補的である2つ以上のプライマー核酸分子、および
iii.2つ以上のポリメラーゼ分子、を含む組成物、
を提供する工程と、
b.ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと(a)の前記組成物における前記標的核酸配列の2つ以上のコピーとの間に多価性結合複合体が形成されることを可能にするのに十分な条件下で前記組成物を前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと接触させる工程であって、ここで、前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ヌクレオチド部分の2つ以上のコピー、および随意に1つ以上の検出可能な標識を含む、工程と、
c.前記多価性結合複合体を検出する工程であって、それによって前記標的核酸配列において前記ヌクレオチドの同一性を判定する、工程と、を含む方法。 - 前記標的核酸配列はDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記多価性結合複合体の検出は、非結合のまたは溶液媒介性のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートが存在しない状態で実施される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、複製され、または増幅され、または複製あるいは増幅によって産生されている、請求項1~3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記1つ以上の検出可能な標識は、蛍光標識である、請求項1~4のいずれか1つに記載の方法。
- 前記多価性複合体の検出する工程は蛍光測定を含む、請求項1~5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は、1種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項1~6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は2種以上のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記2種以上のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記接触させる工程は、3種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含み、および3種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含む、請求項1~10のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ブロックされたヌクレオチドは、3’-O-アジドメチルヌクレオチド、3’-O-メチルヌクレオチド、または3’-O-アルキルヒドロキシルアミンヌクレオチドである、請求項11に記載の方法。
- 前記接触させる工程は、前記多価性結合複合体を安定化させるイオンの存在下で行われる、請求項1~12のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、またはその任意の組み合わせの存在下で行われる、請求項1~13のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は触媒的に不活性である、請求項1~14のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は、突然変異または化学修飾によって触媒的に不活性状態にされている、請求項1~15のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は、必要なイオンまたは補助因子の非存在によって触媒的に不活性状態にされている、請求項1~16のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は、触媒的に活性である、請求項1~17のいずれか1に記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含まない、請求項1~18のうちのいずれか1つに記載の方法。
- 前記多価性結合複合体の持続時間は2秒を超える、請求項1~19のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、25℃~62℃の範囲内の温度で実行することができる、請求項1~20のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、1つ以上の蛍光標識をさらに含み、および前記標的核酸配列の2つ以上のコピーは、表面に堆積し、表面に付着し、または表面にハイブリダイズされ、ここで、表面上の多価性結合複合体の蛍光画像は、前記検出する工程においてコントラストノイズ比が20を超える、請求項1~21のいずれか1つに記載の方法。
- 前記(a)の組成物は、極性非プロトン性溶媒を取り込む緩衝液を使用して、表面に堆積する、請求項1~22のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は、前記ヌクレオチド部分が前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的である時に前記多価性結合複合体を安定化させ、前記ヌクレオチド部分が前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的ではない時に前記多価性結合複合体を不安定にする条件下で実施される、請求項1~23のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、複数の分枝を有するポリマーを含み、かつ前記2つ以上のヌクレオチド部分は、前記分枝に付着している、請求項1~24のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリマーの構成は、星型、くし型、交差型、ボトルブラシ型、またはデンドリマー型である、請求項25に記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、アビジン、ビオチン、アフィニティータグ、およびその組み合わせからなる群から選択された1つ以上の結合基を含む、請求項1~26のいずれか1つに記載の方法。
