JPWO2020243017A5

JPWO2020243017A5 -

Info

Publication number: JPWO2020243017A5
Application number: JP2021561845A
Authority: JP
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2040-05-22

Claims

標的核酸配列においてヌクレオチドの同一性を判定する方法であって、該方法は、
（ａ）組成物であって、
（ｉ）前記標的核酸配列の２つ以上のコピー、
（ｉｉ）前記標的核酸配列の１つ以上の領域に対して相補的である２つ以上のプライマー核酸分子、および
（ｉｉｉ）２つ以上のポリメラーゼ分子、を含む組成物、
を提供する工程と、
（ｂ）ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートと（ａ）の前記組成物における前記標的核酸配列の２つ以上のコピーとの間に多価性結合複合体が形成されることを可能にするのに十分な条件下で前記組成物を前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートと接触させる工程であって、ここで、前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、２つ以上のヌクレオチド部分を含む、工程と、
（ｃ）前記多価性結合複合体を検出する工程であって、それによって前記標的核酸配列において前記ヌクレオチドの同一性を判定する、工程と、を含む方法。
前記標的核酸配列はＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記多価性結合複合体の検出は、非結合のまたは溶液媒介性のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートが存在しない状態で実施される、請求項１に記載の方法。
前記標的核酸配列は、複製され、または増幅され、または複製あるいは増幅によって産生されている、請求項１に記載の方法。
前記多価性結合複合体を検出する工程は蛍光測定を含む、請求項１に記載の方法。
前記接触させる工程は１種のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項１に記載の方法。
前記接触させる工程は２種以上のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含む、請求項１に記載の方法。
前記２種以上のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項７に記載の方法。
前記接触させる工程は、３種のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの使用を含み、および３種のポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの各種は、異なる種のヌクレオチド部分を含む、請求項８に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含む、請求項１に記載の方法。
前記ブロックされたヌクレオチドは、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－メチル、または３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミンヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
前記接触させる工程は、前記多価性結合複合体を安定化させるイオンの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
前記接触させる工程は、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、またはその任意の組み合わせの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
前記ポリメラーゼ分子は触媒的に不活性である、請求項１に記載の方法。
前記ポリメラーゼ分子は、突然変異または化学修飾によって触媒的に不活性状態にされている、請求項１に記載の方法。
前記ポリメラーゼ分子は、必要なイオンまたは補助因子の非存在によって触媒的に不活性状態にされている、請求項１に記載の方法。
前記ポリメラーゼ分子は、触媒的に活性である、請求項１に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、ブロックされたヌクレオチド部分を含まない、請求項１に記載の方法。
前記多価性結合複合体の持続時間は２秒を超える、請求項１に記載の方法。
前記方法は、２５℃～４２℃の範囲内の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、１つ以上の蛍光標識をさらに含み、および前記標的核酸配列の２つ以上のコピーは、表面に堆積し、表面に付着し、または表面にハイブリダイズされ、ここで、表面上の多価性結合複合体の蛍光画像は、前記検出する工程においてコントラストノイズ比が２０を超える、請求項１に記載の方法。
（ａ）の前記組成物は、極性非プロトン性溶媒を取り込む緩衝液を使用して、表面に堆積する、請求項１に記載の方法。
前記接触させる工程は、前記ヌクレオチド部分が前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的である時に前記多価性結合複合体を安定化させ、前記ヌクレオチド部分が前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的ではない時に前記多価性結合複合体を不安定にする条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、複数の分枝を有するポリマーを含み、かつ前記２つ以上のヌクレオチド部分は、前記分枝に付着している、請求項１に記載の方法。
前記ポリマーの構成は、星型、くし型、交差型、ボトルブラシ型、またはデンドリマー型である、請求項２４に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、アビジン、ビオチン、アフィニティータグ、およびその組み合わせからなる群から選択された１つ以上の結合基を含む、請求項１に記載の方法。
（ａ）の前記組成物とポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートとの間に形成された前記多価性結合複合体を不安定にする解離工程をさらに含み、前記解離工程は、前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートの除去を可能にする、請求項１に記載の方法。
前記標的核酸配列の次の塩基に対して相補的なヌクレオチドを、前記２つ以上のプライマー核酸分子へと組み込むための伸長工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
前記伸長工程は、前記解離工程と同時に、またはその工程の後に行われる、請求項２８に記載の方法。
前記ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートは、１つ以上の検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。