- 前記(a)の組成物とポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートとの間に形成された前記多価性結合複合体を不安定にする解離工程をさらに含み、前記解離工程は、前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの除去を可能にする、請求項1~27のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的なヌクレオチドを、前記2つ以上のプライマー核酸分子へと組み込むための伸長工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記伸長工程は、前記解離工程と同時に、またはその工程の後に行われる、請求項29に記載の方法。
- 標的核酸配列においてヌクレオチドの同一性を判定する方法であって、該方法は、
a.組成物であって、
i.前記標的核酸配列の2つ以上のコピー、
ii.前記標的核酸配列の1つ以上の領域に対して相補的である2つ以上のプライマー核酸分子、および
iii.2つ以上のポリメラーゼ分子、を含む組成物、
を提供する工程と、
b.ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと(a)の前記組成物における前記標的核酸配列の2つ以上のコピーとの間に多価性結合複合体が形成されることを可能にするのに十分な条件下で、前記組成物を前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと接触させる工程であって、ここで、前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、可逆的に終止されるヌクレオチド部分の2つ以上のコピー、および随意に1つ以上の切断可能で検出可能な標識を含む、工程と、
c.前記多価性結合複合体を検出する工程であって、それによって前記標的核酸配列において前記ヌクレオチドの同一性を判定する、工程と、を含む方法。 - 前記標的核酸配列はDNAである、請求項31に記載の方法。
- 前記多価性結合複合体の検出後、前記(a)の組成物を、可逆的に終止されたヌクレオチド、または可逆的に終止されたヌクレオチドの2つ以上のコピーを含むポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと接触させる工程をさらに含む、請求項31または32に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、複製され、または増幅され、または複製あるいは増幅によって産生されている、請求項31~33のいずれか1つに記載の方法。
- 前記1つ以上の検出可能な標識は、蛍光標識である、請求項31~34のいずれか1つに記載の方法。
- 前記多価性複合体を検出する工程は蛍光測定を含む、請求項31~35のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は、1種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項31~36のいずれか1つに記載の方法。
- 前記接触させる工程は、2種以上のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項31~37のいずれか1つに記載の方法。
- 前記2種以上のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記接触させる工程は、3種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含み、および3種のポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含む、請求項31~40のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ブロックされたヌクレオチドは、3’-O-アジドメチル、3’-O-メチル、または3’-O-アルキルヒドロキシルアミンである、請求項41に記載の方法。
- 前記接触させる工程は、前記多価性結合複合体を安定化させるイオンの存在下で行われる、請求項31~42のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は触媒的に不活性である、請求項31~43のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は、突然変異または化学修飾によって触媒的に不活性状態にされている、請求項31~44のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ分子は、触媒的に活性である、請求項31~45のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含まない、請求項31~46のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、25℃~80℃の範囲内の温度で実行することができる、請求項31~47のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、1つ以上の蛍光標識をさらに含み、および前記標的核酸配列の2つ以上のコピーは、表面に堆積し、表面に付着し、または表面にハイブリダイズされ、ここで、表面上の多価性結合複合体の蛍光画像は、前記検出する工程においてコントラストノイズ比が20を超える、請求項31~48のいずれか1つに記載の方法。
- システムであって、該システムは、
a)方法を実行するために個々にまたは総体的にプログラムされた1つ以上のコンピュータープロセッサーを含み、該方法は、
i)プライミングされた標的核酸配列を形成するために、その表面に繋留された標的核酸配列の複数のコピーを含む基板を、ポリメラーゼ、および前記標的核酸配列の1つ以上の領域に対して相補的な1つ以上のプライマー核酸配列を含む試薬と接触させる工程と、
ii)ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートと前記プライミングされた標的核酸配列の2つ以上のコピーとの間に多価性結合複合体が形成されることを可能にするのに十分な条件下で、前記基板表面を、前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートを含む試薬と接触させる工程であって、ここで、前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、既知のヌクレオチド部分の2つ以上のコピーおよび検出可能な標識を含む、工程と、
iii)前記多価性結合複合体を検出するために前記基板表面の画像を取得および処理する工程であって、それによって前記標的核酸配列においてヌクレオチドの同一性を判定する、工程と、を含む、システム。 - 一連の試薬を、規定順序および規定時間間隔で前記基板表面に送達するように構成された流体モジュールをさらに含む、請求項50に記載のシステム。
- 前記基板表面の画像を取得するように構成された撮像モジュールをさらに含む、請求項50または51に記載のシステム。
- 前記(ii)と前記(iii)は、2回以上繰り返され、それによって標的核酸配列において一連の2つ以上のヌクレオチドの同一性を判定する、請求項50~52のいずれか1つに記載のシステム。
- 一連の工程は、前記多価性結合複合体を不安定にする解離工程をさらに含み、前記解離工程は前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの除去を可能にする、請求項50~53のいずれか1つに記載のシステム。
- 前記一連の工程は、前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的なヌクレオチドを、前記2つ以上のプライマー核酸分子へと組み込むための伸長工程をさらに含む、請求項54に記載のシステム。
- 前記伸長工程は、前記解離工程と同時に、またはその工程の後に行われる、請求項55に記載のシステム。
- 前記検出可能な標識はフルオロフォアを含み、および前記画像は蛍光画像を含む、請求項50~56のいずれか1つに記載のシステム。
- フルオロフォアがシアニン染料3(Cy3)であり、20X対物レンズ、NA=0.75、532nm光に最適化されたダイクロイックミラー、シアニン染料-3放射のために最適化されたバンドパスフィルタ、およびカメラを装備した倒立蛍光顕微鏡を使用して、非シグナル飽和条件下で画像が取得され、その一方で前記表面が25mMのACES、pH7.4緩衝液に浸されている時に、前記基板表面上の多価性結合複合体の蛍光画像は、コントラストノイズ比が20を超える、請求項57に記載のシステム、
- 前記一連の工程は、60分未満で完了する、請求項50~58のいずれか1つに記載のシステム。
- 前記一連の工程は、30分未満で完了する、請求項50~59のいずれか1つに記載のシステム。
- 前記一連の工程は、10分未満で完了する、請求項50~60のいずれか1つに記載のシステム。
- ベースコールの精度は、判定されたヌクレオチド同一性の少なくとも80%に対して25を超えるQスコアを特徴とする、請求項50~61のいずれか1つに記載のシステム。
- ベースコールの精度は、判定されたヌクレオチド同一性の少なくとも80%に対して30を超えるQスコアを特徴とする、請求項50~62のいずれか1つに記載のシステム。
- ベースコールの精度は、判定されたヌクレオチド同一性の少なくとも80%に対して40を超えるQスコアを特徴とする、請求項50~63のいずれか1つに記載のシステム。
- 組成物であって、前記組成物は、
a)ポリマーコアと、
b)前記ポリマーコアに付着した2つ以上のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分と、を含み、
ここで、リンカーの長さは、前記ポリマーコアに付着しているヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分に依存する、組成物。 - 組成物であって、前記組成物は、
a)ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの混合物を含み、該ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートの各々は、
i)ポリマーコアと、
ii)前記ポリマーコアに付着した2つ以上のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分と、を含み、ここで、リンカーの長さは、前記ポリマーコアに付着しているヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分に依存し、
および前記混合物は、少なくとも異なる2種の付着したヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分を有するポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートを含む、組成物。 - 前記ポリマーコアは、複数の分枝を有するポリマーを含み、および2つ以上のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド、またはヌクレオシドアナログ部分は、前記分枝に付着している、請求項65または66に記載の組成物。
- 前記ポリマーの構成は、星型、くし型、交差型、ボトルブラシ型、またはデンドリマー型である、請求項67に記載の組成物。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、アビジン、ビオチン、アフィニティータグ、およびその組み合わせからなる群から選択された1つ以上の結合基を含む、請求項65~68のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記ポリマーコアはポリエチレングリコール(PEG)分枝分子を含む、請求項65~69のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含む、請求項65~70のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記ブロックされたヌクレオチドは、3’-O-アジドメチルヌクレオチド、3’-O-メチルヌクレオチド、または3’-O-アルキルヒドロキシルアミンヌクレオチドである、請求項71に記載の組成物。
- 前記ポリマー-ヌクレオチドコンジュゲートは、1つ以上の蛍光標識をさらに含む、請求項65~72のいずれか1つに記載の組成物。
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